CN111012788B

CN111012788B - 硝唑尼特和替唑尼特在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN111012788B
Application number: CN201911270735.5A
Authority: CN
Inventors: 韦淑亚; 徐圣; 郑楠
Original assignee: Wuhan Polytechnic University
Current assignee: Wuhan Century Jinhui Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2039-12-12
Also published as: CN111012788A

Abstract

本发明公开了硝唑尼特和替唑尼特在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用，及药物制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染药物方面的应用。本发明发现硝唑尼特和/或替唑尼特及其药学上可接受的盐有效保护动物细胞的药物浓度低，可达微摩尔级浓度级别。本发明还发现硝唑尼特和/或替唑尼特及其药学上可接受的盐能保护细胞抵抗病毒感染并降低病毒在细胞中的核酸量。

Description

硝唑尼特和替唑尼特在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及动物抗病毒领域，更具体地，涉及硝唑尼特和替唑尼特在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用。

背景技术

硝唑尼特(nitazoxanide，NTZ)，化学名为邻[N-(5-硝基噻唑-2-基)氨基甲酰]苯酚乙酸酯(2-(acetyloxy)-N-(5-nitro-2-thiazolyl)benzamide)，是一种噻唑类药物，在上世纪七十年代首次合成。硝唑尼特是一种前药，给药后在体内很快水解为其活性代谢产物替唑尼特(Tizoxanide，TIZ)，但两者生物作用相似，都具有抗寄生虫等药效作用。

自上世纪70年代以来，人们对硝唑尼特和替唑尼特的认识和开发逐渐增多。首先人们为了应对各种原虫病对人类和动物的危害，通过结构改造发明了硝唑尼特和替唑尼特，并发现其对感染人和动物多种绦虫、原虫等都有抑制作用。鉴于硝唑尼特和替唑尼特活性相似，而替唑尼特溶解性差，因此硝唑尼特被作为替唑尼特的前药用于抗寄生虫，并已经于2002年被美国FDA批准用于治疗儿童蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫等肠道原虫感染引起的疾病。经过多年在非洲及南美多个国家使用表明，其抗寄生虫感染效果好，不良反应少。

进一步的研究发现硝唑尼特和替唑尼特还能对众多的厌氧微生物具有抑制作用。而研究机制揭示其抗寄生虫及厌氧微生物的机制可能是干扰其丙酮酸：铁氧还蛋白还原酶(PFOR)所依赖的电子转移反应。丙酮酸：铁氧还蛋白还原酶(PFOR)所依赖的电子转移反应是寄生虫和厌氧微生物能量代谢的重要环节。近年来还发现，硝唑尼特能抑制葡萄球菌等细菌的被膜，具有多种抗微生物模式。

随着人们对硝唑尼特和替唑尼特兴趣的增加，人们相继发现硝唑尼特具有抗病毒活性、抗炎活性等一系列生物活性。其中，实验室研究显示，硝唑尼特或替唑尼特能抑制乙型、丙型肝炎病毒；抑制轮状病毒；能够在翻译后阶段阻断流感病毒血凝素蛋白的成熟，对甲型流感、乙型流感均具有高效抑制活性。临床研究结果显示，一日两次、每次600mg、连续服用5天硝唑尼特能够有效降低普通流感的病程。但抗某些病毒感染的机制尚未完全阐明，硝唑尼特和替唑尼特在抗动物病毒上的应用尚无报道。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)俗称为猪蓝耳病毒，为猪繁殖与呼吸综合征的病原，是一种单股正链有囊膜的RNA病毒。PRRSV根据基因型主要分为两种：Ⅰ型，主要存在欧洲；Ⅱ型，主要存在北美洲。两种基因型大约有60％的序列具有一致性，同时也表现出不同的血清型。

猪繁殖与呼吸综合征是一种高度接触性传染病，以母猪繁殖障碍(晚期流产、早产、死胎、弱胎、木乃伊胎)和仔猪呼吸障碍、非特异性淋巴单核性和间质性肺炎甚至死亡等为主要临床表现。我国南方猪场在2006年爆发了“高热症”(临床上表现为高热、耳朵发绀、高发病率、快速传播和高死亡率)给我们养猪业带来巨大损失，经我国科学家采用多种手段鉴定，证明其就是一种变异的PRRSV，即高致病性PRRSV。目前，PRRSV不仅仍然是我国养猪业的主要病原，也是全世界养猪业的巨大威胁。因此，研究开发抗PRRSV感染和抑制PRRSV病毒复制的有效药物，对动物防控猪繁殖与呼吸综合征具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供硝唑尼特和替唑尼特在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用本发明提供的技术方案如下：

硝唑尼特和/或替唑尼特在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染药物方面的应用。

一种药物制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染药物方面的应用，包括硝唑尼特和/或替唑尼特原型药物，硝唑尼特和/或替唑尼特在药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体或组合。

本发明提供的技术方案至少包括以下有益效果：

1、本发明发现硝唑尼特和/或替唑尼特能有效抑制PRRSV病毒致细胞CPE发生，保护动物细胞的药物浓度低至微摩尔级浓度级别。

2、本发明发现硝唑尼特和/或替唑尼特能保护细胞抵抗病毒感染并降低病毒在细胞中的核酸量。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1 MARC-145细胞在不同硝唑尼特和替唑尼特药物浓度下的细胞存活率；

图2硝唑尼特抑制PRRSV致细胞病变对比图；

图3硝唑尼特或替唑尼特对PRRSV病毒产生细胞病变的抑制作用；

图4硝唑尼特和替唑尼特分别作用PRRSV感染细胞后上清液的TCID50值；

图5 Real-time PCR检测PRRSV ORF-7基因mRNA的表达量。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。

针对猪繁殖与呼吸综合征对动物的巨大危害，本发明目的是寻找对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)有抗病毒活性的药物，可用于PRRSV病毒感染的防治。

本发明提供的硝唑尼特和/或替唑尼特原型药物，硝唑尼特和/或替唑尼特在药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体或组合，具备对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抵抗作用，保护细胞，抑制PRRSV病毒在细胞内的复制等的功能，在防治动物PRRSV病毒病方面具有很好的应用前景。

具体的，“药学上可接受的盐”是指适于受试者的治疗或与受试者的治疗相容的硝唑尼特和/或替唑尼特的酸加成盐或碱加成盐。

酸加成盐是任何碱性化合物的任何无毒的有机或无机酸加成盐。形成酸加成盐的碱性化合物包括例如包含胺基的化合物。形成适合盐的说明性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸，以及酸性金属盐，如正磷酸氢钠和硫酸氢钾。形成适合盐的说明性有机酸包括单羧酸、二羧酸和三羧酸。此类有机酸的实例为例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、扁桃酸、水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、羟乙基磺酸、对甲苯磺酸和其它磺酸,如甲磺酸、乙磺酸和2-羟基乙磺酸。酸加成盐可形成单酸盐或二酸盐，并且此类盐可以水合形式、溶剂合形式或基本上无水的形式存在。通常，酸加成盐更易溶于水和各种亲水性有机溶剂中，并且与其游离碱形式相比通常表现出更高的熔点。

适于受试者的治疗或与受试者的治疗相容的碱加成盐是任何酸性化合物的任何无毒的有机或无机碱加成盐。形成碱加成盐的酸性化合物包括例如包含羧酸基团的化合物。形成适合的盐的说明性无机碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化钡以及氨。形成适合的盐的说明性有机碱包括脂族、脂环族或芳族有机胺,如异丙胺、甲胺、三甲胺、甲基吡啶、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因(procaine)、哈胺(hydrabamine)、胆碱、EGFRaine、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。说明性有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。选择适当的盐可能有用，使得化合物中其它地方的酯官能团(如果有的话)不被水解。用于适当盐的选择准则对于本领域技术人员将是已知的。

“药学上可接受的载体”意指与活性成分混合以允许形成药物制剂(即能够向受试者施用的剂型)的无毒的溶剂、分散剂、赋形剂、佐剂、稀释剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、润滑剂、着色剂、调味剂或其它材料。此类载体的一个非限制性实例是通常用于胃肠外施用的药学上可接受的油。

如本文所用的术语“药物制剂”是指适于药物用途的组合物，包括注射制剂、口服片剂或透皮制剂。注射制剂包括冻干粉针剂；口服制剂包括粉剂、散片剂、口服液、胶囊剂或颗粒剂。

下面的实施例是本发明说明性优选实施方案，对本发明不构成任何限制。实施例中所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

实施例1：硝唑尼特和替唑尼降低猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞CPE实验

将硝唑尼特或替唑尼特作用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的MARC-145细胞，通过检测MARC-145细胞的细胞病变(CPE)来检测其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的活性。

1、实验材料与方法

药物溶液的配制：分别准确称量硝唑尼特及替唑尼特溶于DMSO，配制成硝唑尼特溶液及替唑尼特的母液，置于-4℃保存。

细胞与病毒株：非洲绿猴肾(MARC-145)细胞，由本单位实验室保存，生长培养基为10％FBS(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA)的DMEM培养基，维持培养基为含2％FBS的DMEM培养基。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)vJX143毒株，由本单位实验室保存。将MARC-145细胞接种于96孔板，将病毒液进行10倍系列稀释，然后接种于96孔板，并设正常细胞对照。37℃、5％CO₂培养48-72h。CPE法观察细胞病变情况，按Reed-Muench法计算TCID50。

MTT检测药物细胞毒性：

MARC-145细胞弃旧培养基后用1×PBS清洗，然后0.25％胰蛋白酶消化(2～4min)，收集细胞与离心管中，1500rpm离心5min。弃上清，加入培养基将细胞重悬，将细胞接种于96孔板上，每孔细胞数10000。待细胞长成单层后，吸出生长液，每孔加入100μL含有相应浓度硝唑尼特或替唑尼特(0、0.5、1、1.5、3、6、12μmol/L，分别由硝唑尼特溶液及替唑尼特的母液用DMSO稀释而成)的维持液，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h和48h后，每孔加入20μL MTT，37℃、5％CO₂培养箱中孵育4h，每孔加入150μL DMSO，低速震荡10min，待紫色结晶完全溶解后，并用酶标仪测定吸光度值(λ＝490)。细胞存活率大于80％的孔板对应的硝唑尼特或替唑尼特浓度用于抗病毒实验。

药物抑制PRRSV的细胞病变作用：

长成80％单层的MARC-145细胞培养瓶(底面培养面积25cm²)中加入含有100TCID50/100μL的PRRSV病毒液1mL在37℃作用2h，弃上清，PBS洗涤后加含硝唑尼特或替唑尼特(0、0.5、1、1.5、3、6μmol/L)培养基5mL继续培养。逐日观察细胞形态变化，在显微镜下观察培养细胞的形态和发生细胞病变(CPE)的情况。

接种MARC-145细胞于96孔板，长成70％～80％单层后，吸去培养液，用100μL100TCID50的PRRSV病毒液吸附MARC-145细胞，在37℃孵育1h，PBS洗去游离病毒，加入含硝唑尼特或替唑尼特(0.5、1、1.5、3、6μmol/L)的细胞维持液100μL，每个药物浓度8孔重复，另设药物空白和病毒空白对照，在37℃、5％CO₂继续培养，48h后观察CPE。重复3次，计算药物保护细胞CPE的抑制率，并计算IC50值。抑制率计算公式为：

细胞上清中病毒滴度的测定

将PRRSV病毒稀释成相应浓度加入6孔板中，使每孔含有病毒量为100TCID50，然后放37℃、5％CO₂孵箱孵育2小时，弃病毒液并用PBS洗涤。然后加入用2％细胞维持液稀释的相应浓度硝唑尼特和替唑尼特(0.5、1、1.5、3、6μmol/L)，加入到对应的孔中，每孔加入2mL，细胞对照组只加2％细胞维持液。37℃、5％CO₂继续培养继续培养48h后，收获细胞上清并十倍稀释接种于铺满MARC-145细胞的96孔板100μL/孔，在37℃孵育2h，然后PBS洗去游离病毒，加入细胞维持液100μL，37℃、5％CO₂继续培养48h后观察CPE。按Reed-Muench法计算各个药物浓度的TCID50值。

2、结果

细胞毒性：如图1所示，MARC-145细胞在各硝唑尼特和替唑尼特药物浓度下的细胞存活率在6μmol/L以下均保持在90％以上，但12μmol/L浓度下细胞存活率分别下降到81％和84％。说明本实施例中所使用的硝唑尼特和替唑尼特工作浓度对MARC-145无明显的细胞毒性。因此排除了“药物对细胞毒性从而造成病毒无法在细胞内正常增殖”的可能性，并选择6μmol/L以下的硝唑尼特和替唑尼特药物浓度进行抗PRRSV病毒研究。

药物抑制抑制PRRSV致细胞病变作用：如图2所示，硝唑尼特或替唑尼特作用后在显微镜下观察培养细胞的形态和发生细胞病变(CPE)的情况发现，空白细胞生长良好，细胞呈多边形；空白病毒对照组细胞出现明显的细胞病变，轮廓变圆、多细胞脱落，有许多碎片；各个加药细胞处理组细胞病变随药物浓度的提高而显著下降。总体上，0.5μmol/L浓度的硝唑尼特或0.5μmol/L浓度的替唑尼特作用时，75％以上细胞发生病变；1μmol/L浓度的硝唑尼特或1μmol/L浓度的替唑尼特作用时，近50％细胞发生病变；1.5μmol/L、3μmol/L浓度的硝唑尼特，或1.5μmol/L、3μmol/L浓度的替唑尼特作用时，25％以下的细胞发生病变；6μmol/L浓度的硝唑尼特或6μmol/L浓度的替唑尼特作用时，几乎没有细胞病变。这说明硝唑尼特或替唑尼特具有抑制PRRSV致细胞病变的能力。

如图3所示，进一步通过PRRSV病毒液吸附MARC-145细胞在37℃孵育1h后，加入含硝唑尼特或替唑尼特，48h后观察CPE发现，硝唑尼特或替唑尼特能抑制病毒对细胞的CPE的发生，保护细胞。计算可得其IC50值分别为2.0μmol/L和2.4μmol/L。

细胞上清中病毒滴度的测定：

如图4可见，将0.5、1、1.5、3、6μmol/L硝唑尼特和替唑尼特分别作用PRRSV病毒感染的细胞48h后其上清液进行TCID50测定。按Reed-Muench法计算各个药物浓度的TCID50值，随着药物浓度的增加TCID50值下降，说明硝唑尼特和替唑尼特具有抑制PRRSV病毒感染的MARC-145细胞内繁殖的能力。

实施例2：硝唑尼特和替唑尼特降低猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染细胞病毒核酸载量实验

1、实验方法

药物处理：将PRRSV病毒稀释成相应浓度加入6孔板中，使每孔含有病毒量为100TCID50，然后放37℃、5％CO₂孵箱孵育2小时，弃病毒液并用PBS洗涤。然后加入用2％细胞维持液稀释的相应浓度硝唑尼特和替唑尼特(0.5、1、1.5、3、6μmol/L)，加入到对应的孔中，每孔加入2mL，继续培养24h，细胞对照组只加2％细胞维持液。

提取RNA：

1)丢去培养液，按照RNA提取说明书，向6孔板中每孔加入350μL Buffer RLT，用移液枪吹吸混匀使其充分裂解后，转移到无核酸酶EP管中，离心取上清；

2)加入等体积的70％乙醇，混匀；

3)将上述混合液转入无RNA酶的离心柱中，12000rpm离心15s，弃废液；

4)加入700μL Buffer RW1，12000rpm离心15s，弃废液；

5)加入500μL Buffer RPE，12000rpm离心15s，弃废液；

6)加入500μL Buffer RPE，12000rpm离心2min，弃废液；

7)换新的无RNA酶的2mL收集管，12000rpm离心1min，使滤柱干燥；

8)换上新的1.5mL收集管，每管加入50μL不含RNA酶的水，12000rpm离心2min，洗脱液即含有相应的RNA，加入RNA酶抑制剂，用Nano Drop检测各RNA浓度。

RNA反转录为cDNA：

cDNA的合成按TaKaRa公司试剂盒PrimeScript TM RT-reagent Kit(PerfectReal Time)说明进行。首先在0.2ml PCR管中加入如下组分在冰上配制反转录反应体系：

将上述反应体系混匀后瞬时离心，在PCR仪上按37℃15min进行反转录反应，85℃5sec终止反应。将获得的cDNA取1μl稀释35倍后分装，剩余cDNA和稀释后分装的cDNA均保存在-80℃备用。

Real-time PCR：

以β-actin作为内参基因，将cDNA产物进行Real time PCR，全程实验操作均在冰上进行，并注意相应步骤需要避光条件。按照参考文献提供的引物序列合成PRRSV的ORF-7引物，所用PCR引物序列如下：

Forward primer,PRRSV ORF-7：5’-AGATCATCATCGCCCAACAAAAC-3’；

Reverse primer,PRRSV ORF-7：5’-GACACAATTGCCGCTCACTA-3’；

Forwardprimer,monkeyβ-actin：5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3’；

Reverseprimer,monkeyβ-actin：5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’。

按下列组分在低温冰浴中配制PCR反应液，每个样品重复测3次。

本研究利用人细胞看家基因LDHA作为对照，绘制标准曲线。取未稀释的cDNA进行10倍倍比稀释，共5个稀释度，每个稀释度样品重复3次。取稀释35倍的样品cDNA进行荧光定量PCR反应。

PCR反应条件如下：

95℃	30s
		40cycles：
95℃	5s
		60℃	34s
Dissociation stage

反应结束后运行溶解曲线，对PCR反应进行特异性分析。

采用SPSS15.0统计软件对Real-time PCR数据进行单因素方差分析(One-wayANOVA)。实验数据用x±s的形式表示。与药物空白对照组比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2、实验结果

如图5，采用Real-time PCR方法测定病毒ORF-7的基因结果显示，以0.5、1、1.5、3、6μmol/L硝唑尼特和替唑尼特分别作用PRRSV病毒感染24h后的细胞中病毒ORF-7基因有明显下降，这种趋势是随着药物浓度的增加，ORF-7的基因相对表达量显著下降，说明硝唑尼特和替唑尼特具有抑制MARC-145细胞内PRRSV病毒基因组繁殖的能力。

本发明实施例提供的数据表明，硝唑尼特和替唑尼特可抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染所导致的细胞病变效应(CPE)，保护细胞(如MARC-145细胞)，并在细胞上抑制病毒复制，减少细胞培养物中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸载量。硝唑尼特和替唑尼特的这种保护作用在体外抗PRRSV病毒实验中可达微摩尔级浓度级别，显示了其高效性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.硝唑尼特和/或替唑尼特在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染药物中的应用，及制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒在细胞内复制的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的对象是动物和/或动物细胞。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染药物和抗猪繁殖与呼吸综合征病毒在细胞内复制的药物为药物制剂，均包括硝唑尼特和/或替唑尼特原型药物，硝唑尼特和/或替唑尼特在药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体或组合。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐，包括酸加成盐或碱加成盐。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物制剂包括注射制剂、口服片剂或透皮制剂。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物制剂包括冻干粉针剂、口服粉剂、口服散片剂、口服液、口服胶囊剂或口服颗粒剂。