UA125283C2

UA125283C2 - Великі пористі тривимірні каркасні структури, отримані з активного гідроксіапатиту шляхом біоморфного перетворення природних структур та процес їх отримання

Info

Publication number: UA125283C2
Application number: UAA201801339A
Authority: UA
Inventors: Анна Тамп'єрі; Анна ТАМПьЕРИ; Сімоне Спріо; Симоне СПРИО; Андреа Руффіні; Андреа РУФФИНИ
Original assignee: Ґрінбоун Орто С.Р.Л.; Гринбоун Орто С.Р.Л.
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2016-08-03
Publication date: 2022-02-16
Also published as: DK3331580T3; US20200276356A1; PT3331580T; AU2016304431A1; IL257241B; PH12018500272A1; BR112018002448B1; SI3331580T1; EA035416B1; WO2017021894A1; IL257241A; US11213605B2; CA2994049A1; HUE046337T2; EA201890291A1; ES2758357T3; JP2018523632A; PL3331580T4; US11357886B2; HRP20192181T1

Description

Цей винахід стосується гідроксиапатиту, отриманого з пористої деревини. Зокрема цей винахід стосується біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, отриманої з пористої деревини для застосування, як замінника кістки. Цей винахід також стосується процесу перетворення деревини на біоморфну гідроксиапатитну каркасну структуру, яку може бути застосовано, як замінника кістки.

Основою сучасної обробки та розробки кераміки є добре встановлена послідовність процесів, яка дозволяє отримати великі тривимірні об'єкти. Докладно кажучи, іноваційні керамічні фази може бути синтезовано у вигляді порошків, певні особливості яких, як-то стехіометричні / іонні заміщення, нанорозміри та поверхнева активність, є відповідальними за певні функціональні властивості. На даний час керамічну обробку застосовують для отримання макроскопічних керамічних тривимірних об'єктів адекватної форми та їх пористість передбачає теплову обробку (спікання) синтезованих керамічних порошків, зручно сформованих у тривимірну структуру (для їх консолідації). Всі ці операції є потрібними для отримання керамічних тривимірних об'єктів з належними фізико-хімічними та механічними властивостями, більшість яких втрачається протягом вищезазначеного процесу обробки кераміки (особливо обробки шляхом спікання). Ці серйозні обмеження розвитку функціонального керамічного матеріалу, які пов'язані з сучасним процесом його обробки викликають гальмування подальшого розвитку цієї галузі.

Сьогодні, з розвитком сучасного суспільства, технологічні продукти набувають стійко зростаючої ролі в житті та продуктивності людей, тому існує сильна потреба в розумних інструментах, здатних забезпечити вирішення складних та персоналізованих вимог у різних галузях застосування, як-то охорона здоров'я, екологія, енергетика. Тому існує широкий консенсус щодо необхідності нових підходів для повторюваного та масового виробництва макроскопічних пристроїв зі складною структурною організацією в макромасштабі, але в той же час із складною структурою, визначеною на нанорівні та навіть на кристалічному рівні. Такі макро- та наноструктури є доречними для викликання нетривіальних, але високотехнологічних функціональних ефектів.

Що стосується вищезгаданих питань, пов'язаних з керамічними матеріалами, то слід зазначити про існування потреби у необхідному парадигматичному зміненні з метою отримання

Зо високоефективної кераміки великих розмірів зі складною мікро- та макроструктурою.

Зразковими прикладами такого матеріалу можуть бути каркасні структури кісток з особливим акцентом на регенерацію дефектів великих кісток, які несуть навантаження, оскільки вони повинні бути пористими керамічними тривимірними об'єктами з високою біоактивністю для можливості їх колонізації клітинами та кінцевої регенерації в якості великих кісткових дефектів.

В зв'язку з цим можна зауважити, що досі ще не було знайдено жодного адекватного рішення для цієї потреби клінічної медицини.

Протягом багатьох десятиріч, головним матеріалом для будування кісткової основи було визнано гідроксиапатит (Сат(РОЗє(ОН)г), оскільки ця сполука дуже нагадує склад природного кісткового мінералу та виявляє відмінну біосумісність та остеокондуктивність. Однак, біомімікрія гідроксиапатиту пов'язана з його нанорозміром та наявністю різних іонів, які частково замінюють кальцій та фосфат в апатитній гратці та які є джерелом біологічної активності кісток під час утворення нової тканини, реконструкції та резорбції.

Застосування обробки спіканням до гідроксиапатитних каркасних структур активує поверхневі та об'ємні реакції у ділянках між прилеглими гранулами гідроксиапатиту, які утворюють структуру кристалічної гратки апатиту, видаляючи з неї чужорідні іони та викликаючи об'єднання цих гранул до розміру у кілька мікрометрів зі зменшенням певних поверхневих властивостей, гідрофільності та афінності з білками та клітинами.

Активоване процесом спікання великомасштабне об'єднання гранул призводить до загальної консолідації гідроксиапатитного об'єкту через зменшення міжгранулярної пористості та, в свою чергу, зменшення загального об'єму. Це також викликає залишкові навантаження, які є одними з головних джерел структурних дефектів керамічних матеріалів. В зв'язку з цим можна зауважити, що усунення цих залишкових навантажень у керамічних матеріалах є досить важким через їх високу ригідність (порівняно до металів та полімерів) та вони є одними з найбільш значних факторів, погіршуючих механічні експлуатаційні властивості керамічних матеріалів, особливо у випадку великих об'єктів, які відрізняються складними формами та пористими структурами, в яких змінення об'єму, які супроводжують цикли нагрівання/охолодження легко можуть викликати критичне структурне пошкодження.

З вищезазначених причин слід зазначити, що класичні процеси керамічного синтезу не дозволяють здійснити виробництво керамічних матеріалів, зокрема гідроксиапатитів, які мають бо біоміметичний склад та структуру, а також високу біоактивність та здатність до резорбції. Це особливо стосується випадків синтезу великих пористих керамічних тривимірних об'єктів для регенерації кісткових дефектів критичного розміру (тобто г» 2 см).

Біоміметичний склад та структура мають ключове значення для індукції регенеративного каскаду іп мімо, що може однозначно визначати та сприяти регенерації великих частин кісток, які зазнають навантаження, як-то довгих кісток кінцівок. Такими явищами, які є тісно пов'язаними між собою та повинні відбуватися синергічно з активуванням та підтриманням регенерації кістки зі всіма її функціями, є: ї) швидкий остеогенез, остеокондукція та остеоінтеграція; ії) поширене утворення кровоносних судин; їїї) можливість розвитку біо-резорбці.

Швидкий остеогенез та оостеокондукція роблять можливим виникнення поширеного утворення кісткової тканини та проникнення її у каркасну структуру, що тим самим призводить до появи тісного з'єднання кісткової тканини та каркасної структури та оптимальної остеоінтеграції. Для досягнення цих ефектів потрібно застосування кісткоподібної хімічної композиції, а також наявність добре відкритої та взаємозв'язаної пористості, щоб окрім поширеного проникнення нової кісткової тканини могло бути досягнуто й одночасне утворення судинної сітки, яке буде сприяти утворенню та закінченню розвитку нової кістки. Неповна колонізація каркасної структури може призвести до утворення порожнин, фіброзних або некротичних тканин та буде зменшувати загальну силу та біомеханічні характеристики конструкції кісткової тканини /каркасної структури.

У межах часу, сумісного з новим утворенням кістки, її каркасна структура повинна бути підданою поступовій резорбції з метою досягнення оптимального регенерації кістки після пошкодження або захворювання. Всі досі розроблені кісткові каркасні тривимірні структури було отримано на основі спечених фосфатів кальцію, які є кристалічними матеріалами та які перешкоджають активності остеокластів у порівнянні з нанокристалічним та нанорозмірним іонозаміщеним апатитом; отже, незважаючи на те, що пористі кісткові каркаси з гідроксиапатиту може бути добре вбудовано у оточуючу кісткову тканину за рахунок поверхневої адгезії, втрата біологічної резорбції не дозволить відбутися процесу повної реконструкції, тобто заміщенню каркасної структури новою кістою. Це призводить до неповного регенерації функціональних можливостей ураженої кістки, особливо у випадку дуже довгих кісткових сегментів, які несуть навантаження.

Зо Каркасна структура також повинна, особливо у випадку регенерації довгих кісток, які несуть навантаження, мати адекватні механічні характеристики разом з одночасним зберіганням відкритої макро-пористості, що є проблемою з огляду на те, що ці особливості, як правило, є зворотно пов'язаними (тобто чим вище пористість, тим менше буде механічна стійкість) та на те, що високий рівень пористості є потрібним для забезпечення адекватної колонізації каркасної структури та остеоінтеграції Це є одним з головних доречних факторів, обмежуючих застосування сучасних каркасних структур у відновленні великих частин довгих кісток, які несуть навантаження. Стосовно цього, каркасні структури з ієрархічно організованою пористою структурою можуть виявляти відмінні механічні характеристики у порівнянні з матеріалами, які мають подібну пористість з випадковим чином організованою структурою. У зв'язку з цим слід зазначити, що тільки каркасні структури з такою організованою структурою можуть ефективно активувати процеси механо-трансдукції на клітинному рівні, вмикаючи тим самим регенерацію зрілої, організованої та механічно компетентної кістки.

Запропоновану інновацію отримано на основі парадигматичного змінення класичного процесу керамічного синтезу на новий спосіб реакційного спікання, який дозволяє отримати керамічні фази з визначеним хімічним складом, організовані у великі тривимірні об'єкти зі складною морфологією, ієрархічною структурою та які одночасно мають оптимізовані механічні характеристики, починаючи з ієрархічно організованих природних структур. У цьому відношенні біоморфне перетворення є опорним пунктом цього інноваційного підходу, який може бути застосовано до ієрархічно організованих природних структур (наприклад, структур деревини, рослин, екзоскелетів).

Спробу біоморфного перетворення деревних структур на керамічні структури, які імітують структуру кісткової тканини було успішно здійснено із застосуванням видів деревини з пористою структурою, як-то деревини сосни та ротангу та деревини з більшою щільністю, як сипо та червоний дуб, як матриць для відтворення структури та механічних характеристик, відповідно, губчастої та кортикальної кісткової тканини. Про застосування деревини для отримання біоміметичних гідроксиапатитних каркасних структур було повідомлено у роботі Аппа Татрієгі еї аІ. іп Ше Чдоштаї! ої Маїепа! Спетівігу, 2009, 19, 4973-4980. В цій публікації, Татрієгі еї аї. описують процес перетворення довгих (1 см) шматків деревини сосни та ротангу (слід зазначити, що маленькі шматочки цього матеріалу є неприйнятними для регенерації дефектів бо критичного розміру) на гідроксиапатит. Цей процес полягав у застосуванні піролізу зразків деревини з температурою у 1000С з повільною швидкістю нагрівання та наступною карбюризацією, під час якої карбонову матрицю перетворюють на карбід кальцію. Цієї карбюризації було досягнуто або шляхом інфільтрації рідкої фази або шляхом інфільтрації парової фази, яку було здійснено при температурах, перевищуючих точку кипіння кальцію (1484 "С). Процес карбюризації полягав у застосуванні початкового нагрівання піролізованої деревини до 800 "С з наступним нагріванням до 1100 "С та кінцевим нагріванням до 1650 С протягом З год. Для закінчення цієї реакції було необхідно протягом З год. нагріти піролізовану деревину до цієї температури. Після карбюризації тривимірний каркас карбіду кальцію окислювали для перетворення карбіду кальцію на оксид кальцію, зберігаючи морфологію натуральної деревини. Після окиснення, тривимірну матричну структуру оксиду кальцію було піддано карбонізації для перетворення каркасної структури з оксиду кальцію на матричну структуру з карбонату кальцію

Для того, щоб дозволити молекулам СО» проникнути крізь відкладення СасСо»з, які утворюються аж до ядра структури з Сао було застосовано високі значення тиску (2,2 мПа).

Наостанок було здійснено операцію фосфатизації для перетворення каркасної структури з карбонату кальцію на гідроксиапатитну каркасну структуру з ієрархічно організованою анізотропною морфологією, схожою на подібну морфологію природної деревини. Під час цієї операції отримані з деревини заготовки з СаСОз було просочено протягом доби водним розчином КН2гРоОх з температурою 200 "С та під тиском у 1,2 МПа.

З допомогою вищеописаного процесу було отримано гідроксиапатитну керамічну каркасну структуру з ієрархічно організованою анізотропною морфологією природної деревини.

Міцність при стисканні каркасної структури, яку було отримано з деревини сосни складала 2,5-4 МПа у поздовжньому напрямку та 0,5-1 МПа у поперечному напрямку. Через це слід зазначити, що з допомогою цього процесу можна отримати лише каркасні структури обмеженого розміру, який звичайно є меншим за 1 см. Низькі значення міцності при стисканні у поєднанні з розміром, який не перевищує 1 см робить ці каркасні структури недоречними для регенерації кістки, особливо у випадку кісток, які несуть навантаження. Фактично було визнано те, що критичний кістковий дефект повинен мати довжину, яка у 2-3 рази перевищує діаметр ураженої кістки. Отже, каркас розміром 1 см не може вважатися корисним в цьому відношенні.

Зо Про зазначену вище операцію фосфатизації щодо перетворення деревини на гідроксиапатит було більш детально повідомлено у роботі Кийіпі еї аІ. іп Спетіса! Епдіпеегіпд

Уоитаї 217 (2013) 150-158. Описані в цій публікації циліндричні матриці карбонату кальцію, отримані з деревини ротангу діаметром 8 мм та довжиною 10 мм було застосовано, як початкові матеріали. Процес фосфатизації було здійснено із застосуванням водних розчинів гідрофосфату амонію, дигідрофосфату амонію та аміаку.

У Патентній Заявці М/О 2012/063201, яку було опубліковано 18 травня 2012 р., описано замінник кістки, який містить ядро на основі гідроксиапатиту, отриманий з принаймні однієї пористої деревини та каркас на основі гідроксиапатиту або карбіду силіцію, отриманий з принаймні однієї деревини, яка має нижчу пористість, ніж принаймні одна деревина ядра. Цей каркас було отримано з порожнистою циліндричною формою, прийнятною для розміщення ядра, яке може бути отримано у вигляді твердого циліндру, вставленого у порожнину цього каркасу. Процес отримання цього замінника кістки з деревини також описано в цій заявці.

Першою операцією цього процесу є піроліз природної деревини, як-то ротангу або сосни, шляхом її нагрівання до температури 800-2000 "С, в результаті чого отримують карбоновий матеріал. На другому етапі цей карбоновий матеріал перетворюють на карбід кальцію з температурою 1500-1700 "С. Далі цей карбід кальцію піддають окисленню з температурою 900- 1000 "С. З метою перетворення матеріалу з оксиду кальцію на карбонат кальцію здійснюють процес карбонізації, який відбувається в автоклаві з температурою у 400 "С та під тиском СО», який складає 2,2 МПа та триває одну добу. Потім матеріал карбонату кальцію перетворюють на гідроксиапатит, частково заміщений карбонатом шляхом фосфатування. Ця отримана з ротангу гідроксиапатитна каркасна структура має міцність при стисканні, яка складає 4-5 МПа у поздовжньому напрямку та 1 МПа у поперечному напрямку.

Хоча згадані вище публікації описують успішне перетворення деревини, як-то ротангу та сосни на гідроксиапатит з одночасним чітким відтворенням тривимірної морфології деревини, все ж слід зазначити про неможливість отримання особливостей, прийнятних для регенерації довгих сегментів кісток, які несуть навантаження.

В зв'язку з цим можна зауважити, що всі зазначені публікації, які стосуються отриманих з деревини гідроксиапатитних каркасних структур малого розміру (тобто їх об'єм є меншим за 1 смУ) не можуть мати реального клінічного втілення, особливо стосовно регенерації великих бо частин кісток, які несуть навантаження. Описані у попередньому рівні техніки процеси є неприйнятними для виробництва гідроксиапатитних каркасних структур, які мають габарити, зручні для клінічних застосувань, як-то для регенерації кісткових дефектів критичних розмірів у ділянках, які несуть навантаження, для якої потрібно застосування великих каркасних структур, тобто структур, розмір яких складає принаймні 2 см.

Отже в цій галузі залишається потреба у біоморфній каркасній структурі, зокрема у пористій тривимірній каркасній структурі з біоміметичним хімічним складом, яка буде виявляти адекватні механічні характеристики та морфологія якої буде сприятливою до клітинної колонізації та судинного росту та яка одночасно буде мати розмір, прийнятний для клінічних застосувань.

Така біоморфна каркасна структура буде особливо корисною для кісткової регенерації, зокрема для імплантації у дефекти кісток, які несуть навантаження, як-то довгих кісток кінцівок (наприклад, кісток стегна, плечових кісток, великих та малих гомілкових кісток, променевих кісток), але й також для заміщення та регенерації кісток хребця (наприклад, хребцевих тіл та міжхребцевих дисків) та частин кісток черепа або щелепно-лицьового відділу.

Цей винахід задовольняє вищезазначені потреби шляхом надання біоморфного каркасу, переважно гідроксиапатитної каркасної структури, яка є особливо прийнятною для заміщення та регенерації кісток, зокрема для заміщення та регенерації довгих кісток, які несуть навантаження.

Цей винахід також задовольняє вищезазначені потреби шляхом надання процесу виробництва біоморфного каркасу, переважно тривимірного біоморфного каркасу. Зокрема ця біоморфна каркасна структура є гідроксиапатитним каркасом.

Головним чином цей винахід стосується гідроксиапатитної каркасної структури, отриманої з деревини, яка має загальну пористість у 60-95 95 та яку було виміряно після піролізу цієї деревини. Каркасна структура за винаходом має довжину, виміряну в поздовжньому напрямку, у якому розмір цієї каркасної структури є максимальним та перевищує або дорівнює 2 см.

Більш докладно цей винахід стосується біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, отриманої з деревини, яка має загальну пористість у 60-9595 та яку було виміряно після піролізу цієї деревини. Каркасна структура за винаходом відрізняється ієрархічно організованою пористою структурою та міцністю при стисканні, яка перевищує 5 МПа та переважно складає 10- 20 МПа, виміряною в напрямку вздовж каналоподібних пор (у поздовжному напрямку).

Зо Переважно гідроксиапатит за винаходом виявляє міцність при стисканні вздовж перпендикулярного напрямку довгої осі каналів (поперечний напрямок), яка складає до 10 МПа.

Переважно цей отриманий з деревини біоморфний гідроксиапатитний каркас має ієрархічно організовану пористу структуру, яка походить з ієрархічно організованої пористої структури деревини, з якої її було отримано (природної деревини).

Цей винахід також стосується отриманої з деревини біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, в якій гідроксиапатит є частково заміщено (активовано) одним або кількома іонами, вибраними з групи, яка містить магній, стронцій, кремній, титан, карбонат, натрій, калій, галій, срібло, мідь, залізо, цинк, марганець, європій та гадоліній.

Деревина, з якої отримано цей біоморфний гідроксиапатит має загальну пористість, яку було виміряно після піролізу цієї деревини та яка складає 60-95 95, переважно 65-85 95.

Деревина, яка має таку пористість включає ротанг, сосну, абачі, бальсове дерево, сипо, дуб, рожеве дерево, кемпас та волоський горіх. Переважно біоморфний гідроксиапатит отримують з деревини ротангу.

Біоморфна гідроксиапатитна каркасна структура, яку отримано з деревини за винаходом має структурну згуртованість та механічні властивості, які роблять її особливо прийнятною для застосування, як замінника кістки.

Отже, цей винахід стосується застосування біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, як замінника кістки, а також замінника кістки, який містить цей біоморфний гідроксиапатитний каркас. Винахід також стосується замінника кістки, який складається з цього біоморфного гідроксиапатитного каркасу.

Цей отриманий з деревини біоморфний гідроксиапатитний каркас може бути застосовано, як замінник кістки для відновлення кістки або частини кістки, зокрема кісток тварини та людини.

Переважно цей отриманий з деревини біоморфний гідроксиапатитний каркас може бути застосовано, як кістковий замінник для кісток або частин кісток, підданих механічним навантаженням. Більш переважно ці кістки або частини кісток є довгими кістками кінцівок, як-то кісток стегна, плечових кісток, великих та малих гомілкових кісток та променевих кісток.

Цю отриману з деревини біоморфну гідроксиапатитну каркасну структуру також може бути застосовано для заміщення та/або реконструкції частин кісток черепа, частин кісток щелепно- лицьового відділу та кісток хребця (наприклад, хребцевих тіл та міжхребцевих дисків). бо Біоморфну гідроксиапатитну каркасну структуру за винаходом також може бути застосовано, як фільтр для рідин або газів.

Цей винахід також стосується процесу отримання біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури деревного походження.

Зокрема цей винахід стосується процесу отримання біоморфного гідроксиапатитного каркасу, який має довжину, виміряну в поздовжньому напрямку, в якому його розмір є максимальним та перевищує або дорівнює 2 см та який полягає у застосуванні операцій піролізу, карбюризації, окиснення, гідратації, карбонування та фосфатування шматка деревини (природної деревини), який має загальну пористість принаймні у 20 95, переважно принаймні у 40 96, переважно в межах 60-95 95 та в яких цю пористість виміряно після піролізу цієї деревини.

Прикладами природної деревини, яку може бути піддано дії процесу за винаходом є ротанг, сосна, абачі, бальсове дерево, сипо, дуб, рожеве дерево, кемпас та волоський горіх.

Хоча тут наведено численні втілення цього винаходу, слід зазначити, що й інші втілення будуть зрозумілими фахівцям в цій галузі після його детального опису. Як також буде зрозуміло, певні втілення, як тут описано, є здатними до модифікацій у різних очевидних аспектах без відходу від суті винаходу. Відповідно, наведені креслення та детальний опис повинні розглядатися за своїм характером лише як ілюстративні та не мають обмежувального характеру.

Стислий опис фігур

Наступні фігури ілюструють переважні втілення розкритого тут предмету. Зазначений предмет може бути зрозумілим з посиланням на наступний опис у поєднанні з супровідними фігурами, на яких:

Фіг1 є ілюстрацією особливого втілення біоморфної каркасної структури, яка містить центральний канал.

Фіг2 є фотографічним зображенням тканин експлантованого мишачого черепного даху через 8 тижнів. Розповсюджене кісткоутворення та проникні властивості пор каркасної структури було досягнуто в тієї ж саме мірі, як і у випадку окремої імплантації або імплантації з остеогенними стромальними клітинами. На цій фотографії у випадку а) відображено наявність матеріалу деревини та відсутність тканинних клітин; у випадку р) відображено наявність гідроксиапатиту та відсутність тканинних клітин; у випадку с) відображено наявність матеріалу

Зо деревини та тканинних клітин; та у випадку 4) відображено наявність гідроксиапатиту та тканинних клітин. Стрілками на Фіг.2 Її вказано каналоподібні пори каркасної структури з імітацією гаверсових кісткових систем. Гаверсові системи або остеони є функціональними одиницями компактної речовини кісток та мають вигляд циліндрів кісткової пластинки, оформлених у вигляді концентрованих шарів. Всередині остеонів існує канал, який містить кістковий нерв та канал кровопостачання.

На Фіг.3 зображено діаграму деформування біоморфної каркасної структури, підданої навантаженням шляхом стиснення, на якій у - навантаженню (М), та х - стисненню (мм).

Фіг.4 є розподіленням внутрішнього об'єму пор біоморфного гідроксиапатиту за винаходом порівняно до об'єму пор ієрархічно структурованого гідроксиапатиту, отриманого з допомогою відомого в цій галузі способу.

Фіг.5 є графічним зображенням підвищеної життєздатності мезенхімальних стовбурових клітин при контакті з каркасними структурами, які містять 2-5 молярних відсотків іонів стронцію у порівнянні з позбавленою стронцію матричною структурою (ВС) через 24 год., 48 год., 72 год., 7 днів та 14 днів досліджень. у - 95 відносно ВС.

Фіг.б є графічним зображенням експресії важливих для остеогенезу генів, як-то (а) гена

КИМХаО2 та (Б) гена АГР у каркасних структурах, молярна частка стронцію в яких дорівнює 2 (512 95-ВС) та 5 (5г5 95-ВС). у - змінення експресії «у рази) по відношенню до ВС та х - кількість днів.

Фіг.7 є графічним зображенням життєздатності остеобластів у контакті з каркасними структурами, молярна частка стронцію в яких дорівнює 2 (5г2 95-ВС) та 5 (515 95-ВС), у порівнянні з позбавленою стронцію каркасною структурою (ВС) через 24 год., 48 год., 72 год., 7 днів та 14 днів досліджень. у - 95 відносно ВС.

Фіг.8 є графічним зображенням експресії важливих для остеогенезу генів, як-то (а) гена

Оз5іегіх, (Б) гена Всоіар, та с) гена ІВ5Р у каркасних структурах, молярна частка стронцію в яких дорівнює 2 (512 У0-ВС) та 5 (5г5 У5-ВС). у - змінення експресії (у рази) по відношенню до СТ та х

Е кількість днів.

Фіг. 9 є графічним зображенням експресії важливих для остеогенезу генів, як-то (а) гена

Озастг, (Б) гена СТ5К, та с) гена Мд ВЗ у каркасних структурах, молярна частка стронцію в яких дорівнює 2 (512 95-ВС) та 5 (515 55-ВС). у - змінення експресії (у рази) по відношенню до СТ та х бо - кількість днів. В цьому разі може бути спостережено значне зниження експресії генів,

залучених до головних молекулярних шляхів остеокластів протягом часу; що тим самим свідчить про те, що наявність іонів 5г-" у каркасній структурі пригнічує утворення та активність остеокластів; на Фіг. а) дані на 14 добу досліджень знаходилися поза межею визначення.

На Фіг. 10 наведено порівняння розподілення пор у двох каркасних структурах з карбіду кальцію, отриманих після операції карбюризації за попереднім рівнем техніки та операції карбюризації за винаходом та додаткове порівняння з розподіленням пор у початковій піролізованій деревині. Також на Фіг. 10 наведено характерну площину поверхонь двох каркасних структур на основі карбіду кальцію;

На Фіг. 11, 12 та на двох верхніх Ффіг.13 наведено зображення двох каркасних структур на основі карбіду кальцію (одну отримано із застосуванням попереднього рівня техніки, а другу, відповідно, з допомогою процесу за винаходом), отримані з допомогою скануючого електронного мікроскопу (ЗЕМ);

На двох нижніх зображеннях на Фіг. 13 наведено порівняння розмірів гранул карбіду кальцію;

На Фіг. 14 наведено порівняння кристалічної фази двох каркасних структур з карбіду кальцію, виміряних з допомогою дифракційного рентгенівського аналізу, які було отримано, відповідно, із застосуванням процесу за винаходом та процесу за попереднім розвитком техніки.

На Фіг. 15 наведено зображення каркасної структури з оксиду кальцію, отриманої після операції окиснення за винаходом та каркасної структури з оксиду кальцію, отриманої після операції окиснення за попереднім розвитком техніки, отримані з допомогою скануючого електронного мікроскопу (ЗЕМ).

На Фіг. 16 зображено розподілення пор у двох каркасних структур з оксиду кальцію, отриманих, відповідно, після операції окиснення за винаходом та після операції окиснення за попереднім розвитком техніки;

На Фіг.17 та 18 наведено зображення карбонату кальцію, отримані, відповідно, після операції карбонування за винаходом та операції карбонування за попереднім розвитком техніки з допомогою скануючого електронного мікроскопу (ЗЕМ);

Зо На Фіг. 19 зображено розподілення пор у двох каркасних структурах з карбонату кальцію, отриманих, відповідно, після операції карбонування за винаходом та операції карбонування за попереднім розвитком техніки;

На Фіг. 20 наведено порівняння розподілення пор кінцевої біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури (після фосфатування), отриманої із застосуванням процесу за винаходом та кінцевої біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, отриманої із застосуванням процесу за попереднім розвитком техніки;

На Фіг. 21 наведено результат, отриманий після піддавання шматка деревини ротангу, який має довжину, виміряну в поздовжньому напрямку, в якому розмір цієї каркасної структури є максимальним, дорівнює або перевищує 2 см, операціям процесу відповідно за умовами за попереднім розвитком техніки: навіть перед операцією фосфатування може відбутися руйнування каркасної структури;

На Фіг. 22 наведено результат, отриманий після піддавання шматка деревини ротангу, який має довжину, виміряну в поздовжньому напрямку, в якому розмір цієї каркасної структури є максимальним, дорівнює або перевищує 2 см, операціям процесу відповідно за умовами за попереднім розвитком техніки: навіть у разі, якщо ця каркасна структура зможе зберегтися після операцій цього процесу до фосфатування, її буде зруйновано після фосфатування;

На Фіг. 23 наведено відносну кількісну оцінку (27482) експресії генів відносно експресії генів застосованої для калібрування немодифікованої каркасної структури через 14 днів тривимірних досліджень мишачих мезенхімальних стовбурових клітин, культивованих в динамічному режимі зі всіма дослідженими зразками;

На Фіг. 24 зображено втілення біоморфної каркасної структури кубовидної форми.

На Фіг. 25 зображено каналоподібну структуру біоморфного гідроксиапатитного каркасу, отриманого із застосуванням процесу за винаходом, який має унікальні великі проникні канали (100-300 мікрон у діаметрі) (за даними мікрокомп'ютерної томографії). Ці канали є сприятливими до утворення прийнятних кровоносних судин, підтримуючих кісткову регенерацію.

Як застосовано в цьому описі та у доданій Формулі Винаходу, термінами "ієрархічна пориста структура" або "ієрархічно організована пориста структура" позначено матеріал, який має анізотропну тривимірну пористу структуру, в якій каналоподібні пори з'єднано між собою поперечними каналами та в якій навколо каналоподібних пор існують також мікро- та нанопори. бо Як застосовано в цьому описі та у доданій Формулі Винаходу, значення "міцності при (с;

стисканні" було отримано з допомогою наведеного в наступному описі способу із застосуванням прикладення механічних сил вздовж поздовжнього та поперечного напрямків по відношенню до каналоподібних пор.

Як застосовано в цьому описі та у доданій Формулі Винаходу, термін "кістковий дефект" стосується відсутньої частини або фрагмента кістки або цілої кістки, яка потребує загального заміщення із застосуванням каркасної структури за винаходом.

Як застосовано в цьому описі, "біоморфний гідроксиапатит" стосується матеріалу, який: 1) складається з гідроксиапатиту або 2) містить гідроксиапатит або 3) є матеріалом, який містить або який складається з гідроксиапатиту та ортофосфату кальцію. У випадку, коли матеріал складається з гідроксиапатиту та ортофосфату кальцію, він є двофазним матеріалом. У втіленні винаходу, коли "біоморфний гідроксиапатит" є матеріалом, який містить або який складається з гідроксиапатиту та ортофосфату кальцію, цей гідроксиапатит є активовано одним або більше іонами, вибраними з групи, яка складається з магнію, стронцію, кремнію, титану, карбонату, калію, натрію, срібла, галію, міді, заліза, цинку, марганцю, європію, гадолінію та їх сумішей.

Автори цієї патентної заявки несподівано знайшли можливість отримання з деревини біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, яка виявила наявність біоміметичного хімічного складу, адекватних механічних характеристик та морфології, а також була сприятливою для клітинної колонізації та судинного росту та одночасно мала прийнятний для клінічних застосувань розмір.

У першому аспекті цей винахід стосується біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, отриманої з деревини, загальна пористість якої складає принаймні 20 95, переважно принаймні 40 95, більш переважно 60-95 95, причому цю пористість є виміряно після піролізу цієї деревини, причому ця каркасна структура має довжину, виміряну в поздовжньому напрямку, в якому розмір цієї каркасної структури є максимальним, перевищує або дорівнює 2 см.

Загальна пористість отриманої з допомогою процесу за винаходом біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури є такою ж саме, як і загальна пористість початкової деревини, виміряної після її піролізу. Зокрема, загальна пористість біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, отриманої після застосування процесу за винаходом складає принаймні 20 95, переважно принаймні 40 95, більш переважно 60-95 95.

Зо Переважно ця каркасна структура має довжину, виміряну в поздовжньому напрямку, в якому її розмір є максимальним, перевищує або дорівнює 2 см та досягає кінцевого значення, визначеного відповідно для клінічного застосування. Наприклад, у випадку регенерації довгих кісток, як-то наприклад, кісток стегна, плечових кісток, великих та малих гомілкових кісток та променевих кісток, довжина цього каркасу, виміряна в поздовжньому напрямку, в якому розмір цієї каркасної структури є максимальним, може складати 2-20 см.

Каркасна структура за винаходом переважно має виміряну у поздовжньому напрямку міцність при стисканні, яка перевищує 5 МПа та переважно складає 10-20 МПа.

Переважно каркасна структура за винаходом має виміряну вздовж поперечного напрямку міцність при стисканні, яка може досягати 10 МПа.

Переважно зазначений біоморфний гідроксиапатитний каркас відрізняється наявністю ієрархічно організованої пористої структури. "Ієрархічна пориста структура" або "ієрархічно організована пориста структура" гідроксиапатитного каркасу за винаходом походить від складної тривимірної ієрархічної структури початкової деревини, з якої було отримано цю каркасну структуру, отже вона має ряд пор різного розміру. Різнорозмірні пори цієї ієрархічної структури роблять її бажаною для застосування, як замінника кістки.

Наприклад, пори діаметром 2 200 мкм, переважно 150-300 мкм, більш переважно 200-300 мкм будуть дозволяти відбуватися клітинній колонізації та проліферації та утворенню відповідного дерева васкуляризації. Пори діаметром х 10 мкм, переважно « 1 мкм, більш переважно 0,01 - 0,1 мкм (мікро- та нанопори), які є частково з'єднаними з каналоподібними порами роблять можливим обмін поживними рідинами та усування відходів клітинного метаболізму.

Зберігання ієрархічної пористої структури деревини у гідроксиапатиті призводить до отримання каркасних структур з оптимальними механічними характеристиками та здатних ефективно витримувати механічні навантаження.

Отриманий з деревини гідроксиапатит можна вважати біоморфним матеріалом, оскільки він детально відтворює структуру природного матеріалу.

Зокрема, ієрархічно організована пориста структура каркасного матеріалу за винаходом містить 30-80 95 (від загальної кількості пор) пор діаметром менш, ніж 150 мкм та позосталі пори бо мають діаметр, який перевищує 150 мкм.

У одному втіленні, переважно у разі застосування ротангу, як джерела деревини, 30-60 95 від загальної кількості пор цієї каркасної структури є порами діаметром :х 10 мкм.

У одному втіленні, переважно у разі застосування ротангу, як джерела деревини, принаймні 25 90 від загальної кількості пор цієї каркасної структури та переважно 25-50 9о від загальної кількості пор гідроксиапатитної каркасної структури є порами діаметром «1 мкм, переважно - 0,1 мкм, зокрема 0,01 - 0,1 мкм.

У одному втіленні, переважно у разі застосування ротангу, як джерела деревини, принаймні 20 95 від загальної кількості пор гідроксиапатитної каркасної структури є порами діаметром 2 150 мкм.

Переважно ця гідроксиапатитна каркасна структура має питому площу поверхні (55А) » 9 мг/г, переважно 9-20 ме/г.

Деревиною для отримання цієї гідроксиапатитної каркасної структури може бути будь-яка деревина, яка має загальну пористість, яка складає принаймні 20 956, переважно принаймні 40 95, переважно 60-95 95, більш переважно 65-85 95 (виміряну після піролізу цієї деревини).

Приклади прийнятної деревини, застосованої для отримання гідроксиапатиту включають деревину ротангу, сосни, абачі, бальсового дерева, сипо, дуба, рожевого дерева, кемпасу та волоського горіха та переважно застосованою деревиною є деревина ротангу.

Отримана з деревини гідроксиапатитна каркасна структура може містити гідроксиапатит, який є частково заміщеним одним або кількома іонами. Прикладами таких іонів є іони карбонату, магнію, стронцію, силіцію, титану, натрію, калію, срібла, галію, міді, заліза, цинку, марганцю, європію та гадолінію. Введення карбонату у фосфатну ділянку збільшує біорозчинність та підсилює поверхневу афінність до остеобластних клітин.

Введення магнію забезпечує підвищену здатність до нових репозицій та утворення кісток.

Введення стронцію сприяє відновленню утворення кісткової тканини, яку було уражено метаболічними захворюваннями, як-то остеопорозом, тобто його наявність може посилити регенерацію кісток. Введення срібла, галію, міді та цинку надає антибактеріальних властивостей.

Якщо отримана з деревини гідроксиапатитна каркасна структура містить гідроксиапатит,

Зо який є частково заміщеним одним або кількома іонами, то ця каркасна структура є матеріалом, який містить або який складається з активованого гідроксиапатиту та ортофосфату кальцію.

Відповідно за подальшим втіленням, біоморфна гідроксиапатитна каркасна структура за винаходом може містити: - магній, масова частка якого складає 0-15 95, переважно 1-10 95; та/або - карбонат, масова частка якого складає 0-15 95, переважно 1-10 95; та/або - стронцій, масова частка якого складає 0-15 95, переважно 1-10 95; та/або - титан, масова частка якого складає 0-20 95, переважно 1-10 95; та/або - калій, масова частка якого складає 0-15 95, переважно 1-10 95; та/або - натрій, масова частка якого складає 0-15 95, переважно 1-10 95; та/або -силіцій, масова частка якого складає 0-15 95, переважно 1-10 95; та/або; - срібло, масова частка якого складає 0-15 95, переважно 1-10 95 та/або; - галій, масова частка якого складає 0-15 95, переважно 1-10 95 та/або; - мідь, масова частка якої складає 0-15 95, переважно 1-10 95 та/або; - залізо, масова частка якого складає 0-30 95, переважно 1-10 95; та/або - цинк, масова частка якого складає 0-15 95, переважно 1-10 95 та/або; - марганець, масова частка якого складає 0-15 95, переважно 1-10 95 та/або; - європій, масова частка якого складає 0-15 95, переважно 1-10 95 та/або; - гадоліній, масова частка якого складає 0-15 95, переважно 1-10 95.

Отримана з деревини біоморфна гідроксиапатитна каркасна структура за винаходом має

БО відповідні характеристики біоактивності та біологічної здатності до резорбції, поєднані з належними характеристиками механічної міцності та розміру, які роблять її особливо прийнятною для клінічного застосування, як замінника кістки, зокрема у тварин та людини.

Такий замінник кістки може бути застосовано для заміщення та/або реконструкції та/або регенерації кісток, частин кісток або кісткових дефектів. Наприклад, цей замінник кістки може бути застосовано для заміщення або регенерації кісток або частин кісток, підданих механічним навантаженням, як-то для заміщення або регенерації довгих кісток рук та ніг. Ці довгі кістки можуть включати, наприклад, кістки стегна, плечові кістки, великі та малі гомілкові кістки, променеві кістки тощо.

Цей замінник кістки також може бути застосовано для заміщення та / або реконструкції бо частин черепних кісток, частин кісток щелепно-лицьового відділу та кісток хребців, наприклад,

тіла хребця, міжхребцевого диску та в хірургічних процедурах з хребцем.

У разі застосування біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, як замінника кістки вона може мати форму, яка пристосовується до форми кістки з дефектом, який потребує реконструкції таким чином, щоб суттєво заповнити кістковий пролом. Тому ця каркасна структура та замінник кістки за винаходом може мати будь-яку форму, яка є прийнятною для реконструкції та відновлення кісткових дефектів або для заміщення будь-якої втраченої частини кістки.

Наприклад, каркасна структура або замінник кістки за винаходом може бути кубовидною або клиновидною або приймати форму циліндру чи прямокутної призми. У одному втіленні ця каркасна структура або замінник кістки містить центральний канал, діаметр якого складає приблизно 20 95 - 60 95 від діаметру цього каркасу або замінника кістки. Зокрема ця каркасна структура або замінник кістки має трубчасту форму.

У одному втіленні винахід також стосується каркасної структури або замінника кістки, який має форму циліндру, прямокутної призми, є кубовидним або трубчастим та досягає заввишки 2 см або більше.

У втіленні за винаходом цю каркасну структуру або замінник кістки також може бути покрито тонким шаром на основі гідроксиапатиту та/або колагену для збільшення клітинного зчеплення та проліферації, забезпечуючи тим самим остеоінтеграцію у оточуючій кістковій тканині. Цей шар може додатково містити гідроксиапатит, заміщений одним або кількома іонами, важливими для стимулювання регенерації кістки, як-то карбонат-іонами, іонами магнію, силіцію, калію, натрію та стронцію або іонами, які мають антибактеріальну дію, як-то іонами галію, срібла, міді або цинку.

У додатковому втіленні за винаходом каркасну структуру або замінник кістки може бути просочено природним полімером (вибраним з групи, яка містить желатин, колаген, альгінат, хітозан, геллан, целюлозу) для додаткового покращення механічних властивостей та додаткового сприяння клітинному зчепленню.

Для сприяння клітинному зчепленню до цієї каркасної структури або замінника кістки також може бути додано збагачену тромбоцитами плазму крові, антитіла, білкові фактори росту, фрагменти ДНК, мікроРНК та синтетичну РНК.

Зо Також до цієї каркасної структури або замінника кістки може бути додано лікарські засоби, як-то антибіотики або протиракові ліки.

Також винахід стосується способу реконструкції та/або регенерації кістки тварин або людини, яка має кістковий дефект та полягає у застосуванні наступних операцій: - надання замінника кістки, який містить або складається з біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури за винаходом, яка має форму, яка відповідає формі кісткового дефекту; - імплантація цього замінника кістки у кістковий дефект пацієнта.

Переважно цей спосіб реконструкції та/або регенерації полягає у застосуванні операцій отримання тривимірної моделі кісткового дефекту та у наданні каркасній структурі певній формі, яка буде відповідати формі кісткового дефекту та яку отримують на основі цієї тривимірної моделі. Цю операцію надання форми каркасній структурі може бути застосовано до початкового шматка деревини або до отриманого наприкінці процесу перетворення за винаходом гідроксиапатитного каркасу або до каркасної структури, отриманої після кожного етапу цього процесу (наприклад, після операції карбонування). Переважно цю операцію надання форми застосовують до початкового шматка деревини.

Отримання біоморфного гідроксиапатитного каркасу за винаходом та біоморфного гідроксиапатитного каркасу, частково заміщеного одним або кількома іонами здійснюють в результаті багатоетапного процесу перетворення, який полягає у застосуванні кількох наступних операцій: 1) Піроліз: природну деревину нагрівають з температурою 600-1000"С в інертному середовищі, що дозволяє здійснити розкладання та усунення з процесу всіх органічних сполук та отримати карбонову матрицю. 2) Карбюризація: крізь отриману карбонову матрицю пропускають пару, насичену кальцієм з температурою 900-1200 С під тиском у « 1000 мілібар, переважно « 600 мілібар, більш переважно 0,05-100 мілібар, тим самим перетворюючи цю карбонову матрицю на карбід кальцію (Сас). 3) Окиснення: отриману матрицю з карбіду кальцію нагрівають у повітрі з температурою 750- 1300 "С, переважно 1000-1200 "С, що тим самим дозволяє перетворити карбід кальцію на оксид кальцію (Сад). 4) Гідратація: отриману матрицю з оксиду кальцію піддають дії води, тим самим 60 забезпечуючи поглинання 1-25 молярних відсотків води, переважно з масовою часткою, яка складає 5-15 95. 5) Карбонування: отриману матрицю з оксиду кальцію перетворюють на матрицю з карбонату кальцію шляхом нагрівання з температурою 500-900 "С, переважно з температурою 750-850 "С під тиском із застосуванням СО»г або під тиском із застосуванням суміші СО» та інертного газу (наприклад, аргону, азоту) в межах 4-20 МПа. 6) Фосфатування: отриману матрицю з карбонату кальцію обробляють принаймні однією фосфатною сіллю.

Природну деревину, застосовану під час операції піролізу 1), яка є складовою вищезазначеного багатоетапного процесу переважно вибрано з деревини ротангу, сосни, абачі, бальсового дерева, сипо, дуба, рожевого дерева, кемпасу та волоського горіха та переважно цією природною деревиною є деревина ротангу.

Ця природна деревина має загальну пористість, яка складає принаймні 20 956, переважно принаймні 40 95, більш переважно 60-95 95 та яку є виміряно після піролізу цієї деревини.

Перед операцією піролізу 1) початкову природну деревину може бути вибірково піддано сушінню з температурою 50-90 "С, переважно з температурою 60-80 "С, більш переважно з температурою 65-75 "С. Цю природну деревину може бути піддано сушінню протягом більш, ніж б год., переважно протягом більш, ніж 12 год., переважно протягом більш, ніж 18 год., переважно протягом часу в межах 20-30 год.

Під час операції піролізу цього багатоетапного процесу, застосованою атмосферою інертного газу може бути атмосфера газу, вибраного з групи, яка містить азот та аргон.

Під час операції піролізу цього багатоетапного процесу, природну деревину може бути нагріто з температурою 600-1000 "С, переважно з температурою 800-1000 "С. Операція піролізу може тривати більш, ніж 6 год., переважно більш, ніж 12 год., переважно більш, ніж 18 год. та переважно вона може тривати протягом часу в межах 20-30 год.

Для запобігання утворення тріщин та внутрішнього руйнування матеріалу, тепловий цикл операції піролізу 1) може бути здійснено шляхом нагрівання природної деревини зі швидкістю не більш, ніж 5 "С/хв, переважно не більш, ніж З "С/хв та її охолодження зі швидкістю не більш

З "С/хв, переважно не більш, ніж, 2 "С/хв.

Перед початком операції піролізу 1) зазначений багатоетапний процес може додатково

Зо полягати у здійсненні операції ї) відбору та отримання природної деревини, під час якої може бути вирізано шматок цієї природної деревини з формою, відповідною формі призначеного для відновлення кісткового дефекту. Зокрема природній деревині надають форму шматка деревини, який має довжину, виміряну в поздовжньому напрямку, в якому довжина цієї деревини є максимальною, яка перевищує або дорівнює 2 см. Переважно, розмір цієї деревини досягає кінцевого значення, яке визначають відповідно до клінічної заявки.

Наприклад, природній деревині можна надати форму циліндра, прямої призми або кубоподібну форму. Також цієї природній деревині можна надати мати таку форму, щоб вона містила центральний канал діаметром приблизно 2095 - 6095 від діаметру шматка цієї деревини та зокрема її можна розрізати з отриманням трубчастої форми.

Переважно, операція ії) відбору та виготовлення цієї природної деревини полягає у застосуванні операцій: отримання тривимірної моделі кісткового дефекту та у наданні на основі цієї отриманої моделі цій природній деревині тієї форми, яка відповідає формі кісткового дефекту. Цю операцію надання форми може бути застосовано до початкової природної деревини або до гідроксиапатитного каркасу, отриманого наприкінці багатоетапного процесу перетворення. Переважно операцію по наданню відповідної форми застосовують до початкової природної деревини з метою уникнення внутрішніх та зовнішніх пошкоджень (переломів) цієї каркасної структури.

Під час операції карбюризації 2) зазначеного багатоетапного процесу, реакцію переважно здійснюють з молярним відношенням Са/С (на початку реакції) в межах 1,10-2,50, переважно в межах 1,50 - 2,00. Величина молярного відношення Са/С є важливою, оскільки його значення, які будуть меншими, ніж зазначені межі призведуть до виникнення не повністю закінчених реакції, а значення, які будуть перевищувати ці межі призведуть до закупорювання пор кальцієвими залишками.

Під час операції карбюризації зазначеного багатоетапного процесу, карбонову матрицю нагрівають зі швидкістю нагрівання, яка складає 1-10 "С/хв, переважно зі швидкістю нагрівання, яка складає 1-7 "С/хв.

Автори цієї патентної заявки несподівано виявили, що здійснення операції карбюризації зі зменшеним тиском, як описано вище, сприяє успішному застосуванню наступних операцій процесу, особливо у разі необхідності отримання великої біоморфної каркасної структури. 60 Фактично із застосуванням вищеописаних умов тиску, випарювання кальцію може відбуватися при температурах, які є приблизно на 400-500 "С нижчими за точку кипіння кальцію в кімнатних умовах (тобто 1484 "С), що тим самим неочікувано призводить до повного перетворення піролізованої деревини на карбід кальцію при температурах, які є набагато нижчими за температури будь-якого іншого відомого в цій галузі подібного процесу. Зокрема застосування тиску в межах 0,5-600 мілібар, або переважно 0,05-100 мілібар призводить до суттєво закінченого перетворення піролізованої деревини на карбід кальцію.

Це суттєво закінчене перетворення піролізованої деревини на карбід кальцію буде призводити до сприяння продуктивності наступних операцій перетворення.

Умови карбюризації за винаходом також покращують забезпечення схоронності мікро- та нанопор діаметром х1 мкм (переважно 0,01 - 0,1 мкм) природної деревини, як у каркасній структурі після карбюризації, так і у кінцевому біоморфному каркасі з відносно відомою каркасною структурою, отриманою з деревини із застосуванням відомих процесів.

Фаза карбюризації в цьому процесі є критичною операцією, оскільки належне зберігання мікро- та нанопор після цієї операції буде запорукою того, що кінцева біоморфна каркасна структура також буде виявляти подібну нано/мікропористість. Наявність великого відсотку добре з'єднаних між собою мікро- та нанопор у кінцевій біоморфній каркасній структурі дозволяє відбуватися обміну поживних рідких речовин та усуванню відпрацьованих продуктів клітинного метаболізму.

Окрім покращення зберігання мікро- та нанопор діаметром «1 мкм, застосування описаних тут умов карбюризації призводить до отримання після цього процесу відповідної каркасної структури (а також кінцевого біоморфного каркасу) з питомою площиною поверхні (554А), яка складає 9-20 мг/г. Ця питома площа поверхні є приблизно вдвічі вищою, ніж 55А каркасної структури, отриманої з допомогою відомого у цій галузі процесу, яка складає приблизно 5-6 мг/г (див. порівняльний приклад 4 та Фіг. 10-13).

Застосування умов карбюризації за винаходом також призводить до отримання пористої каркасної структури з карбіду кальцію, яка містить гранули карбіду кальцію, розмір яких є меншим за розмір гранул каркасної структури, отриманої із застосуванням відомого процесу (див. порівняльний приклад 4 та нижні зображення на Фіг. 13).

У порівняльних прикладах показано, що розмір гранул карбіду кальцію у каркасній структурі,

Зо отриманій після процесу карбюризації за винаходом приблизно складає 5-15 мкм (переважно приблизно 10 мкм), тоді як розмір кристалів каркасної структури, отриманої із застосуванням відомих процесів складає приблизно 100 мкм.

Автори цієї патентної заявки несподівано виявили, що такі отримані з допомогою вищеописаних умов карбюризації характеристики, як збільшена питома площина поверхні (З5А) та зменшений розмір гранул, яких неможливо отримати із застосуванням попередньо наведених способів, є важливими для забезпечення високого виходу перетворення природної деревини після кожної операції цього процесу.

У порівняльному прикладі 4 та на Фіг. 14 також показано, що каркасна структура, яку було отримано після процесу карбюризації за винаходом містить карбід кальцію зі змішаною тетрагональною та кубічною кристалічною граткою, тоді як каркасна структура, яку було отримано із застосуванням відомих процесів містить карбід кальцію лише з тетрагональною кристалічною граткою. Оскільки оксид кальцію має лише кубічну кристалічну структуру, то перетворення карбіду кальцію, який частково знаходиться у кубічній формі на оксид кальцію може відбуватися зі зменшеним ризиком виникнення мікротріщин у каркасній структурі, що є надзвичайно корисним для якості кінцевого біоморфного каркасу.

Отже, застосовані в процесі карбюризації умови сильно зменшують кількість дефектів, які може бути спостережено у ієрархічній пористій структурі карбіду кальцію.

Додатково слід зазначити, що застосовані в цьому винаході низькі температури (тобто температури, які є набагато нижчими за 1500 "С) запобігають злиттю гранул між собою та надлишковому ущільненню карбіду кальцію, тобто тим процесам, які викликають структурні деформації та відхилення від оригінальної мікроструктури початкової деревини, погіршуючи тим самим результат наступних операцій цього процесу.

У операції окиснення 3) зазначеного багатоетапного процесу, матрицю з карбіду кальцію може бути нагріто до кінцевої температури у 800-1300 "С, переважно до кінцевої температури, яка складає 1000-1200 "С.

Матрицю з карбіду кальцію під час цієї операції окиснення може бути нагріто зі швидкістю нагрівання в межах 1-15 "С/хв, переважно зі швидкістю нагрівання в межах 1-7 "С/хв.

Окиснення карбіду кальцію, отриманого під тиском відповідно із застосуванням вищезазначеної операції карбюризації призводить до отримання каркасної структури з оксиду бо кальцію зі збільшеною питомою площиною поверхні (ЗА) та до її пористості зі збільшеною фракцією мікро- та нанопор відносно каркасних структур, які можна отримати з допомогою відомих процесів (див. порівняльний приклад 4 та Фіг. 16). Цей порівняльний експеримент довів, що мікро та нано-пористість зберігається також і після операції окиснення.

У операції гідратації 4) зазначеного багатоетапного процесу матрицю з оксиду кальцію піддають дії води. Молярна відсоткова частка поглиненої внаслідок цього процесу води переважно складає 1-25 95, більш переважно складає 5-15 95. Ця операція призводить до утворення гідратованого оксиду кальцію, який містить гідроксид кальцію, масова частка якого складає « 50 95 відносно маси тривимірної структури, що каталізує наступне карбонування Сабо.

Кількість гідроксиду кальцію (Са(ОН)»), як похідного продукту необхідно чітко контролювати для уникнення колапсу тривимірної структури. Описані тут умови гідратації дозволяють зберігати гідроксид кальцію, масова частка якого буде складати х 50 95.

У переважному втіленні, операцію гідратації здійснюють одночасно з операцією карбонування, наприклад, із застосуванням збагаченого водою СО»

Застосування високої температури під час операції карбонування 5) зазначеного багатоетапного процесу разом з одночасним поступовим зростанням тиску СОг у системі до досягнення зазначених вище значень, неочікувано сприяє по суті повному перетворенню гідратованого оксиду кальцію на каркасну структуру з карбонату кальцію, яка має неочікувано високу згуртованість та механічну міцність.

Операцію карбонування зазначеного багатоетапного процесу може бути здійснено відповідно за одним з наступних теплових циклів: - в умовах сталого тиску СО приблизно у 10-15 МПа, повільно збільшуючи температуру до приблизно 750-850 "С, переважно приблизно 800 "С; - в умовах сталої температури приблизно у 750-850 С (або приблизно 700-800 С), переважно приблизно 800 "С, збільшуючи тиск до позначки приблизно у 10-15 МПа; - зберігання тиску на позначці приблизно 4-6 МПа з одночасним зростанням температури до приблизно 750-850 С (або приблизно 700-800 С), переважно до приблизно 800 "С та з наступним збільшенням тиску до приблизно 10-15 МПа.

Процес карбонування відбувається шляхом утворення хімічно активних похідних, як-то гідроксиду кальцію, що призводить до отримання кінцевого карбонату кальцію, який

Зо відрізняється наявністю тонкозернистої структури, суттєво позбавленої будь-яких великих кубічних кристалів карбонату кальцію (210 мкм), які могли б порушити структурну цілісність цієї тривимірної структури. У порівняльному прикладі 4 та на Фіг. 17-18 видно, що завдяки застосуванню операції гідратації, після операції карбонування було отримано структуру, яка у порівнянні з отриманою з допомогою відомих в цій галузі процесів похідною тривимірною структурою була тонкозернистою.

Здійснена у вищезазначених умовах операція карбонування призводить до появи біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, отриманої із застосуванням процесу за винаходом, яка у порівнянні з відомими в цій галузі подібними процесами, в яких операцію карбонування здійснюють з високою температурою та низьким тиском або з високим тиском та низькою температурою, має відмінні механічні властивості.

Автори цієї патентної заявки неочікувано виявили, що досягнення вищезазначених властивостей карбонату кальцію є дуже важливим станом для досягнення повного перетворення великих частин матеріалу (тобто » 2 см) на кінцеву біоморфну каркасну структуру, яка має бажаний склад та зберігає природну мікроструктуру деревини.

У операції фосфатування б) зазначеного багатоетапного процесу, принаймні одну фосфатну сіль може бути вибрано з групи, яка складається з фосфату амонію, фосфату натрію та фосфату калію. Застосування фосфату амонію сприяє кращому контролю рнН, отже процес перетворення стає більш ефективним та отриманий об'єкт має сприятливі механічні властивостей та фізичне зчеплення.

Під час операції фосфатування зазначеного багатоетапного процесу матрицю з карбонату кальцію може бути занурено у розчин, який містить принаймні одну з зазначених фосфатних солей. Цей розчин може мати концентрацію у 0,1-5М, переважно 0,5 - 2,0М.

Під час операції фосфатування зазначеного багатоетапного процесу початкове відношення

РОУСО:» переважно перевищує теоретичне стехіометричне значення у 1,5-5 разів та переважно ця величина перевищує теоретичне стехіометричне значення у 2 - 4 рази.

Під час операції фосфатування зазначеного багатоетапного процесу занурену у багатий на фосфати розчин матрицю з карбонату кальцію може бути нагріто до 25-300 "С під тиском пари, який складає 0,1-2,5 МПа (гідротермічні умови).

Операція фосфатування може тривати приблизно 12-180 год., переважно приблизно 48-120 60 год., більш переважно 24-72 год.

Початкове значення рН застосованого у операції фосфатування зазначеного багатоетапного способу багатого на фосфати розчину переважно складає 7-12.

Заміщення гідроксиапатиту іншими іонами може бути досягнуто шляхом введення прийнятних розчинних солей, які містять інтересуючі іони під час або після закінчення застосованого процесу та переважно протягом процесу фосфатування. Прийнятні іони можуть включати іони стронцію, магнію, силіцію, титану, карбонати, іони натрію, калію, галію, срібла, міді, заліза, цинку, марганцю, європію, гадолінію та їх суміші. Прикладом розчину, який містить іони магнію є МоСІ2 бНгО, прикладом розчину, який містить іони стронцію є 5гСІ2 бНго.

В результаті іонної модифікації кінцевий біоморфний каркас містить або складається з матеріалу, який містить або складається з модифікованого гідроксиапатиту та ортофосфату кальцію.

Відповідно за менш переважним втіленням, в якому природній деревині не надано форми та розміру, прийнятного для застосування, як кісткового замінника (тобто у разі, якщо не здійснюють операцію і) отриманий в результаті зазначеного багатоетапного процесу біоморфний гідроксиапатитний каркас може бути зручно перетворено на каркасну структуру належної форми та вигляду з допомогою відомих способів.

Також винахід стосується біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, отриманої (або яку можна отримати) з допомогою вищеописаного процесу, яка має покращені фізичні та механічні властивості у порівнянні з отриманими з допомогою подібних відомих в цій галузі процесів гідроксиапатитами з ієрархічною структурою.

Зокрема, біоморфному гідроксиапатитному каркасу, отриманому (або який можна отримати) із застосуванням процесу за винаходом притаманні всі вищезазначені функції каркасної структури або замінника кістки за винаходом.

Зокрема, по відношенню до попереднього розвитку техніки, отримана із застосуванням вищеописаного процесу кінцева біоморфна каркасна структура має пористість, яка містить набагато більший відсоток мікро- та нанопор, ніж каркасна структура, отримана із застосуванням подібних відомих в цій галузі процесів. Зокрема принаймні 25 95 від загальної кількості пор та переважно 25-50 90 від загальної кількості пор гідроксиапатитної каркасної структури за винаходом є порами діаметром х 1 мкм, переважно х 0,1 мкм, зокрема 0,01-0,1

Зо МКМ.

Цей високий відсоток мікро- та нанопор є надзвичайно корисним з клінічної точки зору, оскільки наявність мікро- та нанопор дозволяє посилити обмін поживних рідких речовин та усування відпрацьованих продуктів клітинного метаболізму, тим самим покращуючи кісткову регенерацію.

Крім того, біоморфна каркасна структура за винаходом має збільшену питому площину поверхні (9-20 мг/г), ніж питома площина поверхні каркасної структури, отриманої із застосуванням подібних відомих в цій галузі процесів (5-6 ме/г) Збільшена площина поверхні обумовлює її підвищену біоактивність та посилену змочуваність каркасу або замінника кістки, що тим самим покращує процес остеоінтеграції та біорезорбції.

Також біоморфна каркасна структура за винаходом містить гідроксиапатитні гранули розміром приблизно 100-200 нм (тобто наногранули), які є значно меншими за подібних гранул, присутніх у спеченому гідроксиапатиті (розмір яких звичайно складає » 1 мкм). Малі гранули мають клінічні переваги для кісткової регенерації, оскільки клітини їх можуть легше поглинати, що тим самим дозволяє здійснити кращу кісткову регенерацію, ніж кісткова регенерація із застосуванням відомих в цій галузі каркасних структур.

Додатково слід зазначити, що біоморфна каркасна структура за винаходом виявляє міцність при стисканні, яка перевищує 5 МПа та переважно складає 10-20 МПа, яку було виміряно в напрямку вздовж каналоподібних пор (у поздовжному напрямку). Міцність при стисканні цієї структури, яку було виміряно в напрямку вздовж поперечних каналів (у поперечному напрямку) сягала до 10 МПа. Винахідники неочікувано виявили, що ці механічні властивості роблять кінцеву гідроксиапатитну каркасну структуру матеріалом, який не потребує додаткових допоміжних засобів та тому його можна застосовувати в процедурах відновлення несучих частин кістки без вживання армувальних конструкцій або інших конструкцій, які надають стійкості, як-то додаткових каркасів або граток.

В природі нанокристалічний та іонозаміщений гідроксиапатит є головним компонентом, присутнім у твердих тканинах організму; фактично, мінеральна фаза кісткової тканини є наноструктурною фазою, яка складається з дрібно розсіяних гідроксиапатитних пластинчастих кристалів розміром менш, ніж 100 нм, утворюючих тривимірну ієрархічно організовану пористу структуру, якою є сукупна кісткова тканина. бо В цьому відношенні автори цієї патентної заявки неочікувано виявили, що у порівнянні з попереднім рівнем техніки, біоморфне перетворення отриманої з допомогою вищезазначеного процесу природної деревинної структури може однозначно призвести до виникнення гідроксиапатитних кісткових каркасних структур, які одночасно відрізняються також наявністю такого складу, який імітує склад кісткової тканини. Ці каркасні структури є дуже відкритими та з'єднаними між собою макро/мікро/нанопорами, а також мають відмінну механічну міцність, пов'язану з розміром, прийнятним для застосування у ділянках, які несуть навантаження, особливо у довгих сегментальних кістках кінцівок або у великих ділянках кісток щелепно- лицьового відділу або хребця.

Всі ці особливості, одночасну дію яких ніколи рані не спостерігали, мають найважливіше значення для забезпечення масштабної регенерації кісток у несучих ділянках. Відмінності у біоморфній гідроксиапатитній каркасній структурі, які можна отримати з допомогою процесу за винаходом надають важливих клінічних переваг, що можна побачити у порівняльному прикладі 6. Зокрема, у порівнянні з каркасними структурами за попереднім розвитком техніки, каркасні структури за винаходом мають більш високий індуктивний вплив на експресію генів, пов'язаних з остеогенним розвитком, що перетворюється на кращу клінічну ефективність стосовно кісткової регенерації.

Додатковою ілюстрацією цього винаходу є наведені нижче необмежуючі приклади.

Приклади

Способи вимірювання

Загальна пористість деревини, підданої операції піролізу (піролізованої деревини): Для цих досліджень спочатку було зважено шматок піролізованої деревини, який мав форму призми або циліндру та потім шляхом вимірювання його висоти та діаметру було отримано величину його об'єму. Величину абсолютної густини (А.0.) цієї піролізованої деревини було отримано, як відношення її маси/об'єму; значення відносної густини (К.О0.) було отримано шляхом поділу абсолютної густини цієї піролізованої деревини на величину теоретичної густини карбону (тобто

К.0О.-А.0./2,25). Відсоткове значення загальної пористості (95) було отримано за формулою (1- в8.0Бб)"100.

Загальна пористість каркасної структури, отримана після кожної операції цього процесу та біоморфна гідроксиапатитна каркасна структура, отримана наприкінці цього процесу:

Зо Цю пористість було обчислено з допомогою того ж саме способу, як зазначено вище із застосуванням відповідних значень для теоретичної густини кожного матеріалу, отриманого після кожної операції (тобто теоретичної густини Сас», Сас, СасСоз, НА).

Міцність при стисканні: кінцеву каркасну структуру або замінник кістки, якому було надано форму призми або циліндру піддали навантаженням із застосуванням універсальної розривної випробувальної машини гвинтового типу для отримання кривих залежності деформації від навантаження та розривного навантаження. Міцність при стисканні було визначено, як відношення між розривним навантаженням та площиною, підданою стисканню.

Діаметр пор: оцінку розподілення пор за розміром та морфології пор кінцевої каркасної структури або структури, отриманої після кожної операції цього процесу було здійснено відповідно з допомогою способу вимірювання пористості шляхом введення ртуті та із застосуванням скануючої електронної мікроскопії (ЗЕМ). Порометричний аналіз шляхом введення ртуті було здійснено на основі вимірювання введення ртуті у пори зразка під різним тиском.

Кристалічні фази: визначення та кількісна оцінка: визначення та кількісну оцінку кристалічних фаз каркасних структур було здійснено із застосуванням порошкового рентгеноструктурного аналізу (ХКО) з оцінкою розповсюдження рентгенівського випромінювання у зразку у разі сканування під різними кутами та з безперервним режимом сканування.

Питома площина поверхні: аналіз загальної площини поверхні матеріалів на одиницю загального об'єму (мг/г) було здійснено із застосуванням способу БЕТ з оцінкою відношення кількості поглиненого газу до його тиску.

Приклад 1

Виготовлення отриманого з деревини гідроксиапатиту із застосуванням багатоетапного процесу: ї) У дослідженнях було застосовано шматок природної деревини ротангу, якому було надано циліндричної форми наступного розміру: діаметр - 2 см; висота - З см; 1) Піроліз природної деревини:

На початку шматок деревини було піддано сушінню протягом доби при температурі 70 "С, після чого його було піддано більш, ніж 30-хвилинній температурній обробці при 800 "С у потоці 60 азоту, тим самим перетворюючи деревину на матрицю з чистого карбону. Тепловий цикл:

нагрівання до 350 "С зі швидкістю 1 "С/хв та нагрівання з 350 "С до 800 "С зі швидкістю 2 "С/хв.

Зразок зберігали при температурі 800 "С протягом приблизно принаймні 30 хв. та потім матрицю піддали охолодженню зі швидкістю 1 "С/хв. 2) Карбюризація.

Карбонову матрицю піддали нагріванню при температурі 1000 "С в атмосфері аргону та кальцію з тиском 0,5мілібар, тим самим перетворюючи її на карбід кальцію. Час здійснення операції при 1000 7"С-30 хв. 3) Окиснення

Матрицю з карбіду кальцію нагріли у повітрі до 1100 С із застосуванням швидкості нагрівання в межах 1-7 "С/хв, тим самим забезпечуючи її повне перетворення на оксид кальцію. 4) Гідратація

Заготовку з оксиду кальцію активували під впливом води, дозволяючи тим самим Її поглинання з молярною відсотковою часткою приблизно у 10 95. 5) Карбонування

Пре-кондиціоновану гідратовану заготовку піддали нагріванню до 800"С в умовах поступового збільшення тиску СОг від 0,5 до 10 МПа, перетворюючи тим самим заготовку з оксиду кальцію на заготовку з карбонату кальцію. 6) Фосфатування

Заготовку з карбонату кальцію занурили у 0,5 М розчин фосфату амонію з початковим відношенням РО» до СОз, яке в два рази перевищувало теоретичну стехіометричну величину з температурою 200 "С та тиском водяної пари у 2 МПа.

Оцінку міцності при стисканні цієї каркасної структури було здійснено шляхом прикладення механічних сил вздовж перпендикулярного та поперечного напрямку відносно орієнтації каналоподібних пор.

У разі здійснення навантаження в напрямку вздовж пор (що є найбільш клінічно- рефлексивною конфігурацією для імітації біомеханічного впливу іп мімо у випадку довгих сегментальних кісток), каркасна структура (створена у вигляді порожнистого циліндру зовнішнім діаметром у 15 мм, внутрішнім діаметром у 6 мм та висотою 20 мм, вміст пор в якій сягає 60- 65 95 за об'ємом) виявила міцність при стисканні, яка сягала до 16 МПа (тобто із застосуванням

Зо максимально дозволеного навантаження у 250 кг (Фіг. 1 та 3)). У поперечному напрямку ця каркасна структура виявила міцність при стисканні, яка сягала до 4 МПа.

Також зазначену каркасну структуру може бути піддано тепловій обробці з максимальною температурою у 1300С у контрольованому середовищі для додаткового збільшення її механічної міцності.

Кісткоподібні мікроструктурні особливості біоморфної каркасної структури забезпечують доставку топологічної інформації в клітини для побудови нової кісткової тканини з організованою структурою, що було підтверджено випробуваннями іп мімо, в яких цю каркасну структуру було імплантовано у стегна кролів та мишачі кістки черепа.

Зазначена каркасна структура не викликає жодних хворобливих реакцій чи будь-якого некрозу або пост-хірургічних інфекцій. Застосування цієї каркасної структури через місяць призводить до поширеної колонізації новоутвореними клітинами кісткової тканини, подібної до колонізації контролю з наявним у продажу пористим апатитним каркасом (ЕпдіРоге, Ріпсегатіса з.р.А., Наїу).

Вилучені з кісток мишачого даху черепу зразки тканин виявили наявність поширеного утворення кісткової тканини та проникнення клітин у пори каркасної структури як у випадку окремого імплантування цього каркасу, так і у випадку додавання до імплантованої каркасної структури остеогенних стромальних клітин (Фіг. 2а-4). Каналоподібна пористість цієї каркасної структури викликає утворення кісткових структур, які імітують Гаверсові системи (як позначено стрілками на Фіг. 20). Крім того, каналоподібні пори цієї каркасної структури викликають швидкий ангіогенез, сприяючи таким чином утворенню та проникненню нової кісткової тканини. Цей результат підтверджує те, що відповідна орієнтація пористості, яка є взаємопов'язаною з орієнтацією ендогенної судинної мережі може бути ефективною для сприяння ранньому розвитку поширеного ангіогенезу.

Приклад 2

Порівняння біоморфного гідроксиапатиту за винаходом та відомого в цій галузі гідроксиапатиту з ієрархічною структурою

В цих дослідженнях було здійснено порівняльну перевірку розподілення розміру пор отриманого з природної деревини ротангу біоморфного гідроксиапатиту за винаходом та розподілення розміру пор ієрархічно структурованого гідроксиапатиту, отриманого з тієї ж саме

Ге) природної деревини відповідно за способом, наведеним у вид. Аппа Татрієгі еї аї. іп Ше Ууоитаї ої Маїепіа! Спетівігу, 2009, 19, 4973-4980 та із застосуванням способу, наведеного у вид. Кийіпі еї а). іп Спетіса! Епдіпеегіпд дошгпаї 217 (2013) 150-158 лише стосовно операції фосфатування (суміш МНаАНгРО-(МНА2НРО», рнН-9, Ттах-60 "С, час-80 год.).

Результати наведено на Фіг.4, на якій чорними стовпчиками позначено біоморфний гідроксиапатит за винаходом та темно-сірими стовпчиками позначено відомий в цій галузі гідроксиапатит.

Зрозуміло, що збільшуючи кількість пор діаметром 200-300 мкм у біоморфному гідроксиапатиті за винаходом у порівнянні з відомим ієрархічно організованим гідроксиапатитом, слід зробити висновок, що ці пори є найбільш прийнятними для сприяння фізіологічної васкуляризації біоморфного гідроксиапатиту при імплантації, як замінника кістки.

Крім того, на тій саме фіг. 4 показано, що збільшення кількості пор діаметром 0,01 - 0,1 мкм чітко вказує на збереження мікроструктури природної деревини у кінцевому продукті.

Приклад З

Виготовлення гідроксиапатиту, отриманого з деревини та модифікованого іонами Маг та/або 5ге-:

Застосування операцій 1-5 описаного у прикладі 1 багатоетапного процесу призводить до отримання заготовки з карбонату кальцію. Активування цієї заготовки іонами Ма?" та/або 5г- було здійснено відповідно за кожним з наступних способів:

Спосіб 1

До багатого на фосфати 1,0 М розчину було додано розчин 5г-" (у вигляді 9ГСІ). Заготовку з карбонату кальцію, отриману відповідно за зазначеним багатоетапним процесом далі було занурено у цей об'єднаний розчин та нагріто до температури 200 "С з тиском водяної пари у 2

МПа, що призвело до отримання активованого іонами 512 гідроксиапатиту зі збереженням морфології початкового шматка деревини.

Спосіб 2

Заготовку з карбонату кальцію було занурено у багатий на фосфати 1,0 М розчин та піддано нагріванню до температури 25-907С під тиском водяної пари у 0,1 МПа з одночасним поступовим додаванням розчину біг". Це призвело до отримання 5г--активованого

Зо гідроксиапатиту зі збереженням морфології початкового шматка деревини.

Спосіб З

Заготовку з чистого карбонату кальцію (або частково перетвореного на гідроксиапатит шляхом занурення протягом доби у 1,5 М багатий на фосфати розчин при температурі, яка була кімнатною або перевищувала її) було на добу занурено у водний або органічний розчин, який містив іони Зг-. Потім її було вилучено з розчину та занурено у 1,5 М багатий на фосфати розчин з одночасним його нагріванням до температури 200 "С під тиском водяної пари у 0,5-1,5

МПа. Це призвело до отримання 5Бг--модифікованого гідроксиапатиту зі збереженням морфології початкового шматка деревини.

Властивості модифікованої іонами стронцію каркасної структури

Було виявлено, що застосування розробленої гідроксиапатитної та модифікованої іонами стронцію каркасної структури призвело до збільшення життєздатності мезенхимальних стовбурових клітин (М5С) у порівнянні з каркасними структурами, позбавленими модифікації іонами стронцію (Фіг. 5).

Застосування модифікованих іонами стронцію каркасних структур також виявило наявність добре розвиненої морфології та збільшеної експресії важливих для остеогенезу генів, як-то

ЕиМХа та АЇ Р (Фіг. 6), тобто тим самим вони діють, як промотори диференціації остеобластів.

Зокрема, у порівнянні з 5ЗІі- позбавленим каркасом було виявлено наявність значного збільшення рівня мРНК обох цих генів (р«0,05). Це збільшення було особливо значним для каркасної структури, молярна частка стронцію в якій складала 2 95.

У випадку застосування Зг-заміщених гідроксиапатитних каркасних структур було спостережено збільшення проліферації преостеобластів протягом 14-денного дослідження (Фіг. 7). Збільшення вмісту стронцію у каркасній структурі призвело до набагато збільшеної та довготривалої життєздатності клітин. Ці результати вказують на успішне викликання та підтримання утворення нової кісткової тканини.

Каркасна структура за винаходом також виявляє можливість підтримання остеобластного фенотипу протягом двотижневих досліджень (Фіг. 8).

Поведінку клітин у контакті з каркасом зі стронцієвим заміщеннями було досліджено також шляхом спостереження поведінки остеокластів. Попередній морфологічний аналіз було здійснено для перевірки та затвердження цієї моделі остеокластогенезу. Остеокласти, які росли бо на поверхні каркасної структури мали типові морфологічні характеристики.

Також було здійснено оцінку відповідної генної експресії головного маркеру, залученого до активності та утворення остеокластів (О5саг, Іпіедгіп ВЗ та СагерзіпкК) (Фіг. 9). Цей аналіз виявив наявність значного зниження з часом експресії всіх цих генів, пов'язаних з головними молекулярними шляхами остеокластів, що є показником того, що наявність іонів 5г-" у каркасній структурі призводить до пригнічення утворення та активності остеокластів.

На закінчення слід додати, що заміщення гідроксиапатитів іонами біг" призводить до біологічної дії на клітини кісткової тканини, зокрема викликаючи ї) значну індуктивну дію, спрямовану до генів, пов'язаних з остеогенезом мезенхімальних стовбурових клітин; ії) індуктивну дію на проліферацію остеобластів та ії) пригнічуючу дію на активність остеокластів. "Для випадків імплантації у сегментальний кістковий дефект було розроблено нову каркасну структуру з наявністю центрального каналу, розташованого у напрямку, паралельному головному односпрямованому напрямку пор таким чином, щоб бути спрямованим до уламків кістки для впровадження розвитку нового кісткового мозку (Фіг. 1). Розмір цього каналу визначають в залежності від певного дефекту; однак, для підтримання адекватної міцності, він має діаметр в межах 20-60 95 відносно ширини цілої каркасної структури.

Приклад 4 - порівняння біоморфного гідроксиапатиту за винаходом та відомого в цій галузі гідроксиапатиту з ієрархічною структурою

В цих дослідженнях було здійснено порівняльну перевірку біоморфного гідроксиапатиту, отриманого із застосуванням процесу за винаходом та гідроксиапатитної каркасної структури, отриманої з тієї ж природної деревини (ротангу) відповідно за способом, наведеним у вид. Аппа

Татрієїі еї а. іп їШе ЧуЧоштаї ої Маїйегіа! Снетівігу, 2009, 19, 4973-4980. Застосований у процесі за винаходом шматок деревини ротангу мав довжину, яка складала 2 см та яку було виміряно в поздовжньому напрямку, в якому розмір цієї каркасної структури був максимальним.

Застосований у процесі за попереднім розвитком техніки шматок деревини ротангу мав довжину, яка складала 1 см та яку також було виміряно в поздовжньому напрямку, в якому розмір цієї каркасної структури був максимальним.

Після кожної операції цих двох процесів було здійснено аналіз та порівняння питомої площини поверхні (554А) та розподілення пор похідних та кінцевих каркасних структур (див. Фіг.

Зо 10, 16, 19 та 20). Крім того, було здійснено додаткове порівняння розмірів кристалів карбіду кальцію двох похідних каркасних структур, отриманих після операції карбюризації (див. нижні зображення на фіг. 13).

Також після операції карбюризації було здійснено порівняння структури кристалічної гратки двох каркасних структур карбіду кальцію, яке наведено на Фіг. 14.

На Фіг. 10 наведено порівняння розподілення пор двох каркасних структур з карбіду кальцію, отриманих після відповідних операцій карбюризації та їх додаткове порівняння з розподіленням пор початкової піролізованої деревини. На цій фігурі також наведено й питому площину поверхні цих двох каркасних структур з карбіду кальцію. Результати свідчать, що тільки каркасна структура з карбіду кальцію, яку було отримано після операції карбюризації за винаходом зберігає мікро та нано-розподілення пор деревини ротангу (розмір пор «1мкм).

Порівняння двох величин питомої площини поверхні свідчить про позитивну дію досліджуваної каркасної структури за винаходом.

На фіг. 11, 12 та 13 (див. дві верхні фігури) наведено зображення, отримані з допомогою скануючого електронного мікроскопу (ЕМ) двох каркасних структур з карбіду кальцію, на яких можна чітко побачити найкраще зберігання мікро та нано-пористості природної деревини.

На Фіг. 13 (див. дві нижні фігури) наведено порівняння розмірів кристалів карбіду кальцію.

Гранули отриманого за винаходом карбіду кальцію мають середній розмір приблизно у 10 мкм, тоді як гранули, отримані з допомогою процесу за попереднім розвитком техніки мають середній розмір приблизно у 100 мкм.

На Фіг. 14 наведено порівняння кристалічної фази двох каркасних структур з карбіду кальцію, виміряних з допомогою дифракційного рентгенівського аналізу. Отримані результати вказують на те, що отриманий за винаходом карбід кальцію має як тетрагональну, так і кубічну кристалічну гратку, тоді як карбід кальцію за попереднім рівнем техніки має лише тетрагональну гратку. Каркасна структура з карбіду кальцію за винаходом містить підвищену кількість молекул

Са(ОнН)» порівняно до каркасної структури за попереднім розвитком техніки.

На Фіг.15 наведено зображення каркасної структури з оксиду кальцію, отримані після відповідних операцій окиснення з допомогою скануючого електронного мікроскопу (ЗЕМ). На зображеннях отриманої каркасної структури за винаходом видно, що ця структура зберігає мікропористість між гранулами Сас, тоді як у каркасній структурі за попереднім розвитком бо техніки ця мікропористість повністю відсутня.

На Фіг. 16 зображено розподілення пор двох каркасних структур з оксиду кальцію. На цьому порівнянні чітко можна побачити, що отримана після операції окиснення фракція мікро- та нанопор та питома площина поверхні є збільшеними саме у каркасній структурі за винаходом.

На Фіг. 17 та 18 наведено зображення карбонату кальцію, отримані після відповідного карбонування з допомогою скануючого електронного мікроскопу (ЗЕМ). Матеріал за винаходом має розповсюджену дрібну структуру у порівнянні з матеріалом за попереднім розвитком техніки, цільна структура якого відрізняється наявністю великих кристалів кальциту (розміром до приблизно 50 мкм). Під час операції фосфатування ці великі кристали викликають розриви або руйнування структури.

На Фіг. 19 наведено розподілення пор двох отриманих після операції карбонування каркасних структур з карбонату кальцію. Порівняння цього розподілення пор та питомої площини поверхні надає результат, подібний до обговореного вище результату для оксиду кальцію, тобто збереження у цьому процесі мікро- та нанопористої структури з порами розміром «1 мкм та збільшення величини 55А у структурах за попереднім розвитком техніки.

На Фіг. 20 наведено порівняння між розподіленням пор кінцевої біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури (після фосфатування), отриманої із застосуванням процесу за винаходом та кінцевої біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури за попереднім розвитком техніки. Також наведено порівняння відповідних величин питомої площі поверхні (З5А).

Результати вказують, що біоморфна каркасна структура за винаходом має збільшену фракцію мікро- та нанопор та підвищену питому площину поверхні у порівнянні з каркасною структурою за попереднім розвитком техніки.

Приклад 5 - процес за попереднім рівнем техніки, застосований до зразка деревини ротангу, який мав довжину, виміряну в поздовжньому напрямку, в якому розмір каркасної структури є максимальними та дорівнює 2 см.

Цю перевірку було здійснено для демонстрації того, що процес за попереднім розвитком техніки Аппа Таптрієгі еї аї. іп їпе доштпаї ої Маїегіа! Спетівігу, 2009, 19, 4973-4980) не дозволяє здійснити виробництво каркасних структур з довжиною, виміряною в поздовжньому напрямку, в якому розмір каркасу є максимальним та дорівнює або перевищує 2 см, тобто каркасних

Зо структур, інтересуючих з клінічної точки зору для регенерації кісткової тканини.

Для цієї мети зразок деревини ротангу було піддано операціям процесу відповідно за умовами, описаними у роботі Татрієгі еї аї.

На Фіг. 21 показано, що каркасну структуру може бути пошкоджено навіть перед операцією фосфатування. На Фіг. 22 показано, що навіть у разі, якщо каркасна структура залишається неушкодженою під час операцій процесу аж до фосфатування, то після фосфатування її буде зруйновано.

Ця перевірка чітко виявила, що збільшення масштабу керамічного продукту часто не є операцією, яка не викликає труднощів; навпаки, умови цього процесу повинні бути зміненими (інколи сильно зміненими) для того, щоб отримати продукти більшої довжини навіть у разі, коли процес отримання малого керамічного продукту є відомим в цій галузі.

Приклад 6 - Порівняльна перевірка

Ці дослідження іп мйго було здійснено із застосуванням мишачих мезенхимальних стовбурових клітин (птпМ5С). Аналіз визначеного профілю генетичної експресії було здійснено для перевірки надлишкових рівнів експресії певних генів, залучених до остеогенної диференціації, викликаної з допомогою біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, отриманої із застосуванням процесу за винаходом та біоморфної гідроксиапатитної каркасної структури, отриманої із застосуванням процесу за попереднім розвитком техніки.

Опис зразків

Дві досліджені каркасні структури було визначено наступним чином:

01711110 | Розмірдюу Модадв | сюридаці

Зразок Розмір диску й под зразків стерилізації модифіковано Са/р - 165 о. 8,00 мм, ЕЮОН х УФ-

Каркасна (за винаходом) Ме/Са- 1164 (45 о0мм 9 випроміню- структура за З/Са - 0,59 ' вання (за винаходом) " Ї: 4,00 мм вання

Каркасна Не у-променеве . , випроміню- структура за модифіковано Са/р-4 77 2: 8,00 мм, вання

Татрівгі єї (за попереднім " Ї: 4,00 мм 25 кГр а. рівнем техніки) Саттавай

Результати

Досліджені гени було пов'язано з обома ранніми (Кипха2 та АЇ Р) та пізньою стадією (ОРМ) детермінації остеогенної диференціації клітин та вважається, що вони активуються під час клітинного росту у всіх каркасних структурах за винаходом порівняно до каркасних структур за попереднім рівнем техніки та зі значною різницею, виявленою для генів Кипх2 та ОРМ (рх0,0001). Для генів ВМР2 та Со115 жодної відмінності рівнів їх експресії у всіх досліджених зразках спостережено не було, імовірно через те, що ген ВМР2, який є регулятором активування шляху диференціації на той час (через 14 днів динамічного культивування) вже здійснив власні біологічні функції, про що свідчить наявність активування генів Кипх2, Аїр та

ОРМ (1)Ї. З іншого боку, Соі15 є дуже пізнім маркером, пов'язаним з утворенням мінералізованого кісткового матриксу (21 та імовірно, що часу культивування було недостатньо для викликання його експресії. Жодних відмінності також не було спостережено між індуктивною дією модифікованих або немодифікованих каркасних структур за винаходом (див. Фіг. 23).

На Фіг. 23 наведено відносну кількісну оцінку (272893 експресії генів відносно експресії немодифікованої каркасної структури за попереднім рівнем техніки, яку було застосовано, як калібратор, після 14 днів тривимірного культивування мезенхимальних стовбурових клітин в динамічному режимі зі всіма досліджуваними зразками. Також було наведено показники середньої та стандартної похибки для трьох зразків. Статистичний аналіз було здійснено з допомогою двобічного дисперсійного аналізу (АМОМА) з наступним ретроспективним аналізом

Бонфероні та було виявлено значну різницю на графіку: 7 "рх0, 0001.

З наведених вище тестів можна стверджувати, що каркасні структури за винаходом мають більш високу індуктивну силу, спрямовану до експресії генів, пов'язаних з остеогенним розвитком відносно каркасних структур попереднього рівня техніки.

Джерела інформації:

ПІ Атсп Огаї Віої. 2013 дап;58(1):42-9. дої: 10.1016/.агспогаїріо.2012.07.010. Ериб 2012 Аца 9.

Їеадег депе5 іп о5іеодепевібз: а Шеогеїїса! 5ішау ("Лідерні гени в остеогенезі: теоретичне дослідження"). ОпПапао В, сіасотеїі І, Кіссі М, Вагопе А, Сомапі 0.

Зо (2! У Сеїї РНузіої. 2012 А!йцод;227(8):3151-61. адої: 10.1002/ср.24001. ЕхігасейІШіаг саїсійт спгопісаПу іпдисед питап о5іеобіазів ейПесів: зресіїс тоашіаїйіоп ої овзівосаїЇсіп апа соІПадеп їуре

ХМ (Дія людських остеобластів, як наслідок постійного впливу позаклітинного кальцію: специфічна модуляція остеокальцину та колагену ХМ типу". сариві Е, Мапгегаїпі С, Сгабвві Е,

Ріасепіїпі А, Саціпі І, Ріагдо С, І атьепіпі Е, Ріма В, 7Іпі М, Расспіпі А, І івідпоїї С.

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура, яку отримано з деревини із загальною пористістю, яка складає принаймні 20 95, виміряною після піролізу цієї деревини, причому ця каркасна структура має довжину, виміряну в поздовжньому напрямку, в якому розмір цієї каркасної структури є максимальним, перевищує або дорівнює 2 см.

2. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура за п. 1 із загальною пористістю деревини, яка складає 60-95 95.

З. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура за п. 1 або 2, яка має виміряну в поздовжньому напрямку міцність при стисканні, яка перевищує 5 МПа.

4. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура за пп. 1-3, яка має ієрархічно організовану пористу структуру, яка походить від ієрархічно організованої пористої структури деревини, з якої її було отримано.

5. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура за пп. 1-4, в якій застосовану деревину, вибрану з ротанга, сосни, абачі, бальсового дерева, сипо, дуба, паліандра, кемпаса та волоського горіха.

6. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура за пп. 1-5, в якій ієрархічно організована пориста структура містить 30-80 96 пор діаметром менш ніж 150 мкм, та пори, позосталі від 100 95 загальної кількості пор, то пори, діаметр яких перевищує 150 мкм.

1. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура за п. б, в якій застосованою деревиною є ротанг, 30-60 95 від загальної кількості пор каркасної структури, то пори діаметром «10 мкм.

8. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура за п. 6, в якій застосованою деревиною є ротанг, принаймні 25 95 від загальної кількості пор цієї каркасної структури, то пори діаметром 1 мкм.

9. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура за пп. 6-8, в якій застосованою деревиною є ротанг, принаймні 20 95 від загальної кількості пор цієї каркасної структури, то пори діаметром 2150 мкм.

10. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура за пп. 6-9, яка має питому поверхню (55А) »9 ме/г.

11. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура за пп. 1-7, в якій зазначений гідроксіапатит частково заміщено одним або більше іонами, вибраними з групи, яка містить іони магнію, стронцію, силіцію, титану, карбонату, натрію, калію, срібла, галію, міді, заліза, цинку, мангану, європію та гадолінію.

12. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура за пп. 1-11, призначена для застосування у медичній галузі як замісник кістки та має форму, що є відповідною формі кісткового дефекту, який підлягає реконструкції.

13. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура за п. 12, призначена для застосування у заміщенні або регенерації кістки або частини кістки.

14. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура для застосування за п. 13, в якому зазначена кістка або частини кістки є кісткою або частинами кістки, підданими механічним навантаженням.

15. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура для застосування за п. 14, в якому зазначена кістка або частини кістки є довгими кістками рук та ніг, такими як великі гомілкові кістки, плюсневі кістки, малі гомілкові кістки, кістки стегна, плечові кістки або променеві кістки.

16. Біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура для застосування за п. 14, в якому зазначена кістка або частини кістки є частинами кісток черепа, кістками хребця або частинами кісток щелепно-лицьового відділу.

17. Замінник кістки, який містить біоморфну гідроксіапатитну каркасну структуру за пп. 1-11.

18. Процес отримання біоморфної гідроксіапатитної каркасної структури за пп. 1-16 або замінника кістки за п. 17, який полягає у операціях: 1) піроліз: природну деревину, вибрану з ротанга, сосни, абачі, бальсового дерева, сипо, дуба, паліандра, кемпаса та волоського горіха, нагрівають з температурою 6000-1000 "С в інертному середовищі з отриманням карбонової матриці; 2) карбюризація: карбонову матрицю просочують кальцієм у стані пари з температурою 900- 1200 "С та під тиском у «100000 Па з отриманням матриці з карбіду кальцію; 3) окиснення: матрицю з карбіду кальцію (СаСг) нагрівають у повітрі з температурою 750- 1300 "С з отриманням матриці з оксиду кальцію; 4) гідратація: матрицю з оксиду кальцію піддають дії води, тим самим забезпечуючи поглинання 1-25 молярних відсотків води; 5) карбонування: матрицю з оксиду кальцію перетворюють на карбонат кальцію шляхом нагрівання з температурою 500-900 "С під тиском 4-20 МПа; 6) фосфатування: матрицю з карбонату кальцію обробляють принаймні однією фосфатною сіллю, вибраною з групи, яка складається з фосфату амонію, фосфату натрію, фосфату калію та їх сумішей, з отриманням біоморфного гідроксіапатитного каркаса.

19. Процес за п. 18, в якому після операції 1) природна деревина має загальну пористість, яка складає принаймні 20 95.

20. Процес за п. 18 або 19, в якому перед операцією піролізу 1) цей процес полягає у застосуванні операції ї) відбору та виготовлення природної деревини, яку розрізають на шматки довжиною, виміряною в поздовжньому напрямку, в якому розмір цієї деревини є максимальним бо та перевищує або дорівнює 2 см, а операція ї) відбору та виготовлення природної деревини полягає у застосуванні операцій отримання тривимірної моделі кісткового дефекту та у наданні на основі цієї отриманої моделі цій природній деревині тієї форми, яка відповідає формі кісткового дефекту.

21. Процес за будь-яким з пп. 18-20, в якому операцію карбюризації 2) здійснено з молярним відношенням Са/С, яке на початку реакції складає 1,10-2,50.

22. Процес за будь-яким з пп. 18-21, в якому операцію карбонування 5) здійснюють відповідно за одним з наступних теплових циклів: - в умовах сталого тиску СО приблизно у 10 МПа, повільно збільшуючи температуру до величини приблизно 750-850 "С; - в умовах сталої температури приблизно у 750-850 "С, піднімаючи тиск до приблизно 10 МПа; - зберігаючи тиск на позначці приблизно 4-6 МПа з одночасним збільшенням температури до приблизно 750-850 "С з наступним збільшенням тиску до приблизно 10 МПа.

23. Процес за будь-яким з пп. 18-21, в якому в операції фосфатування 6) матрицю з карбонату кальцію занурюють у розчин на водній основі, який містить принаймні одну фосфатну сіль та який має концентрацію фосфату у 0,1-5 М.

24. Процес за будь-яким з пп. 18-23, в якому початкове відношення РОг/СОз у операції фосфатування б) у 1,5-5 разів перевищує теоретичну стехіометричну величину.

25. Процес за будь-яким з пп. 18-24, в якому операцію фосфатування 6) здійснено у присутності іонів магнію, стронцію, силіцію, титану, карбонату, натрію, калію, срібла, галію, міді, заліза, цинку, мангану, європію та гадолінію або їх сумішей.

26. Отримана з деревини біоморфна гідроксіапатитна каркасна структура, яку можна отримати за допомогою процесу, як описано у пп. 18-25.

27. Біоморфний гідроксіапатит, отриманий з деревини, яка має загальну пористість у 60-95 95, виміряну після піролізу цієї деревини, та який відрізняється ієрархічно організованою пористою структурою та міцністю при стисканні, виміряною в поздовжньому напрямку, яка перевищує 5

МПа.

28. Замінник кістки, який містить біоморфну гідроксіапатитну каркасну структуру за п. 26. ан окон пед им п г я г - а: пк си о Е Он МЕ НН о Че

Дер т СОННИК -к | З Кн с ше ІН ШЕ а в Я о ПЕК Ето В о: ПЕ В ШТ ПО КК на с о ох ПО р в п ов о , в' ОО НЕ п: пешло еВ ПЛАВКИ З нт ЛОКК М ВК НН ПЕЖКНИЯ ев МОН НН по 0. ВО ПОД с ПЕЕОЕНЕК с ОМ и рено нн -к Б 5 1 Мо НН М М М о и ОК М М нн, шдеї МОМ со ВВ он: З В 55-х

НО . ЕХ зи її с я ть, 5 - що ОО ов с Вк КК ан НН и и ВО и с п п 1 а 0 С В ан КК ОВК Ко Й а М ШКО КК ОК ЕК ПМК х М ЕМКОН КК КО с - Я ЗЕ с її Я ОК КЕ ОО ОО с ше МО в КОВО ВК КК НК о ОК КВ є г Ян КЕКВ КК ОО «Ж п ше ХИКККНЕВ Я с ОХ с ОМ З КК ЕЕ о ОН М че о. ЕК ВК : ПИВ о. п ХЕ . КО ОО Я ж ППНННЩЦНЩНН НН деко ЧЕ у с с долу пидди. КВ. і : Ек ква в в ОНИ : : ї з х Ї ї Ж У

І Ц. т. т. я т зх ї х : ї х ї З З ВУ х : ї З : Ь З Е й ї : ї З : Х я Я З ж Е : мо в В оо зов ВИХ ОВ ЕВ ВО о о оон во Бо їх : ШТ : т ЗХ З ї снея ї : ся ї ї ; ї й і : ї 5 Ї 5 : : ї ї : ї : 5 З х Ї ву : : т т і Я т ї олЕх ї : ЩО, ї ШИ х Я Може ї : п : г я : і у ї Е т : І З т і ї ї х В ія к ї ї 3 г х ї : її У: Бу й хх ї : я -- : ту З х ї Може ї х п т. КУ З; з ї 7 ї : і: Ї 2 Х ї Е і ї Н г ї г 5. ї їх їх ї : щі Х о Н Н ї З. -- мити кити Ж : Я 7 й : Бош 5 х ї о ї : ї : Ї :8 ї Я Ву і : ї : Ї ї : Зк ї ї ї ї : 5: ї пилинки я сипиг. пити КВ їх Е Що УТ : о ТА МД Утя ї п ї : ї о, ї г ї СН ї : ї і Я З ї ї ї

: 5. г Е Я Я ї ї : ї х в З І : Ві ї : т Ї ІЗ З т ї З ож ц В Пен оо ї

: п. т т я т ї ДОСЖУ х : ї : ї З т ї дО ї : ї ї с г В З З ї : ї їй оса КУ іх ї ї : Я ї т ї їх. ЩОКУ ї : ї ї вх. ї ї ія х : ї : Б. ї Н | Е : ї ї КУ; т і: ї х : ї г Е : ї ї : т т З Я ї -х ї : ї пит г Еф с КЕлих х Кох ї : : ї х ї Ї Кл ї : ї х моя ї : Н І ї У ее й ї в і Ху ї н Овен оон нн а ново рони ННЯ ї ї ї ех х ї ї роя : : : к- т ву : ї Н ї : : х : її Х ї Н М : : Я ї ї і Е Бяко о 5. : : Х т г : ї 3 УІШНУ К ї с: т. о її к ц У ї ї ї. Кз ї їх їх ІЗ КОЩЕ ох: ї : нн вн нн нн нн нення же же ї : 5 кя : ІЗ і: Я ще Не : : 4 Я : ї : ан Е ї ке : 5 : 1 м ВЗ ї : : Ше І у ї ї їх о хі ї : Пе поиртитчахтисиці о поту. юристи Арт Ку нини г реиив ит М Х, - І : : Зк. х ї В ія я г п К ї В. : 2 ї й ТО р Її : ї ре Е с В З кН : і: пас г ї : іще МОЇ : МИТИ ним вч й п "7 К Ган ї : ї ї пово, Ко ї ї ож Е ї - К х Меч т. х І яса ї т п т Тео К ї: (З - З ї : х їх Каасо ї : хе З : Е їх Е во я : ПЕН: ЗКУ : : Ї х ве о ї Н ї : : ї ї ей т 3 ї : п т: Е. по р гне їх р ен ня ї : г : її ї Ша : ія ї : ї З : око ї Н І : : : х Я й З ша і: : : ї їх ї Кому Може і: : ї : т щі і ах ж ї ї ї : т ї ща Бо 1 ї : : : ї. НЯ т і Де ї : т х ТЕ В ї 5 ї : ї т ї ї ї Ь ї ї т х т в; ї Во. ї : ен в В В кВ в и в В ВХ ї : ї І х т х я І т т п ща с т 5 т : х т п о Я Ж ї : : З їх Ї х р ЯН ї З В х ш ї х Зк їх : ДУ УТ УКМАККК КАХ КК ХХ ЕК КК КК КК ЖК ї : - ЩЕ їх с КУ. ря Ж БК ох: Кт т : КУ хх МЕ 2 м х : хх ТЕ ЖЕ Боня 7 кочнео НИ сх я І : КЕ варом і У : о во Кк :

Фіг. З хе шщ ОО ка и ШЕ ще ке ї ЖЕ ож жх: ХАОС

Ен. ОБ 5: ж ши ШЕ. ніш ще (Е «МО Сх Ж бе МО шЕ ши ши ше ч шен : зе Е : : : Бош Бу : : и дощ КУ : ї ї ї : слкк щх : х ї ї Н г еждюв О, КУ : ї ше ЩЕ ск : ї ї ї Н КУ їх : ї МИНЕ І г : Е о ваьеаівБ а 5 ще | ши їх ше ши ши щ шшН

ШЕ . ши ши: ЩІ шо шк. Я і 5 ке схюхк МОНЕ СемрУє кі ЗХ З мов ; Ж І «тт КЕ СЛуЖвИк Здаю ВК що зів. |: ШИ сзхооєстетюювио заакив і КЗ я Ж : АЖ ТОК, віВнва» ПДК: ЗКОнаючк В Я Ж Яна ї З я свв Га | ї ж. « Ш нь ШЕ СОЯ шк 31 ЗЕ шеки ОХ 5 пи шо що ши ШЕ и ШК хо БЕ ЖЕ БЕ ші шах ше ЕЕ за ЩЕ ЩЕ ОО Е - ЩЕ її . й її ою й є БЕ и й шй й їж З 5 ЕН кан се КИ иним гу ОК елеоо ВИ зрааа ния зо ща занна Корж: я зач о в ов. Те, тв че щу вк Ж Ж В жо Ж Ж ше КО ие Ж ющо ж Ж ХО УВО Ж, т Я мово що ще М ще ЗК лю ЕХ МЖК дО жа в х Я Щщ- мМ ЕоОжю лю ха ЩО МО ХО хх ЖЕ хх О ке. З ОКО ГУ ї ІЗ З ІЗ цк МЕ - ке 3 ж рон щ ї з ЛА ск с. іх ях «МОМ ЖХКМКМ Мих

ІЗ . ЕК Ов Ж КК к жк ОО Я ІЗ ОККО рин оон Коня Во Я ІЗ о в ІОН Я ї МНН ПИЛИП х З і; ОК КН о КО ПЕК ІЗ Е ПО КОХ Я ІЗ ПЕН ККХККААКККА КАК

ОК. - 5 й со ІЗ к ке ХМ ВЕ КО ЮК: Ко я ще БЕ Ма ОК КК Ж : З Ко ї во ях кни Х КО г: КЕ Ох ї. Е КОХ З мк ХО : М. Моз В «ЕЕ КО Пе М ІЗ Я ве во Е СХ ОО ЗК еКУ ФИИПИ НИКИ НИКИКИШишИИ КОНЯ ЗК Ве Ск ПЕКИ, ОХ р в У ЕВ ЗНУ Д.В ВЕНУ ЕНН АХ ЗИМИ ИН ИНшИИИИИИИИг ВО р нн ПШХ роко в нн АХ р ВК нн ПЕВ ЕОМ в ве в х Е фумекоо со ооуюо з н сснкдкдннннкнк нн дккннннннни с. щк й Ка ія това сонна сзвваоввосов увавваовновс Б Я ЕЕ ке я ек пк ще хо ще ж ки їх ! оду АККАУНТ АКТКНМ Я Мо.

АБИюХ Ку т : БО совок: сек струнко: педноююе МК розши Е я же сом их.

КО й е 5 : ж ЕІ Карен ккруктувим з Зх коххх цю Ж й ШЕ: рен ЗЕВВРРОИХ МЖеВ ки ТКЕНЬККЕ ПЕД ВКЛ ОБ ся в В хе щоб уе ща Ко ій Ж Ж г ї що з Ж жк : тя КЕ щ х ск ГК ш Е ци вісі сь, и КИ ЖЕ са ШКО ЩЕ - ЩЕ сег В КЗ - р МОВ Е о ЩЕ 5 Її.

Я Се ОО су БО дд х ЩЕ т Е Я Я еШКЗ У дека Х рю З до зх є хі ; З до Ух ЩО сл. з ЕЕ У МОЖ ГУ

М.М ОМ Ж КО о тобою як х же у ко ЗК МОП ож о я КУ Ноя Х ОО УДО СМОМХ вн а ЖОВ І КО ж вм : З у У с й і а ях Е. Е і зивввннвнннй З ГУ Кн Я З В | ск В Е КхЯ : З М З З з сх МЕ. Я о КІ я. - З ек : Ко КО "Я ах Е їх ї х Я Е я Е З ие е се З жук 5 к Н КІ оно о) х Км МИ КЕШ ц кептетен Доки оон ШО ППКП г ФО МЕТ й ПІНИ : ДИЛИ ий ДЛ ї ПИТНІ Исий : МИпИШЛИШ ТИ КИТ ПЛИНИ ; МИХ ЖИ зано Я МИЛИ я ни ПЕКИ ВЕ МЕ х ДНЕЙ ії КЕШ КОЖ ПЕТИИИННИСКИИИК ПЕН ГО ЧО Десокою ОН а З ЕЗ рокі рми Кв кв вн ЕЕЕЕК Кк тій оон докнкноддктннк Й КУ цк -х -х де ЖЕ що Б Ехя Б е Б У З я хх т Б КУ - З - КУ я «о х к- де дек. де ї ї . Бу : В 3 5 Е ; Е гу З ї : : Е х З Н : Е фотюнчяя дення Конссо Е у Ї Н З ? : і ; ! пєюч Е ше і, ї «ж У З ; : Н Кк ї до х З їй ів їж х Мо БО КЕ в я во у т КИТЕШИИИН ни ІКИЛИс ї- ВЕК З Ж ПЛТЛРУИСЛИИЕЦ В ВЕ т У ИЙ їх ТКИИИ МИ ІрХИКИПИИИИИИХИИИ ; МОВ Е пов І ВЕ нн де ЕВ сен НЯ 5 ОО ІЗ Ме В І КІ вин КЕ ПИШИ МИТИ 3 МИЛИИИЛИИМИИТИТИИЕ і ДМИММИИИН КЕН ДОМИ ПИВ ВИТКИ МИ ДИЛИ КИТИ УК Ж ПНЯ КК КК 5 І їх ї ЖУК ум Кен в в жк Кене Зк кро ришн й т м Б БЗЯ Я 7х У й Ба жо Я а хе КУ ж га «ех - с хе х ЩЕ що Ж. Же дк хі «3 Ко КЗ хх ее. пе Же зх ж Мк хх - І ЖЕ : Ї Е ї з ту оо сжЖашеенктки ув я Ж Ж кожУВ о Вико й ние Ж КУ ня сорменове вкрив В В Е : Я "Ше й ще Я г Її дей З Е ШЕ ооо прути Як рак мот зах ПЕИИСІКО М з НН ІМ. й и С: Е дон стивниеху іо Ки І І КЗ Е ДЕ о Я ї ооо Ж: К с о Я їх ПИ Й К ІЗ оо З: їх ПИТИ Й з х ЗБ: х зе З: з ГУ Я: М ем Кх р неви нен іонні ке 5 що т як . щу кі я ях НЕ: х ХО ; КІ х З 4 . що «ак Я Се; ; : 3 Бак сожх Я ва: кр БІ ЗК У І З КВ : : н : Ма З | Е же КО З | п Е їй й Н що Я й ї Е гроооюссююоу КОВШ В : лаву ЕЖЖ зх ї ГО КЕ Я ІЗ ї схожа 00 ЯК Я ІУ ІЯ седе Я о: В ШЕ: у: хе я Е Є ОО ЖИ В Е: Ж ом Я ІЗ МИ Я Я ШИК Ж ск : ї ЕНЕЙ г. В І З Е : ї Б ЩЕ а Е і ЩА М з МНН. сосок, де фдфня З З ЯН сосссн поКввякюс дом. То пн чі рак : г т яв яв ха задо я . її ще ту - 5 ї х: Я НЯ ве я Же ж -к кв хво во воові : Б Бо В Б

В. Бе З Ве ше и се ше Ма У вк Я вк вк. Я я Б В он М ве ще ще Кс : З Гжу Ж в ше ШИ ще що ще в ку З ШЕ Ку щ. М Ко ХУ СКхкКо КМХ Вес ОКХ. и а: БУ о В ше ши ни ш мо м ше шк нн и : | З з зни ще и НЕ ; ї й м х В НЕ КУДНИЯ : З З В З ЩЕ МК З Е Е У ще шк ше ие Ши М х З 3 ія їх ІЗ ІЗ ІЗ З ї І З ІЗ ї ро І: З ї ї: ВУ ї ІЗ ШЕ ІЗ їх ІЗ т у ї ІЗ ш Ї З З В Е: і Її. Ж В З З : З Ї Ї ї ї х З : у : х ї ї 3 : ЕЯ і повин З : х 3 г Ж Її ГУ : У 3 ІЗ х ІЗ ї х З : -й : У : ї 3 І: В гоже і: й ї : Ж родова роде У В В 3 : ї Ї : ї З З : ї і ЕН ше ше шк шк ши ше ІЗ З 3 ї ЖЕ : ї її не : й З : ї ; : Е ву І З 3 : ПО ня щ щ : З З Е Кт ї а до. шк шк ши ШЕ Є МНН, з я 3 8 З : Е ще ях із З 5 : ї "яке УК КУ Я ше ше ШЕ ше й ще ШИ НИК Б Б шк шк ши шк НИ НЕ Ко 5 : З ІЗ : ш І ї ї ях с. : З З Е ї : : х в дк ше ниш ни ИН и п ЧУ КУ г ІЗ Ку 3 і: ї 5 : Ш М. Ж. ІЗ З 5 В й 1. кою сл в ж ши ши ши | ще ше ши ши ни ШЕ : х Е ї З З : ї В ІЗ в З : З | НЕ: їв а. ще фе ше ШЕ ШИ ЯК М . ШОЕ ї З | ї З со В в-Я их я Е КУ ІЧ КУ БУ: Ух І вк Ь; В З ; ЩІ : й ее . | : : Еш вн че я : З ї З Е БО ще ШЕ ше шк шк ни ни | . : З І Ї: ї ї : ЩЕ ох ех ІЗ З 3 Е ї З Ж. днк ВШ ї КУ 3 я ї ї Шок Ї: я х З Ї : : : Н ЕК : ; с ши ши ши ши ши т З ІЗ 3 І ї ї ВЕУ КУ Ко Я Я і | В Її вав сн КЗ Шк КУ ї ЩШ ї В ож ук до. КЕ. р В: т їх з Я ї Ж х у Ку ше Шк п м о МЕ Є: ш- г о в КК ї- в оз х ЖЕ З ЖЕ КЕ М: ЩЕ що ще я о ТЕ КВ ЦК БНВО що шо : й Й КЗ Я ка і ЗО п, хг с 1 ! с: п - 1

ОА і. ОО же ! ЕЕ і. її і с г у С В ЕО пове "лип її. й в . хг Я ХХ ДЕ. Б: КЕ ак Кх БК ОКХ: Сх си а ЕВ ЕЕ Е її ї і с ші Б Б о ; о Б

3 Ж. і Ка щі КоЯ що аа З В МО о Я о яйя 5 я ЕЕ о п. ще БК. п п В и Ск Б ЕХ 5 Б: З с є Б Е в о й п о. КО в ЕВ Ж с г її о. в і 1 ЕІ о Її Ол ве 5 Е Ж о о с її о б . ЕЕ КО 8. с. 3 : с Ма МОЯ ще хх Ж ККЗ о о. сш | .

Ео«.. . . с я о

І. | . с І КЕ о» З ХО ОЗ . З. МВ с Ж о. Зх о. ХВ шк | сш зак еко КОКО о ХЕ КК ЯВНКЯ: с с ; ї І. / вв їй с о . й ! | як с У ЕОШеОу З 5 Ж ОВЕН ВЕ -е о с і її що З о ЕЕ же же с о о. о і ні: КЕ. г о. З о. Я. Б: ЩО Її

Б о. о - ши т а о. с її І г | о. о ще о. ї Ж МОЖ ХК о МКООСЕ |: ОКХ с с с З ке ТЕ . с С МОН с У СУЩЕ ЕХ с с ХО Ех КЕ З о о. ЗК М о г. КОТ що ов ! Вк НЕ о ОБО с КО есе ВОК в Ко її і ЩЕ ря і о шо ЕВ. ші: шо о. ої г п ЕК г КУ о Зк КУ К. о ТО . с "Я . о. ої Б Б х г о с з о. Ох о В шк. ОХ Б о ї Ії ц Тк 1 с З ОКО ше ШЕ Б з ОО ХА її ОО о. Б щ же Ко о. . . о о. У ЕЕ о. ОКО о Я.

о. о. ЕЕ о шо. . о ЕКО се ЗХ Ох ОВК: пер Х ХХ х ще с 1 5 о. . х о с о . о с Б і с шо Ох ще меж. ЩЕ: В ТОВ БУ З 5 о. ОО о МК й З ОКУ о о о ОБ Ге щ в п є о Я. В ш . . с ни -е о КЕ. с БІшЕ о. о. ЩЕ вне її

Зманитьсів Зх Зв внвакажюття г! Е іевкай ТежНККію ї А ВОруятуви маку пи Я КЗ. вквічнв тва би» ше Ей "саонів ! Б : і ка ЩЕ ЩЕ : Р : сх М ОТ ї ші ЕН І: ої ша ЕР вії я о І ї Е Кк їУ ї : , їк ї Ж ! Б: УА Я ЗИ в щ к : й ! а Бе КН г і з : пі НК, НІЧ Е х жі М І ж 0 Нео : У п 561 в з М, МУ, о о Ко Аг и ВИ щі т щоб в ! ше Ж а В че Щі ши и ою і ! ве в Є : І г х 8 в З В Певломовния сля акаЕ й с хоенееее п я . ши по с: її її о п її о о Я : с о о . о ЩІ ша ЗХ ХХ КЕНЕ ж шк о о: 3-х, -.- 0 виш . о Ох ГЖ. 0 0 Х о по еВ Ж У 000 о. . Я де МК ОКО ОК ОК Ом Я м З . г. и У п Ох ОА . о З 0 З ЯКЕ о. 5 -Я ВК С у . КО її сесеКс вен ої Е ок о. . о. ши . о. . . ЕН ї . о. СОЯ З . ОХ З щ МІВ ще щОЕ ОКХ КОХ ВОК ха о. М . З ще п. 0. о 000 ї с Ох ЩК Я о. ЗХ ОЗ З ІВ г і. о. УКОСУ КО КО . МЖК 5 ХО . ж й

ЕЕ . 0. о. ШІ. о. 5 0. 3 ГЕ М Зх о. о Б . МИ АХА КАХ я каш ож СИН вона струєтура, тах в| тн ншшш З вин Керкавна пк м чні я шиття У У У У У Ух У ІЗ т сани х сх - з с КЕ ення пла КК ххх КАК СТ ше | інший Я Ге вн жи шк ШИ наван, ши й ши вн сн . | ши сх: НН пккхетют ! -- ш о не ШК ї ресекх ї ! К ши Б зе ри і С Як В ох ооохетесткоссоссосся Й З Б і ЧЕ Фо ЩЕ КУ х т Еш : ниж ; ї їх Ш Ш Ш но сх їувичай и! ї ши Дивним вохмув ор ска а повер ся мнения не гу ні ше ОК. ЖЕ ЕВ У ЕНН ка Я ЗБЕ УКР КОН ДНЕМ ТО Її За вино т В

Е5:Я

ЖК. жк КЕ Я КО її ни Кк Вешіно нон и г ое 000000 00 А ЯН с В с о х 5. В: Не Я о. я Зх Ту КОЖ С МОВ ЕВ ОО. ЕН АК ВК З хв ВЕБ ЕЕ їх я с с - о. о. ОХ НН: 0000000 п - в с с

НЕ. о с що ОК КК НК В, І: ОО 5 : В . с Б ОО КИ КЕ БЕ:

о 0. НЕ: Б А КВ КВ ше: с Б о о о. й шу її с ОХ ня х о. о. о. и КОВО ЗОВ В ОО ВН М СК ЗУ ОККО Я КО ; ек: КОКО УК 5 ІВ о ЩО о о 1 що . КО ОО с меж Б ОХ 0: її в С ОН пе ОО К Не з їх З ов ЇХ і. вв ВО й ов с ї с ї

Жов. с Ох кош . я с ЕК кое о 55 БІ 0. І. ж ї п. с. о 5 І ях 5. МКК КТК ВЖК Я ж ВБИВ п. п ов, 0 І ШЕ а о Ст аа Щі в. о с М шо Е Вих 0. ОО СОСОК ШЕ; ша ОМ о о 5 Свв. в: їі ГО а Я, ОН С еВ о. о Ох по Е 5 х МОВ Ка Б. Б НН ЕХО еВ ШИ ЩЕ В ОВК ОН Кк ІЗ о. КК КК ОККО ШЕ Я "ПО МК КВ ОСОБ о. її. І я 6 й с . ОО ОО я г 5 с ХО оо СВ В ах п о. ії о о ОБО я Ж 55 5. о Я Ж її її с: Її . 0: ші нНн її УКХ ЗХ Ох ши ШИ В ОК КОВВЯ ен Ж с БАХ в в їх. о

5. В 52 пн ші п ХХ: КВК Я МО КН ще КМ ОМ Ж шк Шк ШЕ ве Не ко а с 00 Б . 5. ЗО нх ЛКК КК В МКК с с В її с с . о а В 5 ЩЕ БЕ А Й о 5 . А щі МО КЕ й шо. с: В ЕЗ о с ОХ За ем 5 ЯК Я МК о. БО ОО ОВ з 5 я ВУ З ПЕК КК ЗХ МК 5 сх З Ж В ОБОХ КСО В о. з С ЕЕ ШИ о. Х . . с. ! а г п. о. А ВУ ОМ ВЕ: ще В. хо: Б п з її Б о. й ЦІ 1. з п. с ЕК ЗЕ ВУХ ВМ ВХ ШИК о ої . - г г і ТО ОО Я МО Зоо В ей СТВ с КК УМХ ОК щ а КК КВ ЗОН с З щ Е С НК МОХ ХК о СК ОК КО В БУХ СНИ КО о с. . і !

ЕК . 3. її. щХ о о 5 и оо в Б, - о. о. о. с с: я нс п.

а . з о В Я БЕ Я УК АК М В СХ ЗВ У що . 0. шк ВВЕ Ж ОК ЯК КК В ОК Я 7 ОО х о ВЕУ Ж хх КЕ хе ОЗ ще: о Ко А З ОО Б о я п. ще я тя Ж БА І ОХ у Ба КОВІ ККЗ Ух З я г 0 Ку Ей ЕЯ и . оо У

З. 15 і: в. жи оса ДЕК Я: хи КН В Ін В БУ ще Моря Б с: ОЗ у . с її - МЕ Еш й 7 ЗБК. Що. с ЗЕ як ВИ ККХ Б. я БЖ НЯ ЗК У КЕ о ВХ Ох в кх їх б ВВЕ ЗОН сх 5. М НЕ ЖК Ви ДВ ш КН о 1хаф Ж ОКО З ї ких; я Жідо Я с. т ЕВ ОО ту ЗО ТО я о То ТИ За ВА КК о НИ й о 5