UA124534C2 - Рослина daucus carota, яка є стійкою до справжньої борошнистої роси, яка викликається фітопатогеном erysiphe heraclei - Google Patents

Abstract

Винахід стосується рослини Daucus carota, яка є стійкою до справжньої борошнистої роси, яка викликається фітопатогеном Erysiphe heraclei, та насіння, їстівних частин, пилку, яйцеклітин, калюсу, суспензійної культури, соматичних ембріонів, ембріонів або частин рослини Daucus carota.

Description

Даний винахід належить до справжньої борошнистої роси і особливо справжньої борошнистої роси, що викликається фітопатогеном Егузірпе Пегасівї, стійких рослин моркви або рослин Юашсивх сагоїа, причому стійкість до справжньої борошнистої роси забезпечується одним або двома домінантними генами стійкості до справжньої борошнистої роси. Даний винахід, крім того, належить до молекулярних маркерів, генетично пов'язаних з генами, що забезпечують стійкість до справжньої борошнистої роси, і особливо справжньої борошнистої роси, що викликається фітопатогеном Егузірпе Пегасіевї, і їхнього застосування для ідентифікації рослин моркви, або рослин Юайсих сагоїа, що є стійкими до справжньої борошнистої роси, і особливо справжньої борошнистої роси, що викликається фітопатогеном Егузірпе Пегасівї. Даний винахід також належить до насіння, частин рослин і особливо їстівних частин рослин даного винаходу.

Морква, або Юайсиє сагоїа, є вирощуваною рослиною із сімейства трбейЙегає (або

Аріасеає), яке поширене в багатьох частинах світу. Сімейство ШтрбейПегає складається з багатьох видів, які в цілому являють собою ароматичні рослини з порожнистими стеблами; воно є одним з 20 найбільших сімейств квітучих рослин. Відомі, поряд з родом Юаисив, інші вирощувані рослини, наприклад кмин, селера, коріандр, кріп, фенхель, петрушка і пастернак.

Загалом Штрбейегає охоплює більш 3500 видів.

Дика морква, Юашйсих сагоїа Ї.., є ендемічною у значній частині світу і має білий стрижневий корінь, який є їстівним, знаходячись на ювенільній стадії, але стає деревним після тривалого росту. Вирощувана морква, Юаисиб5 сагоїа і особливо Юацйсиє осагоїа 55р. взаїїми5, є коренеплодом, звичайно оранжевим, але відомі також пурпурні, червоні, жовті і білі сорти.

Як правило, у більш помірних кліматичних зонах, Юаисиб5 сагоїа являє собою дворічну рослину, яка має період вегетативного росту в перший рік після посіву; після перезимівлі рослина розцвіте на другий рік вирощування. У тропічних і субтропічних районах морква має річний життєвий цикл; перехід з вегетативної стадії на стадію розмноження відбувається без яровизації. Крім того, декілька диких видів також мають річний життєвий цикл.

Листя укладаються в спіральну структуру. Коли квітконіс подовжується, кінчик стебла загострюється і стає сильно розгалуженим суцвіттям. Довжина стебла може досягати 60-200 см.

Квітки розміщаються в зонтиках з білими, іноді світло-зеленими або жовтими квітконіжками; індивідуальні квітки тримаються на квітконіжках. Перший зонтик присутній на кінці основного стебла, додаткові зонтики будуть рости із цього основного відгалуження. Кожна квітка має п'ять пелюсток, п'ять тичинок і одну центральну приймочку. Квітки є протандричними, що означає, що спочатку пиляки випускають свій пилок, перш ніж приймочка квітки може бути запилена. Цей механізм деякою мірою запобігає самозапиленню і сприяє перехресному запиленню. Диски з нектаром присутні на верхній поверхні плодолистиків. Квітки приваблюють запилюючих комах, після запліднення зовнішня частина зонтика звивається усередину, змінюючи зонтик на опуклу форму, а потім на чашоподібну форму. Насіння розвивається приблизно через 30 днів і складається із двох мерикарпіїв, кожен з яких містить справжнє насіння.

Поява чоловічої стерильності у ЮОаисиє є особливістю, яка дуже корисна для створення гібридного насіння. Відомі два типи чоловічої стерильності у роду Юацсив (посилання 1, 2, 3; так званий тип "коричневий пиляк" (пиляки вироджуються і зморщуються, перш ніж вони можуть розповсюджувати пилок) і пелюсткоподібний тип, коли тичинки замінені пелюстковими структурами (посилання 1).

Чоловіча стерильність, спостережувана в моркви, як правило, є цитоплазматичною чоловічою стерильністю, що означає, що генетична детермінанта, що обумовлює цю ознаку, не знаходиться на ядерних хромосомах, а скоріше кодується мітохондріаальною ДНК. Оскільки мітохондрії передаються потомству тільки яйцеклітинами, ця особливість успадковується по материнській лінії. Оскільки виникнення чоловічої стерильності робить можливим 100 95 перехресне запилення, гібриди Юайси5 легко створити. Морква являє собою культуру, яка страждає від інбридингової депресії, але гетерозис, або гібридна енергія, може бути дуже сильним.

Моркву вирощують задля її поживного стрижневого кореня. Більша частина цього кореня складається із зовнішньої кори флоеми і внутрішнього ядра ксилеми. Більша частина кори відносно ядра, як вважається, має високий рівень якості плодоовочевої культури. Відомо багато форм стрижневого кореня, залежно від використання переважна кругла, конічна або більш циліндрична форма. Довжина кореня варіює від 5 до навіть 40 см; діаметр може варіювати від 1 до 10 см. Колір стрижневого кореня є білим у дикого типу, але вирощувані форми в основному оранжеві, іноді червоні, пурпурні, чорні або жовті. Стрижневий корінь багатий каротином, особливо В-каротином, важливим антиоксидантом, який може метаболізуватися у вітамін А.

Крім того, морква є джерелом харчового волокна, вітамінів С, Вє ії К ії антиоксидантного бо фалькаринолу. Антиоксиданти (включаючи каротиноїди) вивчалися на предмет їх здатності попереджати хронічні захворювання. Вільні цукри в основному являють собою сахарозу, глюкозу і фруктозу.

Вирощування моркви здійснюється в усьому світі. В 2011 році було вирощено більше 35 мільйонів тонн моркви (посилання 5), Як і у випадку з будь-якою культурою, яку вирощує людство, існує також багато загроз для гарного врожаю цієї культури. Відомо багато бактеріальних, грибкових, вірусних і віроїдних захворювань поряд з великою кількістю комах-шкідників і нематод. Основні бактеріальні і грибкові захворювання викликають, серед іншого, Хапіпотопав сатрезвійв5, Егміпіа сагоїамога, АпПегпагіа дашсі, Апетатїіа гадісіпа, Руїйішт 5рр., Нпігосюпіа 5рр., зсіегоїіпіа 5рр., Ризагішт 5рр, Воїгуїі5 сіпегеа и Рпуїорпїога 5рр. Такі нематоди як Неїегодега сагоїає, МеіІоідодупе 5рр. і Ргаїуіепспи5 5рр. викликають серйозне ушкодження стрижневого кореня, що призводить до втрати врожаю і продукту, який не придатний для маркетингу. Крім того, відомо, що величезна кількість вірусів і віроїдів впливає на здоров'я рослин і врожайність моркви.

Зменшення врожайності моркви, викликане цими патогенами, привело до проведення спеціалізованих селекційних програм компаніями і державними інститутами для внесення стійкості до цих патогенів. Одним із захворювань, що виявляють суттєвий вплив на вирощування моркви, є справжня борошниста роса, що викликається Егузірпе Пегасієвї. Егузірпе

Пегасієї належить до Азсоптусеїа, порядку Егузірпаев5, і викликає справжню борошнисту росу, що є хворобою листя, в декількох членів ОптреПЦегає (посилання 5, 6), З Е, Ппегасієї відомо кілька спеціальних форм, які, загалом, специфічні для різних родів у цьому сімействі.

Після зараження Егузірпе Пегасієї рослини моркви стають вкритими грибами і спорами.

Гаусторії використовуються грибом для проникнення в клітини рослини, але не для перетинання клітинної мембрани; отже, гриб присутній внутрішньоклітинно. Через ці гаусторії поживні речовини і вода абсорбуються з екстраклітинного простору зараженої рослини.

Спочатку плями гриба з'являються на нижніх листах, а потім розповсюджуються на більш високі частини рослини. Ці плями розповсюджуються до загальної колонізації рослини, у тому числі, якщо присутній, на квітконісєс. Хвороба найбільш тяжка при температурах, що мають місце влітку і восени. Тяжка інфекція призводить до втрати листя, зменшення врожайності і у випадку насінних культур до погіршення якості насіння. Втрата врожаю на 20 95 не рідка. У вологих

Зо умовах інфікована тканина може бути легко уражена іншими (вторинними) патогенами, що призводить до швидкого опадання листя. Через втрату листя уражений урожай не можна збирати належним чином, оскільки сучасні стеблопідйомники витягають моркву з грунту, використовуючи Її листя.

Одним з підходів до запобігання впливу інфікування Егузірпе Пегасівї може бути застосування фунгіцидів. Однак застосування пестицидів у цілому все більш обмежується, і також свідомість громадськості полягає в тому, щоб уникати застосування цих сполук. Більше того, виробники органічної продукції не застосовують фунгіциди при її вирощуванні. Відповідно, у даній галузі існує явна потреба в забезпеченні моркви, яка стійка до Егузірпе Пегасівї.

У дослідженні, проведеному японським інститутом, спроба внесення стійкості до Егузірпе

Ппегасієї була зроблена з використанням трансгенного підходу, використовуючи ген лізоциму людини під контролем конститутивного промотору 355 СамУ. Деякі трансформанти продемонстрували підвищену стійкість до Егузірпе Пегасівї. Ця стійкість була підтверджена у потомства (посилання 7),

Задача даного винаходу полягає в тому, щоб частково, якщо не повністю, забезпечити вирішення вищевказаних проблем у даній галузі з використанням генетичного матеріалу із зародкової плазми Юаийси5. Зокрема, задачею даного винаходу є, серед інших задач, забезпечення рослин моркви, або Юайсиє сагоїа, що є стійкими до Егузірпе Пегасієї або справжньої борошнистої роси.

Вищевказані задачі, серед інших задач, задовольняються за рахунок забезпечення рослин, генів і молекулярних маркерів, як зазначено в формулі винаходу, що додається.

Зокрема, вищевказані задачі, серед інших задач, згідно з першим аспектом даного винаходу задовольняються за рахунок забезпечення рослин Юаисих сагоїа, що є стійкими до справжньої борошнистої роси, що викликається фітопатогеном Егузірпе Пегасієї, причому стійкість забезпечується першим геном стійкості, або ЕП1, розташованим на хромосомі З рослини між

ЗЕО ІЮО МО:4, також позначуваної тут як 9708, і БЕО ІО МО:5, також позначуваної тут як 9625.

В альтернативному варіанті, вищевказані задачі, серед інших задач, згідно з першим аспектом даного винаходу задовольняються за рахунок забезпечення рослин Юаисих сагоїа, що є стійкими до справжньої борошнистої роси, що викликається фітопатогеном Егузірпе Пегасівї, причому стійкість забезпечується першим геном стійкості, або ЕНТ, розташованим на хромосомі бо З рослини між будь-яким з молекулярних маркерів, позначених тут як 9618, 9620, 9624, 9703 або 9708, з однієї сторони і будь-яким з молекулярних маркерів, позначених тут як 9625, 9629, 9635, 9631 або 9636, з іншої сторони.

В альтернативному варіанті, вищевказані задачі, серед інших задач, згідно з першим аспектом даного винаходу задовольняються за рахунок забезпечення рослин Юаисиз сагоїа, що є стійкими до справжньої борошнистої роси, що викликається фітопатогеном Егузірпе Пегасіві, причому стійкість забезпечується першим геном стійкості, або ЕН, розташованим на хромосомі

З рослини між будь-якою з ЗЕО ІЮ МО:1, 2, З або 4 з однієї сторони і будь-якою з БЕО ІЮО МО: 5, б або 7 з іншої сторони.

Геном Юайсиє сагоїа був (частково) секвенований (посилання 8) | дя послідовність загальнодоступна в МСВІ з порядковим номером РКОМА268187 (посилання 9), У послідовності

РЕОМА268187 перший ген стійкості даного винаходу, або ЕПІ, можна знайти між положеннями 1648619 їі 1739519 хромосоми 3. Використовуючи представлені тут послідовності, кваліфікований фахівець може легко ідентифікувати перший ген стійкості даного винаходу, або

ЕМІ, в іншій загальнодоступній інформації про послідовність геному Юацйсив5 сагоїа і особливо його хромосоми 3, наприклад, між положенням 5ЕБО ІЮ МО:4 і 5ЕБО ІЮО МО:5 у ній. В альтернативному варіанті, перший ген стійкості даного винаходу, або ЕЙ1, можна знайти між будь-якою з 5ЕО ІЮ МО-1, 2, З або 4 з однієї сторони і будь-якою з ЗЕО ІЮО МО:5, 6 або 7 з іншої сторони.

Згідно з переважним варіантом здійснення цього першого аспекту даного винаходу в рослин

Раийсих сагоїа даного винаходу стійкість додатково забезпечується другим геном стійкості, або

Епг, розташованим на хромосомі З рослини між ЗЕО ІО МО:11, також позначуваною тут як 9671, і ЗЕО ІЮ МО:12, також позначуваною тут як 9672.

В альтернативному варіанті цього переважного варіанта здійснення даного винаходу додаткова стійкість забезпечується другим геном стійкості, або Ейп2, розташованим на хромосомі З рослини між будь-яким з молекулярних маркерів, позначуваних тут як 9659, 9666, 9669, 9670 або 9671, з однієї сторони і будь-яким з молекулярних маркерів, позначуваних тут як 9672, 6709, 9674, 9677, 9528, 6909, 4201 або 6069, з іншої сторони.

В альтернативному варіанті цього переважного варіанта здійснення даного винаходу додаткова стійкість забезпечується другим геном стійкості, або Еп2, розташованим на

Ко) хромосомі З рослини між будь-якою з БЗЕО ІЮ МО: ЗЕО ІЮО МО:8, 9, 10 або 11 з однієї сторони і будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 12, 13, 14 або 15 з іншої сторони.

Геном Юашйсивх сагоїа був (частково) секвенований, і ця послідовність загальнодоступна в

МСВІ з порядковим номером РКОУМА268187 (посилання 9), У послідовності РЕУМА268187 другий ген стійкості даного винаходу, або Еп?2, можна знайти між положеннями 45210264 і 45845221 хромосоми 3. Використовуючи представлені тут послідовності, кваліфікований фахівець може легко ідентифікувати другий ген стійкості даного винаходу, або ЕП2, в іншій загальнодоступній інформації про послідовність геному Юаисивх сагоїа і особливо його хромосоми 3, наприклад, між положенням 5ЕБЕО ІО МО:11 ії 5ЕО ІЮ МО:12 у ній. В альтернативному варіанті, другий ген стійкості даного винаходу, або Еп2, можна знайти між будь-якою з ЗЕО ІЮО МО: 8, 9, 10 або 11 з однієї сторони і будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 12, 13, 14 або 15 з іншої сторони.

Згідно з іншим переважним варіантом здійснення перший ген стійкості даного винаходу, або

ЕМП, розташований на хромосомі З в 2,68 СМ, а другий ген стійкості даного винаходу, або Еп2, розташований на хромосомі З в 76,7 СМ. Як відзначено вище, ці положення на хромосомі в сантиморганах (СМ) відповідають відстані, у послідовності РЕКЮМА268187, між положеннями 1648619 і 1739519 і між 4522264 і 45845221 хромосоми 3, відповідно.

Згідно зі ще одним переважним варіантом здійснення перший ген стійкості даного винаходу, або Еп!, можна одержати, одержаний або походить із насіння рослини Юацйсив5 сагоїа, депонованої 19 березня 2015 року під номером депонування МСІМВ 42389 (Регдизоп Виїйаіпод,

Стгаіреїопе Евіаїє, Виск5ригп, Абегдеєп АВ21 9МА, Об'єднане Королівство). Іншими словами, перший ген стійкості даного винаходу, або ЕМ, є переважно геном стійкості, який можна знайти в депозиті насіння МСІМВ 42389.

Згідно зі ще одним переважним варіантом здійснення другий ген стійкості даного винаходу, або Еп2, можна одержати, одержаний або походить із насіння рослини Юайсив сагоїа, депонованої 16 квітня 2015 року під номером депонування МСІМВ 42397 (Регдизоп Виїйаїіпод,

Стгаіреїопе Евіаїє, Виск5ригп, Абегдеєп АВ21 9МА, Об'єднане Королівство). Іншими словами, другий ген стійкості даного винаходу, або ЕП2, є переважно геном стійкості, який можна знайти в депозиті насіння МСІМВ 42397.

Згідно з переважним варіантом здійснення даного винаходу перший ген стійкості даного винаходу, або ЕПІ1, може бути ідентифікований за допомогою принаймні одного молекулярного 60 маркера, який вибирається з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО:1, ЗЕО ІО МО:2, 5ЕО ІЮ МО:3,

ЗЕО ІЮ МО:4, 5ЕО ІЮО МО:5, 5ЕО ІЮ МО:6 і БЕО ІЮО МО:7. Іншими словами, перший ген стійкості даного винаходу, або ЕЙІ1, генетично пов'язаний із принаймні одним молекулярним маркером, який вибирається з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО:1, 5ЕО І МО:2, 5ЕО ІЮО МО:3, 5ЕО ІЮ

МО:4, ЗЕО ІЮ МО:5, ЗЕО 1Ю МО:6 ії БЕО ІЮ МО:7.

Згідно з ще одним переважним варіантом здійснення даного винаходу другий ген стійкості даного винаходу, або Ейп2, може бути ідентифікований за допомогою принаймні одного молекулярного маркера, який вибирається з групи, що складається з 5ЕО І МО:8, 5ЕО І

МО:9, 5ЕО ІЮ МО-10, 5ЕО 10 МО 1, 5ЕО І МО:12, 5ЕО І МО:13, ЗЕО ІЮО МО:14 і 5ЕО ІО

МО:15. Іншими словами, другий ген стійкості даного винаходу, або ЕП2, генетично пов'язаний із принаймні одним молекулярним маркером, який вибирається з групи, що складається з ЗЕО ІЮ

МО:8, 5ЕО ІО МО:9, 5ЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІО МО-11, 5ЕО ІЮ МО:12, ЗЕО ІЮ МО:13, ЗЕО ІО МО:14 і

ЗЕО ІЮ МО:15.

Беручи до уваги генетичний зв'язок між першим геном стійкості даного винаходу, або ЕН, і молекулярними маркерами даного винаходу, даний винахід згідно з особливо переважним варіантом здійснення належить до рослин Юаийси5 сагоїа, що містять у своєму геномі принаймні одну геномну послідовність, яка вибирається із групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО:1, ЗЕО ІО

МО:2, ЗЕО ІЮ МО:З3, ЗЕО 1Ю МО:4, 5ЕО ІЮ МО:5, ЗЕО ІЮ МО:6 ії БЕО ІЮ МО:7.

Беручи до уваги генетичний зв'язок між другим геном стійкості даного винаходу, або ЕНЗ, і молекулярними маркерами даного винаходу, даний винахід згідно з особливо переважним варіантом здійснення належить до рослин Юаийсиз сагоїга, що містять у своєму геномі принаймні одну геномну послідовність, яка вибирається із групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО:8, 5ЕО ІЮ

МО:9, 5ЕБЕО І МО:10, 5ЕО ІЮ МО:11, 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕБО ІО МО:13, 5ЕО ІЮО МО:14 ї 5ЕО ІО

МО:15.

Згідно з найбільш переважним варіантом здійснення даний винахід належить до рослин

Юайсив сагоїа, що містять у своєму геномі принаймні одну геномну послідовність, яка вибирається із групи, що містить з БЕО ІЮ МО:1, 5ЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮО МО:3, 5ЕО ІО МО:4, ЗЕО

ІО МО:5, 5ЕО ІЮ МО:6 і 5БЕО ІЮ МО:7, і принаймні одну геномну послідовність, яка вибирається із групи, що складається з БЕО ІЮ МО:8, 5ЕО ІО МО:9, 5ЕО ІЮО МО:10, 5ЕО ІЮО МО:11, 5БЕО І

МО:12, БЕО ІО МО:13, 5ЕО ІЮ МО:14 і БЕО ІЮ МО:15.

Зо Рослини, визначені вище, переважно являють собою гібридні рослини, більш переважно стерильні гібридні рослини і найбільш переважно гібридні рослини із чоловічою стерильністю, наприклад із цитоплазматичною чоловічою стерильністю.

Рослини Юаисих сагоїа даного винаходу переважно являють собою рослини Юацйсив сагоїа 55р. заїймив.

Згідно з іншим аспектом даний винахід належить до насіння, їстівних частин, пилку, яйцеклітин, калюсу, суспензійної культури, (соматичних) ембріонів або частин рослини Юаисиб сагоїа, визначеної вище.

Беручи до уваги генетичний зв'язок між молекулярними маркерами даного винаходу і генами стійкості даного винаходу ЕП! і ЕП2, даний винахід належить, згідно зі ще одним аспектом, до застосування одного або більше молекулярних маркерів, які вибираються з групи, що складається з БЕО ІЮ МО 1, 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮО МО:3, 5ЕО ІЮ МО:4, 5ЕО ІЮ МО:5, 5ЕО ІЮ

МО:6, 5ЕО ІО МО:7, 5ЕО І МО:8, 5ЕО ІЮ МО:9, 5ЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮ МО-11, 5ЕО ІЮ МО 12,

ЗЕО ІЮ МО:13, 5ЕО ІО МО:14 ії 5ЕО ІЮ МО:15, для ідентифікації рослини Юайсив5 сагоїа, що є стійкою до справжньої борошнистої роси, що викликається фітопатогеном Егузірпе Пегасіеї.

Усе ще беручи до уваги генетичний зв'язок між молекулярними маркерами даного винаходу і генами стійкості даного винаходу ЕПІ і ЕП2, даний винахід належить, згідно зі ще одним аспектом, до гена, що забезпечує стійкість до справжньої борошнистої роси, що викликається фітопатогеном Егузірпе Пегасівї, причому ген розташований на хромосомі З в 2,6 СМ, і цей ген можна ідентифікувати за допомогою принаймні одного молекулярного маркера, який

БО вибирається з групи, що складається з БЕО ІЮ МО:1, ЗЕО ІЮО МО:2, ЗЕО ІЮО МО 3, 5ЕО ІЮ МО4,

ЗЕО ІЮО МО:5, 5ЕО ІЮО МО:6 ії 5ЕО ІЮО МО:7, і до гена, розташованого на хромосомі З в 76,7 СМ, і причому цей ген можна ідентифікувати за допомогою принаймні одного молекулярного маркера, який вибирається з групи, що складається з 5ЕО І МО:8, 5ЕО 10 МО:9, 5ЕО І МО:10,

ЗЕО ІЮ МО:11, БЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІО МО:13, 5ЕО ІЮ МО:14 і БЕО І МО:15.

Даний винахід буде додатково докладно описаний у наступних прикладах і кресленнях, на яких: на фіг. 1 представлена схематична фізична карта хромосоми З Юацйсиб5 сагоїа, на якій показані як молекулярні маркери даного винаходу, так і перший ген стійкості даного винаходу

ЕНІ ї другий ген стійкості даного винаходу ЕпП2, що забезпечують стійкість до фітопатогену (510) Егузірне Негасівї;

на фіг. 2 представлені послідовності маркерів 5МР як молекулярні маркери, показані на фіг. 1, і їх положення на хромосомі 2 послідовності РК)МА268187 (посилання 9),

ЗЕО ІО МО:1-7 відповідають ЗМР, що представляє ген стійкості в локусі ЕМ1.

ЗЕО ІО МО:8-15 відповідають 5МР, що представляє ген стійкості в локусі ЕП2.

ЗЕО ІО МО:16-22 відповідають 5МР, що представляє ген сприйнятливості в локусі ЕЙ1.

ЗЕО ІО МО:23-30 відповідають 5МР, що представляє ген сприйнятливості в локусі ЕП2.

Використання коду відповідно до нуклеотидного коду ІШРАС (посилання 10);

А:аденін Т-тимін

С-цитозин с-гуанін

К-со або Т

УМА або Т

УС або Т.

Приклади

Приклад 1. Випробування на стійкість до Егузірпе Пегасієї у теплиці

Гриб, як облігатний паразит, підтримували на прийнятних сприйнятливих рослинах моркви, поміщаючи заражені листя між ними. Інфекцію розповсюджували серед цих рослин, використовуючи вентилятор, за допомогою потоків повітря спори розподілялися серед рослин.

Рослини, що підлягають випробуванню на стійкість, висівали в грунт на столах, приблизно 30 рослин у ряд. Кожні 20 рядів рослин для оцінки ряду стійкого матеріалу для змагання 0 і змагання 1, і кожний сприйнятливий матеріал був включений. Коли висота рослин досягала приблизно З см, зараження відбувалося шляхом додавання інфікованого листя, що чітко демонструвало спори грибів. Рослини, що підлягають аналізу на стійкість, спочатку гладили цим листям, а потім листя для зараження поміщали між молодими рослинами. Спори розповсюджувалися далі за допомогою вентилятора. Температура становила 16-2 "С вночі, 22-2 7С у денний час, мінімум 16 годин світла (або довше, якщо тривалість дня була більше) і максимум 8 годин темряви. Вологість підтримували на високому рівні, розпилюючи воду між столами кілька разів на тиждень. Через б тижнів рослини оцінювали; інфіковані листи були вкриті білим борошнистим міцелієм і спорами і часто стають ураженими хлорозом.

Тяжкість інфекції відображали шляхом підрахунку симптомів від 0 (повністю сприйнятливі)

Зо до 9 (повністю стійкі). Ретельно перевіряли, що сприйнятливі контрольні рослини дійсно демонструють симптоми Е. Пегасієї інфекції.

Приклад 2. Польові випробування на стійкість до Е. Пегасієї

Польові випробування проводилися в голландських кліматологічних умовах. Грибний інокулят був приготовлений, як описано вище в прикладі 1. Матеріал, що підлягає випробуванню в польових умовах, безпосередньо висівається в першій половині травня.

Коли висота рослин досягала приблизно З см, інокулят розповсюджували шляхом розміщення горщиків зі споротвірними рослинами в полі між молодими матеріалами, що підлягають випробуванню. Вітер буде розповсюджувати спори з рослин для зараження.

Рослини оцінювали на їх стійкість або сприйнятливість, коли симптоми були чітко помітні в сухих погодних умовах. Тяжкість інфекції відображали шляхом підрахунку симптомів від 0 (повністю сприйнятливі) до 9 (повністю стійкі).

Приклад 3. Молекулярна характеристика геномної ДНК і картування генів стійкості

Застосовуючи два доступні генетичні ресурси стійкості, описані вище, дві популяції Е151 були одержані шляхом схрещування різних джерел стійкості зі сприйнятливою лінією моркви, після чого одержана в результаті рослина Е1 самозапилювалася. Спостережувана сегрегація трьох стійких рослин на одну сприйнятливу рослину показала, що дійсно в обох випадках стійкість основана на домінантній ознаці.

Основні дослідження приводять до часткової генетичної карти 0. сагоїа, а також до майже повної послідовності її геному, представленої МОВІ у вигляді проекту РКОМА268187 «(посилання 9),

Принаймні 2000 насінин було зібрано від покоління Е151 від схрещування між диференціальними джерелами стійкості і сприйнятливою лінією моркви. Для виконання картування ОТГ. (локусу кількісних ознак) 1200 рослин від кожного схрещування вирощували в теплиці. Від кожної індивідуальної рослини листяний матеріал використовувався для виділення

ДНК і послідовного маркерного аналізу.

Інбредні рослини з відібраних індивідуальних рослин із кросинговером поблизу локусу стійкості піддавали випробуванню в теплиці, як описано в прикладі 1, і була підтверджена стійкість.

Щоб розробити більше маркерів у вигляді однонуклеотидних поліморфізмів (5МР) в області гена стійкості, був розпочатий проект, що стосується послідовності, з використанням доступних 60 джерел стійкості до Е. Пегасіевї|.

Використовуючи маркери ЗМР, що охоплюють весь геном, обидва гени стійкості були визначені як розташовані на хромосомі 3. Використовуючи послідовності двох стійких ліній і однієї сприйнятливої лінії, у поєднанні з доступною послідовністю геному, для обох локусів стійкості була виявлена множина 5МР. На основі кросинговерів, присутніх у популяціях картування, кожний локус стійкості може бути розташований у послідовності геному, представленій МОВІ як РЕОУМА268187 (посилання 9),

Для 0. сагоїа із вхідним номером МСІМВ42389 локус стійкості (ЕП!) був розташований на хромосомі З в 2,68 СМ, що відповідає фрагменту між положенням 1648619 і 1739519 п.о.

Використовуючи послідовності, описані вище, більше маркерів у вигляді 5МР було розроблено в області локусу стійкості і використано для генотипування джерел стійкості і індивідуальних рослин із кросинговером поблизу локусу стійкості, див. таблицю 1 нижче.

Таблиця 1

Генотипування і оцінка перевірки на викликання захворювання у інформативних індивідуальних рослин у випадку 0. сагоїа із вхідним номером МСІМВ42389

Фізичне Гісімвісприй (3312-11... ІндивідуальнихрослинЕії 3... ження 13. | 19 | 05 | 12 | 21. | 22 | 09 | 25 | 01 | 04 | 18 | 02 | оз

СсНАЗ: ве | ее а | |в п|п|п н|п пунк пи"|ву в/в

СсНАЗ: о |в ап пп пн и|н н"|н|к/в| в в.

СсНАЗ: мов ап пп пн и|н н"|н|кв| в в.

СсНАЗ: емз |ввю ап пп піні пи|н/н"|ни|н в/в в.

СсНАЗ: ме |в а| | п|п|п нн" пунк пи"|ву в/в перевірка на викликан- ня захво- й 5 й й й й й й й й й 5 5 5 рювання хвороби

СсНАЗ: ве | уювіа| | п|п|пи пи"|п" п"|н|и и"|ву в/в

СсНАЗ: ве | вла а || прп пн и|н н"|н|к в/в в.

СсНАЗ: 5 | юю ап піп піні и|ни | и"|к| кв в в. я СсНАЗ: зви» а| вп прп пів п|ки и"|к| ку в/в в.

СсНАЗ: ве | дою) а| в» |п|п"|н|н|в|п|н"|н|нк|и"|»ув| в " щодо маркера 9631: на основі даних кросинговеру фізична карта в цій області була скоректована для упорядкування маркерів.

Локус стійкості розташований між маркерами 9618 і 9631.

Крім того, для Ю. сагоїа із вхідним номером МСІМВ42397 локус стійкості (Епг) був визначений на хромосомі З поблизу 76,7 СМ, що відповідає фрагменту між положеннями 42210264 п.о. і 45845221 п.о.

Також для генотипу із вхідним номером МСІМВ42397 більше маркерів можна було розробити з використанням інформації з проекту, що стосується послідовності, і використовувати для генотипування вхідного номера МСІМВ42397 і індивідуальних рослин із кросинговером, див. таблицю 2 нижче. (с;

Таблиця 2

Генотипування і оцінка перевірки на викликання захворювання у інформативних індивідуальних рослин з генотипом із вхідним номером МСІМВ42397 мар | роктня ЧЕ пом вот нерв отв ТОБ Ивов' ов Пов Товт тот еоБ еов

Маркер 179067479067479067479067479067479067479067-419067-79067-79067179067479067- может ОБУ ренти в роя ро рт поро гео твєтвя

СсНАЗ: ее /деюю а || п п |п|ні|н"|п п"|п" и в| в

СсНАЗ: зе дове а | | п п п н|н|п"|н|в в/в» | в

СсНАЗ: ее дою а | | п п |п|н|н"|пк |в в|в|в| в

СсНАЗ: ее | зовню а || п п|п/н|н"|п" п"|в в|в|в| в

СсНАЗ: ем |та а | 6 п п|п"|ні|н"|н" кв в|в|в| в перевірка на викликан- ІЙ 5 ІЙ ІЙ ІЙ ій ій ій 5 5 5 5 5 ня захво- рювання

СсНАЗ: ет двоє а | вп п|п"|ні|н"|нк к"|в в|в|в| в

СсНАЗ: еле маю а |в/|п п|п/ні|н"|н" н"|в в|в|в| в

СсНАЗ: зем о здвеу| а | | п пп н|н|н"|к"|в в/в» | в

СсНАЗ: ее вою а | | п п|п"|н|в|н" к|в в|в| |в

СсНАЗ: ев доми а || п п|п|ні|н"|нк к"|в в|в|в| в

СсНАЗ: свое | звею а || п п|п/н|н"|п"/н"|в в|в|в| в

СсНАЗ: оо зво а | |" п"|п" н|н|н"|к|в в/в» | в во |в а ||| п|пн"|н|н"|н|ь|в|в|н| п в.

Графічно цю ситуацію можна альтернативно проілюструвати, як показано на фіг. 1.

Як видно і з положення в СМ, і з положення в парах основ і проілюстровано на фіг. 1, залучені домінантні гени стійкості даного винаходу розташовані далеко один від одного на хромосомі 3. Це відкриття двох окремих генів стійкості означає, що ці гени стійкості переважно можуть бути зістиковані, наприклад, у гібрид, щоб мати більш міцну генетичну основу для довгочасної стійкості.

Інформація про депонування:

Зразки насіння джерел стійкості, згаданих вище, були депоновані в МСІМВ, Регди5оп

Вийаїпа; Стаірвіопе Евіаїє, Виско5ригп, Абегаееп, Шотландія, АВ21 9ХА, як: - МСІМВ42389 (0. сагоїа 2954561), 19 березня 2015; - МСІМВ42397: (0. сагоїа 1360572), 16 квітня 2015.

Джерела інформації: 1. Кпадаумла, 9., 0. Ровіизагпу, У.М. Сівітай апа 0.3. М/оїуп. Оеєемеіортепіа! апа тогрпо!одісаї апаїузев ої потеоїїс суїоріазтіс таїе 5іепіе апа Тепіе саїтої Помуегв. Зех. Ріапі Вергоад. 7: 41-50 (1994). 2. ММеїЇсп 9.Е., сгітваї! Е.С. Маїе «їегіїйу іп Те саїтої. Зсіепсе. 1947. Мої. 106, Мо 2763 р. 594.

З. Мипдег, Н. Реїаїсіа їуре рег. сотт. Сей іп: Ма Стор Веїаймев5: Сепотіс апа Вгеедіпд

Везоигсев Медеїаріев; вдів Бу С. Коївє. 5ргіпдег. ІЗВМ 978-3-642-20450-0 р. 106. (2011). 4. пиру/еп.мікіредіа.Огдлмікі/Сатосіе поїе-7ідог 2005-14 (даїа ої їйе ЕАО, іпсіцаїпд їштпір). 5. Вгашп ) (1987) А топоадгарн ої Те Егузірпаез (рождегу тіідемв5). Веіпей 2йиМома Неадмідіа 89, 1-700. б. Сиппіпдіюп ОН, УМаївоп А, І ірегаїо ОВ, допев В (2008) Рігвії гесога ої рожмадегу тідем оп сатоїв іп АизігавІйа. Аивігаіавзіап Ріапі Оізеазе Моїез З, 38-41. 7. ТаКаїсні, М. апа К. Оєда. Тгтапздепіс сагтоїв м/ййп епнапсей гевзівіїапсе адаіпві їмо та|ог рашодепв, Егузірне Негасівї апа АКегпагіа дацсі. Ріапі сі. 153: 135-144 (2000).

8. пер:/Лимли. моги мізс.еди/вітопіар/заага/зед/іпаєх. пІті. 9. пер:/Лимли.пебрі.піт. пін. дом/біоргоїес/РВОМА268187/ (мегзіоп 2, Осіобег 9, 2015). 10. пир:/Лимли.

Віоіптоптаїсв5.огд/втв5/Лирас.піті.

Claims (10)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Рослина Оаийсив сагоїа, яка є стійкою до справжньої борошнистої роси, яка викликається фітопатогеном Егузірпе Негасієї причому зазначена стійкість забезпечується першим геном стійкості, розташованим на хромосомі З зазначеної рослини між 5ЕО ІЮО МО: 4 і ЗЕО ІО МО: 5, де зазначена стійкість додатково забезпечується другим геном стійкості, розташованим на хромосомі З зазначеної рослини між БЕО ІЮ МО: 11 ії БЕО ІЮО МО: 12; причому зазначений перший ген стійкості розташований на хромосомі З в 2,68 СМ і може бути одержаний з насіння рослини Оаийсивх сагоїа, депонованого під номером депонування МСІМВ 42389; причому зазначений другий ген стійкості розташований на хромосомі З в 76,7 СМ і може бути одержаний з насіння рослини Оаийсивх сагоїа, депонованого під номером депонування МСІМВ 42397.

2. Рослина ЮДаисив сагоїа за п. 1, де зазначений перший ген стійкості може бути ідентифікований за допомогою щонайменше одного молекулярного маркера, вибраного з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІО МО: б ї БЕО ІО МО: 7.

З. Рослина Юаисив сагоїа за п. 1 або 2, де зазначений другий ген стійкості може бути ідентифікований за допомогою щонайменше одного молекулярного маркера, вибраного з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 9, 5ЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО ІЮО МО: 11, 5ЕО ІЮ МО: 12, ЗЕО ІЮ МО: 13, БЕО ІЮО МО: 14 і 5ЕО ІЮО МО: 15.

4. Рослина Паийсих сагоїа за будь-яким з пп. 1-3, яка містить у своєму геномі щонайменше одну геномну послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 3, ЗЕО ІЮ МО: 4, ЗЕО ІЮ МО: 5, ЗЕО ІЮО МО: 6 і ЗЕО І МО: 7.

5. Рослина Пашсизх сагоїа за будь-яким з пп. 1-4, яка містить у своєму геномі щонайменше одну Ко) геномну послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 9, 5ЕО ІЮ МО: 10, БЕО ІО МО: 11, 5ЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО ІЮО МО: 13, 5ЕО ІО МО: 14 ії 5ЕО ІЮ МО: 15.

6. Рослина Оашсизх сагоїа за будь-яким з пп. 1-5, де зазначена рослина є гібридною рослиною.

7. Рослина Оаийсив сагоїа за п. б, де зазначена гібридна рослина є стерильною гібридною рослиною.

8. Рослина Оайсиє сагоїа за п. 7, де зазначена стерильна гібридна рослина є гібридною рослиною із чоловічою стерильністю, переважно із цитоплазматичною чоловічою стерильністю.

9. Рослина Паийсивх сагоїа за будь-яким з пп. 1-8, де зазначена рослина є Оаисив сагоїа 55р. займив.

10. Насіння, їстівні частини, пилок, яйцеклітини, калюс, суспензійна культура, соматичні ембріони, ембріони або частини рослини Прайси» сагоїа за будь-яким з пп. 1-9.

М ! ЗБК аз их й У зях шк ЕНІ пи ш 2.8 ак й ! Ус М, ща: ко КЛ; ік К КИ пні зво за35 Ше б я йе і зва зе Яке до я зе, Ен ; 75.7 М Ка дю 7 за є зт у есе: ІЙ «шу кова

Фіг. 1

Й чоніна НЕ Положення Поспідовність (нуклеотид МЕ видіпений жирним шруфтом і ши й шо 7 ! підкреслений!) ! КОТОМ | 9620 | МББАЯС | СТОАССОВАСССВАВАСТСОСОВАССТСТТСААСТОССТОССТОСАВАСА ! ТСАСССОАСССВАСССОССОТСАЛАСССВАСААААТЕСТОСТОССАСАТЕ ЗО Мо. 2 ї СтУН 1851,351 | ААТСТТОААСТТАСТАВССТІТАТТОООСТТАТОСТТЧОСААСАТОСТОС і | ЗВАБАСААЛАТАЗОАСТАТОТАСААТАВСАВСАВААТТОСАСТТТТТВАТ ! | А 5ЕДІВМо.3 9703 | 16616582 | ТІСТСАДАААТТСВОЛАВАВААТОСАААТОСТТАСО У ВООСАСААВАТ і : ВАССОТТССААСОСАТТОСТСТТАТВОАТИТОАСССАВАТТТТААВССТІ і | сАб ЗО ЩО Мо,4 0 9708 | 3,863,368 / ЗОТААТОТАСТТАААВАЛААВСАСТОСААСАСТСТІСТАЄТОЯТТАСТТА і ! | БАТСАССАОСАУАМУ СТАЛА ТУТССТАВССАТТАССТАТТТАТААСТАА ЗЕД Мо. 5 | 9635 | 1673099 | ООСТТТОСАСТОВАВБОВСОВАТСТСАВТСОЗОТСТЗАОВАААТСТІТОС і АВОССТОСВТТАВАССТАСОСССССТАВАЛАСТАТСАТСАТОТОСОСТІв АД АВ Кун» «дя ЖАВ А ВАА А ААА КАЛ А ААААЖАЖ АЖ АЖ АЛ ДЖ АЖ АЖ АЛВА ААЖА А АДААЖ АЖ АААЖ АЖАЖА ЛАВКА НКТ АЛ АДАВАЖАА АЖ ВВАЖАВ АЖ ДВА КАТ АЖА ВА АД АААЖ АД АРК АВ КАААЖ АЖ ВВА АТ А АВ АТА АД гей ІЮ Мо, 8 ЗЕЛЯ | 3/705,759 | ССТЛАТОАСАВВОСТОАААТСТОВО СВО ТССПАААСССААДАСАСАОСА Її АССАСОБАСТСТОВТАТАТОСТТТСАТТСТІССТО ТОССТОСААТТТ ТА ІА нн п п в в в в в ЕЕ 1змМО.7 | 9535 | 3/734835 БАТАСТТСАВАСТОСТСААТОЛАСТТОССААСОВАТСАТСТТОВААВОЇ ТТСТТСОАВААССАААССААТТАДИТОАСТОСОВТААОССАССАЛО ТО тв 4 ОБЕОІО Моя ЗБ 5 БАВх | ТААТААСОТАТАТАТАТАТОАТАТИАСТТСТАССАСТТОВТІВАКЛАВАТА і ВАДАТСАТТОАААСАСТТОЗТТТОААСССТТОВАТТОААВАТААОСТСТ ананас мн нн знан АК КЕН а Анна Ан АН с о А А а Кн нан О5БДО Мо, Я 09565 | 5.290166 | БССАТТАСАОСЛАССААТААСТОТСЛАСАСОСОСОССТІААЄТАААТАА і | СІТТТАТАССТОВСАСАВАСТАВТООАСТААТОТСТАТСААААССТАТО : | й | вт ЗЕО Мо. 19 1 9570 45,295,089 | ТТОААТТСТОСТОТАААСТТОВТСАТОТОСТОСТОВТОАТОВСАСТАТТА ! ! Енн ЗЕ О Мо, її 9571 | 45,3023,019 | ТАСЕТЕТЕТ КТ ЕСЕ ЕА Е ЕЕ ЖТААК і | І САТСОССАСВАСТТОСАВАССАЛОСТАСТОСТСАТСАСТОАТТТАЧСАСО ' ЗЕ02ІО Мо 12 1 9872 | 45,81025 | СТСТААТАССАТТТОТОТІСТААТАТТКСТТОТТСАВОТСАСТТТАСТИТТА ! і І САТССТАВОТСТОСТОАССОВТТТСТААОСТТАТСТАСТОАТОСТЄТ алко півонія дров вер пертвр уву к и оч пу оре о о о у пн очима ОЗЕДІВМоі3 вМюЮ Бі | АТОСОСТОТСАВААААТТОТТАССТОВОААЛДАВААВСССТСАСОАОВОЧА 5ЕД ОО Мо. 15 ! 9574 1 45,525,457 | ОСВАЄТАТТАСССААААТТОВССССААТАТАТАТТТ ТТ НОТАТОСООСТАТ З ! АТТОАТТОСАССААТОТСАСААТСТІВАССАМЗАААЛААОАЄТОССТТА С А ЗЕ Мо. і15 0 З677 ) 45,350385 | ТЗТАСЗАТАТАТОТТСАВТСТОТТСТТОАВССТОАТ ТТ ТАСАСААТСТИТВ інт птн інн ЕКС ОСТООЛААААТОАЛАСТТТАВАЛОВТТ Р ТСТРТОАТСТСТТАА ЗНО Мо 16 0 9520 | ЗБОЇ | СТОАСССВАСОССАСАСТСОЕССОАССТСТТСААСТОССТОССТОСАСВАСА і і І ЯСАСССОАССОВАСССВОСОТСАААСОСПАСААЛАТССТССТОСОАСЬТС і і | ів ІБЕОІО Мо 17 9654 | БОБ1Я5Е | ЛАТСТТОААСТТАОТАСОСТТТАТТОСССТТАТОСТТОВСАЛСАТОСТОЄ ! ! . АБАБАСАААТАОСАСТАТОТАСААТАВСАОСАОЛАТТО САТ ВАТ

Фіг.2

ЕВ Мо ЇЕ 803 0 ІЕЕ? | ТТСТСАААДАТТСООВАСААААТОСАААТОСТТ АСУ ВОВСАСААВАТ ! | АВС ТТ ССАЛОСОВ ГОСТ ТА ТОВБАТОТОВОССВОВ ТТ АОС і саб : фиитнююютнютькятютю АЮ КА ААА АЖ АФК КК КА АК КВК ВА КЛЕЮ пут нути прути упину п учета т тн ву тт тн у вейот й т тоне в й РР Ж ву й А Рг А А А М М р А й Ат ле о М М А МВ Ж АЖ А А Ж ЖЖ АЖ ЖЖ АЖ ЖВЬКИ. а Віа її ЗК БЕЗ ЯБЯ її ШОТААТО ТАС т АААААДААССАСТТАВКАСТСТ СТАС ТОВ АЄТТА : ВАТСАССАВСАТА АС ТОААЛАТ СТ АСССАТТАССТАТТТАТААСТАК : ЗБ Но, 2 | З 1 ДТ РОК АСТОВАВИОСОВА ТС ТО ТОССОБТСТОАОВАААТТ ТО . НУ Ме. 51 : Ба ! зи я ЕКСТААТСАСАССОСТОАЛАТСТО ОВС ОО АКА САЛАСАВАВСЯ і ! | ! : АСТАССВАСТС ТОВ ТАТА ТОСТ СА ТЕСТ ТОСНУССЕТОСААТТТТ РЕА ! Кіно осінні лані знов оо нн зірок от кв оопо ооо ооо іон ооо окопів оо рова і рови ОЗ О Мо ля 0 Б Ї 3,234,355 І ВАТАСТТСАСАЄТОСТСААТОААСТТООСААСОСАТСАТСТТССААЮЕЇ : : | ТЕСТТСОАВААССАЛАССААТТААВТЗАСТОООСТТАЛОССАССЛАЄТОС : і : О-щ і ІЗ І ї І в : Енн о нд он вн зно рос дон о фр ннннн зиккт В о в рн фр п р фо рве ор де коор лоно фі фено ви СИ Нв я | БЕЗЕ я 53 ВХ ! ТАВТААКОТАТАТАТАТАТЗА ТАТ ВАСТ ТС ТАСНСАС ТО ТТОВВАСАТА ; : ! ПАДАВ ОДААСАЄТТОВ ТОВСТА ТОЛАВАТЛАВЕ ТС : ОЗОН Ме Я 0 ЗОБЯ 0 аБЛЯВІВ ОССАТТАСАСОДАССААТААСТО ТОААСАСОСОСООКТІААСТАААТАХ Я Н Е Н і ; І ! | ОКПТАТАОСТОООАСАВАСТАЄТООДОТААТЕТСТАТСААААСССАТО і нини нн нн нн нн НН НК НН МН НО МНН КН КН НО НО КОНОНКО МЛК ОКОЛО НН НН ВБАНО Мо ЕВ ОО 0 БОНН ТТУААТТСТОСТОТАААСТТЯ КАТЕ ТОСТОСТОСТОАНУСАЄТАТТА : | : | ДААТТААСАТОБВАСОВОВСТС ТТ ТСА ТТ АВААОСАСАСВТ АНА шин нн нн

ЕОМ. 6 Б 5, НАУ | ТАСОТСТОТАЄТАТОАОСТО ТК ПСАРОААЗ ТКУ ТСТОАСАТААТА : і В ВАТ ЧОССАСВАСТ ОСАСАССААССТАСТОСТОАТСАСТОАТТТАВСАО ща ванн крим днк За о о р ооо ооо ук они и в хх сх с Н ЖОВ Ме у | ЗБК ОО ЯБТЬНОВ СПЛААТАССКТТТО ТО ТСТААТАТ ТЕСТУ САТ ТАЄ: нт ноут СТАВИ СТВО ТАКО СТАЛОСТІ ТАТСТАСТОАТОСТЯ ЗВО Мо, 28 ! В ЯБЬМО 0 АТСССТОТСАСААААТЕЮТТАССТОВОВАААВААВ ОСТ КАСОАМСВА По по нік ос ЯК На ЦИ КОН МОЯ БІВ БОБ САЛО ТАКТ АСССТАННИ ОВС ССАТАТ ГАТТ ТТ ТТ ОТАТСВОСТАЄ о : і ВТТОАТНЖАССВАТ КАСА ОКОМ СОАААВАВОВСТОКСТІВ 18 ПУ в и Ви М ШОВ НО ме пи ке фени соч Кв ев А БЮ Ме. ЗО 1 ЗУ? | ЗБОЇ ТОТАСОАТАТА НУ САС ТТ ПС ТОДОССТОАТ ПТ АСАСААТСТТА нн нн мн АОС ВО ТО С АААААТОАААСТТТАСААСВТ ТТ СТ ТОАТСТСТВА

Фіг.2 (продовження!)