ITUB20152962A1 - Grandi scaffold porosi in 3D realizzati in idrossiapatite attiva ottenuta tramite trasformazione biomorfica di strutture naturali - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

“Grandi scaffold porosi in 3D realizzati in idrossi apatite attiva ottenuta tramite trasformazione biomorfica di strutture naturali”

La presente descrizione si riferisce a idrossiapatite ottenuta da legno poroso. In particolare, la presente descrizione si riferisce a uno scaffold di idrossiapatite biomorfica ottenuto da legno poroso per l'uso come sostituto osseo.

Fondamento

La lavorazione e l'ingegneria della ceramica attuali sono basate su una sequenza di processi ben noti che consentono la produzione di grandi corpi in 3D. Più nello specifico, fasi ceramiche innovative possono essere sintetizzate come polveri, in cui caratteristiche specifiche come stechiometria / sostituzioni ioniche, nanodimensioni, e attività superficiale, sono responsabili di funzionalità specifiche. La lavorazione di ceramica attualmente usata per ottenere corpi di ceramica in 3D macroscopici con forma e porosità adeguate richiede trattamento termico (sinterizzazione) del corpo di ceramica sintetizzato (per consolidare il corpo) seguito da ulteriori fasi di lavorazione a macchina e lucidatura. Tutte queste fasi sono necessarie per ottenere ceramiche in 3D con proprietà fisiche e meccaniche adeguate ma esse degradano irreversibilmente lo stato chimico-fisico della fase ceramica "attiva" come preparata (in particolare il trattamento di sinterizzazione). Le serie limitazioni nello sviluppo di materiale ceramico funzionale, associate al processo ceramico attuale, impediscono ulteriori progressi nel campo.

Oggi, con l'evoluzione della società moderna, i prodotti tecnologici stanno assumendo un ruolo sempre crescente nella vita e nella produttività delle persone, cosicché esiste un forte bisogno di utensili intelligenti in grado di fornire soluzioni a richieste complesse e personalizzate, in vari campi di applicazione, ad esempio sanità, ambiente, energia. Pertanto, esiste largo consenso sulla necessità di nuovi approcci per la produzione ripetibile e di massa di dispositivi macroscopici con un'organizzazione strutturale complessa sulla macroscala ma, allo stesso tempo con una struttura complessa definita sulla nanoscala, e anche sulla scala dei cristalli. Tali macro- e nanostrutture sono importanti per indurre effetti funzionali non banali, ma intelligenti.

Rispetto alle questioni summenzionate riguardo ai materiali ceramici, è richiesto un cambiamento paradigmatico al fine di sviluppare grandi ceramiche altamente attive con micro- e macrostrutture complesse.

Gli scaffold ossei possono essere presi come esempio rappresentativo poiché dovrebbero essere ceramiche porose con elevata attività, al fine di rigenerare grandi difetti ossei. In effetti, al momento, non sono state trovate soluzioni adeguate per risolvere questa necessità clinica.

Per molte decadi, l'idrossiapatite (Caio(P04)6(OH)2) è stata riconosciuta come il materiale primario per scaffold ossei, in quanto assomiglia molto alla composizione del minerale osseo e ha mostrato biocompatibilità e osteoconduttività eccellenti. Tuttavia, la biomimetica dell'idrossiapatite è correlata alle sue nanodimensioni e a molteplici ioni che sostituiscono calcio e fosfato nel reticolo dell'apatite, i quali sono la fonte dell'attività biologica dell'osso durante la formazione, il rimodellamento e il riassorbimento di nuovo tessuto.

L'applicazione del processo di sinterizzazione a scaffold di idrossiapatite attiva reazioni di superficie e bulk in corrispondenza dell'interfaccia tra particelle di idrossiapatite adiacenti che dà un ordinamento migliorato dei cristalli e coalescenza dei grani fino a diversi micrometri, con riduzione di superficie specifica, idrofilia e affinità con proteine e cellule.

L'estesa coalescenza dei grani attivata tramite il processo di sinterizzazione produce un consolidamento dell'intero corpo di idrossiapatite attraverso la riduzione della porosità intergranulare e, a sua volta, del volume totale. Questo genera altresì sforzi residui che sono tra le maggiori fonti di difetti strutturali nei materiali ceramici. Infatti, la sistemazione di sforzi residui in materiali ceramici è difficile a causa della loro elevata rigidità (in confronto a metalli e polimeri), ed è tra i fattori più significativi che influenzano le prestazioni meccaniche di materiali ceramici, in particolare nel caso di forme complesse e strutture porose, dove variazioni di volume in seguito a cicli di riscaldamento/raffreddamento provocano facilmente danni strutturali critici.

Per le suddette ragioni, il processo di sintesi di ceramica classico non consente la produzione di materiali ceramici, in particolare idrossiapatiti aventi una composizione e una struttura biomimetiche. Questo è particolarmente vero quando sono sintetizzati grandi corpi di ceramica in 3D per lo scopo di rigenerazione ossea.

La composizione e la struttura biomimetiche sono di importanza centrale per indurre effetti biologici in vivo che possono determinare e promuovere in maniera unica la rigenerazione di parti di osso grandi e sottoposte a carichi come le ossa lunghe degli arti. Questi fenomeni, i quali sono strettamente correlati e devono avvenire in sinergia per attivare e sostenere la rigenerazione dell'osso con tutte le sue funzioni, sono: i) osteogenesi e osteoconduzione rapide; ii) formazione di vasi sanguigni estesa; iii) capacità di bioriassorbimento progressivo.

Osteogenesi e osteoconduzione rapide consentono la formazione di osso estesa e la penetrazione nello scaffold. La porosità aperta e interconnessa consente la penetrazione ossea diffusa e massiva, e la simultanea formazione di una rete vascolare che assiste la formazione e la maturazione del nuovo osso. La colonizzazione incompleta dello scaffold può comportare la formazione di vuoti, tessuti fibrosi o aree necrotiche, e ridurrà la resistenza complessiva e le prestazioni biomeccaniche del costrutto osso/biomateriale.

In tempi compatibili con il metabolismo osseo, lo scaffold dovrebbe essere completamente riassorbito, per ottenere la rigenerazione ottimale dell'osso in seguito a danno o malattia. Tutti gli scaffold ossei in 3D sviluppati finora sono basati su fosfati di calcio sinterizzati che sono materiali cristallini che oppongono elevata resistenza all'attività degli osteoclasti, rispetto all'apatite ione-sostituita nanocristallina, nanodimensionata; pertanto, sebbene gli scaffold di idrossiapatite di osso porosi possano essere ben integrati nell'osso circostante tramite adesione superficiale, la mancanza di bioriassorbimento non consente la completa sostituzione dello scaffold con il nuovo osso. Questo può risultare in un recupero incompleto della capacità funzionale dell'osso malato, in particolare nel caso di segmenti ossei molto lunghi.

In particolare nel caso di ossa lunghe, sottoposte a carichi, lo scaffold deve mostrare adeguate prestazioni meccaniche, mantenendo al contempo una macroporosità aperta, il che rappresenta una sfida considerando che queste caratteristiche normalmente sono inversamente correlate (ovvero, maggiore è la porosità, minore è la resistenza meccanica) e che è richiesto un tasso di porosità elevato per fornire osteointegrazione e stabilità fisica adeguate. Questo è uno dei fattori più importanti limitanti l'applicazione degli scaffold attuali nella rigenerazione di porzioni estese di ossa lunghe, sottoposte a carichi. A questo riguardo, scaffold con strutture porose organizzate gerarchicamente possono mostrare prestazioni meccaniche superiori rispetto a materiali con una porosità simile, ma organizzata in modo casuale. Inoltre, scaffold con una struttura organizzata possono attivare in modo più efficiente processi di meccanotrasduzione a livello cellulare, innescando la rigenerazione dell'osso maturo e organizzato.

L'innovazione proposta è basata su un cambiamento paradigmatico dal processo di sintesi di ceramica classico a un " processo di sintesi/consoiidamento in una sola fase ", che consente la generazione di fasi ceramiche con una composizione chimica definita, organizzate in un grande corpo in 3D con una morfologia complessa, struttura gerarchica e, allo stesso tempo, prestazioni meccaniche ottimizzate, a partire da strutture naturali organizzate gerarchicamente. A questo riguardo la trasformazione biomorfica è il fulcro di questo approccio innovativo che può essere applicato a strutture naturali organizzate gerarchicamente (ad esempio, legni, piante, esoscheletri).

La trasformazione biomorfica di strutture lignee in ceramiche che imitano un osso è stata sperimentata con successo usando legni con strutture porose come legno di pino e rattan, e legni più densi come quercia rossa e sipo, come modelli per riprodurre la struttura e le prestazioni meccaniche di un osso spugnoso e corticale, rispettivamente.

L'uso di legno nella formazione di scaffold di idrossiapatite biomimetica è stato riportato da Anna Tampieri et al. nel Journal of Material Chemistry, 2009, 19, 4973-4980. In questa pubblicazione, Tampieri et al. descrivono il processo di conversione di pezzi lunghi 1 cm (un pezzo piccolo, inadeguato per la rigenerazione di difetti di dimensione critica) di legno di rattan e legno di pino in idrossiapatite. Il processo comprendeva la pirolisi dei campioni di legno a una temperatura di 1000 °C usando un tasso di riscaldamento lento, seguita da carburizzazione in cui il modello di carbonio era trasformato in carburo di calcio. La carburizzazione veniva ottenuta tramite infiltrazione in fase liquida o infiltrazione in fase vapore. La filtrazione di vapore era eseguita a temperature superiori al punto di ebollizione del calcio (1484 °C). L'infiltrazione di vapore era più efficace della filtrazione liquida nel mantenere la struttura iniziale del modello organico soprattutto a livello micrometrico. Il processo di carburizzazione comprendeva il riscaldamento iniziale del legno pirolizzato a 800 °C, seguito da riscaldamento a 1100 °C e infine a 1650 °C per 3 ore. Era necessario riscaldare il legno pirolizzato a questa temperatura per 3 ore per assicurarsi che la reazione giungesse al completamento. A temperature più alte, si rilevava la deformazione del carburo di calcio. In seguito alla carburizzazione, lo scaffold di carburo di calcio tridimensionale era ossidato per trasformare il carburo di calcio in ossido di calcio, mantenendo al contempo la morfologia del legno nativo. Dopo l'ossidazione, lo scaffold di ossido di calcio tridimensionale veniva sottoposto a carbonatazione per trasformare lo scaffold di ossido di calcio in carbonato di calcio. Sono stati impiegati valori di alta pressione (2,2 MPa) per permettere la penetrazione di CO2 attraverso l'accumulo di CaCOa formatosi, fino al nucleo della struttura di CaO. Si è riscontrato che la conversione di CaO in CaC03 non era correlata alla temperatura. La fase finale nella formazione dello scaffold di ceramica di idrossiapatite tridimensionale con una morfologia anisotropa organizzata gerarchicamente del legno nativo era la fosfatizzazione. In questa fase, i modelli di CaC03derivati da legno sono stati immersi in una soluzione acquosa di KH2P04a una temperatura di 200 °C, sotto una pressione di 1,2 MPa per 24 ore.

Il processo sopra descritto ha prodotto scaffold di ceramica di idrossiapatite con la morfologia anisotropa organizzata gerarchicamente del legno nativo.

La resistenza alla compressione dello scaffold derivato dal legno di pino, misurata in direzione longitudinale era nell'intervallo tra 2,5 e 4 MPa, e in direzione trasversale, era nell'intervallo tra 0,5 e 1 MPa.

Ciò nonostante, la resistenza alla compressione dello scaffold derivato dal legno di pino era scarsa (2,5-4 MPa in direzione longitudinale) e dunque tramite questo processo sono ottenibili solo scaffold di dimensione limitata, tipicamente di meno di 1 cm.

La summenzionata fase di fosfatizzazione nella conversione di legno in idrossiapatite, è stata riportata in maggior dettaglio da Ruffini et al. in Chemical Engineering Journal 217 (2013) 150-158. In questa pubblicazione, sono stati usati come materiali di partenza modelli cilindrici di carbonato di calcio derivato da rattan aventi diametro di 8 mm e lunghezza di 10 mm. Il processo di fosfatizzazione è stato effettuato usando soluzioni acquose di idrogenofosfato di diammonio, diidrogenofosfato di ammonio e ammoniaca.

La domanda di brevetto WO 2012/063201 pubblicata il 18 maggio 2012, descrive un sostituto osseo comprendente un nucleo, a base di idrossiapatite, ottenuto da almeno un legno poroso, e un guscio a base di idrossiapatite o carburo di silicio ottenuto da almeno un legno avente una porosità inferiore rispetto all'almeno un legno del nucleo. Il guscio è stato preparato in una forma cilindrica cava adatta per accogliere il nucleo, il quale poteva essere preparato come un cilindro solido che è inserito nella cavità del guscio. Nella domanda è descritto anche il processo per ottenere il sostituto osseo dal legno. La prima fase è la pirolisi di un legno nativo come rattan o pino, riscaldandolo a una temperatura tra 800 e 2000 °C. Da questo processo, è ottenuto un materiale di carbonio. Nella seconda fase, il materiale di carbonio è trasformato in carburo di calcio a una temperatura tra 1500 e 1700 °C. In seguito, il carburo di calcio è ossidato a una temperatura tra 900 e 1000 °C. Al fine di convertire il materiale di ossido di calcio in carbonato di calcio, è eseguita la carbonatazione in un'autoclave a una temperatura di 400 °C con una pressione di C02di 2,2 MPa per 24 ore. Il materiale di carbonato di calcio è poi trasformato in idrossiapatite parzialmente sostituita con carbonato tramite fosfatizzazione. I risultanti scaffold di idrossiapatite derivati da rattan, hanno una resistenza alla compressione tra 4 e 5 MPa in direzione longitudinale, e una resistenza alla compressione di 1 MPa in direzione trasversale.

Sebbene le summenzionate pubblicazioni descrivano la trasformazione riuscita di un legno come rattan e pino in idrossiapatite, riproducendo al contempo in una certa misura la morfologia tridimensionale del legno, non sono stati ottenuti scaffold che mostrino caratteristiche adeguate per l'applicazione clinica.

Infatti tutte le pubblicazioni menzionate si riferiscono a scaffold di idrossiapatite ottenuti da legno aventi piccole dimensioni (ovvero un volume di meno di 1 cm<3>) che non possono avere reali applicazioni cliniche. I processi descritti nella tecnica anteriore non sono adatti per produrre scaffold di idrossiapatite aventi dimensioni idonee per applicazioni cliniche, come per la rigenerazione di difetti di un osso sottoposto a carichi dove sono necessari scaffold di grandi dimensioni.

Dunque rimane la necessità nella tecnica di uno scaffold biomorfico con una composizione chimica biomimetica che mostri prestazioni meccaniche adeguate, una morfologia favorente la colonizzazione cellulare e la crescita vascolare e, allo stesso tempo, che abbia dimensioni idonee per applicazioni cliniche.

Uno scaffold biomorfico di questo tipo sarebbe particolarmente adatto per la rigenerazione ossea, in particolare per l'impianto in difetti di osso sottoposto a carichi, come le ossa lunghe degli arti (ad esempio femore, tibia, metatarso, omero), ma anche per la sostituzione e rigenerazione di ossa della colonna vertebrale (ad esempio vertebre, disco intervertebrale), parti di osso cranico o parti di osso maxillo-facciale.

La presente invenzione soddisfa le necessità di cui sopra fornendo uno scaffold di idrossiapatite particolarmente adatto per la sostituzione e rigenerazione ossea.

Sommario dell’invenzione

In generale, la presente descrizione descrive uno scaffold di idrossiapatite ottenuto da un legno avente una porosità totale tra il 60% e il 95%, detta porosità essendo misurata dopo aver sottoposto il legno a una fase di pirolisi, lo scaffold avendo una lunghezza, misurata lungo una direzione in cui una dimensione dello scaffold è massima, maggiore o uguale a 2 cm. Più in particolare la presente descrizione descrive uno scaffold di idrossiapatite biomorfica ottenuto da un legno avente una porosità totale tra il 60% e il 95% (detta porosità essendo misurata dopo aver sottoposto il legno a una fase di pirolisi), detta idrossiapatite essendo caratterizzata da una struttura dei pori organizzata gerarchicamente e da una resistenza alla compressione di più di 5 MPa, preferibilmente tra 10 MPa e 20 MPa, misurata nella direzione lungo i pori simili a canali (direzione longitudinale).

Preferibilmente l'idrossiapatite dell'invenzione mostra una resistenza alla compressione lungo la direzione dei canali trasversali (direzione trasversale) fino a 10 MPa.

Preferibilmente, lo scaffold di idrossiapatite biomorfica ottenuto da legno, ha una struttura dei pori organizzata gerarchicamente che deriva dalla struttura dei pori organizzata gerarchicamente del legno da cui esso è ottenuto (legno nativo).

La presente descrizione si riferisce altresì a uno scaffold di idrossiapatite biomorfica derivato da legno, in cui l'idrossiapatite è parzialmente sostituita con uno o più ioni selezionati dal gruppo comprendente magnesio, stronzio, silicio, carbonato, sodio e potassio.

Il legno da cui è derivata l'idrossiapatite biomorfica ha una porosità totale tra il 60% e il 95%, preferibilmente tra il 65% e i'85% (detta porosità essendo misurata dopo aver sottoposto il legno a una fase di pirolisi). Legni mostranti una porosità in questi intervalli includono legno di rattan, pino, abachi e balsa. Preferibilmente l'idrossiapatite biomorfica è ottenuta da legno di rattan.

Lo scaffold di idrossiapatite biomorfica ottenuto da legno secondo l'invenzione presenta coesione strutturale e proprietà meccaniche che lo rendono particolarmente adatto per l'uso come sostituto osseo.

Dunque, la presente descrizione si riferisce all'uso dello scaffold di idrossiapatite biomorfica come sostituto osseo, così come a un sostituto osseo comprendente detto scaffold di idrossiapatite biomorfica. L'invenzione si riferisce altresì a un sostituto osseo costituito da detto scaffold di idrossiapatite biomorfica.

Lo scaffold di idrossiapatite biomorfica derivato da legno può essere usato come sostituto osseo per rigenerare un osso o una porzione di osso, in particolare, ossa umane o animali. Preferibilmente, lo scaffold di idrossiapatite biomorfica derivato da legno può essere usato come sostituto osseo per ossa o porzioni di osso che sono sottoposte a carichi meccanici. Più preferibilmente l'osso o porzioni di osso sono ossa lunghe della gamba e del braccio come la tibia, il metatarso, il femore, l'omero e il radio.

Lo scaffold di idrossiapatite biomorfica derivato da legno può altresì essere usato nella sostituzione e/o ricostruzione di parti di osso cranico, parti di osso maxillo-facciale e ossa della colonna vertebrale (ad esempio vertebre, disco intervertebrale).

Lo scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo l'invenzione può essere altresì usato come filtro per acqua o aria.

La presente descrizione descrive altresì un processo per ottenere uno scaffold di idrossiapatite biomorfica derivato da legno.

Sebbene siano descritte molteplici forme di realizzazione, altre forme di realizzazione appariranno evidenti ai tecnici del ramo dalla seguente descrizione dettagliata. Come risulterà evidente, alcune forme di realizzazione, come descritte nella presente, sono suscettibili di modificazioni in vari aspetti ovvi, il tutto senza distaccarsi dall'invenzione. Pertanto, i disegni e la descrizione dettagliata sono da considerarsi di natura illustrativa e non limitativa.

Breve descrizione delle figure

Le seguenti figure illustrano forme di realizzazione preferite dell'oggetto descritto nella presente. L'oggetto rivendicato può essere compreso tramite riferimento alla seguente descrizione considerata congiuntamente alle unite figure, in cui:

la Fig. 1 mostra una particolare forma di realizzazione dello scaffold biomorfico che comprende un canale centrale.

La Fig. 2 mostra fotografie che illustrano tessuti di calotte craniche di topi espiantate dopo 8 settimane. È stata ottenuta una formazione di osso estesa e una penetrazione dei pori dello scaffold in misura simile quando impiantato da solo o con cellule stromali osteogeniche, dove a) rappresenta legno e nessuna cellula, b) rappresenta idrossiapatite e nessuna cellula, c) rappresenta legno e cellule, e d) rappresenta idrossiapatite e cellule. Le frecce in Figura 3 f) puntano ai pori simili a canali dello scaffold i quali imitano i sistemi haversiani. I sistemi haversiani o osteoni sono l'unità funzionale di osso compatto, in forma di cilindri fatti di lamelle ossee organizzate in strati concentrici. Al centro degli osteoni è presente un canale, contenente il nervo osseo e la circolazione sanguigna.

La Fig. 3 mostra una curva sforzo-deformazione di uno scaffold biomorfico sottoposto a carico compressivo, in cui y = sforzo (N), e x = deformazione (mm).

La Fig. 4 mostra la distribuzione del volume di poro interno dell'idrossiapatite biomorfica della presente descrizione comparata con il volume di poro del l'id ross iapatite strutturata gerarchicamente ottenuta con un metodo noto nella tecnica.

La Fig. 5 mostra un grafico che rappresenta la vitalità migliorata di cellule staminali mesenchimali quando a contatto con scaffold comprendenti il 2 e il 5% in moli di Sr, rispetto a uno scaffold privo di stronzio (BC) dopo 24 ore, 48 ore, 72 ore, 7 giorni e 14 giorni, y = % rispetto a BC.

La Fig. 6 mostra grafici che rappresentano l'espressione di geni importanti per l'osteogenesi, come (a) RUNX2 e (b) ALP in scaffold contenenti il 2% in moli (Sr2%-BC) e il 5% in moli (Sr5%-BC) di stronzio, y = fold change di espressione rispetto a BC e x = giorni.

La Fig. 7 mostra un grafico che rappresenta la vitalità degli osteoblasti quando a contatto con scaffold comprendenti il 2% in moli (Sr2%-BC) e il 5% in moli (Sr5%-BC) di Sr, rispetto a uno scaffold privo di stronzio (BC) dopo 24 ore, 48 ore, 72 ore, 7 giorni e 14 giorni, y = % rispetto a BC.

La Fig. 8 mostra grafici che rappresentano l'espressione di geni importanti per l'osteogenesi, come (a) Osterix, (b) BGlap, e (c) IBSP in scaffold contenenti il 2% in moli (Sr2%-BC) e il 5% in moli (Sr5%-BC) di stronzio, y = fold change di espressione rispetto a CT e x = giorni.

La Fig. 9 mostra grafici che rappresentano l’espressione di geni importanti per gli osteoclasti, come (a) Oscar, (b) CTSK, e (c) Itg β3 in scaffold contenenti il 2% in moli (Sr2%-BC) e il 5% in moli (Sr5%-BC) di stronzio, y = fold change di espressione rispetto a CT e x = giorni. Si può osservare una significativa diminuzione dei geni coinvolti nei principali percorsi molecolari degli osteoclasti nel tempo, indicante dunque che la presenza di ioni Sr<2+>nello scaffold inibisce la formazione e l'attività degli osteoclasti.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

Come usato nella presente descrizione e nelle unite rivendicazioni, “struttura dei pori gerarchica” o “struttura dei pori organizzata gerarchicamente” indica un materiale avente una struttura dei pori tridimensionale anisotropa in cui pori simili a canali sono interconnessi attraverso canali trasversali e in cui sono presenti micropori nell'area circostante i pori simili a canali.

Come usato nella presente descrizione e nelle unite rivendicazioni, i valori di “resistenza alla compressione” sono ottenuti con il metodo descritto nella seguente descrizione esercitando forze meccaniche lungo le direzioni longitudinale e trasversale, rispetto ai pori simili a canali.

Come usato nella presente descrizione e nelle unite rivendicazioni, “difetto osseo” si riferisce a una parte o porzione mancante dell'osso o all'intero osso mancante che deve essere totalmente sostituito dallo scaffold dell'invenzione.

Gli inventori della presente domanda di brevetto hanno sorprendentemente trovato che è possibile ottenere uno scaffold di idrossiapatite biomorfica da legno il quale mostra una composizione chimica biomimetica, adeguate prestazioni meccaniche, una morfologia favorente la colonizzazione cellulare e la crescita vascolare e, allo stesso tempo, ha dimensioni idonee per applicazioni cliniche.

In un primo aspetto, la presente descrizione descrive uno scaffold di idrossiapatite biomorfica ottenuto da un legno avente una porosità totale tra il 60% e il 95%, detta porosità essendo misurata dopo aver sottoposto il legno a una fase di pirolisi, lo scaffold avendo una lunghezza, misurata lungo una direzione in cui una dimensione dello scaffold è massima, maggiore o uguale a 2 cm.

Preferibilmente, lo scaffold ha una lunghezza, misurata lungo una direzione in cui una dimensione dello scaffold è massima, che è maggiore o uguale a 2 cm e raggiunge un valore finale che è determinato secondo l'applicazione clinica. Ad esempio nel caso di sostituzione ossea di ossa lunghe, come tibia, femore, metatarso, omero, radio, la lunghezza dello scaffold, misurata lungo una direzione in cui una dimensione dello scaffold è massima, può essere compresa tra 2 e 20 cm.

Preferibilmente, lo scaffold dell'invenzione ha una resistenza alla compressione misurata nella direzione longitudinale di più di 5 MPa, preferibilmente tra 10 MPa e 20 MPa.

Preferibilmente lo scaffold dell'invenzione mostra una resistenza alla compressione lungo la direzione trasversale fino a 10 MPa.

Preferibilmente, lo scaffold di idrossiapatite biomorfica è caratterizzato da una struttura dei pori organizzata gerarchicamente.

La “struttura dei pori gerarchica” o “struttura dei pori organizzata gerarchicamente” dello scaffold di idrossiapatite dell'invenzione deriva dalla struttura gerarchica tridimensionale complessa del legno di partenza da cui lo scaffold è ottenuto e dunque ha una gamma di pori di dimensioni differenti. I pori di dimensioni differenti nella struttura gerarchica la rendono desiderabile per l'uso come sostituto osseo.

Ad esempio, pori aventi un diametro ≥ 200 pm, preferibilmente tra 150 e 300 μιτι, più preferibilmente 200-300 pm permetteranno la colonizzazione e la proliferazione cellulare e la formazione di un albero vascolare appropriato. Pori aventi un diametro ≤ 10 μιτι, in particolare tra 0,01 e 0,1 μιτπ, che interconnettono parzialmente i pori simili a canali, permettono lo scambio di fluidi nutrienti e lo scarico dei prodotti di scarto del metabolismo cellulare.

La conservazione della struttura dei pori gerarchica del legno nell'idrossiapatite fornisce scaffold con caratteristiche meccaniche ottimali e consente lo scarico efficiente di carichi meccanici.

Poiché ridrossiapatite ottenuta da legno riproduce nel dettaglio la struttura di un materiale naturale, essa può essere definita biomorfica.

In particolare, la struttura dei pori organizzata gerarchicamente dello scaffold dell'invenzione include tra il 30% e Γ80% (della porosità totale) di pori aventi un diametro al di sotto di 150 μιτι, il rimanente fino al 100% della porosità totale essendo pori aventi un diametro maggiore di 150 μιτι.

In una forma di realizzazione, quando il legno di partenza è rattan, almeno il 25% della porosità totale, preferibilmente tra il 25% e il 50% della porosità totale dello scaffold di idrossiapatite è dovuta a pori aventi un diametro ≤ 0,1 μιτπ, in particolare tra 0,01 e 0,1 μηπ.

In una forma di realizzazione, quando il legno di partenza è rattan, almeno il 30% della porosità totale dello scaffold di idrossiapatite è dovuta a pori che hanno un diametro ≥ 200 μιτι.

Il legno usato per ottenere lo scaffold di idrossiapatite può essere un qualsiasi legno con elevata porosità, ad esempio avente una porosità totale tra il 60% e il 95%, più preferibilmente una porosità tra il 65% e Γ85% (detta porosità essendo misurata dopo aver sottoposto il legno a una fase di pirolisi).

Esempi di legni idonei usati per ottenere l'idrossiapatite includono legno di rattan, pino, abachi e balsa, preferibilmente il legno usato è legno di ratta ri.

Lo scaffold di idrossiapatite ottenuto da legno può comprendere idrossiapatite parzialmente sostituita con uno o più ioni. Esempi di tali ioni sono carbonato, magnesio, stronzio, silicio, sodio e potassio. L'introduzione di carbonato nel sito fosfato fornisce disordine strutturale simile all'osso, una maggiore biosolubilità, e una migliore affinità superficiale agli osteoblasti.

L'introduzione di magnesio fornisce capacità aumentata di apposizione e formazione del nuovo osso. L'introduzione di stronzio aiuta a ristabilire la produzione di osso, affetto da malattie metaboliche come l'osteoporosi, cosicché la sua presenza può aumentare la rigenerazione dell'osso.

Secondo un'ulteriore forma di realizzazione, lo scaffold di idrossiapatite biomorfica della presente descrizione può comprendere:

- 0-15% in peso di magnesio, preferibilmente 1-10% in peso; e/o

- 0-15% in peso di carbonato, preferibilmente 1-10% in peso; e/o

- 0-15% in peso di stronzio, preferibilmente 1-10% in peso; e/o

- 0-15% in peso di potassio, preferibilmente 1-10% in peso; e/o

- 0-15% in peso di sodio, preferibilmente 1-10% in peso; e/o

- 0-15% in peso di silicio, preferibilmente 1-10% in peso.

Lo scaffold di idrossiapatite biomorfica ottenuto da legno secondo la presente descrizione possiede caratteristiche di bioattività e di bioriassorbimento combinate con caratteristiche di resistenza meccanica e dimensioni che lo rendono particolarmente idoneo per l'uso clinico come sostituto osseo, in particolare in esseri umani e animali. Un sostituto osseo di questo tipo può essere usato per sostituire e/o ricostruire e/o rigenerare un osso, porzioni di osso o difetti ossei. Ad esempio, il sostituto osseo può essere usato per sostituire o rigenerare un osso o porzioni di osso che sono sottoposte a carichi meccanici. Ad esempio, il sostituto osseo può essere usato per sostituire o rigenerare le ossa lunghe delle braccia e delle gambe. Tali ossa lunghe possono includere la tibia, il femore, il metatarso, l'omero, il radio, ecc.

Il sostituto osseo può anche essere usato nella sostituzione e/o ricostruzione di parti di osso cranico, parti di osso maxillo-facciale e ossa della colonna vertebrale (ad esempio vertebre, disco intervertebrale).

Quando usato come sostituto osseo, lo scaffold di idrossiapatite biomorfica può avere una forma che si adatta alla forma del difetto osseo che deve essere ricostruito in modo tale da riempire sostanzialmente la lacuna ossea. Dunque, lo scaffold e il sostituto osseo secondo l'invenzione possono avere una qualsiasi forma idonea allo scopo di ricostruire e rigenerare difetti ossei o sostituire qualsiasi parte mancante dell'osso. Ad esempio lo scaffold o il sostituto osseo secondo la presente descrizione possono assumere la forma di un cilindro, di un prisma retto, o di un cuboide. In una forma di realizzazione, lo scaffold o il sostituto osseo comprende un canale centrale con un diametro tra circa il 20% e circa il 60% del diametro dello scaffold o del sostituto osseo. In particolare, lo scaffold o il sostituto osseo ha una forma tubolare.

In una forma di realizzazione, la presente descrizione si riferisce inoltre a uno scaffold o a un sostituto osseo avente una forma cilindrica, a prisma retto, a cuboide o tubolare, avente un'altezza maggiore o uguale a 2 cm.

In una forma di realizzazione della presente descrizione, lo scaffold o il sostituto osseo può essere rivestito con un sottile strato a base di idrossiapatite e/o collagene per aumentare l'adesione e la proliferazione cellulare, e dunque l'osteointegrazione nel tessuto osseo circostante. Lo strato può comprendere in aggiunta idrossiapatite sostituita con ioni importanti per la stimolazione della rigenerazione ossea come carbonato, magnesio, silicio, potassio, sodio e stronzio.

In un'ulteriore forma di realizzazione della presente descrizione, lo soaffold o il sostituto osseo può essere immerso in un polimero naturale (scelto tra il gruppo comprendente gelatina, alginato, chitosano, gellano, cellulosa) per aumentare ulteriormente le proprietà meccaniche e promuovere ulteriormente l'adesione cellulare.

L'invenzione si riferisce inoltre a un metodo di ricostruzione e/o rigenerazione di un osso umano o animale avente un difetto osseo, comprendente le fasi di:

- fornire un sostituto osseo comprendente o consistente nello scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo l'invenzione avente una forma che corrisponde alla forma di un difetto osseo;

- impiantare il sostituto osseo nel difetto osseo del paziente.

Preferibilmente, il metodo di ricostruzione e/o rigenerazione include le fasi di fornire un modello in 3D del difetto osseo, e in base al modello 3D ottenuto, conferire allo scaffold una forma corrispondente alla forma del difetto osseo. La fase di conferire una forma allo scaffold può essere applicata al pezzo di legno di partenza o allo scaffold di idrossiapatite ottenuto alla fine del processo di trasformazione secondo l'invenzione. Preferibilmente la fase di conferire la forma è applicata al pezzo di legno di partenza.

Lo scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo l'invenzione e lo scaffold di idrossiapatite biomorfica parzialmente sostituita con uno o più ioni, è ottenuto da un processo di trasformazione multifase comprendente le seguenti fasi:

1) Pirolisi: un legno nativo è riscaldato a una temperatura nell'intervallo da 600 °C a 1000 °C in un'atmosfera inerte per permettere la decomposizione e l'eliminazione di tutte le sostanze organiche. Da questo processo si ottiene un modello di carbonio.

2) Carburizzazione: nel modello di carbonio viene infiltrato calcio allo stato vapore a una temperatura nell'Intervallo di 900-1500 °C, preferibilmente da 900 a 1200 °C, e a una pressione < 1000 mbar, preferibilmente nell'intervallo da 0,5 a 600 mbar, trasformando così il modello di carbonio in carburo di calcio.

3) Ossidazione: il modello di carburo di calcio (CaC2) è riscaldato in aria a una temperatura nell'intervallo da 750 a 1300 °C, preferibilmente 1000-1200 °C, consentendo così la trasformazione del carburo di calcio in ossido di calcio.

4) Idratazione: il modello di ossido di calcio è esposto ad acqua, consentendo così la captazione di acqua in una quantità di 1-25% in moli, preferibilmente 5-15% in peso.

5) Carbonatazione: il modello di ossido di calcio è trasformato in carbonato di calcio tramite riscaldamento a una temperatura nell'Intervallo da 500 a 900 °C, preferibilmente a una temperatura nell’Intervallo da 750 a 850 °C sotto una pressione di CO2, 0 una pressione di miscela di CO2 e un gas inerte (ad esempio argon, azoto). L'intervallo di pressione è da 4 a 20 MPa.

6) Fosfatizzazione: il modello di carbonato di calcio è trattato con almeno un sale fosfato.

Nella fase di pirolisi 1) del processo multifase, il legno nativo è preferibilmente selezionato tra legno di rattan, pino, abachi e balsa. Più preferibilmente il legno nativo è legno di rattan.

Prima della fase di pirolisi 1), il legno nativo di partenza può essere opzionalmente essiccato a una temperatura tra 50 °C e 90 °C, preferibilmente a una temperatura tra 60 °C e 80 °C, più preferibilmente a una temperatura tra 65 °C e 75 °C. Il legno nativo può essere essiooato per più di 6 ore, preferibilmente per più di 12 ore, preferibilmente per più di 18 ore, preferibilmente per un tempo compreso tra 20 e 30 ore.

Nella fase di pirolisi del processo multifase, l'atmosfera inerte può essere un'atmosfera di un gas selezionato dal gruppo comprendente azoto e argon.

Nella fase di pirolisi del processo multifase, il legno nativo può essere riscaldato a una temperatura tra 600 °C e 1000 °C, preferibilmente a una temperatura tra 800 °C e 1000 °C. La fase di pirolisi può durare più di 6 ore, preferibilmente più di 12 ore, preferibilmente più di 18 ore, preferibilmente detta fase può durare per un tempo compreso tra 20 e 30 ore.

Il ciclo termico della fase di pirolisi 1) può essere eseguito riscaldando il legno nativo al tasso non superiore a 5 °C/min, preferibilmente non superiore a 3 °C/min e tramite raffreddamento a un tasso non superiore a 3 °C/min, preferibilmente non superiore a 2 °C/min, per evitare la formazione di crepe e la frattura interna del materiale.

Prima della fase di pirolisi 1), il metodo multifase può comprendere in aggiunta una fase i) di selezione e preparazione del legno nativo, in cui detto legno nativo può essere tagliato in un pezzo avente una forma corrispondente alla forma di un difetto osseo da ricostruire. In particolare il legno nativo è formato in un pezzo di legno avente una lunghezza, misurata lungo una direzione in cui la dimensione del legno è massima, che è maggiore o uguale a 2 cm. Preferibilmente, la dimensione del legno raggiunge un valore finale che è determinato secondo l'applicazione clinica.

Ad esempio, il legno nativo può essere formato sotto forma di un cilindro, prisma retto, o cuboide. Il legno nativo può anche essere formato in modo tale da comprendere un canale centrale con un diametro da circa il 20% a circa il 60% del diametro del pezzo di legno. In particolare, il legno nativo può essere tagliato in una forma tubolare.

Preferibilmente, la fase i) di selezione e preparazione del legno nativo, comprende le fasi di: fornire un modello in 3D di un difetto osseo e, in base al modello in 3D ottenuto, conferire al legno nativo una forma corrispondente alla forma del difetto osseo. La fase di conferire una forma al legno nativo può essere applicata al legno nativo di partenza o allo scaffold di idrossiapatite ottenuto al termine del processo di trasformazione multifase. Preferibilmente la fase di conferire la forma è applicata al legno nativo di partenza per evitare danni interni ed esterni (frattura) dello scaffold.

Nella fase di carburizzazione 2) del processo multifase, la reazione è preferibilmente condotta con un rapporto molare Ca/C (all'inizio della reazione) nell'intervallo da 1,10 a 2,50, preferibilmente nell'intervallo da 1,50 a 2,00. Il rapporto molare Ca/C è importante perché rapporti al di sotto dell'Intervallo conducono a reazioni incomplete e rapporti al di sopra dell'Intervallo conducono all'ostruzione dei pori da parte di residui di Ca. Nella fase di carburizzazione del processo multifase, il modello di carbonio è riscaldato a un tasso di riscaldamento nell'Intervallo da 1 a 10 °C/min, preferibilmente a un tasso di riscaldamento nell'Intervallo da 1 a 7 °C/min. Le condizioni impiegate nella fase di carburizzazione del processo multifase assicurano che si osservino solo un numero minimo di difetti nella struttura dei pori gerarchica della struttura di carburo di calcio. Inoltre, queste condizioni assicurano una reattività adeguata e dunque facilitano le fasi seguenti del processo di trasformazione. Temperature più basse non assicurano un'adeguata evaporazione del calcio; temperature più alte conducono a un'eccessiva consolidazione del materiale, danneggiando così la microstruttura originale del legno e compromettendo l'esito delle seguenti fasi del processo.

Nella fase di ossidazione 3) del processo multifase, il modello di carburo di calcio può essere riscaldato fino a una temperatura finale nell'intervallo da 800 a 1300 °C, preferibilmente fino a una temperatura finale nell'Intervallo da 1000 a 1200 °C.

Nella fase di ossidazione del processo multifase, il modello di carburo di calcio può essere riscaldato a un tasso di riscaldamento nell'Intervallo da 1 a 15 °C/min, preferibilmente a un tasso di riscaldamento nell'intervallo da 1 a 7 °C/min.

Nella fase di idratazione 4) del processo multifase il modello di ossido di calcio è esposto ad acqua, consentendo dunque la captazione di acqua in una quantità preferibilmente compresa nell'intervallo di 1-25% in moli, più preferibilmente compresa nell'intervallo di 5-15% in moli. Questo attiva il modello di ossido di calcio per la seguente carbonatazione.

In una forma di realizzazione preferita, la fase di idratazione è condotta simultaneamente alla fase di carbonatazione, ad esempio usando C02arricchita con acqua.

Nella fase di carbonatazione 5) del processo multifase, l'uso di una temperatura elevata aumentando al contempo progressivamente la pressione di CO2 nel sistema fino ai valori indicati in precedenza, consente sorprendentemente la conversione sostanzialmente completa di ossido di calcio in un modello di carbonato di calcio che mostra coesione e resistenza meccanica sorprendentemente elevate.

La fase di carbonatazione del processo multifase può essere condotta secondo uno dei seguenti cicli termici:

- a una pressione costante di CO2 di circa 10 MPa, aumentando lentamente la temperatura a un valore nell'Intervallo di circa 750-850 °C, preferibilmente a circa 800 °C;

- a una temperatura costante di circa 750-850 °C, preferibilmente a circa 800 °C aumentando la pressione fino a circa 10 MPa;

- mantenendo la pressione a circa 4-6 MPa aumentando al contempo la temperatura fino a circa 750-850 °C, preferibilmente fino a circa 800 °C e successivamente aumentando la pressione fino a circalO MPa.

La fase di carbonatazione condotta nelle condizioni descritte in precedenza ha come risultato proprietà meccaniche superiori dello scaffold di idrossiapatite biomorfica ottenibile tramite il processo secondo l'invenzione rispetto a processi simili noti nella tecnica, in cui la fase di carbonatazione è condotta a un'alta temperatura e bassa pressione o ad alta pressione e bassa temperatura.

Nella fase di fosfatizzazione 6) del processo multifase, l'almeno un sale fosfato può essere selezionato dal gruppo consistente in fosfato di ammonio, fosfato di sodio, e fosfato di potassio. L'uso di fosfato di ammonio consente un miglior controllo del pH, per cui il processo di conversione è più efficace e il corpo risultante ha proprietà meccaniche e coesione fisica favorevoli.

Nella fase di fosfatizzazione del processo multifase, il modello di carbonato di calcio può essere immerso in una soluzione comprendente almeno uno di detti sali fosfati. La soluzione può avere una concentrazione da 0,1 a 5 M, preferibilmente una concentrazione da 0,5 a 2,0 M.

Il rapporto di partenza di PO4/CO3 nella fase di fosfatizzazione del processo multifase è preferibilmente da 1,5 a 5 volte il valore stechiometrico teorico, preferibilmente da 2 a 4 volte il valore stechiometrico teorico.

Nella fase di fosfatizzazione del processo multifase, il modello di carbonato di calcio immerso in una soluzione ricca di fosfato può essere riscaldato da 25 °C a 300 °C sotto una pressione vapore nell'intervallo da 0,1 a 2,5 MPa (condizioni idrotermiche).

La fase di fosfatizzazione può durare da circa 12 a circa 180 ore, preferibilmente da circa 48 a circa 120 ore.

Il pH di partenza della soluzione ricca di fosfato nella fase di fosfatizzazione del metodo multifase è preferibilmente tra pH 7 e 12.

La sostituzione dell'idrossiapatite con altri ioni può essere ottenuta introducendo sali solubili idonei contenenti gli ioni d'interesse durante o dopo il completamento del processo, preferibilmente durante il processo di fosfatizzazione. Ioni idonei possono includere stronzio, magnesio, silicio, carbonato, sodio, potassio e miscele degli stessi. Un esempio di una soluzione contenente ioni di magnesio è MgCÌ26H20,e un esempio di una soluzione contenente ioni di stronzio è SrCb.

Secondo una forma di realizzazione meno preferita, laddove il legno nativo non sia stato formato in forma e dimensioni adatte per essere usato come sostituto osseo (ovvero, la fase i) non è eseguita), lo scaffold di idrossiapatite biomorfica ottenuto dal processo multifase può convenientemente essere formato in uno scaffold avente la forma richiesta tramite tecniche note.

L'invenzione si riferisce altresì allo scaffold di idrossiapatite biomorfica ottenuto (o ottenibile) dal processo precedentemente descritto, avente proprietà fisiche e meccaniche migliorate rispetto a idrossiapatiti strutturate gerarchicamente ottenute tramite processi simili noti nella tecnica.

In particolare, lo scaffold di idrossiapatite biomorfica ottenuto (o ottenibile) dal processo della presente descrizione possiede tutte le caratteristiche descritte in precedenza per lo scaffold o sostituto osseo secondo l'invenzione.

La presente invenzione è ulteriormente illustrata tramite i seguenti esempi non limitativi.

Esempi

Metodi di misurazione

Porosità totale di legno sottoposto a una fase di pirolisi (legno pirolizzato): un pezzo di legno pirolizzato, formato come un prisma o un cilindro, è pesato, poi si ottiene il volume misurando diametro e altezza. La densità assoluta (A.D.) del legno pirolizzato è ottenuta tramite il rapporto peso/volume; la densità relativa (R.D.) è ottenuta dividendo la A.D. del legno pirolizzato per la densità teorica del carbonio (cioè R.D.=A.D./2,25). La porosità totale è ottenuta tramite 1-R.D.

Resistenza alla compressione: lo scaffold o sostituto osseo finale, formato come un prisma o un cilindro, è sottoposto a carichi usando una macchina di prova di tipo a vite universale per ottenere curve sforzodeformazione e il carico di rottura. La resistenza alla compressione è data dal rapporto tra il carico di rottura e l'area sottoposta a compressione. Diametro dei pori: la distribuzione della dimensione dei pori e la morfologia dei pori dello scaffold finale sono valutati per mezzo di porosimetria a intrusione di mercurio e microscopia elettronica a scansione, rispettivamente.

Esempio 1

Preparazione di un'idrossiapatite derivata da legno usando il processo multifase:

i) Un pezzo di partenza di legno di rattan nativo è formato in una forma cilindrica avente le seguenti dimensioni: diametro = 2 cm; altezza = 3 cm;

1) Pirolisi del legno nativo

Il pezzo di legno di partenza è essiccato a 70 °C per 24 ore, poi trattato a 800 °C per più di 30 minuti sotto flusso di azoto, trasformandosi così in un modello di carbonio puro. Ciclo termico: riscaldamento a 1 °C/min fino a 350 °C e 2 °C/min da 350 a 800 °C. Il campione è mantenuto a una temperatura di 800 °C per circa almeno 30 minuti e in seguito il modello è raffreddato a 1 °C/min.

2) Carburizzazione

Il modello di carbonio è sottoposto a riscaldamento a 1000 °C sotto un'atmosfera di argon a 0,5 mbar, trasformandosi così in carburo di calcio. Tempo di permanenza a 1000 °C = 30 minuti.

3) Ossidazione

Il modello di carburo di calcio è riscaldato in aria fino a 1100 °C seguendo un tasso di riscaldamento nell'intervallo di 7 °C/min, consentendo così la completa trasformazione in ossido di calcio.

4) Idratazione

Il corpo di ossido di calcio è attivato tramite esposizione ad acqua, consentendo così la captazione di acqua nella quantità del 10% in moli.

5) Carbonatazione

Il corpo idratato precondizionato è riscaldato a 800 °C sotto una pressione di C02progressivamente crescente da 0,5 a 10 MPa. Questo trasforma il corpo di ossido di calcio in carbonato di calcio.

6) Fosfatizzazione

Il corpo di carbonato di calcio è immerso in una soluzione di 0,5 M di fosfato di ammonio e un rapporto di partenza di P04su CO3 di 2 volte il valore stechiometrico teorico, a una temperatura di 200 °C sotto una pressione di vapore acqueo di 2 MPa.

La resistenza alla compressione dello scaffold è stata valutata esercitando forze meccaniche lungo la direzione perpendicolare e trasversale, rispetto aN'orientamento dei pori simili a canali.

Tramite carichi lungo la direzione dei pori (la quale è la configurazione che meglio riflette la condizione clinica per imitare gli stimoli biomeccanici in vivo nel caso di ossa segmentali lunghe), lo scaffold (sviluppato come un cilindro cavo con diametro esterno = 20 mm; diametro interno = 8 mm; altezza = 17 mm, e un'estensione di pori del 60-65% in volume) ha mostrato resistenza alla compressione fino a 16 MPa (ovvero 470 Kg di carico massimo (Figure 1 e 3). Nella direzione trasversale, lo scaffold ha mostrato resistenza alla compressione fino a 4 MPa.

Lo scaffold può altresì essere sottoposto a trattamento termico a una temperatura massima di 900 °C, in atmosfera controllata, per aumentare ulteriormente la resistenza meccanica dello scaffold.

Le caratteristiche microstrutturali simili all'osso dello scaffold biomorfico consentono la consegna di informazioni topologiche alle cellule per costruire nuovo tessuto osseo con una struttura organizzata. Questo è stato confermato tramite prove in vivo dove lo scaffold è stato impiantato in femori di coniglio e calotte craniche di topo.

Lo scaffold non ha indotto reazioni tossiche avverse né necrosi o infezioni dopo l'intervento chirurgico. Lo scaffold ha dato una colonizzazione estesa da parte dell'osso appena formato dopo 1 mese, similmente al controllo che era uno scaffold di apatite porosa disponibile in commercio: EngiPore, Finceramica S.p.A., Italia.

I tessuti espiantati da calotte craniche di topi hanno mostrato formazione di osso estesa e penetrazione nei pori dello scaffold sia quando lo scaffold era impiantato da solo sia quando erano state aggiunte cellule stromali osteogeniche allo scaffold impiantato (Figura 2a-d). La porosità simile a canali dello scaffold ha indotto la formazione di strutture ossee imitanti sistemi haversiani (come indicato dalle frecce in figura 2f). Inoltre, i pori simili a canali dello soaffold hanno indotto una rapida angiogenesi così da aiutare la formazione e la penetrazione del nuovo osso. Questo risultato conferma che un orientamento idoneo della porosità in relazione airorientamento della rete vascolare endogena può essere efficace nel promuovere uno sviluppo precoce di angiogenesi estesa.

Esempio 2

Confronto di idrossiapatite biomorfica secondo l'invenzione e idrossiapatite strutturata gerarchicamente nota nella tecnica.

È stata fatta una prova di confronto tra la distribuzione della dimensione dei pori deN'idrossiapatite biomorfica secondo la presente descrizione ottenuta da legno nativo di rattan e la distribuzione della dimensione dei pori di un'idrossiapatite strutturata gerarchicamente ottenuta dallo stesso legno nativo secondo l'insegnamento di Anna Tampieri et al. nel Journal of Material Chemistry, 2009, 19, 4973-4980 usando l'insegnamento di Ruffini ef al. in Chemical Engineering Journal 217 (2013) 150-158 solo per la fase di fosfatizzazione (Miscela di NH4H2P04-(NH4)2HP04, pH=9, Tmax=60 °C, tempo=80h).

I risultati sono mostrati in Figura 4, in cui le colonne grigio scuro si riferiscono all'id ross iapatite biomorfica secondo l'invenzione e le colonne grigio chiaro all'idrossiapatite nota nella tecnica.

È evidente l'aumento nel numero di pori aventi diametro compreso nell'intervallo 200-300 μιτι nell'idrossiapatite biomorfica secondo la presente descrizione rispetto all'idrossiapatite organizzata gerarchicamente nota, detti pori essendo quelli con le dimensioni più appropriate per promuovere una vascolarizzazione fisiologica deN'idrossiapatite biomorfica quando impiantata come sostituto osseo. Inoltre, la stessa Figura 4 mostra un numero crescente di pori aventi un diametro nell'intervallo 0,01 - 0,1 micron, il che indica chiaramente che la microstruttura del legno nativo è conservata nel prodotto finale.

Esempio 3

Preparazione di un'idrossiapatite derivata da legno additivata con Mg<2+>e/o Sr<2+>:

Le fasi da 1 a 5 del metodo multifase come descritto nell'esempio 1 sono seguite per dare il corpo di carbonato di calcio. L'additivazione con ioni di Mg<2+>e/o Sr<2+>è stata ottenuta secondo ciascuno dei seguenti metodi:

Metodo 1

Una soluzione di Sr<2+>(in forma di SrCI) è aggiunta a 1,0 M di una soluzione ricca di fosfato. Il corpo di carbonato di calcio preparato secondo il metodo multifase è poi immerso nella soluzione combinata e riscaldato fino a una temperatura di 200 °C sotto una pressione di vapore acqueo di 2 MPa. Ciò produce un'idrossiapatite additivata con Sr<2>con la morfologia del pezzo di legno di partenza.

Metodo 2

Il corpo di carbonato di calcio è immerso in 1,0 M di soluzione ricca di fosfato. Mentre si riscalda a una temperatura di 25-90 °C sotto una pressione di vapore acqueo di 0,1 MPa, si aggiunge progressivamente una soluzione di Sr<2+>. Ciò produce un'idrossiapatite additivata con Sr<2>con la morfologia del pezzo di legno di partenza.

Metodo 3

Il corpo di carbonato di calcio è immerso in una soluzione acquosa o organica contenente ioni di Sr<2+>per 24h. Esso è poi rimosso dalla soluzione ed è immerso in 1,0 M di una soluzione ricca di fosfato. Mentre si riscalda a una temperatura di 200 °C sotto una pressione di vapore acqueo nell'intervallo 0,5-1 ,5 MPa. Ciò produce un'idrossiapatite additivata con Sr<2>con la morfologia del pezzo di legno di partenza.

Proprietà dello scaffold sostituito con stronzio

Sono stati sviluppati scaffold di idrossiapatite sostituiti con stronzio che sono risultati mostrare una vitalità migliorata delle cellule staminali mesenchimali (MSC) rispetto agli scaffold privi di stronzio (Figura 5).

Gli scaffold di stronzio hanno altresì mostrato una morfologia ben diffusa e un'espressione aumentata di geni importanti per l'osteogenesi, come RUNX2 e ALP (Figura 6), agendo dunque come promotori di differenziazione osteoblastica. In particolare, rispetto allo scaffold privo di Sr, è stato rilevato un aumento significativo nel livello di mRNA di entrambi i geni (p<0,05). Questo aumento era particolarmente elevato per lo scaffold con il 2% in moli di Sr.

Si è osservata una proliferazione aumentata di pre-osteoblasti durante 14 giorni di indagine quando si sono usati scaffold di idrossiapatite sostituita con Sr (Figura 7). In effetti, un aumento di stronzio nello scaffold ha dato una vitalità cellulare molto più elevata nel lungo termine. Questi risultati implicano che la formazione di nuovo osso può essere indotta e sostenuta con successo.

Lo scaffold ha altresì dimostrato la possibilità di mantenere il fenotipo osteoblastico durante le due settimane di indagine (Figura 8).

Il comportamento delle cellule a contatto con lo scaffold sostituito con stronzio è stato indagato anche osservando il comportamento degli osteoclasti. È stata eseguita un'analisi morfologica preliminare per confermare e convalidare il modello di osteoclastogenesi. Gli osteoclasti cresciuti sulla superficie dello scaffold mostrano la loro tipica morfologia.

È stata valutata l'espressione genica relativa del marcatore principale coinvolto nell'attività e nella formazione degli osteoclasti (Oscar, Integrina β3 e Catepsina K) (Figura 9). L'analisi ha mostrato un calo significativo nell'espressione genica nel tempo di tutti i geni coinvolti nei principali percorsi molecolari degli osteoclasti, indicando così che la presenza di ioni di Sr<2+>nello scaffold inibisce la formazione e l'attività degli osteoclasti.

In conclusione, la sostituzione di idrossiapatiti con ioni di Sr<2*>ha prodotto un effetto biologico sulle cellule ossee, nello specifico provocando: i) un effetto induttivo significativo su geni correlati osteogenici di MSC; ii) un effetto induttivo sulla proliferazione degli osteoblasti e iii) un effetto inibitore sull'attività degli osteoclasti.

Nel caso di impianto in un difetto di osso segmentale, il nuovo scaffold è progettato per presentare un canale centrale che si estende in direzione parallela alla porosità unidirezionale principale così da essere esposto ai monconi di osso come guida per lo sviluppo di nuovo midollo osseo (Figura 1). La dimensione di canale è definita sulla base del difetto specifico; tuttavia, per mantenere una resistenza adeguata, il canale ha un diametro nell'intervallo del 20 - 60% rispetto alla larghezza dell'intero scaffold.

RIVENDICAZIONI

1. Scaffold di idrossiapatite biomorfica ottenuto da un legno avente una porosità totale tra il 60% e il 95%, detta porosità essendo misurata dopo aver sottoposto il legno a una fase di pirolisi, detto scaffold avendo una lunghezza, misurata lungo una direzione in cui una dimensione dello scaffold è massima, maggiore o uguale a 2 cm.

2. Scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 1 avente una resistenza alla compressione maggiore di 5 MPa, preferibilmente tra 10 MPa e 20 MPa.

3. Scaffold di ìdrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 1 o 2, avente una struttura dei pori organizzata gerarchicamente, la quale preferibilmente deriva dalla struttura dei pori organizzata gerarchicamente del legno da cui esso è ottenuto.

4. Scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui il legno è selezionato tra legno di rattan, pino, abachi e balsa, preferibilmente rattan.

5. Scaffold di ìdrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 3 o 4, in cui la struttura dei pori organizzata gerarchicamente include tra il 30 e l'80%, della porosità totale, di pori aventi un diametro al di sotto di 150 μιτι, 11 rimanente fino al 100% della porosità totale essendo pori aventi un diametro maggiore di 150 μιτι.

6. Scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 5, in cui, quando il legno è rattan, tra il 30% e il 60% della porosità totale dello scaffold è dovuta a pori aventi un diametro ≤ 10 μιτι.

7. Scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 6, in cui, quando il legno è rattan, almeno il 25% della porosità totale, preferibilmente tra il 25% e il 50% della porosità totale dello scaffold è dovuta a pori aventi un diametro ≤ 0,1 pm, in particolare tra 0,01 e 0,1 μιτι.

8. Scaffold di ìdrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 6 o 7, in cui, quando il legno è rattan, almeno il 30% della porosità totale dello scaffold è dovuta a pori che hanno un diametro ≥ 200 μιτι.

9. Scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui detta idrossiapatite è parzialmente sostituita con uno o più ioni selezionati dal gruppo comprendente magnesio, stronzio, silicio, carbonato, sodio e potassio.

10. Scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9, per l'uso in campo medico.

11. Scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 10 per l'uso come sostituto osseo.

12. Scaffold di idrossiapatite biomorfica per l'uso secondo la rivendicazione 11 avente una forma corrispondente alla forma di un difetto osseo da ricostruire.

13. Scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 11 o 12 per l'uso nella sostituzione o rigenerazione di un osso o di una porzione di osso.

14. Scaffold di idrossiapatite biomorfica per l'uso secondo la rivendicazione 13, in cui detto osso o porzioni di osso sono un osso o porzioni di osso sottoposto/e a carichi meccanici.

15. Scaffold di idrossiapatite biomorfica per l'uso secondo la rivendicazione 13, in cui detto osso o porzioni di osso sono ossa lunghe della gamba e del braccio, preferibilmente la tibia, il metatarso, il femore, l'omero o il radio.

16. Scaffold di idrossiapatite biomorfica per l'uso secondo la rivendicazione 13, in cui detto osso o porzioni di osso sono parti di osso cranico, ossa della colonna vertebrale o parti di osso maxillo-facciale.

17. Sostituto osseo comprendente lo scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 16.

18. Processo per produrre uno scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 16 o il sostituto osseo secondo la rivendicazione 17, comprendente le fasi di:

1 ) Pirolisi: un legno nativo è riscaldato a una temperatura nell'intervallo da 600 °C a 1000 °C in un'atmosfera inerte a dare un modello di carbonio; 2) Carburizzazione: nel modello di carbonio viene infiltrato calcio allo stato vapore a una temperatura nell'intervallo di 900-1500 °C, preferibilmente da 900 a 1200 °C e a una pressione di <1000 mbar, a dare un modello di carburo di calcio;

3) Ossidazione: il modello di carburo di calcio (CaC2) è riscaldato in aria a una temperatura nell'intervallo da 750 a 1300 °C, preferibilmente 1000-1200 °C, a dare un modello di ossido di calcio;

4) Idratazione: il modello di ossido di calcio è esposto ad acqua, consentendo così la captazione di acqua in una quantità di 1-25% in moli, preferibilmente 5-15% in moli;

5) Carbonatazione: il modello di ossido di calcio è trasformato in carbonato di calcio tramite riscaldamento a una temperatura nell'intervallo da 500 a 900 °C, preferibilmente a una temperatura nell'intervallo da 750 a 850 °C sotto una pressione nell'intervallo da 4 a 20 MPa;

6) Fosfatizzazione: il modello di carbonato di calcio è trattato con almeno un sale fosfato a dare lo scaffold di idrossiapatite biomorfica.

19. Idrossiapatite biomorfica ottenuta da un legno avente una porosità totale tra il 60% e il 95%, detta porosità essendo misurata dopo aver sottoposto il legno a una fase di pirolisi, detta idrossiapatite essendo caratterizzata da una struttura dei pori organizzata gerarchicamente e da una resistenza alla compressione maggiore di 5 MPa, preferibilmente tra 10 MPa e 20 MPa.

Claims (19)

1. RIVENDICAZIONI 1. Scaffold di idrossiapatite biomorfica ottenuto da un legno avente una porosità totale tra il 60% e il 95%, detta porosità essendo misurata dopo aver sottoposto il legno a una fase di pirolisi, detto scaffold avendo una lunghezza, misurata lungo una direzione in cui una dimensione dello scaffold è massima, maggiore o uguale a 2 cm.
2. 2. Scaffold di ìdrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 1 avente una resistenza alla compressione maggiore di 5 MPa, preferibilmente tra 10 MPa e 20 MPa.
3. 3. Scaffold di ìdrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 1 o 2, avente una struttura dei pori organizzata gerarchicamente, la quale preferibilmente deriva dalla struttura dei pori organizzata gerarchicamente del legno da cui esso è ottenuto.
4. 4. Scaffold di ìdrossiapatite biomorfica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui il legno è selezionato tra legno di rattan, pino, abachi e balsa, preferibilmente rattan.
5. 5. Scaffold di ìdrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 3 o 4, in cui la struttura dei pori organizzata gerarchicamente include tra il 30 e l'80%, della porosità totale, di pori aventi un diametro al di sotto di 150 μιτι, 11 rimanente fino al 100% della porosità totale essendo pori aventi un diametro maggiore di 150 μιτι.
6. 6. Scaffold di ìdrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 5, in cui, quando il legno è rattan, tra il 30% e il 60% della porosità totale dello scaffold è dovuta a pori aventi un diametro ≤ 10 μιτι.
7. 7. Scaffold di ìdrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 6, in cui, quando il legno è rattan, almeno il 25% della porosità totale, preferibilmente tra il 25% e il 50% della porosità totale dello scaffold è dovuta a pori aventi un diametro ≤ 0,1 pm, in particolare tra 0,01 e 0,1 μιτι.
8. 8. Scaffold di ìdrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 6 o 7, in cui, quando il legno è rattan, almeno il 30% della porosità totale dello scaffold è dovuta a pori che hanno un diametro ≥ 200 μιτι.
9. 9. Scaffold di idrossiapatite biomorfioa secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui detta idrossiapatite è parzialmente sostituita con uno o più ioni selezionati dal gruppo comprendente magnesio, stronzio, silicio, carbonato, sodio e potassio.
10. 10. Scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9, per l'uso in campo medico.
11. 11. Scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 10 per l'uso come sostituto osseo.
12. 12. Scaffold di idrossiapatite biomorfica per l'uso secondo la rivendicazione 11 avente una forma corrispondente alla forma di un difetto osseo da ricostruire.
13. 13. Scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo la rivendicazione 11 o 12 per l'uso nella sostituzione o rigenerazione di un osso o di una porzione di osso.
14. 14. Scaffold di idrossiapatite biomorfica per l'uso secondo la rivendicazione 13, in cui detto osso o porzioni di osso sono un osso o porzioni di osso sottoposto/e a carichi meccanici.
15. 15. Scaffold di idrossiapatite biomorfica per l'uso secondo la rivendicazione 13, in cui detto osso o porzioni di osso sono ossa lunghe della gamba e del braccio, preferibilmente la tibia, il metatarso, il femore, l'omero o il radio.
16. 16. Scaffold di idrossiapatite biomorfica per l'uso secondo la rivendicazione 13, in cui detto osso o porzioni di osso sono parti di osso cranico, ossa della colonna vertebrale o parti di osso maxillo-facciale.
17. 17. Sostituto osseo comprendente lo scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 16.
18. 18. Processo per produrre uno scaffold di idrossiapatite biomorfica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 16 o il sostituto osseo secondo la rivendicazione 17, comprendente le fasi di: 1 ) Pirolisi: un legno nativo è riscaldato a una temperatura nell'intervallo da 600 °C a 1000 °C in un'atmosfera inerte a dare un modello di carbonio; 2) Carburizzazione: nel modello di carbonio viene infiltrato calcio allo stato vapore a una temperatura nell'intervallo di 900-1500 °C, preferibilmente da 900 a 1200 °C e a una pressione di <1000 mbar, a dare un modello di carburo di calcio; 3) Ossidazione: il modello di carburo di calcio (CaC2) è riscaldato in aria a una temperatura nell'intervallo da 750 a 1300 °C, preferibilmente 1000-1200 °C, a dare un modello di ossido di calcio; 4) Idratazione: il modello di ossido di calcio è esposto ad acqua, consentendo così la captazione di acqua in una quantità di 1-25% in moli, preferibilmente 5-15% in moli; 5) Carbonatazione: il modello di ossido di calcio è trasformato in carbonato di calcio tramite riscaldamento a una temperatura nell'intervallo da 500 a 900 °C, preferibilmente a una temperatura nell'intervallo da 750 a 850 °C sotto una pressione nell'intervallo da 4 a 20 MPa; 6) Fosfatizzazione: il modello di carbonato di calcio è trattato con almeno un sale fosfato a dare lo scaffold di idrossiapatite biomorfica.
19. 19. Idrossiapatite biomorfica ottenuta da un legno avente una porosità totale tra il 60% e il 95%, detta porosità essendo misurata dopo aver sottoposto il legno a una fase di pirolisi, detta idrossiapatite essendo caratterizzata da una struttura dei pori organizzata gerarchicamente e da una resistenza alla compressione maggiore di 5 MPa, preferibilmente tra 10 MPa e 20 MPa.