BR112018002448B1

BR112018002448B1 - Grandes arcabouços porosos 3d fabricados de hidroxiapatita ativa obtida por transformação biomórfica de estruturas naturais e processo para obter os mesmos

Info

Publication number: BR112018002448B1
Application number: BR112018002448-1A
Authority: BR
Inventors: Anna Tampieri; Simone Sprio; Andrea Ruffini
Original assignee: GreenBone Ortho S.r.l.
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2016-08-03
Publication date: 2021-10-13
Also published as: DK3331580T3; US11213605B2; ES2758357T3; MY185917A; CN108348637A; PL3331580T3; HUE046337T2; IL257241A; EA201890291A1; US20190008997A1; EP3590544B1; US20200276356A1; EP3590544A1; AU2016304431A1; EA035416B1; US10688218B2; US11357886B2; PH12018500272A1; IL257241B; CN108348637B

Abstract

a presente descrição se refere à hidroxiapatita obtida a partir de madeira porosa com uma resistência compressiva alta e dimensões apropriadas para aplicações clínicas. a madeira porosa apresenta uma porosidade entre 60% e 95%, sendo a referida porosidade medida depois de submeter a madeira a uma etapa de pirólise, e sendo selecionada de rattan, pinus, abacá balsa, sipo, carvalho, palisandro, bambus e madeira de nogueira. a hidroxiapatita pode ser substituída por um ou mais íons tais como, magnésio, estrôncio, silício, titânio, carbonato, potássio, sódio, prata, gálio, cobre, ferro, zinco, manganês, európio, gadolínio. também é revelado um substituto para o osso compreendendo hidroxiapatita obtida de madeira porosa. o substituto do osso é empregado para substituição e regeneração de um osso ou de uma porção óssea, preferivelmente para ossos submetidos às cargas mecânicas, tais como, ossos longos da perna e do braço, preferivelmente da tíbia, fíbula, fêmur, úmero e rádio. a invenção se refere também a um processo para fabricação de um arcabouço biomórfico de hidroxiapatita a partir de madeira.

Description

[001] A presente descrição se refere à hidroxiapatita obtida a partir de madeira porosa. Em particular, a presente descrição se refere a um arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtido a partir de madeira porosa para utilização como um substituto ósseo. A revelação se refere também a um processo para converter madeira em um arcabouço de hidroxiapatita biomórfica que pode ser usado como substituto ósseo.

ANTECEDENTES

[002] O processamento cerâmico atual e a engenharia se baseiam em uma sequência bem estabelecida de processos que permitem a produção de grandes corpos 3D. Mais especificamente, as fases cerâmicas inovadoras podem ser sintetizadas como pós, onde características específicas como estequiometria/substituição iônica, nano dimensão e atividade superficial são responsáveis por funcionalidades específicas. O processamento cerâmico atualmente utilizado para a obtenção de corpos cerâmicos 3D macroscópicos com forma e porosidade adequadas implica em tratamento térmico (sinterização) dos pós cerâmicos sintetizados adequadamente formados em um corpo 3-D (para consolidar o corpo). Todas essas etapas são necessárias para obter cerâmicas 3D com propriedades físicas e mecânicas adequadas, a maioria das quais são degradadas durante o processo cerâmico acima mencionado (particularmente o tratamento de sinterização). As graves limitações no desenvolvimento de material cerâmico funcional, associadas ao atual processo cerâmico, impedem novos progressos no campo. Hoje em dia, com a evolução da sociedade moderna, os produtos tecnológicos estão assumindo um papel cada vez maior na vida e na produtividade das pessoas, de modo que há uma forte necessidade de ferramentas inteligentes capazes de fornecer soluções para demandas complexas e personalizadas, em vários campos de aplicação, por exemplo, saúde, meio ambiente, energia. Por conseguinte, existe um amplo consenso de que são necessárias novas abordagens para a produção repetitiva e maciça de dispositivos macroscópicos com organização estrutural complexa em macro escala, mas, ao mesmo tempo, com uma estrutura complexa definida a nanoescala e até mesmo em escala cristal. Tais macro e nanoestruturas são relevantes para induzir efeitos funcionais não triviais, mas inteligentes.

[003] No que diz respeito às questões acima mencionadas em relação aos materiais cerâmicos, é necessária uma mudança paradigmática para desenvolver cerâmicas altamente ativas com micro e macroestruturas complexas.

[004] Os arcabouços ósseos, com foco especial na regeneração de grandes defeitos ósseos que sustentam carga, podem ser tomados como um exemplo representativo, uma vez que devem ser cerâmicas 3-D porosas com alta bioatividade, para poderem ser colonizadas por células e, em última instância, regeneradas como grandes defeitos ósseos. Na verdade, nenhuma solução adequada foi encontrada até a data para resolver essa necessidade clínica.

[005] Durante muitas décadas, a hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) foi reconhecida como o material principal para o arcabouço ósseo, pois se parece muito com a composição do mineral ósseo e demonstrou excelente biocompatibilidade e osteocondutividade. No entanto, a biomimética da hidroxiapatita está relacionada à nanométrica e à presença de íons múltiplos, substituindo parcialmente o cálcio e o fosfato na rede de apatita, que são a fonte da atividade biológica do osso durante a nova formação, remodelação e reabsorção de tecidos.

[006] A aplicação do tratamento de sinterização os arcabouços de hidroxiapatita ativa as reações superficiais e em massa na interface entre grãos de hidroxiapatita adjacentes que produzem ordenamento de cristais, com expulsão de íons estrangeiros da rede de apatita e coalescência de grãos até vários micrômetros, com redução da superfície específica, hidrofilicidade e afinidade com proteínas e células.

[007] A coalescência extensiva de grãos ativada pelo processo de sinterização produz consolidação de todo o corpo de hidroxiapatita através da redução da porosidade intergranular e, por sua vez, do volume total. Isso também gera tensões residuais que estão entre as principais fontes de defeitos estruturais nos materiais cerâmicos. De fato, a acomodação de tensões residuais em materiais cerâmicos é difícil devido à sua alta rigidez (em comparação com metais e polímeros) e está entre os fatores mais significativos que prejudicam o desempenho mecânico de materiais cerâmicos, particularmente no caso de grandes peças caracterizadas por formas e estruturas porosas e complexas, onde as variações de volume após ciclos de aquecimento/resfriamento provocam facilmente danos estruturais críticos.

[008] Em vista das razões acima mencionadas, o processo de síntese de cerâmica clássica não permite a fabricação de materiais cerâmicos, em particular hidroxiapatitas com composição biomimética e estrutura, alta bioatividade e reabsorção. Isto é especialmente verdadeiro quando cerâmicas 3D porosas e grandes são sintetizadas para a regeneração de defeitos ósseos de tamanho crítico (isto é, > 2 cm).

[009] A composição e a estrutura biomimética são de relevância fundamental para induzir a cascata regenerativa in vivo que pode determinar e promover de forma exclusiva a regeneração de grandes peças ósseas portadoras de carga, como os ossos longos dos membros. Esses fenômenos, que estão estreitamente interrelacionados e devem ocorrer em sinergia para ativar e sustentar a regeneração do osso com todas as suas funções, são: i) osteogênese rápida, osteocondução e osteointegração; ii) formação extensiva de vasos sanguíneos; iii) capacidade de bioreabsorção progressiva.

[010] Osteogênese e osteocondução rápidas permitem a formação extensiva de osso e a penetração no arcabouço, resultando, assim, em interface apertada de osso/arcabouço e osteointegração ótima. Para atingir esses efeitos, é necessária uma composição química semelhante ao osso, bem como uma porosidade aberta e interconectada, de modo que, além da extensa penetração do tecido ósseo novo, pode ser obtida uma formação simultânea de uma rede vascular que auxilia na formação e maturação do novo osso. A colonização incompleta do arcabouço pode resultar na formação de vazios, tecidos fibrosos ou áreas necróticas e reduzirá a força global e o desempenho biomecânico da construção do osso/arcabouço.

[011] Em tempos compatíveis com a nova formação óssea, o arcabouço deve ser resorvido progressivamente, para obter uma regeneração ideal do osso, após danos ou doenças. Todos os arcabouços ósseos 3D desenvolvidos até agora se baseiam em fosfatos de cálcio sintetizados que são materiais cristalinos que impedem a atividade dos osteoclastos, em comparação com as apatitas nanocristalinas, nanodimensionadas, apatitas substituídas com íon; portanto, embora os arcabouços porosos de hidroxiapatita do osso possam ser bem integrados no osso circundante por adesão superficial, a falta de bioreabsorção não permite o processo completo de remodelação, isto é, a substituição do arcabouço com o novo osso. Isso resulta em recuperação incompleta da capacidade funcional do osso doente, particularmente no caso de segmentos ósseos muito longos, que sustentam carga.

[012] Particularmente no caso de ossos longos e que sustentam carga, o arcabouço também deve exibir um desempenho mecânico adequado, mantendo uma macro porosidade aberta, o que é um desafio considerando que essas características são normalmente inversamente relacionadas (ou seja, quanto maior a porosidade, menor a resistência mecânica) e que é necessária uma elevada extensão de porosidade para proporcionar uma colonização e uma osteointegração de arcabouços adequadas. Este é um dos fatores mais relevantes que limitam a aplicação de arcabouços atuais na regeneração de porções extensas de ossos longos e que sustentam carga. A este respeito, os arcabouços com estruturas porosas hierarquicamente organizadas que podem exibir desempenho mecânico superior em comparação com materiais com porosidade similar, porém organizada aleatoriamente. A este respeito, apenas os arcabouços com essa estrutura organizada podem ativar eficientemente os processos de transdução mecânica no nível celular, provocando assim a regeneração de osso maduro, organizado e mecanicamente competente.

[013] A inovação proposta se baseia em uma mudança paradigmática do processo de síntese cerâmica clássica para uma nova forma de sinterização reativa que permite a geração de fases cerâmicas com composição química definida, organizada em um grande corpo 3D com morfologia complexa, estrutura hierárquica e, ao mesmo tempo, desempenho mecânico otimizado, a partir de estruturas naturais hierarquicamente organizadas. A este respeito, a transformação biomórfica é o fulcro desta abordagem inovadora que pode ser aplicada a estruturas naturais hierarquicamente organizadas (por exemplo, madeiras, plantas, exoesqueletos).

[014] A transformação biomecânica de estruturas lenhosas para cerâmica imitadora de osso foi tentada com sucesso utilizando madeiras com estruturas porosas, como madeiras de pinheiro e rattan, e madeiras mais densas, como carvalho vermelho e sipo, como modelos para reproduzir a estrutura e o desempenho mecânico do osso esponjoso e cortical, respectivamente. O uso de madeira na formação de arcabouços biomiméticos de hidroxiapatita foi relatado por Anna Tampieri e outros no Journal of Material Chemistry, 2009, 19, 4973-4980. Nesta publicação, Tampieri e outros descreve o processo de conversão de peças de 1 cm de comprimento (portanto, uma peça pequena, não adequada para a regeneração de defeitos de tamanho crítico) de madeira de rattan e madeira de pinus em hidroxiapatita. O processo envolveu a pirólise dos espécimes de madeira a uma temperatura de 1.000°C utilizando uma velocidade de aquecimento lenta, seguida de carburação em que o modelo de carbono foi transformado em carbeto de cálcio. A carburação foi conseguida por infiltração em fase líquida ou infiltração em fase de vapor. A infiltração de vapor foi realizada a temperaturas superiores ao ponto de ebulição do cálcio (1.484 °C). O processo de carburação envolveu o aquecimento inicial da madeira pirolizada a 800°C, seguido de aquecimento a 1.100°C e finalmente a 1.650°C durante 3 horas. Era necessário aquecer a madeira que passou por processo de pirólise a esta temperatura durante 3 horas para garantir que a reação fosse concluída. Após a carburação, o arcabouço de carbeto de cálcio tridimensional foi oxidado para transformar o carbeto de cálcio em óxido de cálcio, preservando a morfologia da madeira nativa. Após a oxidação, o arcabouço de óxido de cálcio tridimensional foi carbonado para transformar o arcabouço de óxido de cálcio em um arcabouço de carbonato de cálcio. Foram utilizados valores de alta pressão (2,2 MPa) para permitir a penetração de CO2 através da escala de formação de CaCO3, até o núcleo da estrutura de CaO. Finalmente, realizou-se uma etapa de fosfatização para transformar o arcabouço de carbonato de cálcio em um arcabouço de hidroxiapatita com uma morfologia anisotrópica hierarquicamente organizada, semelhante à da madeira nativa. Durante esta etapa, as placas de CaCO3 de derivados de madeira foram embebidas numa solução aquosa de KH2PO4 a uma temperatura de 200°C, sob uma pressão de 1,2 MPa durante 24 horas.

[015] O processo descrito acima produziu arcabouços cerâmicos de hidroxiapatita com a morfologia anisotrópica hierarquicamente organizada de madeira nativa. A resistência à compressão do arcabouço derivado da madeira pinus, medido na direção longitudinal variou entre 2,5 e 4 MPa, e na direção transversal, variou entre 0,5 e 1 MPa. Portanto, apenas os arcabouços de dimensão limitada, tipicamente de menos de 1 cm, podem ser obtidos pelo referido processo. Os valores baixos da resistência à compressão, também associados a um tamanho < 1 cm, tornam esses arcabouços não relevantes para a regeneração óssea, particularmente no caso de ossos que sustentam carga. Na verdade, é aceito que, para ser crítico, um defeito ósseo deve ter um comprimento de 2-3 vezes o diâmetro do osso afetado. Por isso, um arcabouço de 1 cm de tamanho não pode ser considerado útil a este respeito.

[016] A etapa de fosfatização mencionada acima na conversão de madeira em hidroxiapatita foi relatada com mais detalhes por Ruffini e outros em Chemical Engineering Journal 217 (2013) 150-158. Nesta publicação, foram utilizados modelos cilíndricos de carbonato de cálcio derivado de rattan com diâmetros de 8 mm e comprimentos de 10 mm como materiais de partida. O processo de fosfatização foi realizado utilizando soluções aquosas de hidrogenofosfato de diamônio, di-hidrogenofosfato de amônio e amônia.

[017] O pedido de patente WO 2012/063201, publicado em 18 de maio de 2012, descreve um substituto ósseo que compreende um núcleo, com base em hidroxiapatita obtido a partir de pelo menos uma madeira porosa e um invólucro à base de hidroxiapatita ou carbeto de silício obtido a partir de pelo menos uma madeira com uma porosidade menor do que pelo menos uma madeira do núcleo. A casca foi preparada numa forma cilíndrica oca adequada para acomodar o núcleo, que poderia ser preparado como um cilindro sólido que é inserido na cavidade da concha. O processo para obter o substituto ósseo da madeira também é descrito na aplicação. A primeira etapa é a pirólise de uma madeira nativa, como rattan ou pinus, por aquecimento a uma temperatura entre 800 e 2.000°C. A partir deste processo, obtém-se um material de carbono. Na segunda etapa, o material de carbono é transformado em carbeto de cálcio a uma temperatura entre 1.500 a 1.700°C. Em seguida, o carbeto de cálcio é oxidado a uma temperatura entre 900 e 1.000°C. Para converter o material de óxido de cálcio em carbonato de cálcio, a carbonação é realizada em uma autoclave a uma temperatura de 400°C com uma pressão de CO2 de 2,2 MPa durante 24 horas. O material de carbonato de cálcio é então transformado em hidroxiapatita parcialmente substituída com carbonato por fosfatização. Os arcabouços de hidroxiapatita resultantes derivados do rattantêm uma resistência à compressão entre 4 e 5 MPa na direção longitudinal e uma resistência à compressão de 1 MPa na direção transversal.

[018] Embora as publicações mencionadas acima descrevam a transformação bem sucedida da madeira, como o rattan e o pinus em hidroxiapatita, enquanto reproduzem de forma justa a morfologia tridimensional da madeira, os arcabouços que exibem características adequadas para a regeneração de segmentos longos de osso que sustenta carga não podem ser obtidas.

[019] De fato, todas as publicações mencionadas se referem aos arcabouços de hidroxiapatita obtidos a partir de madeira, com dimensões pequenas (isto é, um volume inferior a 1 cm3) que não podem ter aplicações clínicas reais, particularmente para a regeneração de grandes peças ósseas que sustentam carga. Os processos descritos na técnica anterior não são adequados para a fabricação de arcabouços de hidroxiapatita com dimensões que são convenientes para aplicações clínicas, tais como a regeneração de defeitos ósseos que sustentam carga de tamanho crítico, em que os grandes arcabouços, ou seja, com tamanho pelo menos igual a 2 cm, são precisos.

[020] Assim, continua a existir uma necessidade na arte para um arcabouço biomórfico, em particular um arcabouço 3D poroso, com uma composição química biomimética que exibe desempenho mecânico adequado, uma morfologia favorável à colonização celular e crescimento vascular e, ao mesmo tempo, apresentando dimensões adequadas para aplicações clínicas.

[021] Tal arcabouço biomórfico seria particularmente adequado para a regeneração óssea, em particular para implantação em defeitos ósseos que sustentam carga, como ossos longos dos membros (por exemplo, fêmur, tíbia, úmero, fíbula, rádio), mas também para a substituição e regeneração dos ossos da coluna vertebral (por exemplo, corpos vertebrais, disco intervertebral), partes do osso craniano ou partes ósseas maxilo-faciais. A presente revelação satisfaz as necessidades acima, fornecendo um arcabouço biomórfico, preferivelmente um arcabouço de hidroxiapatita particularmente adequado para substituição e regeneração óssea, em particular para substituição e regeneração de ossos que sustentam carga.

[022] A presente revelação satisfaz as necessidades acima também fornecendo um processo para a fabricação de um arcabouço biomórfico, preferivelmente um arcabouço biomórfico 3D. Em particular, o arcabouço biomórfico é um arcabouço de hidroxiapatita.

SUMÁRIO DA REVELAÇÃO

[023] Em geral, a presente descrição descreve um arcabouço de hidroxiapatita obtido a partir de uma madeira com uma porosidade total entre 60% e 95%, sendo a referida porosidade medida depois de submeter a madeira a uma etapa de pirólise, o arcabouço tendo um comprimento medido ao longo de uma direção, em que uma dimensão do arcabouço é máxima, maior ou igual a 2 cm.

[024] Mais particularmente, a presente revelação descreve um arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtido a partir de uma madeira com uma porosidade total entre 60% e 95% (a referida porosidade sendo medida depois de submeter a madeira a uma etapa de pirólise), sendo a referida hidroxiapatita caracterizada por um poro hierarquicamente organizado estrutura e uma resistência à compressão superior a 5 MPa, preferivelmente entre 10 MPa e 20 MPa, medida na direção ao longo dos poros do canal (direção longitudinal). Preferivelmente, a hidroxiapatita da revelação ilustra uma resistência à compressão ao longo da direção perpendicular do eixo longo dos canais (direção transversal) de até 10 MPa.

[025] Preferivelmente, o arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtido a partir da madeira possui uma estrutura de poros hierarquicamente organizada que decorre da estrutura de poros hierarquicamente organizada da madeira a partir da qual é obtida (madeira nativa). A presente descrição também se refere a um arcabouço de hidroxiapatita biomórfica derivada de madeira, em que a hidroxiapatita é parcialmente substituída (dopada) com um ou mais íons selecionados do grupo que compreende magnésio, estrôncio, silício, titânio, carbonato, sódio, potássio, gálio, prata, cobre, ferro, zinco, manganês, európio e gadolínio.

[026] A madeira a partir da qual a hidroxiapatita biomórfica é derivada tem uma porosidade total entre 60% e 95%, preferivelmente entre 65% e 85% (a referida porosidade sendo medida depois de submeter a madeira a uma etapa de pirólise). As madeiras que exibem porosidade dentro dessas faixas incluem rattan, pinus, madeira de abachi, balsa, sipo, carvalho, jacarandá, Kempas e madeira de nogueira. Preferivelmente, a hidroxiapatita biomórfica é obtida a partir de madeira de rattan.

[027] O arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtido a partir da madeira da revelação possui coesão estrutural e propriedades mecânicas que o tornam particularmente adequado para uso como substituto ósseo.

[028] Portanto, a presente revelação se refere ao uso do arcabouço de hidroxiapatita biomórfica como substituto ósseo, bem como a um substituto ósseo compreendendo o referido arcabouço de hidroxiapatita biomórfica. A revelação se refere também a um substituto ósseo que consiste no referido arcabouço de hidroxiapatita biomórfica.

[029] O arcabouço de hidroxiapatita biomórfica derivado da madeira pode ser usado como um substituto ósseo para regenerar um osso ou uma porção óssea, em particular ossos humanos e animais. Preferivelmente, o arcabouço de hidroxiapatita biomórfica derivado da madeira pode ser usado como um substituto ósseo para ossos ou porções ósseas que são submetidos a cargas mecânicas. Mais preferencialmente, os ossos ou porções ósseas são ossos longos da perna e do braço, como a tíbia, fíbula, fêmur, úmero e rádio.

[030] O arcabouço de hidroxiapatita biomórfica derivado da madeira também pode ser usado na substituição e/ou reconstrução de partes ósseas cranianas, partes ósseas maxilo-faciais e ossos da coluna vertebral (por exemplo, corpos vertebrais, disco intervertebral).

[031] O arcabouço de hidroxiapatita biomórfica da revelação também pode ser usado como um filtro para líquidos ou gases.

[032] A presente descrição também descreve um processo para a obtenção de um arcabouço de hidroxiapatita biomórfica derivado da madeira.

[033] Mais particularmente, a presente revelação descreve um processo para a produção de um arcabouço de hidroxiapatita biomórfica com um comprimento, medido ao longo de uma direção na qual uma dimensão do arcabouço é máxima, maior ou igual a 2 cm, que compreende as etapas de pirólise, carburação, oxidação, hidratação, carbonação e fosfatização de um pedaço de madeira (madeira nativa) com uma porosidade total de pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 40%, mais preferencialmente compreendida entre 60% e 95%, em que a referida porosidade é medida após sujeição da madeira à etapa da pirólise. Exemplos de madeira nativa que podem ser submetidos ao processo da invenção são: rattan, pinheiro, abachi, balsa, sipo, carvalho, jacarandá, Kempas e nogueira.

[034] Embora sejam reveladas múltiplas formas de realização, ainda outras formas de realização serão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição detalhada a seguir. Como será evidente, certas formas de realização, como reveladas no presente documento, são capazes de modificações em vários aspectos óbvios, todos sem se afastar da revelação. Consequentemente, os desenhos e a descrição detalhada devem ser considerados de natureza ilustrativa e não restritivos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[035] As figuras que se seguem ilustram formas de realização preferidas da matéria descrita no presente documento. O objeto reivindicado pode ser entendido por referência à descrição que se segue, em conjunto com as figuras anexas, nas quais:

[036] A Figura 1 ilustra uma forma de realização particular do arcabouço biomórfico que possui um canal central.

[037] A Figura 2 ilustra fotografias que descrevem tecidos de calvária de camundongos explantados após 8 semanas. A formação extensiva dos ossos e a penetração dos poros do arcabouço foram alcançadas de forma semelhante quando implantadas isoladamente ou com células estromais osteogênicas, onde a) representa madeira e sem células, b) representa hidroxiapatita e sem células, c) representa madeira e células e d) representa hidroxiapatita e células. As setas na Figura 2 f) apontam para os poros do tipo canal do arcabouço que imitam sistemas Haversianos. Os sistemas Haversianos ou ósteons são a unidade funcional do osso compacto, sob a forma de cilindros feitos de lamelas ósseas organizadas em camadas concêntricas. No meio dos ósteons existe um canal, contendo o nervo do osso e o suprimento de sangue.

[038] A Figura 3 ilustra uma curva tensão- deformação de um arcabouço biomórfico submetido a carga compressiva, em que y = estresse (N) e x = tensão (mm).

[039] A Figura 4 ilustra a distribuição do volume de poro interno da hidroxiapatita biomórfica da presente revelação em comparação com o volume de poros da hidroxiapatita hierarquicamente estruturada obtida com um método conhecido na técnica.

[040] A Figura 5 ilustra um gráfico que representa a viabilidade melhorada de células-tronco mesenquimais quando em contato com arcabouços compreendendo 2 e 5% molar de Sr, em comparação com um arcabouço isento de estrôncio (BC) após 24 horas, 48 horas, 72 horas, 7 dias e 14 dias, y = % em relação a BC.

[041] A Figura 6 ilustra gráficos que representam a expressão de genes relevantes para osteogênese, tais como (a) RUNX2 e (b) ALP em arcabouços contendo 2% molar (Sr2%- BC) e 5% molar (Sr5%-BC) de estrôncio, y = expressão de mudança de dobra em relação a BC e x = dias.

[042] A Figura 7 ilustra um gráfico que representa a viabilidade de osteoblastos quando em contato com arcabouços compreendendo 2% molar (Sr2% -BC) e 5% molar (Sr5% -BC) de Sr, em comparação com um arcabouço isento de estrôncio (BC) após 24 horas, 48 horas, 72 horas, 7 dias e 14 dias, y = % em relação a BC.

[043] A Figura 8 ilustra gráficos que representam a expressão de genes relevantes para osteogênese, tais como (a) Osterix, (b) BGlap e c) IBSP em arcabouços contendo 2% molar (Sr2% - BC) e 5% molar (Sr5% -B) de estrôncio, y = expressão de mudança de dobra em relação a CT e x = dias.

[044] A Figura 9 ilustra gráficos que representam a expressão de genes relevantes para osteoclastos, tais como (a) Osacr, (b) CTSK e c) Itg β3 em arcabouços contendo 2% molar (Sr2% -BC) e 5% molar (Sr5% BC) de estrôncio, y = expressão de mudança de dobra em relação a CT e x = dias. Uma diminuição significativa dos genes envolvidos nas principais vias moleculares dos osteoclastos ao longo do tempo pode ser vista; indicando assim que a presença de íons Sr2+ no arcabouço inibe a formação e atividade dos osteoclastos; na figura a) os dados de 14 dias estavam abaixo do limite de detecção.

[045] A Figura 10 ilustra uma comparação da distribuição de poros de dois arcabouços de carbeto de cálcio obtidos após a etapa de carburação da técnica anterior e a etapa de carburação da presente invenção, comparado ainda com a distribuição de poros da madeira pirolizada inicial. A área de superfície específica dos dois arcabouços de carbeto de cálcio também é relatada na figura;

[046] As figuras 11, 12 e 13, duas imagens superiores mostram imersões SEM de dois arcabouços de carbeto de cálcio obtidos com o processo da invenção e o processo da técnica anterior, respectivamente;

[047] Figura 13 - as duas imagens inferiors mostram uma comparação da dimensão dos grânulos de carbeto de cálcio;

[048] A Figura 14 ilustra uma comparação da fase de cristal dos dois arcabouços de carbeto de cálcio, medida com XR-XRD, obtida com o processo da invenção e o processo da técnica anterior, respectivamente.

[049] A Figura 15 ilustra imagens SEM do arcabouço de óxido de cálcio obtido após a etapa de oxidação da presente invenção e a etapa de oxidação da técnica anterior;

[050] A Figura 16 representa a distribuição de poros dos dois arcabouços de óxido de cálcio obtidos após a etapa de oxidação da presente invenção e a etapa de oxidação da técnica anterior, respectivamente;

[051] As Figuras 17 e 18 mostram imagens SEM do carbonato de cálcio obtidas após a etapa de carbonação de acordo com a presente invenção e a etapa de carbonação da técnica anterior, respectivamente;

[052] A Figura 19 ilustra que a distribuição de poros dos dois arcabouços de carbonato de cálcio obtidos após a etapa de carbonação de acordo com a presente invenção e a etapa de carbonação da técnica anterior, respectivamente;

[053] A Figura 20 ilustra a comparação entre a distribuição de poros do arcabouço biomórfico de hidroxiapatita final (após fosfatização) obtido com o processo de revelação e o arcabouço de hidroxiapatita biomórfica final da técnica anterior;

[054] A Figura 21 mostra o resultado obtido após submeter um pedaço de madeira de rattan com um comprimento, medido ao longo de uma direção em que uma dimensão do arcabouço é no máximo igual ou superior a 2 cm, às etapas do processo de acordo com as condições descritas na técnica anterior: mesmo antes da etapa de fosfatização, o arcabouço pode ser rompido;

[055] A Figura 22 ilustra o resultado obtido após submeter um pedaço de madeira de rattan com um comprimento, medido ao longo de uma direção na qual uma dimensão do arcabouço é máxima, igual ou superior a 2 cm, às etapas do processo de acordo com as condições descritas no anterior arte: mesmo que o arcabouço sobreviva às etapas do processo até a fosfatização, após a fosfatização, o arcabouço falha;

[056] A Figura 23 ilustra a quantificação relativa (2-ΔΔCt) da expressão gênica em relação à expressão do arcabouço não dopado da técnica anterior usado como calibrador, após 14 dias de imMSCs 3D cultivado em condição dinâmica com todas as amostras testadas;

[057] A Figura 24 ilustra uma forma de realização do arcabouço biomórfico com forma cuboide.

[058] A Figura 25 ilustra que a estrutura semelhante ao canal do arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtida com o processo da presente revelação é caracterizada de forma exclusiva por canais grandes permeáveis (100 a 300 micra de diâmetro) (microcopiografia). Tais canais permitem à formação de vasos sanguíneos adequados que suportam a regeneração óssea.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA REVELAÇÃO

[059] Tal como utilizado na presente descrição e nas reivindicações anexas, "estrutura de poros organizada hierarquicamente" indica um material que possui uma estrutura de poro tridimensional anisotrópica na qual os poros do canal são interligados através de canais transversais e em que micro e nanoporos estão presentes na área que circunda os poros do canal.

[060] Conforme usado na presente descrição e nas reivindicações anexas, os valores de "resistência à compressão" são obtidos com o método fornecido na descrição a seguir, exercendo forças mecânicas ao longo das direções longitudinal e transversal, em relação aos poros do canal.

[061] Conforme usado na presente descrição e nas reivindicações anexas, "defeito ósseo"se refere a uma parte ou porção do osso ou ao osso inteiro que está faltando e precisa ser totalmente substituída pelo arcabouço da revelação.

[062] Tal como usado na presente descrição, "hidroxiapatita biomórfica"se refere a um material que: 1) consiste em hidroxiapatita ou 2) compreende hidroxiapatita ou 3) é um material que compreende ou consiste em hidroxiapatita e fosfato tricálcico. Caso o material consista em hidroxiapatita e fosfato tricálcico, o material é um material bifásico. Numa forma de realização da invenção, quando a "hidroxiapatita biomórfica" é um material que compreende ou consiste em hidroxiapatita e fosfato tricálcico, a hidroxiapatita é dopada com um ou mais íons escolhidos no grupo que consiste em magnésio, estrôncio, silício, titânio, carbonato, potássio, sódio, prata, gálio, cobre, ferro, zinco, manganês, európio, gadolínio e suas misturas.

[063] Os inventores do presente Pedido de Patente descobriram surpreendentemente que é possível obter um arcabouço de hidroxiapatita biomórfica de madeira que exibe uma composição química biomimética, um desempenho mecânico adequado, uma morfologia favorável à colonização celular e crescimento vascular e, ao mesmo tempo, com dimensões adequadas para aplicações clínicas.

[064] Num primeiro aspecto, a presente descrição descreve um arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtido a partir de uma madeira com uma porosidade total de pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 40%, mais preferencialmente compreendida entre 60% e 95%, em que a referida porosidade é medida após sujeição da madeira à etapa da pirólise, o arcabouço tendo um comprimento, medido ao longo de uma direção na qual uma dimensão do arcabouço é máxima, maior ou igual a 2 cm.

[065] A total porosidade total do arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtida após o processo de revelação é a mesma que a porosidade total da madeira de partida medida depois de submeter a madeira à etapa da pirólise. Em particular, a porosidade total do arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtida após o processo de revelação é pelo menos de 20%, preferivelmente pelo menos 40%, mais preferencialmente compreendida entre 60% e 95%.

[066] Preferivelmente, o arcabouço tem um comprimento, medido ao longo de uma direção em que uma dimensão do arcabouço é máxima, que é maior ou igual a 2 cm e atinge um valor final que é determinado de acordo com a aplicação clínica. Por exemplo, no caso da substituição óssea de ossos longos, como a tíbia, o fêmur, a fíbula, o úmero, o rádio, o comprimento do arcabouço, medido ao longo de uma direção na qual uma dimensão do arcabouço é máxima, pode ser compreendida entre 2 e 20 cm.

[067] Preferivelmente, o arcabouço da descrição tem uma resistência à compressão medida na direção longitudinal superior a 5 MPa, preferivelmente entre 10 MPa e 20 MPa.

[068] Preferivelmente, o arcabouço da descrição ilustra uma resistência à compressão ao longo da direção transversal de até 10 MPa.

[069] Preferivelmente, o arcabouço de hidroxiapatita biomórfica caracteriza-se por uma estrutura de poros hierarquicamente organizada.

[070] A "estrutura de poros hierárquica"ou "estrutura de poro hierarquicamente organizada" do arcabouço de hidroxiapatita da revelação deriva da estrutura hierárquica tridimensional complexa da madeira de partida a partir da qual o arcabouço é obtido e, portanto, tem uma faixa de poros de tamanho diferente. Os poros de tamanho diferente na estrutura hierárquica se tornam desejáveis para uso como um substituto ósseo. Por exemplo, poros com diâmetro > 200 μm, preferivelmente entre 150-300 μm, mais preferencialmente 200-300 μm permitirão colonização e proliferação de células e a formação de uma árvore de vascularização apropriada. Poros com um diâmetro <10 μm, preferivelmente <1 μm, mais preferencialmente entre 0,01 e 0,1 μm (micro e nanoporos), que interligam parcialmente os poros do canal, permitem a troca de fluidos nutrientes e a descarga dos resíduos de células da célula metabolismo. A preservação da estrutura de poros hierárquicos da madeira na hidroxiapatita, proporciona estruturas com características mecânicas ótimas e permite a descarga eficiente de cargas mecânicas.

[071] Como a hidroxiapatita obtida da madeira reproduz a estrutura de um material natural em detalhes, pode ser assim referida como sendo biomórfica.

[072] Em particular, a estrutura de poros hierarquicamente organizada do arcabouço da descrição inclui entre 30% e 80% (da porosidade total) de poros com um diâmetro inferior a 150 μm, o restante para 100% da porosidade total sendo poros com diâmetro maior que 150 μm.

[073] Numa forma de realização, preferivelmente quando a madeira de partida é rattan, entre 30% e 60% da porosidade total do arcabouço é devido a poros com um diâmetro < 10 μm.

[074] Numa forma de realização, preferivelmente quando a madeira de partida é rattan, pelo menos 25% da porosidade total, preferivelmente entre 25% e 50% da porosidade total do arcabouço de hidroxiapatita se deve aos poros com um diâmetro < 1 μm, preferivelmente < 0,1 μm, em particular entre 0,01 e 0,1 μm.

[075] Numa forma de realização, preferivelmente quando a madeira de partida é de rattan, pelo menos 20% da porosidade total do arcabouço de hidroxiapatita se deve aos poros que têm diâmetro > 150 μm.

[076] Preferivelmente, o arcabouço de hidroxiapatita tem uma área de superfície específica (SSA) > 9 m2/g, preferivelmente de 9 a 20 m2/g.

[077] A madeira utilizada para obter o arcabouço de hidroxiapatita pode ser qualquer madeira com uma porosidade total de pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 40%, mais preferencialmente compreendida entre 60% e 95%, ainda mais preferencialmente uma porosidade entre 65% e 85% (a referida porosidade é medida após submeter a madeira a uma etapa de pirólise).

[078] Exemplos de madeiras adequadas utilizadas para obter a hidroxiapatita incluem rattan, pinheiro, abachi, balsa, sipo, carvalho, jacarandá, Kempas e madeira de nogueira, preferivelmente a madeira utilizada é madeira de rattan.

[079] O arcabouço de hidroxiapatita obtido a partir de madeira pode compreender hidroxiapatita que é parcialmente substituída com um ou mais íons. Exemplos de tais íons são carbonato, magnésio, estrôncio, silício, titânio, sódio, potássio, prata, gálio, cobre, ferro, zinco, manganês, európio e gadolínio. A introdução de carbonato no local de fosfato aumenta a biosolubilidade e aumenta a afinidade superficial para células de osteoblasto.

[080] A introdução do magnésio proporciona uma capacidade aprimorada de aposição e formação de osso novo. A introdução do estrôncio auxilia no restabelecimento da produção óssea, afetada por doenças metabólicas, como a osteoporose, de modo que sua presença pode aumentar a regeneração óssea.

[081] A introdução de prata, gálio, cobre e zinco fornece propriedades antibacterianas. Quando o arcabouço de hidroxiapatita obtido a partir de madeira compreende hidroxiapatita que é parcialmente substituída com um ou mais íons, o arcabouço é um material que compreende ou consiste em hidroxiapatita dopada e fosfato tricálcico. De acordo com uma outra forma de realização, o arcabouço de hidroxiapatita biomórfica da presente revelação pode compreender: - 0-15% em peso de magnésio, preferivelmente 1 a 10% em peso; e/ou - 0-15% em peso de carbonato, preferivelmente 1 a 10% em peso; e/ou - 0-15% em peso de estrôncio, preferivelmente 1 a 10% em peso; e/ou - 0-20% em peso de titânio, preferivelmente 1 a 10% em peso; e/ou - 0-15% em peso de potássio, preferivelmente 1 a 10% em peso; e/ou - 0-15% em peso de sódio, preferivelmente 1 a 10% em peso; e/ou - 0-15% em peso de silício, preferivelmente 1 a 10% em peso e/ou; - 0-15% em peso de prata, preferivelmente 1 a 10% em peso e/ou; - 0-15% em peso de gálio, preferivelmente 1 a 10% em peso e/ou; - 0-15% em peso de cobre, preferivelmente 1 a 10% em peso e/ou; - 0 a 30% em peso de ferro, preferivelmente 1 a 10% em peso; e/ou - 0-15% em peso de zinco, preferivelmente 1 a 10% em peso e/ou ; - 0-15% em peso de manganês, preferivelmente 1 a 10% em peso e/ou; - 0-15% em peso de európio, preferivelmente 1 a 10% em peso e/ou; - 0-15% em peso de gadolínio, preferivelmente 1 a 10% em peso e/ou.

[082] O arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtido a partir de madeira de acordo com a presente revelação possui características de bioatividade e bioreabsorção combinadas com características de resistência mecânica e dimensões que o tornam particularmente adequado para uso clínico como substituto ósseo, em particular em humanos e animais. Tal substituto ósseo pode ser usado para substituir e/ou reconstruir e/ou regenerar ossos, porções ósseas ou defeitos ósseos. Por exemplo, o substituto ósseo pode ser usado para substituir ou regenerar ossos ou porções ósseas sujeitos a cargas mecânicas. Por exemplo, o substituto ósseo pode ser usado para substituir ou regenerar os ossos longos dos braços e pernas. Tais ossos longos podem incluir a tíbia, fêmur, fíbula, úmero, rádio, etc.

[083] O substituto ósseo também pode ser usado na substituição e/ou reconstrução de partes ósseas cranianas, partes ósseas maxilo-faciais e ossos da coluna vertebral, por exemplo, corpos vertebrais, disco intervertebral) e nos procedimentos cirúrgicos de fusão vertebral.

[084] Quando usado como um substituto ósseo, o arcabouço de hidroxiapatita biomórfica pode ter uma forma que se adapta à forma do defeito ósseo que precisa ser reconstruído de forma a preencher substancialmente qualquer fenda óssea. Portanto, o arcabouço e o substituto ósseo da revelação podem ter qualquer forma que seja adequada para a reconstrução e regeneração de defeitos ósseos ou para substituir qualquer parte faltante do osso.

[085] Por exemplo, o arcabouço ou o substituto ósseo da presente revelação pode assumir a forma de um cilindro, prisma direito ou cuboide, ou cunhas. Numa forma de realização, o arcabouço ou o substituto ósseo compreende um canal central com um diâmetro entre cerca de 20% a cerca de 60% do diâmetro do arcabouço ou o substituto ósseo. Em particular, o arcabouço ou o substituto ósseo tem uma forma tubular. Numa forma de realização, a presente descrição se refere ainda a um arcabouço ou a um substituto ósseo com um prisma cilíndrico, prisma direito, cuboide ou forma tubular, tendo uma altura maior ou igual a 2 cm.

[086] Numa forma de realização da presente descrição, o arcabouço ou o substituto ósseo pode ser revestido com uma camada fina com base em hidroxiapatita e/ou colágeno para aumentar a adesão e proliferação celular e, assim, a osteointegração no tecido ósseo circundante. A camada pode compreender adicionalmente hidroxiapatita substituída com um ou mais íons relevantes para a estimulação da regeneração óssea, tais como carbonato, magnésio, silício, potássio, sódio e estrôncio, ou com efeito antibacteriano, como gálio, prata, cobre ou zinco.

[087] Numa outra forma de realização da presente descrição, o arcabouço ou o substituto ósseo podem ser embebidos em um polímero natural (escolhido entre o grupo que compreende gelatina, colágeno, alginato, quitosano, gelano, celulose) para aumentar ainda mais as propriedades mecânicas e promover ainda mais a adesão celular.

[088] Para o arcabouço ou células substitutas ósseas, plasma rico em plaquetas, anticorpos, proteínas de fatores de crescimento, fragmentos de DNA, RNAm, RNasi podem ser adicionados para ajudar a adesão celular.

[089] Também podem ser adicionados medicamentos, como antibióticos ou fármacos anticancerígenos, ao arcabouço ou ao substituto ósseo.

[090] A revelação se refere também a um método de reconstrução e/ou regeneração de um osso humano ou animal com um defeito ósseo, compreendendo as etapas de: - proporcionar um substituto ósseo compreendendo ou consistindo no arcabouço de hidroxiapatita biomórfica da descrição tendo uma forma que corresponde à forma de um defeito ósseo; - implantação do substituto ósseo no defeito ósseo do paciente.

[091] Preferivelmente, o método de reconstrução e/ou regeneração inclui as etapas de fornecer um modelo 3D do defeito ósseo e, com base no modelo 3D obtido, conferindo ao arcabouço uma forma correspondente à forma do defeito ósseo. A etapa de conferir uma forma ao arcabouço pode ser aplicada ao pedaço inicial de madeira ou ao arcabouço de hidroxiapatita obtido no final do processo de transformação da descrição ou ao arcabouço obtido após cada etapa do processo (por exemplo, após a etapa carbonação). Preferivelmente, a etapa de transmitir a forma é aplicada ao pedaço de madeira inicial.

[092] O arcabouço de hidroxiapatita biomórfica da revelação e o arcabouço de hidroxiapatita biomórfica parcialmente substituído com um ou mais íons é obtido a partir de um processo de transformação de várias etapas que compreende as etapas a seguir.

[093] 1) Pirólise: uma madeira nativa é aquecida a uma temperatura na faixa de 600°C a 1.000°C sob uma atmosfera inerte para permitir a decomposição e a eliminação de todas as substâncias orgânicas. A partir desse processo, obtém-se um modelo de carbono.

[094] 2) Carburação: o modelo de carbono é infiltrado com cálcio no estado do vapor a uma temperatura na faixa de 900 a 1.200°C e a uma pressão < 1.000 mbar, preferivelmente < 600 mbar, mais preferencialmente na faixa de 0,05 a 100 mbar, assim transformando o modelo de carbono em carbeto de cálcio (CaC2).

[095] 3) Oxidação: o modelo de carbeto de cálcio é aquecido no ar a uma temperatura na faixa de 750 a 1300°C, preferivelmente 1000-1200°C, permitindo assim a transformação do carbeto de cálcio em óxido de cálcio (CaO).

[096] 4) Hidratação: o modelo de óxido de cálcio é exposto à água, permitindo assim a absorção de água numa quantidade de 1 a 25% molar, preferivelmente 5-15% em peso.

[097] 5) Carbonação: o modelo de óxido de cálcio é transformado em carbonato de cálcio por aquecimento a uma temperatura na faixa de 500 a 900°C, preferivelmente a uma temperatura na faixa de 750 a 850°C sob uma pressão de CO2, ou uma mistura de CO2 e uma pressão de gás inerte (por exemplo, argônio, nitrogênio). A faixa de pressão é de 4 a 20 MPa.

[098] 6) Fosfatização: o modelo de carbonato de cálcio é tratado com pelo menos um sal fosfato.

[099] Na etapa de pirólise 1) do processo de várias etapas, a madeira nativa é preferencialmente selecionada entre rattan, pinheiro, abachi, balsa, carvalho, jacarandá, Kempas e madeira de nogueira. Mais preferencialmente, a madeira nativa é madeira de rattan.

[0100] A madeira nativa tem uma porosidade total de pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 40%, mais preferencialmente compreendida entre 60% e 95%, em que a referida porosidade é medida após submeter a madeira à etapa de pirólise.

[0101] Antes da etapa de pirólise 1), a madeira nativa de partida pode ser opcionalmente seca a uma temperatura entre 50°C e 90°C, preferivelmente a uma temperatura entre 60°C e 80°C, mais preferencialmente a uma temperatura entre 65°C e 75°C. A madeira nativa pode ser seca por mais de 6 horas, preferivelmente por mais de 12 horas, preferivelmente por mais de 18 horas, preferivelmente por um período compreendido entre 20 e 30 horas.

[0102] Na etapa de pirólise do processo de várias etapas, a atmosfera inerte pode ser uma atmosfera de um gás selecionado do grupo que compreende nitrogênio e argônio.

[0103] Na etapa de pirólise do processo de várias etapas, a madeira nativa pode ser aquecida a uma temperatura entre 600°C a 1.000°C, preferivelmente a uma temperatura entre 800°C e 1.000°C. A etapa de pirólise pode durar mais de 6 horas, preferivelmente mais de 12 horas, preferivelmente mais de 18 horas, preferivelmente o referida etapa pode durar um tempo compreendido entre 20 e 30 horas.

[0104] O ciclo térmico da etapa de pirólise 1) pode ser realizado por aquecimento da madeira nativa a uma taxa não superior a 5° C/min., preferivelmente não superior a 3°C/min. e por arrefecimento a uma velocidade não superior a 3°C/min., preferivelmente não superior a 2°C/min., para evitar a formação de fissuras e a fratura interna do material.

[0105] Antes da etapa de pirólise 1), o método de múltiplas etapas pode compreender adicionalmente uma etapa i) de seleção e preparação da madeira nativa, em que a referida madeira nativa pode ser cortada em uma peça com uma forma correspondente à forma de um defeito ósseo a ser reconstruído. Em particular, a madeira nativa é moldada em um pedaço de madeira com um comprimento, medido ao longo de uma direção em que uma dimensão da madeira é máxima, que é maior ou igual a 2 cm. Preferivelmente, a dimensão da madeira atinge um valor final que é determinado de acordo com a aplicação clínica.

[0106] Por exemplo, a madeira nativa pode ser moldada na forma de um cilindro, prisma direito ou cuboide. A madeira nativa também pode ser moldada de modo a compreender um canal central com um diâmetro entre cerca de 20% a cerca de 60% do diâmetro do pedaço de madeira. Em particular, a madeira nativa pode ser cortada em forma tubular. Preferivelmente, a etapa i) de seleção e preparação da madeira nativa, compreende as etapas de: fornecer um modelo 3D de um defeito ósseo e, com base no modelo 3D obtido, transmitir à madeira nativa uma forma correspondente à forma do defeito ósseo. A etapa de conferir uma forma à madeira nativa pode ser aplicada à madeira nativa inicial ou ao arcabouço de hidroxiapatita obtido no final do processo de transformação em várias etapas. Preferivelmente, a etapa de conferir a forma é aplicada na madeira nativa inicial para evitar danos (fratura) internos e externos do arcabouço.

[0107] Na etapa de carburação 2) do processo de várias etapas, a reação é preferivelmente realizada com uma razão molar Ca/C (no início da reação) na faixa de 1,10 a 2,50, preferivelmente na faixa de 1,50 a 2,00. A razão molar de Ca/C é importante porque as proporções abaixo do intervalo conduzem a reações incompletas e proporções acima do intervalo levam à obstrução dos poros por resíduos de Ca. Na etapa de carburação do processo de várias etapas, o modelo de carbono é aquecido a uma taxa de aquecimento na faixa de 1 a 10°C/min., preferivelmente a uma taxa de aquecimento na faixa de 1 a 7°C/min.

[0108] Os inventores do presente Pedido de Patente descobriram surpreendentemente que a realização da etapa de carburação a uma pressão reduzida como descrito acima é uma vantagem para a aplicação bem sucedida das etapas subsequentes do processo, particularmente quando um grande arcabouço biomórfico precisa ser produzido.

[0109] De fato, utilizando as condições de pressão acima descritas, a evaporação do cálcio pode ocorrer a temperaturas que são cerca de 400-500°C inferiores ao ponto de ebulição do cálcio na atmosfera ambiente (isto é, 1.484°C), produzindo, de forma inesperada, a transformação completa da madeira pirolizada em carbeto de cálcio a uma temperatura muito inferior a qualquer outro processo conhecido na técnica. Em particular, o uso de pressão na faixa de 0,5-600 mbar, ou preferivelmente de 0,05 a 100 mbar, resulta em uma transformação substancialmente completa da madeira pirolizada em carbeto de cálcio.

[0110] Uma transformação substancialmente completa da madeira pirolizada em carbeto de cálcio resultará numa vantagem para os rendimentos das etapas de transformação subsequentes.

[0111] As condições de carburação da presente revelação também melhoram a preservação dos micro e nanoporos com diâmetros < 1 μm (preferivelmente de 0,01 a 0,1 μm) da madeira nativa tanto no arcabouço após a carburação quanto no arcabouço biomórfico final, com respeito para os arcabouços conhecidos obtidos a partir de madeira usando processos conhecidos.

[0112] A fase de carburação é uma etapa crítico no processo porque uma boa preservação da micro e nanoporosidade após esta etapa assegurará que o arcabouço biomórfico final exiba nano/microporosidade similar. A presença de uma alta porcentagem de micro e nanoporos bem interconectados no arcabouço biomórfico final permite a troca de fluidos nutrientes e a descarga dos produtos de resíduos do metabolismo celular.

[0113] Além de melhorar a preservação dos micro e nanoporos com diâmetros < 1 μm, as condições de carburação descritas no presente documento produzem um arcabouço após a carburação (e também um arcabouço biomórfico final) com área superficial específica (SSA) de 9 a 20 m2/g. Essa área de superfície específica é aproximadamente 2 vezes maior do que a SSA de um arcabouço obtido com um processo conhecido na técnica - que é de cerca de 5-6 m2/g (vide exemplo comparativo 4 e figuras 10-13).

[0114] As condições de carburação da presente descrição também produzem um invólucro de carbeto de cálcio poroso contendo grãos de carbeto de cálcio que são menores do que os grãos de um arcabouço obtidos com um processo conhecido (vide exemplo comparativo 4 e figura 13).

[0115] Os exemplos comparativos mostram que as dimensões dos grãos de carbeto de cálcio no arcabouço após a carburação de acordo com a presente descrição são cerca de 5-15 μm (preferivelmente cerca de 10 μm), enquanto as dimensões de cristal do arcabouço após a carburação obtida com processos conhecidos é cerca de 100 μm.

[0116] Os inventores do presente Pedido de Patente descobriram surpreendentemente que a área de superfície específica mais elevada (SSA) e a dimensão menor dos grãos que são obtidos com as condições de carburação descritas acima e que não podem ser obtidas por métodos anteriormente divulgados são importantes para garantir alto rendimento de transformação da madeira nativa após cada etapa do processo.

[0117] O exemplo comparativo 4 e a figura 14 também mostram que o arcabouço após a carburação de acordo com a presente descrição contém carbeto de cálcio com uma mistura de rede cristalina tetragonal e cúbica, enquanto que o arcabouço obtido com processos conhecidos contém carbeto de cálcio apenas com uma rede cristalina tetragonal. Uma vez que o óxido de cálcio tem apenas uma estrutura de cristal cúbico, a transformação de um carbeto de cálcio, que está parcialmente em forma cúbica, em óxido de cálcio, pode ocorrer com menor risco de gerar microfraturas no arcabouço. Isso é extremamente vantajoso para a qualidade do arcabouço biomórfico final. Portanto, as condições empregadas na etapa de carburação reduzem fortemente o número de defeitos que podem ser observados na estrutura de poros hierárquicos do carbeto de cálcio.

[0118] Além disso, as baixas temperaturas empregadas na revelação atual (ou seja, bem abaixo de 1.500°C) impedem a coalescência de grãos e a consolidação excessiva do carbeto de cálcio, o que provoca distorção estrutural e desvios da microestrutura original da madeira de partida, prejudicando assim o resultado das etapas do processo que se seguem.

[0119] Na etapa de oxidação 3) do processo de várias etapas, o modelo de carbeto de cálcio pode ser aquecido até uma temperatura final na faixa de 800 a 1.300°C, preferivelmente a uma temperatura final na faixa de 1.000 a 1.200°C. Na etapa de oxidação, o modelo de carbeto de cálcio pode ser aquecido a uma taxa de aquecimento na faixa de 1 a 15°C/min., preferivelmente a uma taxa de aquecimento na faixa de 1 a 7°C/min. A oxidação do carbeto de cálcio obtido em pressão de acordo com a etapa de carburação descrita acima conduz a um arcabouço de óxido de cálcio com maior área de superfície específica (SSA) e uma porosidade com uma fração de micro e nanoporos maior em relação aos arcabouços obtidos com os processos conhecidos (vide exemplo comparativo 4 e Figura 16). O experimento comparativo ilustra que a micro e a nanoporosidade são conservadas também após a etapa de oxidação.

[0120] Na etapa de hidratação 4) do processo de várias etapas, o modelo de óxido de cálcio é exposto à água, permitindo assim a captação de água numa quantidade preferencialmente compreendida na faixa de 1 a 25% molar, mais preferencialmente compreendida na faixa de 5 a 15 mol por cento. Esta etapa leva à formação de óxido de cálcio hidratado contendo hidróxido de cálcio em quantidade <50% em peso da estrutura 3D, que catalisa a subsequente carbonação de CaO. A quantidade de hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) como produto intermediário deve ser rigorosamente controlada para evitar o colapso da estrutura em 3D. As condições de hidratação descritas nos presente documentos permitem manter a quantidade de hidróxido de cálcio <50%.

[0121] Numa forma de realização preferida, a etapa de hidratação é conduzida ao mesmo tempo que a etapa de carbonação, por exemplo utilizando CO2 enriquecido com água.

[0122] Na etapa de carbonação 5) do processo de várias etapas, o uso de alta temperatura enquanto se aumenta progressivamente a pressão de CO2 no sistema até os valores indicados acima, permite surpreendentemente a conversão substancialmente completa de óxido de cálcio hidratado em um modelo de carbonato de cálcio que exibe surpreendentemente alta coesão e resistência mecânica. A etapa de carbonação do processo de múltiplas etapas pode ser realizado de acordo com um dos ciclos térmicos que se seguem: - a uma pressão de CO2 constante de cerca de 10-15 MPa, aumentando lentamente a temperatura a um valor na faixa de cerca de 750-850°C, preferivelmente a cerca de 800°C; - a uma temperatura constante de cerca de 750-850°C (ou cerca de 700-800°C), preferivelmente a cerca de 800°C aumentando a pressão até cerca de 10-15 MPa; - manter a pressão a cerca de 4-6 MPa enquanto eleva a temperatura até cerca de 750-850°C (ou cerca de 700-800°C), preferivelmente até cerca de 800°C e subsequentemente aumentando a pressão até cerca de 10-15 MPa.

[0123] O processo de carbonação ocorre através da formação de intermediários reativos, como o hidróxido de cálcio. Isso leva a um carbonato de cálcio final caracterizado por uma estrutura de grão fino substancialmente livre de qualquer grande cristal cúbico de carbonato de cálcio (> 10 μm), o que pode comprometer a integridade estrutural da estrutura 3D. O exemplo comparativo 4 e as Figuras 17-18 mostram que, graças à aplicação de uma etapa de hidratação, após a etapa de carbonação é obtida uma estrutura de grão fino, em comparação com a estrutura 3D intermediária que é obtida com os processos conhecidos na técnica.

[0124] A etapa de carbonação realizada nas condições descritas acima resulta em propriedades mecânicas superiores do arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtida pelo processo da descrição quando comparada a processos similares conhecidos na técnica, em que a etapa de carbonação é realizada a alta temperatura e baixa pressão ou alta pressão e baixa temperatura.

[0125] Os inventores do presente Pedido de Patente descobriram surpreendentemente que a realização das características relatadas acima no carbonato de cálcio é uma condição importante para permitir a transformação completa de grandes peças (ou seja, > 2 cm) em um arcabouço biomórfico final com a composição desejada e manutenção da microestrutura de madeira original.

[0126] Na etapa de fosfatização 6) do processo de várias etapas, o pelo menos um sal de fosfato pode ser selecionado do grupo que consiste em fosfato de amônio, fosfato de sódio e fosfato de potássio. O uso de fosfato de amônio permite um melhor controle do pH, portanto, o processo de conversão é mais eficiente e o corpo resultante possui propriedades mecânicas favoráveis e coesão física. Na etapa de fosfatização do processo de várias etapas, o modelo de carbonato de cálcio pode ser imerso numa solução compreendendo pelo menos um dos referidos sais de Fosfato. A solução pode ter uma concentração de 0,1 a 5 M, preferivelmente uma concentração de 0,5 a 2,0 M.

[0127] A razão de partida de PO4/CO3 na etapa de fosfatização do processo de múltiplas etapas é preferivelmente 1,5 a 5 vezes o valor estequiométrico teórico, preferivelmente 2 a 4 vezes o valor estequiométrico teórico.

[0128] Na etapa de fosfatização do processo de várias etapas, o modelo de carbonato de cálcio imerso em uma solução rica em fosfato pode ser aquecido de 25°C a 300°C sob uma pressão de vapor na faixa de 0,1 a 2,5 MPa (condições hidrotérmicas). A etapa de fosfatização pode durar cerca de 12 a cerca de 180 horas, preferivelmente cerca de 48 a cerca de 120 horas, mais preferencialmente de 24 a 72 horas.

[0129] O pH de partida da solução rica em fosfato na etapa de fosfatização do método de múltiplas etapas é preferivelmente entre pH 7 e 12.

[0130] A substituição da hidroxiapatita por outros íons pode ser conseguida através da introdução de sais solúveis adequados contendo os íons de interesse durante ou após a conclusão do processo, preferivelmente durante o processo de fosfatização. Os íons adequados podem incluir estrôncio, magnésio, silício, titânio, carbonato, sódio, potássio, gálio, prata, cobre, ferro, zinco, manganês, európio, gadolínio e suas misturas. Um exemplo de uma solução contendo íons de magnésio é MgCl2*6H2O, e um exemplo de uma solução contendo íons de estrôncio é SrCl2* 6H2O.

[0131] Como consequência do doping iônico, o arcabouço biomórfico final compreende ou consiste num material que compreende ou consiste em hidroxiapatita dopada e fosfato tricálcico.

[0132] De acordo com uma forma de realização menos preferida, em que a madeira nativa não foi moldada em forma e dimensões adequadas para ser utilizada como substituto ósseo (isto é, se a etapa i) não for realizada), o arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtido a partir do processo de várias etapas pode ser convenientemente moldado em um arcabouço com a forma e as forma requeridas por técnicas conhecidas.

[0133] A revelação se refere também ao arcabouço de hidroxiapatita biomórfica que foi obtido a partir do processo descrito acima, com propriedades físicas e mecânicas melhoradas se comparado à hidroxiapatitas hierarquicamente estruturadas obtidas por processos semelhantes conhecidos na técnica.

[0134] Em particular, o arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtido (ou a ser obtido) a partir do processo da presente descrição possui todas as características acima descritas para o arcabouço ou substituto ósseo da descrição.

[0135] Em particular, em relação à técnica anterior, o arcabouço biomórfico final obtido com o processo descrito no presente documento possui uma porosidade que é composta por uma maior porcentagem de micro e nanoporos do que os arcabouços obtidos por processos similares conhecidos na técnica. Em particular, pelo menos 25% da porosidade total, preferivelmente entre 25% e 50% da porosidade total do arcabouço de hidroxiapatita da revelação se devem a poros com um diâmetro < 1 μm, preferivelmente <0,1 μm, em particular entre 0,01 e 0,1 μm.

[0136] Esta alta porcentagem de micro e nanoporosidade é extremamente vantajosa do ponto de vista clínico, porque micro e nanoporos permitem a troca de fluidos nutritivos e a descarga dos produtos de resíduos do metabolismo celular melhoram, melhorando assim a regeneração óssea.

[0137] Além disso, o arcabouço biomórfico da revelação ilustra uma área superficial específica maior (9 a 20 m2/g versus 5-6 m2/g) do que um arcabouço obtido com um processo conhecido na técnica. Uma área de superfície mais alta determina a bioatividade da superfície melhorada e a melhor flexibilidade do arcabouço ou substituto ósseo, melhorando assim o processo de osteointegração e bioreabsorção.

[0138] Também o arcabouço biomórfico da revelação inclui grãos de hidroxiapatita de cerca de 100-200 nm (isto é, nanogrãos), muito menores do que os presentes na hidroxiapatita sinterizada (isto é tipicamente > 1 μm). Pequenos grãos mostram uma vantagem clínica para a regeneração óssea porque podem ser mais facilmente reabsorvidos pelas células, permitindo assim uma melhor regeneração óssea em relação ao arcabouço conhecido na técnica.

[0139] Além disso, o arcabouço biomórfico da descrição exibe resistência à compressão superior a 5 MPa, preferivelmente entre 10 MPa e 20 MPa, medida na direção ao longo dos poros semelhantes a canal (direção longitudinal) e uma resistência à compressão ao longo da direção dos poros transversais (direção transversal) de até 10 MPa. Os inventores da presente descrição descobriram surpreendentemente que essas características mecânicas tornam o arcabouço de hidroxiapatita final como um material autônomo, portanto, pode ser aplicado em procedimentos de regeneração de peças ósseas portadoras de carga sem o uso de nenhuma estrutura de reforço ou sustentação, tal como conchas ou barras. Na natureza, a hidroxiapatita nanocristalina, ion-substituída é o principal componente presente nos tecidos duros do corpo; de fato, a fase mineral no osso é uma fase nanoestruturada composta de plaquetas de hidroxiapatita finamente dispersas de dimensões abaixo de 100 nm que se organizam em uma estrutura porosa organizada hierarquicamente 3D representando todo o tecido ósseo.

[0140] A este respeito, os inventores da presente descrição descobriram surpreendentemente que, quando comparada com a técnica anteriormente conhecida, a transformação biomórfica de estruturas naturais de madeira obtidas pelo processo acima descrito, pode originar exclusivamente arcabouços ósseos de hidroxiapatita final exibindo simultaneamente a composição imitadora de osso, macro/micro/nanoporosidade aberta e elevada e resistência mecânica superior, associada a um tamanho relevante para a aplicação em locais de suporte de carga, particularmente em ossos segmentares longos dos membros, grandes regiões maxilo-faciais ou na coluna vertebral.

[0141] Todos esses recursos, que nunca foram mostrados ocorrendo simultaneamente, são de extrema importância para permitir a regeneração óssea extensa em sítios que sustentam carga. As diferenças na estrutura de arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtida com o processo de acordo com a presente descrição produzem vantagens clínicas importantes que são mostradas no exemplo comparativo 6. Em particular, os arcabouços atuais mostram maior poder indutivo na expressão de genes relacionados à osteogenicidade, em relação aos arcabouços da técnica anterior, que se traduzem em melhor desempenho clínico em termos de regeneração óssea.

[0142] A presente descrição é ainda ilustrada pelos exemplos não limitativos que se seguem.

EXEMPLOS Métodos de medição Porosidade total da madeira submetida a uma etapa de pirólise (madeira pirolizada):

[0143] Um pedaço de madeira que passa por pirólise formada como um prisma ou um cilindro é pesado, após o volume ser obtido medindo-se o diâmetro e a altura. A densidade absoluta (A.D.) da madeira pirolizada é obtida por relação peso/volume; a densidade relativa (R.D.) é obtida dividindo a A.D. da madeira pirolizada pela densidade teórica de carbono (isto é, R.D. = A.D./2,25). A porosidade total (%) é obtida por (1-R.D)*100.

Porosidade total de um arcabouço obtido após cada etapa do processo e do arcabouço de hidroxapatita biomórfico obtido no final do processo:

[0144] A porosidade é calculada aplicando o mesmo método como acima utilizando valores apropriados para a densidade teórica de cada material obtido após cada etapa (isto é, a densidade teórica de CaC2, CaO, CaCO3, HA).

Resistência à compressão:

[0145] O arcabouço final ou substituto ósseo, moldado como um prisma ou um cilindro, é submetido à carga usando uma máquina de teste de tipo parafuso universal para obter curvas de tensão deformação e a carga de fratura. A resistência à compressão é dada pela relação entre a carga de fratura e a área submetida à compressão.

Diâmetro da porca:

[0146] A distribuição do tamanho dos poros e a morfologia dos poros do arcabouço final ou após cada etapa do processo são avaliadas por meio de porosimetria por intrusão com mercúrio e microscopia eletrônica de varredura (SEM), respectivamente. A análise de porosimetria por intrusão de mercúrio baseia-se na medida da intrusão de mercúrio nos poros da amostra em várias pressões.

Fases cristalinas: identificação e guantificação

[0147] As fases cristalinas nos arcabouços são identificadas e quantificadas por técnica de difração de raios X em pó (XRD), avaliando o resultado da incidência da radiação X na amostra, com ângulos diferentes e contínuos.

Área de superfície específica:

[0148] A área de superfície total dos materiais por unidade de volume (m2/g) é avaliada utilizando o método BET, estimado a partir da quantidade de gás adsorvido em relação à sua pressão.

Exemplo 1 Preparação de uma hidroxiapatita derivada de madeira utilizando o processo de várias etapas:

[0149] i) Um pedaço de madeira de rattan nativa é moldado em forma cilíndrica com as dimensões que se seguem: diâmetro = 2 cm; altura = 3 cm;

1) Pirólise da Madeira Nativa

[0150] A peça de madeira de partida é seca a 70°C durante 24 horas, depois tratada a 800°C durante mais de 30 minutos sob nitrogênio circulante, transformando-se em modelo de carbono puro. Ciclo térmico: aquecimento a 1°C/min. até 350°C e 2°C/min. de 350°C a 800°C. A amostra é mantida a uma temperatura de 800°C durante cerca de pelo menos 30 min. e subsequentemente o modelo é resfriado a 1°C/min.

2) Carburação

[0151] O modelo de carbono é submetido a aquecimento a 1.000°C sob atmosfera de argônio e cálcio a 0,5 mbar, transformando-se em carbeto de cálcio. Tempo de espera a 1.000°C = 30 minutos.

3) Oxidação

[0152] O modelo de carbeto de cálcio é aquecido no ar até 1.100°C seguindo uma taxa de aquecimento na faixa de 1-7°C/min., permitindo a transformação completa em óxido de cálcio.

4) Hidratação

[0153] O corpo de óxido de cálcio é ativado pela exposição à água, permitindo assim a absorção de água nas quantidades de cerca de 10% molar. 5) Carbonação O corpo hidratado pré-condicionado é aquecido a 800°C sob uma pressão de CO2 progressivamente crescente de 0,5 a 10 MPa. Isso transforma o corpo de óxido de cálcio em carbonato de cálcio.

6) Fosfatização

[0154] O corpo de carbonato de cálcio é imerso em uma solução de fosfato de amônio 0,5 M e uma razão PO4 a CO3 inicial de 2 vezes o valor estequiométrico teórico, a temperaturas de 200°C sob uma pressão de vapor de água de 2 MPa.

[0155] A resistência à compressão do arcabouço foi avaliada exercendo forças mecânicas ao longo da direção perpendicular e transversal, em relação à orientação dos poros do canal.

[0156] Ao carregar ao longo da direção do poro (que é a configuração mais clinicamente reflexiva para imitar os estímulos biomecânicos in vivo no caso de ossos segmentares longos), o arcabouço (desenvolvido como um cilindro oco com diâmetro externo = 15 mm, diâmetro interno = 6 mm de altura = 20 mm e uma extensão de poro de 60-65% vol.) exibiram resistência à compressão de até 16 MPa (isto é 250 kg de carga final (Figuras 1 e 3). Na direção transversal, o arcabouço exibiu resistência à compressão de até 4 MPa.

[0157] O arcabouço também pode ser submetido a tratamento térmico a uma temperatura máxima de 1.300°C, em atmosfera controlada, para aumentar ainda mais a resistência mecânica do arcabouço.

[0158] As características microestruturais semelhantes aos ossos do arcabouço biomórfico permitem a liberação de informações topológicas às células para construir um tecido ósseo novo com estrutura organizada. Isto foi confirmado por testes in vivo onde o arcabouço foi implantado em fêmures de coelho e calvária de camundongo.

[0159] O arcabouço não induziu quaisquer reações adversas tóxicas nem qualquer necrose ou infecção após a cirurgia. O arcabouço proporcionou uma extensa colonização pelo osso recém formado após 1 mês, semelhante ao controle que era um arcabouço de apatita porosa comercial: EngiPore, Finceramica S.p.A., Itália.

[0160] Os tecidos explantados da calvária dos camundongos mostraram formação extensiva de osso e penetração nos poros do arcabouço tanto quando o arcabouço foi implantado sozinho e também quando as células do estroma osteogênico foram adicionadas ao arcabouço implantado (Figura 2a-d). A porosidade semelhante a canal do arcabouço induziu a formação de estruturas ósseas imitando sistemas Haversianos (como indicado pelas setas na figura 2f). Além disso, os poros do tipo canal do arcabouço induziram angiogênese rápida para ajudar a formação e penetração do novo osso. Este resultado confirma que uma orientação adequada da porosidade em relação à orientação da rede vascular endógena pode ser efetiva na promoção do desenvolvimento precoce da angiogênese extensiva.

Exemplo 2 Comparação de hidroxiapatita biomórfica da revelação e hidroxiapatita estruturada hierarquicamente conhecida na técnica

[0161] Um teste de comparação foi realizado entre a distribuição do tamanho dos poros da hidroxiapatita biomórfica da presente revelação obtida a partir de madeira nativa do rattan e a distribuição do tamanho dos poros de uma hidroxiapatita hierarquicamente estruturada obtida a partir da mesma madeira nativa de acordo com os ensinamentos de Anna Tampieri e outros no Journal of Material Chemistry, 2009, 19, 4973-4980, utilizando o ensino de Ruffini e outros em Chemical Engineering Journal 217 (2013) 150-158 apenas para a etapa de fosfatização (Mistura de NH4H2PO4- (NH4)2HPO4, pH = 9, Tmax = 60°C, tempo = 80h).

[0162] Os resultados são mostrados na Figura 4, em que as colunas negras se referem à hidroxiapatita biomórfica da revelação e as colunas cinza escuro à hidroxiapatita conhecida na técnica.

[0163] É evidente o aumento no número de poros com diâmetro compreendido na faixa de 200-300 μm na hidroxiapatita biomórfica da presente revelação em comparação com a hidroxiapatita hierarquicamente organizada conhecida sendo os referidos poros os que têm as dimensões mais apropriadas para promover uma vascularização fisiológica da hidroxiapatita biomórfica quando implantada como substituta óssea. Além disso, a mesma Figura 4 ilustra um número crescente de poros com diâmetro na faixa de 0,01 a 0,1 mícron, o que indica claramente que a microestrutura da madeira nativa é preservada no produto final.

Exemplo 3 Preparação de uma hidroxiapatita derivada de madeira dopada com Mg2+ e/ou Sr2+:

[0164] As etapas 1 a 5 do método de múltiplas etapas como descrito no exemplo 1 são seguidas para produzir o corpo de carbonato de cálcio. O doping com os íons Mg2+ e/ou Sr2+ foi conseguido de acordo com cada um dos métodos que se seguem:

Método 1

[0165] Uma solução de Sr2+ (na forma de SrCl) é adicionada a uma solução rica em fosfato a 1,0 M. O corpo de carbonato de cálcio preparado de acordo com o método de múltiplas etapas é então imerso na solução combinada e aquecido a uma temperatura de 200°C sob uma pressão de vapor de água de 2 MPa. Isso produz uma hidroxiapatita dopada com SR2 com a morfologia da peça de madeira inicial.

Método 2

[0166] O corpo de carbonato de cálcio é imerso em solução rica em fosfato a 1,0 M. Enquanto se aquece a uma temperatura de 25-90°C sob uma pressão de vapor de água de 0,1 MPa, uma solução de Sr2+ é adicionada progressivamente. Isso produz uma hidroxiapatita Sr2+ com a morfologia da peça de madeira inicial.

Método 3

[0167] O corpo puro de carbonato de cálcio (ou parcialmente convertido em hidroxiapatita por imersão em solução rica em fosfato a 0,5 M a temperatura ambiente ou superior durante 24 horas) é imerso numa solução aquosa ou orgânica contendo íons Sr2+ durante 24h. O mesmo é então removido da solução e é imerso em solução rica em fosfato a 1,5 M. Ao aquecer a uma temperatura de 200°C sob uma pressão de vapor de água na faixa de 0,5-1,5 MPa. Isso produz uma hidroxiapatita dopada com D2+ com a morfologia da peça de madeira inicial.

Propriedades do arcabouço substituído com estrôncio

[0168] Os arcabouços de hidroxiapatita substituídos com estrôncio foram desenvolvidos e verificou- se que apresentam viabilidade melhorada de células estaminais mesenquimais (MSCs) quando comparados aos arcabouços isentos de estrôncio (Figuras 5).

[0169] Os arcabouços de estrôncio também apresentaram morfologia bem disseminada e aumento da expressão de genes relevantes para osteogênese, como RUNX2 e ALP (Figura 6), atuando como promotores da diferenciação osteoblástica. Em particular, quando comparado ao arcabouço isento de Sr foi detectado um aumento significativo no nível de RNAm de ambos os genes (p <0,05). Este aumento foi particularmente alto para o arcabouço com 2% molar de Sr.

[0170] A maior proliferação de pré-osteoblastos durante 14 dias de investigação foi observada quando os arcabouços de hidroxiapatita substituídos por Sr foram usados (Figura 7). De fato, um aumento do estrôncio no arcabouço produziu uma viabilidade celular muito maior em longo prazo. Estes resultados implicam no fato de que a nova formação óssea pode ser induzida e sustentada com sucesso.

[0171] O arcabouço também demonstrou a possibilidade de manter o fenótipo osteoblástico durante as duas semanas da investigação (Figura 8).

[0172] O comportamento das células em contato com o arcabouço de estrôncio substituído foi investigado também observando o comportamento dos osteoclastos. Uma análise morfológica preliminar foi realizada para confirmar e validar o modelo de osteoclastogênese. Os osteoclastos cultivados na superfície do arcabouço exibem sua morfologia típica.

[0173] A expressão gênica relativa do marcador principal envolvido na atividade e formação de osteoclastos (Oscar, Integrin β3 e CatepsinK) foi avaliada (Figura 9). A análise mostrou uma diminuição significativa na expressão genética ao longo do tempo de todos os genes envolvidos nas principais vias moleculares dos osteoclastos, indicando assim que a presença de íons Sr2+ no arcabouço inibe a formação e a atividade dos osteoclastos.

[0174] Foi concluído que a substituição de hidroxiapatitas por íons Sr2+ produziu um efeito biológico sobre células ósseas, causando especificamente: i) um efeito indutivo significativo sobre os genes relacionados à osteogênese MCSs; ii) um efeito indutivo na proliferação de osteoblastos e iii) um efeito inibitório sobre a atividade dos osteoclastos. • No caso de implantação em um defeito ósseo segmentar, o novo arcabouço é projetado para apresentar um canal central que se estende em direção paralela à porosidade unidirecional principal, de modo a ser exposto aos cotos ósseos como guia para o desenvolvimento de medula óssea nova (figura 1). O tamanho do canal é definido com base no defeito específico; no entanto, para manter uma resistência adequada, o canal tem um diâmetro na faixa de 20 a 60% em relação à largura total do arcabouço.

Exemplo 4 - Comparação de hidroxiapatita biomórfica da revelação e hidroxiapatita hierarquicamente estruturada conhecida na técnica

[0175] Um teste de comparação foi realizado entre uma hidroxiapatita biomórfica fabricada utilizando o processo de revelação e um arcabouço de hidroxiapatita obtido a partir da mesma madeira nativa (rattan) de acordo com os ensinamentos de Anna Tampieri e outros no Journal of Material Chemistry, 2009, 19, 4973-4980. A madeira de rattan utilizada no processo de revelação tem um comprimento, medido ao longo de uma direção na qual uma dimensão do arcabouço é máxima, igual a 2 cm. A madeira de rattan utilizada no processo da técnica anterior tem um comprimento, medido ao longo de uma direção na qual uma dimensão do arcabouço é máxima, igual a 1 cm. Após cada etapa dos dois processos, a área superficial específica (SSA) e a distribuição dos poros dos arcabouços intermediários e finais foram analisadas e comparadas (vide Figuras 10, 16, 19 e 20). Além disso, após a etapa de carburação, as dimensões de cristal de carbeto de cálcio dos dois arcabouços intermediários foram comparadas (vide Figura 13 - figuras inferiores). A estrutura de rede cristalina dos dois arcabouços de carbeto de cálcio foi comparada após a etapa de carburação. A comparação é mostrada na Figura 14. A Figura 10 ilustra uma comparação da distribuição dos poros dos dois arcabouços de carbeto de cálcio obtidos após as respectivas etapas de carburação, em comparação com a distribuição dos poros da madeira pirolizada inicial. A área de superfície específica dos dois arcabouços de carbeto de cálcio também é relatada na figura. Os resultados mostram que apenas o arcabouço de carbeto de cálcio obtido após a etapa de carburação da revelação preserva a distribuição de micro e nanoporos da madeira de rattan(dimensão de poros <1 μm). Também a comparação das duas áreas superficiais específicas ilustra uma melhoria no arcabouço de acordo com a presente revelação. As figuras 11, 12 e duas figuras de topo 13 mostram as imagens SEM dos dois arcabouços de carbeto de cálcio, dos quais a melhor preservação da micro e nanoporosidade da madeira nativa pode ser claramente vista. As duas figuras inferiores 13 mostram uma comparação da dimensão dos cristais de carbeto de carbono. O carbeto de cálcio obtido de acordo com a presente descrição ilustra partes menores com um tamanho médio de cerca de 10 μm, enquanto as partes menores obtidos com o processo da técnica anterior têm um tamanho médio de cerca de 100 μm.

[0176] A Figura 14 ilustra uma comparação da fase de cristal dos dois arcabouços de carbeto de cálcio, medidos com XR-XRD. Os resultados mostram que o carbeto de cálcio obtido de acordo com a presente descrição possui uma rede cristalina tetragonal e cúbica, enquanto que o carbeto de cálcio da técnica anterior tem apenas uma rede tetragonal. O arcabouço de carbeto de cálcio da revelação contém uma quantidade maior de Ca(OH)2 em relação ao arcabouço de técnica anterior.

[0177] A Figura 15 ilustra imagens SEM do arcabouço de óxido de cálcio obtido após as respectivas etapas de oxidação. As imagens correspondentes ao arcabouço obtido de acordo com a presente descrição preservam uma microporosidade entre as partes menores de CaO, enquanto que no arcabouço de técnica anterior a microporosidade está completamente perdida.

[0178] A Figura 16 ilustra a distribuição dos poros dos dois arcabouços de óxido de cálcio. A comparação ilustra claramente que a fração de micro e nanoporosidade obtida após a etapa de oxidação é maior no arcabouço de acordo com a presente descrição, bem como a área de superfície específica.

[0179] As Figuras 17 e 18 mostram imagens SEM do carbonato de cálcio obtido após a respectiva carbonação. O material de acordo com a presente descrição ilustra uma estrutura fina estendida, em comparação com a técnica anterior, em que grandes cristais de calcita (até cerca de 50 μL) caracterizam toda a estrutura. Os cristais grandes fazem com que a estrutura se quebre ou rompa durante a etapa de fosfatização.

[0180] A Figura 19 ilustra a distribuição dos poros dos dois arcabouços de carbonato de cálcio obtidos após a etapa de carbonação. A comparação da distribuição de poros e a área de superfície específica mostram um resultado, semelhante ao discutido acima para o óxido de cálcio: a estrutura de micro e nanoporos <1 μm é mantida com o presente processo e SSA maior é obtido com relação à arte anterior.

[0181] A Figura 20 ilustra a comparação entre a distribuição de poros do arcabouço de hidroxiapatita biomórfica final (após fosfatização) obtida com o processo de revelação e o arcabouço de hidroxiapatita biomórfica final da técnica anterior. Uma comparação do respectivo SSA também é mostrada.

[0182] Os resultados mostram que o arcabouço biomórfico da revelação possui uma maior fração de micro e nanoporosidade do que o da técnica anterior, bem como uma área de superfície específica maior.

Exemplo 5 - Processo da técnica anterior aplicado a uma peça de madeira rattan com um comprimento medido ao longo de uma direção na qual uma dimensão do arcabouço é máxima, sendo igual a 2 cm.

[0183] Um teste foi realizado para demonstrar que o processo da técnica anterior (Anna Tampieri e outros, no Journal of Material Chemistry, 2009, 19, 4973-4980) não permite a fabricação de arcabouços com um comprimento medido ao longo de uma direção na qual uma dimensão do arcabouço é máxima, sendo igual ou superior a 2 cm, ou seja, arcabouços de interesse clínico para regeneração óssea.

[0184] Para este fim, um pedaço de madeira de rattan foi submetido às etapas do processo de acordo com as condições descritas em Tampieri e outros.

[0185] A Figura 21 mostra que, mesmo antes da etapa de fosfatização, o arcabouço pode se romper. A Figura 22 ilustra que mesmo que o arcabouço sobreviva às etapas do processo até a fosfatização, após a fosfatização, o arcabouço se rompe.

[0186] O teste ilustra claramente que a ampliação de um produto cerâmico geralmente não é uma operação direta; em vez disso, as condições do processo precisam ser alteradas (às vezes modificadas fortemente) para preparar produtos maiores, mesmo quando um processo para obtenção de produto cerâmico pequeno é conhecido na técnica.

Exemplo 6 - Teste comparativo

[0187] Um estudo in vitro foi realizado com células estaminais mesenquimais de camundongo (mMSCs). O perfil de expressão de genes foi analisado para testar a superexpressão de genes específicos envolvidos na diferenciação osteogênica induzida por um arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtido com o processo da presente revelação e um arcabouço de hidroxiapatita biomórfica obtido com o processo da técnica anterior.

Descrição da amostra

[0188] Os dois arcabouços testados são definidos da forma que se segue:

Resultados

[0189] Os genes testados, relacionados ao compromisso do estágio precoce (Runx2 e ALP) e estágio tardio (OPN) de diferenciação osteogênica, parecem estar suprarregulados nas células cultivadas em todos os arcabouços de revelação em comparação com os arcabouços da técnica anterior, com uma diferença significativa para Runx2 e OPN (p < 0,0001). Não foram observadas diferenças na expressão do gene BMP2 e Col15 em todas as amostras testadas, provavelmente porque o BMP2, que é o regulador a montante da via de diferenciação, após 14 dias de cultura dinâmica, já realizou sua função biológica como sugerido pela regulação positiva de Runx2, Alp e OPN [1]. Ao contrário, Col15 é um marcador muito tardio relacionado à produção de matriz óssea mineralizada [2] e provavelmente o tempo de cultura não foi suficiente para induzir sua expressão. Não foram observadas diferenças entre o efeito indutivo dos arcabouços de revelação dopados ou não dopados (vide Figura 23).

[0190] A Figura 23 ilustra a quantificação relativa (2-ΔΔCt) da expressão gênica em relação à expressão do arcabouço não dopado da técnica anterior usado como calibrador, após 14 dias de mMSCs 3D cultivados em condição dinâmica com todas as amostras testadas. O erro médio e padrão de três amostras foi indicado. A análise estatística foi feita por ANOVA de dois sentidos, seguido do teste post hoc de Bonferroni e diferença significativa é indicada no gráfico: <****> p < 0,0001.

[0191] A partir dos testes acima, é possível afirmar que os arcabouços de revelação mostram maior poder indutivo na expressão de genes relacionados à osteogenicidade, em relação aos arcabouços da técnica anterior. REFERÊNCIAS [1] Arch Oral Biol. janeiro de 2013; 58(1):42-9. doi: 10.1016/j.archoralbio.2012.07.010. Epub 2012 Aug 9. Leader genes in osteogenesis: a theoretical study. Orlando B, Giacomelli L, Ricci M, Barone A, Covani U. [2] J Cell Physiol. agosto de 2012; 227(8):3151- 61. doi: 10.1002/jcp.24001. Extracellular calcium chronically induced human osteoblasts effects: specific modulation of osteocalcin and collagen type XV. Gabusi E, Manferdini C, Grassi F, Piacentini A, Cattini L, Filardo G, Lambertini E, Piva R, Zini N, Facchini A, Lisignoli G.

Claims

1. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica caracterizadopor ser obtido a partir de uma madeira apresentando uma porosidade total de pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente entre 60% e 95%, sendo a referida porosidade medida depois de submeter a madeira a uma etapa de pirólise, o referido arcabouço apresentando um comprimento, medido ao longo de uma direção em que uma dimensão do arcabouço é máxima, maior ou igual a 2 cm.

2. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopor apresentar uma resistência à compressão, medida na direção longitudinal, superior a 5 MPa, preferivelmente entre 10 MPa e 40 MPa, mais preferivelmente entre 10 MPa e 20 MPa.

3. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopor apresentar uma estrutura de poros hierarquicamente organizada, que deriva da estrutura de poros hierarquicamente organizada da madeira a partir da qual é obtido.

4. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que a madeira é selecionada dentre madeira de rattan, pinheiro, abachi, balsa, sipo, carvalho, jacarandá, Kempas e nogueira, preferivelmente rattan.

5. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadopelo fato de que a estrutura de poros hierarquicamente organizada inclui entre 30% e 80%, da porosidade total, de poros com um diâmetro inferior a 150 μm, o restante até 100% da porosidade total sendo de poros com diâmetro superior a 150 μm.

6. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que, preferivelmente quando a madeira é rattan, entre 30% e 60% da porosidade total do arcabouço se devem a poros com um diâmetro menor ou igual a 10 μm.

7. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que, preferivelmente quando a madeira é rattan, pelo menos 25% da porosidade total, preferivelmente entre 25% e 50% da porosidade total do arcabouço se devem a poros com um diâmetro menor ou igual a 1 μm, preferivelmente menor ou igual a 0,1 μm, mais preferivelmente entre 0,01 μm e 0,1 μm.

8. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizadopelo fato de que, preferivelmente quando a madeira é rattan, pelo menos 20% da porosidade total do arcabouço se deve a poros que têm diâmetro maior ou igual a 150 μm.

9. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizadopor apresentar uma área de superfície específica (SSA) maior que 9 m2/g, preferivelmente de 9 m2/g a 20 m2/g.

10. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadopelo fato de que a referida hidroxiapatita é parcialmente substituída com um ou mais íons selecionados do grupo que compreende magnésio, estrôncio, titânio, silício, carbonato, sódio, potássio, prata, gálio, cobre, ferro, zinco, manganês, európio e gadolínio.

11. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizadopor ser para uso no campo médico, preferencialmente para uso como um substituto ósseo, em que preferencialmente o substituto ósseo tem uma forma correspondente à forma de um defeito ósseo a ser reconstruído.

12. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopor ser para uso na substituição ou regeneração de um osso ou uma porção óssea.

13. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o referido osso ou porção óssea é um osso ou porção óssea sujeito(a) a cargas mecânicas, preferencialmente um osso longo da perna e do braço ou o referido osso ou porção óssea é uma parte óssea craniana, um osso da coluna vertebral ou uma parte óssea maxilo-facial.

14. Arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o referido osso longo da perna e do braço é tíbia, metatarso, fíbula, fêmur, úmero ou rádio.

15. Substituto ósseo caracterizadopor compreender o arcabouço de hidroxiapatita biomórfica conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

16. Processo para a produção de um arcabouço de hidroxiapatita biomórfica, conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 14 ou do substituto ósseo conforme definido na reivindicação 15, caracterizadopor compreender as etapas de:1) Pirólise: uma madeira nativa, preferivelmente selecionada dentre madeira de rattan, pinheiro, abachi, balsa, sipo, carvalho, jacarandá, Kempas e nogueira, mais preferivelmente um pedaço de madeira de rattan, é aquecida a uma temperatura na faixa de 600°C a 1000°C, em atmosfera inerte, para produzir um modelo de carbono; 2) Carburação: o modelo de carbono é infiltrado com cálcio no estado de vapor, a uma temperatura na faixa de 900°C a 1200°C e a uma pressão menor do que 100.000 Pa (menor do que 1.000 mbar), preferivelmente menor do que 60.000 Pa (menor do que 600 mbar), mais preferivelmente na faixa de 5 a 10.000 Pa (0,05 a 100 mbar), para produzir um modelo de carbeto de cálcio; 3) Oxidação: o modelo de carbeto de cálcio (CaC2) é aquecido em ar a uma temperatura na faixa de 750°C a 1300°C, preferivelmente 1000°C a 1200°C, para produzir um modelo de óxido de cálcio; 4) Hidratação: o modelo de óxido de cálcio é exposto à água, preferencialmente à umidade, permitindo assim a absorção de água em uma quantidade compreendida na faixa de 1% a 25% molar, preferivelmente na faixa de 5% a 15% molar; 5) Carbonatação: o modelo de óxido de cálcio é transformado em carbonato de cálcio por aquecimento a uma temperatura na faixa de 500°C a 900°C, preferivelmente a uma temperatura na faixa de 750°C a 850°C, sob uma pressão na faixa de 4 MPa a 20 MPa; 6) Fosfatização: o modelo de carbonato de cálcio é tratado com pelo menos um sal de fosfato, preferivelmente selecionado do grupo que consiste em fosfato de amônio, fosfato de sódio, fosfato de potássio e misturas destes, para produzir o arcabouço de hidroxiapatita biomórfica.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que, após a etapa 1), a madeira nativa tem uma porosidade total de pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente compreendida entre 60% e 95%.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizadopelo fato de que antes da etapa de pirólise 1), o processo compreende uma etapa i) de seleção e preparação da madeira nativa, em que a referida madeira nativa é cortada em uma peça com um comprimento, medido ao longo de uma direção em que uma dimensão da madeira é máxima, que é maior do que ou igual a 2 cm, em que, preferivelmente, a referida etapa i) compreende ainda as etapas de: fornecer um modelo 3D de um defeito ósseo e, com base no modelo 3D obtido, conferir à madeira nativa uma forma correspondente à forma do defeito ósseo.

19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizadopelo fato de que a etapa de carburação 2) é realizada com uma razão molar Ca/C, no início da reação, na faixa de 1,10 a 2,50, preferivelmente na faixa de 1,50 a 2,00.

20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizadopelo fato de que a etapa de carbonatação 5) é realizada de acordo com um dos seguintes ciclos térmicos: - a uma pressão de CO2 constante de 10 MPa, aumentando lentamente a temperatura a um valor na faixa de 750°C a 850°C, preferivelmente de 800°C; - a uma temperatura constante de 750°C a 850°C, preferivelmente de 800°C, aumentando a pressão até 10 MPa; - manutenção da pressão a 4 MPa a 6 Mpa, enquanto aumenta a temperatura até 750°C a 850°C, preferivelmente até 800°C e, subsequentemente, aumentando a pressão até 10 MPa.

21. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizadopelo fato de que, na etapa de fosfatização 6), o modelo de carbonato de cálcio é imerso em uma solução à base de água compreendendo pelo menos um sal de fosfato, a referida solução apresentando uma concentração de fosfato de 0,1 M a 5 M, preferivelmente uma concentração de 0,5 M a 2,0 M.

22. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizadopelo fato de que a razão de partida de PO4/CO3 na etapa de fosfatização 6) é de 1,5 a 5 vezes o valor estequiométrico teórico, preferivelmente 2 a 4 vezes o valor estequiométrico teórico.

23.Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22, caracterizadopelo fato de que a etapa de fosfatização 6) é realizada na presença de íons de magnésio, estrôncio, silício, titânio, carbonato, sódio, potássio, prata, gálio, cobre, ferro, zinco, manganês, európio, gadolínio, ou misturas destes.