CN101829363B

CN101829363B - 一种骨组织工程仿生支架材料的制备方法

Info

Publication number: CN101829363B
Application number: CN 201010186144
Authority: CN
Inventors: 钱军民; 张伟; 康亚红
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2030-05-28
Also published as: CN101829363A

Abstract

本发明公开了一种新型的骨组织工程仿生支架材料的制备方法，属于骨组织工程领域。以天然植物组织为模板，经碳化、真空/压力浸渍无机溶胶、空气中氧化去除模板和高温烧结等工艺过程，即制得结构仿生的生物陶瓷或生物活性玻璃多孔支架材料。本发明制成的多孔支架材料，具有良好的理化和生物学性质，尤其是具有植物组织的以管状孔为鲜明特征的多孔结构，与松质骨非常类似，其孔隙率为70～95％，孔径大小范围为10～280μm；其独特的多孔结构可加快支架内外物质交换速度，利于支架材料降解速度的控制，促进新生骨生长。本发明的骨组织工程仿生支架材料的制备方法在骨科、牙科和颌面外科等硬组织的再生修复领域应用前景广阔。

Description

一种骨组织工程仿生支架材料的制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，尤其是骨组织缺损再生修复的组织工程技术领域；具体来说是骨组织工程仿生支架材料的制备方法。

背景技术

由外伤或疾病造成的骨缺损在临床上十分常见，不仅严重影响患者的生活品质，而且给他们带来了沉重的经济负担。然而，由于骨自身修复能力有限，对其修复一直是外科临床上的一个难题，至今尚无特效的治疗方法。目前，临床上多采用自体/异体骨移植、骨膜移植、骨细胞移植、微骨折等修复方法。但它们存在供体来源有限、修复面积小、免疫排斥、移植细胞流失或耐受应力差等不足之处，修复效果不佳。而近年来发展起来的组织工程学，为骨缺损的修复再生提供了全新思路。

骨组织工程的一个显著特征是它应用了支架技术。因此，仿生多孔支架材料的制备就成为了骨组织工程技术的三个关键因素(支架材料、种子细胞和信号因子)之一。多孔支架材料在工程化骨组织过程中具有举足轻重的地位，它不仅为细胞增殖、组织生长提供空间，并直接决定细胞的行为和功能，如细胞在管状孔中沿孔分布，而在球形孔中，则聚集成球形，而且支架材料孔结构对支架内部的传质过程(营养物质的传送、气体交换和代谢产物排出)具有决定性的影响，直接影响新生骨组织的生长。理想的骨组织工程支架材料应具有类似自然骨的三维连通的多孔结构，优异的生物相容性、骨传导性甚至是骨诱导性，与新骨组织生长相匹配的降解速度和力学性能，甚至具有粘附、刺激和引导细胞和新生组织生物学功能的特性。多孔支架材料的性质取决于制备方法，目前应用最为广泛的支架制备方法主要有纤维粘接法、静电纺丝法、溶液浇铸或模压/粒子沥滤法、冷冻-干燥法、发泡法、凝胶注模法、热致相分离等，在骨组织工程支架制备中发挥了重要作用，然而它们存在不能很好地控制支架三维孔结构和调节力学性能的共同缺点(Hench L，etal.Science，2002，295：1014～1017)。近几年，又发展了快速成型技术和微细加工技术，在控制内外部孔结构和孔隙率方面取得较大进步，然而它们制得的支架孔隙率通常小于80％，力学性能也有待提高。

利用组织工程在体外构建骨组织时的常见问题是，支架外缘组织发育良好而中心部位不完善甚至坏死。目前公认的原因是，支架内外物质交换受限造成的，即孔结构不利于种子细胞向支架中心渗透，造成接种时细胞分布不均匀，也不利于氧、营养物质传输至支架中心及细胞代谢产物排出，造成支架内部的细胞因营养物质和氧供给不足而向营养物质和氧浓度较高的表面迁移，最终导致中心部位细胞数少和死亡。解决该问题的根本途径是获得类似天然骨结构的仿生支架。

一些研究表明，高连通性、高孔隙率的蜂窝状孔结构不仅具有高的强度，而且可促进支架内外营养成分和代谢产物的快速交换，实现种子细胞在整个支架中的均匀分布和高密度培养(Masuoka K，et al.J Biomed Mater Res，2005，75B：177～184和Hollister SJ.Nat Mater，2005，(4)：518～524)，在骨组织工程仿生支架制备中受到越来越多的关注。目前，已开发出几种构建蜂窝状孔结构多孔支架的技术，主要有：(1)在冷冻-干燥工艺中，通过产生温度梯度控制冰晶生长来实现；(2)间接快速成型法，即先制备柱形树脂‘负模’，然后用‘反向’法实现；(3)软刻蚀法，即在基质Si上加工成纵向孔隙的微图形，用作模子，制成相应图形的聚合物膜，经叠层获得管状孔；(4)平行排列钢丝或棉纤维模板法；(5)利用藻酸盐二价金属离子交联时产生规则管状孔的特性。其中，方法(1)应用最多，可获得呈单一取向、孔径大小均匀的蜂窝状支架，但管状孔连通性不够理想，而且仅适用于聚合物材料；其他方法分别由于尺寸精度低、可选材质种类受限、模板纤维布置困难和孔结构重现性差等问题，使应用受到很大限制。

近些年，利用天然生物组织制备仿生支架材料受到了很大重视。如国内专利ZL 200510057220.9通过溶剂和酶去除自然骨组织中有机的抗原性成分和细胞成分，可得到保留骨基质天然孔结构的无机多孔支架。但这种方法仍存在免疫原性和传染病风险，且力学性能通常较差。再如，以海星、海胆和乌贼等的微管状孔结构骨骼为模板也可以制备生物陶瓷基骨仿生支架(Rocha JHG，et al.Bone，2005，37：850～857)，该类支架虽然具有各向贯通的多孔结构，但其孔径仅有几十微米，实际应用受到很大限制。

最近几年，人们开始探索木材在生物医学领域尤其是骨修复中应用的可能性。木材是一种天然生物高分子组成的复合材料，具有独特的多级孔结构和优异的力学性能。其孔结构的基本特征是众多管状孔沿木材轴向平行排列，且管状孔间由孔径为几个至上百μm的纹孔实现高连通。根据木材种类不同，管状孔孔径大小范围为几个μm至mm级(成俊卿.木材学.北京：中国林业出版社，1985)，孔隙率范围为65～95％。

木材的多孔结构与自然松质骨结构十分相似，在骨修复再生中潜力很大。目前，已有将木材用作骨替代物的研究报道，如在以木材为模板制成的多孔Al₂O₃和SiC陶瓷上修饰生物活性材料涂层(Rambo CR，et al.Mater Sci Eng C，2006，26：92～99)，不仅具有与骨匹配的力学性能，还可赋予其良好的生物活性、骨传导性及成骨细胞相容性。但这种材料不可生物降解。最近，有研究者直接将热处理过的白桦木材用作骨替代物(Rekola J，et al.Acta Biomater，2009，5：1596～1604和Aho AJ，et al.J Biomed Mater Res Part B：Appl Biomater，2007，83B：64～71)，其多孔结构不仅可促进木材与骨间的结合，还具有很好的骨传导性。但是，木材本身不具有生物活性和骨诱导性，虽可生物降解，但其降解速度很慢。

我们曾直接用羟基磷灰石溶胶和45S5玻璃溶胶浸渍木材(Qian JM，et al.J Mater Sci：Mater Med，2008，19：3373～3383和Qian JM，et al.Mater Sci Eng C，2009，29：1361～1364)，经空气氧化去除模板和高温烧结，制成了木材结构形貌的羟基磷灰石和45S5玻璃支架。但由于是直接利用陶瓷或玻璃前驱体溶胶浸渍木材后进行热处理，所得支架强度不够理想。有研究者通过将金属钙蒸汽反应性渗入多孔木炭(松木和藤)中形成CaC₂，再经空气氧化成CaO、CO₂碳化成CaCO₃，最后与磷酸二氢钾水热反应形成羟基磷灰石(Tampieri A，et al.J Mater Chem，2009，19，4973～4980)，但该制备过程涉及多次高温气相反应，反应条件难于控制。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的骨组织工程仿生支架材料的制备方法，以克服现有骨组织工程支架材料制备方法的不足，以及由其造成的骨组织工程中普遍存在的支架外缘组织生长良好而内部坏死的现象。本发明的骨组织工程支架材料的制备方法，可制备出多孔结构和力学特性仿自然骨的支架材料，其突出特点是具有蜂窝状、高孔隙率的多孔结构，不仅可促进支架内外物质交换，而且具有生物相容性好、降解性能可控、力学性能理想和制备工艺相对简单等优点，可用于各种缺损骨组织的再生修复。

为达到上述目的，本发明采用的制备技术方案主要包括以下步骤：

(1)木材、藤类或秸秆类植物组织模板，在真空或惰性气体环境中以1～15℃/min的升温速度加热至400～650℃，碳化2～5小时，得到多孔碳；

(2)以硝酸钙、硝酸钠、有机烷基酯为原料，按摩尔比1～5∶0～4∶1～6配制无机溶胶，溶于乙醇和水混合溶剂中，浓度为0.5～2mol/L，在pH＝2～11的环境下合成固含量为10～40wt％的无机溶胶；

(3)将(1)得到的多孔碳放置于浸渍罐中，首先抽真空并保持0.5～3小时，加入(2)得到的无机溶胶后，将浸渍罐中压力用氮气、空气或氩气将罐内压力提高至5～10个大气压，并保持1～4小时，然后将浸渍溶胶的多孔碳置于真空干燥箱中，在30～110℃干燥5～12小时，进行凝胶化；该浸渍过程循环3～7次，使多孔碳中凝胶浸渍量达到100～400％，得到碳/凝胶复合物；

(4)将(3)得到的碳/凝胶复合物置于马弗炉中，在空气环境中以1～15℃/min的升温速度加热至400～600℃氧化2～6小时，去除模板后以10～30℃/min的升温速度加热至1000～1500℃烧结0.5～6小时，制得仿生骨多孔支架材料。

所说的植物模板的孔隙率为65～95％，孔径大小范围20～350μm。

所述的植物组织模板为泡桐、松木、紫藤或甘蔗。

所述的有机烷基酯为正硅酸乙酯、钛酸丁酯或磷酸三乙酯；所述的无机溶胶为羟基磷灰石溶胶、45S5玻璃溶胶、硅酸钙溶胶或钛酸钙溶胶。

本发明具有以下技术效果：

(1)很多植物组织具有与自然骨十分相似的多孔结构和力学特性，通过本发明的技术手段可将它们的多孔结构完整转移至无机生物材料，这种孔结构是现有骨组织工程支架制备方法无法得到的。

(2)本发明制得的无机生物材料仿生支架，由于只保留了植物独特的多孔结构，而不保留其中的有机成分(小分子和高分子)，使得支架材料具有类似自然骨的多孔结构和力学特性，在骨再生修复生长过程中可促进新骨生长，而且避免了植物中有机成分对细胞和再生组织的不利影响。

(3)本发明制得的多孔支架材料具有典型的相互连通的蜂窝状孔结构特点，既可实现种子细胞在支架内部的高密度种植与培养，又可促进工程化组织过程中支架内外部之间的物质交换，即能为内部细胞和组织及时提供营养成分，同时还能将代谢产物及时扩散出支架材料，适于较长骨缺损的再生修复。

(4)本发明制得的多孔支架材料为生物陶瓷、生物活性玻璃及其复合材料，如羟基磷灰石、45S5生物活性玻璃、硅酸钙、钛酸钙、羟基磷灰石/磷酸三钙双相陶瓷材料等，具有理想的生物相容性、生物可降解性、骨诱导性、骨传导性等性质，将恰当的材料组合与蜂窝状孔结构结合，可实现支架材料降解速度与力学性能的动态调节，赋予支架材料具有足够的机械强度和合适的生物降解速度，适用于承重骨缺损的修复再生。

(5)本发明的骨组织工程仿生支架材料的制备方法，具有植物模板易获得、成本较低、工艺相对简单、支架材料适用范围广等特点，可获得与自然骨多孔结构和力学行为均相似的骨仿生支架，解决了骨组织工程仿生支架材料制备的难题。

(6)本发明适用于各种原因造成的骨和牙等硬组织缺损的组织工程技术修复，具有广阔的临床应用前景。

附图说明

图1为由植物模板制备骨组织工程仿生支架材料的技术路线示意图。

图2为实施例1中由藤模板制成的羟基磷灰石仿生支架的微观形貌(SEM照片)。

图3为实施例2中由藤模板制成的45S5生物活性玻璃仿生支架的微观形貌(SEM照片)。

图4为实施例3中由甘蔗模板制成的45S5生物活性玻璃仿生支架的微观形貌(SEM照片)。

下面结合附图对本发明的内容作进一步详细说明。

具体实施方式

参照图1所示，该制备方法包括以下步骤：(1)以机械加工成一定形状的木材、藤类或秸秆类植物组织模板，如泡桐、松木、紫藤、甘蔗等，在真空或惰性气体环境中以1～15℃/min的升温速度加热至400～650℃，碳化2～5小时；(2)以硝酸钙、硝酸钠、正硅酸乙酯、钛酸丁酯、磷酸三乙酯等为原料，按目标产物化学组成配制混合物，溶于乙醇和水混合溶剂中，浓度为0.5～2mol/L，在pH2-11的环境下合成固含量为10～40wt％的羟基磷灰石溶胶、45S5玻璃溶胶、硅酸钙溶胶、钛酸钙溶胶等；(3)将(1)得到的多孔碳放置于浸渍罐中，首先抽真空并保持0.5～3小时，加入(2)得到的无机溶胶后，将浸渍罐中压力用氮气、空气或氩气等将罐内压力提高至5～10个大气压，并保持1～4小时，然后将浸渍溶胶的多孔碳置于真空干燥箱中，在30～110℃干燥5～12小时，进行凝胶化。该浸渍过程循环3～7次，使多孔碳中凝胶浸渍量达到100～400％；(4)将(3)得到的碳/凝胶复合物置于马弗炉中，在空气环境中以1～15℃/min的升温速度加热至400～600℃氧化2～6小时去除植物模板，最后以10～30℃/min的升温速度加热至1000～1500℃烧结0.5～6小时，制得仿生骨多孔支架材料。

参照图2所示，该多孔支架孔隙率为94％，孔径大小为10～220μm。其孔径分布为两峰分布形式，孔径较大的为平行排列的蜂窝状，孔径约为100～220μm；蜂窝状孔通过孔径为10～40μm的小孔连通，这两类孔分别源于植物模板的蜂窝状孔和蜂窝状孔间的纹孔。蜂窝状孔可促进液体中物质的扩散，即作为支架使用时的营养成分和代谢废物的交换，小孔利于细胞在支架上的粘附。

参照图3所示，该多孔支架孔隙率为89％，孔径大小为50～210μm。该支架的孔结构同样为双峰分布形式。其来源和作用同图2所述。

参照图4所示，该支架孔隙率为85％，孔径大小为30～220μm。该支架的孔结构为单峰分布形式。其来源和作用同图2和图3所述。

实施例1

(1)植物模板选取和成形：选取木本藤类植物紫藤为初始模板，其管状孔孔径为20～240μm，孔隙率为86％，经机械加成制成圆柱状块状材料；

(2)碳化：将(1)中块状材料置于真空电阻炉中，以5℃/min的升温速度加热至550℃，保温碳化3小时，得到保留模板外部几何形状和内部孔结构的多孔碳；

(3)溶胶制备与真空/压力浸渍：按照Ca/P摩尔比为1.67，量取相应量的硝酸钙和磷酸三乙酯，在盐酸催化作用下，在乙醇和水的混合溶剂中，室温制备固含量为20wt％的羟基磷灰石前驱体溶胶；室温陈化12小时后，采用真空/压力浸渍工艺浸渍多孔碳，具体如下：将多孔碳放置于浸渍罐中，先抽真空并保持1小时，加入溶胶后利用氮气将浸渍罐中压力提高至5个大气压，并保持2小时，然后将浸渍溶胶的多孔碳置于真空干燥箱中，在80℃干燥8个小时，实现凝胶化。该浸渍过程循环4次，使多孔碳中凝胶含量达到220wt％，获得碳/凝胶复合物；

(4)模板去除和高温烧结：将(3)中碳/凝胶复合物置于马弗炉中，以10℃/min的升温速度加热至500℃，保持4小时，氧化去除碳模板，随后以20℃/min的升温速度加热至1300℃，在此温度下烧结2小时，得到保持模板多孔结构和形状的羟基磷灰石仿生多孔支架材料。

实施例2

(1)植物模板选取和成形：与实施例1中(1)相同；

(2)碳化：将(1)中块状材料置于真空电阻炉中，以2℃/min的升温速度加热至500℃，保温碳化5小时，得到保留模板外部几何形状和内部孔结构的多孔碳；

(3)溶胶制备与真空/压力浸渍：按照组分SiO₂、P₂O₅、CaO和Na₂O的质量百分数分别为45wt％、6wt％、24.5wt％和24.5wt％，分别量取相应量的正硅酸乙酯、磷酸三乙酯、硝酸钙和硝酸钠，在柠檬酸催化作用下，在乙醇和水的混合溶剂中，室温制备固含量为30wt％的45S5生物活性玻璃前驱体溶胶；室温陈化24小时后，采用真空/压力浸渍工艺浸渍多孔碳，具体如下：将多孔碳放置于浸渍罐中，先抽真空并保持1小时，加入溶胶后利用氮气将浸渍罐中压力提高至10个大气压，并保持3小时，然后将浸渍溶胶的多孔碳置于真空干燥箱中，在100℃干燥5个小时，实现凝胶化。该浸渍过程循环5次，使多孔碳中凝胶含量达到260wt％，获得碳/凝胶复合物；

(4)模板去除和高温烧结：将(3)中碳/凝胶复合物置于马弗炉中，以5℃/min的升温速度加热至550℃，保持3小时，氧化去除碳模板，随后以20℃/min的升温速度加热至1050℃，在此温度下烧结1小时，得到保持模板多孔结构和形状的羟基磷灰石仿生多孔支架材料。

实施例3

(1)植物模板选取和成形：选取秸秆类植物甘蔗为初始模板，其管状孔孔径为60～290μm，孔隙率为88％，经机械加成制成圆柱状块状材料；

(2)碳化：将(1)中块状材料置于真空电阻炉中，以2℃/min的升温速度加热至520℃，保温碳化2.5小时，得到保留模板外部几何形状和内部孔结构的多孔碳；

(3)溶胶制备与真空/压力浸渍：采用与实施例2一样的工艺制备10wt％和30wt％两种固含量的45S5生物活性玻璃溶胶，进行真空/压力浸渍，具体如下：将多孔碳放置于浸渍罐中，先抽真空并保持1小时，加入10wt％的溶胶后利用氩气将浸渍罐中压力提高至3个大气压，并保持2.5小时，然后将浸渍溶胶的多孔碳置于真空干燥箱中，在100℃干燥4个小时，实现凝胶化。然后采用30wt％的溶胶再进行3个浸渍循环，采用使多孔碳中凝胶含量达到350wt％，获得碳/凝胶复合物；

(4)模板去除和高温烧结：将(3)中碳/凝胶复合物置于马弗炉中，以1℃/min的升温速度加热至550℃，保持4小时，氧化去除碳模板，随后以25℃/min的升温速度加热至1030℃，在此温度下烧结3小时，得到保持模板多孔结构和形状的45S5生物活性玻璃仿生多孔支架。

Claims

1.一种骨组织工程仿生支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利1所述的骨组织工程仿生支架材料的制备方法，其特征在于：所说的植物模板的孔隙率为65～95％，孔径大小范围20～350μm。

3.根据权利1所述的骨组织工程仿生支架材料的制备方法，其特征在于：所述的植物组织模板为泡桐、松木、紫藤或甘蔗。

4.根据权利1所述的骨组织工程仿生支架材料的制备方法，其特征在于：所述的有机烷基酯为正硅酸乙酯、钛酸丁酯或磷酸三乙酯；所述的无机溶胶为羟基磷灰石溶胶、45S5玻璃溶胶、硅酸钙溶胶或钛酸钙溶胶。