UA124399C2

UA124399C2 - Макроциклічна сполука та її застосування

Info

Publication number: UA124399C2
Application number: UAA201910898A
Authority: UA
Inventors: Йосіто Кісі; Йосито Киси; Казунобу Кіра; Казунобу КИРА; Кен Іто; Кен ИТО
Original assignee: Президент Енд Феллоуз Оф Гарвард Колледж; Президент Энд Феллоуз Оф Гарвард Колледж; ЕЙСАЙ Ар ЕНД Ді МЕНЕДЖМЕНТ КО., ЛТД.; Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд.
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2021-09-08
Also published as: MD3606928T2; PT3606928T; EP3606928A1; LT3606928T; JP7400025B2; BR112019020208A2; TWI781163B; SG11201908603PA; ZA201906279B; HUE060466T2; JOP20190234B1; MX2019011982A; WO2018187331A8; WO2018187331A1; PE20200602A1; IL288991A; CN110831946A; ES2931533T3; JP6366873B1; HRP20221385T1

Abstract

У даному винаході пропонується нова Сполука (1), яка має ефект ремоделювання судин пухлини і/або активність проти CAF (фібробластів пов'язаних з раком), або її фармацевтично прийнятна сіль, необов'язково у фармацевтично прийнятному носії та її медичне застосування. Сполука (1)

Description

пухлини і/або активність проти САКЕ (фібробластів пов'язаних з раком), або її фармацевтично прийнятна сіль, необов'язково у фармацевтично прийнятному носії та її медичне застосування.

ІН нон:

Н - о, еомера о

НО,,, Ге) ; н

І о-- В що о о ее) : - 0 - Х в)

НМ. де о Н Н Н : Н АН

Ко, з, А Оп

Н п, (Ф)

Сполука (1)

НО,,, Ге) у, Н

С» обитот обо

М. чо Н нн Я Нн ян

Кк з, й о. й пе)

Дана заявка запитує пріоритет відповідно до Зводу законів США 35 5 119 (е) щодо попередніх заявок на патент США, О.5.5.М. 62/482030, поданої 5 квітня 2017 р., 0О.5.5.М. 62/526 677, поданої 29 червня 2017 р., і 0.5.5.М. 62/586 416, поданої 15 листопада 2017 року і відповідно до Зводу законів США 35 5 120 щодо заявки на патент США, О.5.5.М. 15/814 105, поданої 15 листопада 2017 р.; повний зміст кожної з яких включений у даний документ за допомогою посилання.

Галузь техніки

Даний винахід стосується нової макроциклічної сполуки, що має ефекти ремоделювання судин пухлини і активність проти САЕ (фібробластів пов'язаних з раком). Сполука може застосовуватися для лікування раку або інгібування росту пухлини у суб'єкта.

Рівень техніки

Галіхондрини, такі як галіхондрин В, є протипухлинними засобами, спочатку виділеними з морської губки Наїїспопагіа оКадаї (див., наприклад, Ю. Оетига еї аї. "Могпаїїспопагіп А: Ап

Апійштог Роїуеїпег Масгоїїде їгот а Магіпе 5ропде" 9). Ат. Спет. 5ос., 107, 4796 (1985)) і згодом виявлені у АхіпеїІа 5р., РпакКеїйа сапегі і І ізвопаепагух 5р. Повний синтез галіхондрину В був опублікований в 1992 році (див., наприклад, У. Ківпі еї аї. "Тоїа! Зупіпеві5 ої Наїїспопагіп В апа

Могпаїїспопагіп В" ОО. Ат. Спет. ос. 114, 3162 (1992)). Галіхондрин В продемонстрував інгібування іп міїго полімеризації тубуліну, зборки мікротрубочок, перехресного зшивання бета-5- тубуліну, зв'язування СТР і вінбластину з тубуліном і тубулін-залежного гідролізу СТР, і показав протиракові властивості іп міїго та іп мімо (див., наприклад, У. Нігаїа еї аї. "Наїїспопагіп5 -апіййтог роїуеєїйег тасгоїїде5 їйот а тагіпе зропде" Риге Аррі. Спет., 58, 701 (1986); Роавіасй еї аї. "Сотрагаїме апійштог асіїміев ої паійспопагіп5 апа міпріазііпе адаіпої пПитап їштог хеподгайв" .). ої Ехрегітепіа! ТПегарешісв в Опсоіоду 1996; 1: 119, 125).

Мезилат ерибуліну (Наіамеп"М), який був розроблений на основі галіхондрину В (див., наприклад, міжнародну публікацію Мо ММО 1999/065894, яка опублікована 23 грудня 1999 року; міжнародну публікацію Мо М/О 2005/118565, яка опублікована 15 грудня 2005 року та ММ. 7пепа еї аІ. "Масгосусіїс Кеопе апаіодиез ої Наїїспопагіп В" Віоогдапіс 8. Медісіпа! Спетівігу І еНег5 14, 5551-5554 (2004)), на даний момент клінічно застосовується в багатьох країнах для лікування, наприклад, метастатичного раку молочної залози і прогресуючої ліпосаркоми.

Додаткові патентні публікації, в яких описуються галіхондрини, включають патент США Мо 5436238 Кібпі зі співавторами, виданий 25 липня 1995 р.; патент США Мо 5338865 Кізпі зі співавторами, виданий 16 серпня 1994 р.; і ММО 2016/003975, поданий Ківпі зі співавторами, які були передані Президенту і членам керівної ради Гарвардського університету.

Див. також, наприклад, патент США Мо 5,786,492; патент США Мо 8,598,373; патент США Мо 9,206,194; патент США Мо 9,469,651; УМО/2009/124237А1; МО/1993/017690А1;

УМО/2012/147900А1; патент США Мо 7,982,060; патент США Мо 8,618,313; патент США Мо 9,303,050; патент США Мо 8,093,410; патент США Ме 8,350,067; патент США Мо 8,975,422; патент

США Мо 8,987,479; патент США Мо 8,203,010; патент США Мо 8,445,701; патент США Мо 8,884,031; патент США Мо КЕ45,324; патент США Мо 8,927,597; патент США Мо 9,382,262; патент

США Мо 9,303,039; УМО/2009/046308А1; УМО/2006/076100А3; УМО/2006/076100А2;

УМО/2015/085193А1;. МУО/2016/176560А1; патент США Мо 9,278,979; патент США Мо 9,029,573;

МО/2011/094339А1; М О/2016/179607А1; МО/2009/064029А1; МО/2013/142999А1;

МО/2015/066729А1; МО/2016/038624А1; і ММО/2015/000070А1.

Фібробласти, пов'язані з раком (САБЕ), які широко виявляються в різних солідних пухлинах, являють собою стромальні клітини. Добре відомо, що СА відіграють важливу роль в ангіогенезі, інвазії і метастазуванні. Повідомляється, що існує тісний зв'язок між кількістю САКЕ і клінічним прогнозом, наприклад, при інвазивному раку молочної залози (див., наприклад, М.

Уатазийа еї аї. "Коїе ої взігота! туоїйбгобіавбіб5 іп іпмазіме Бгеавзі сапсег: вігота! ехргезвіоп ої аірпа-5тооїій тивсіє асіїп соггеїасез м/йй могзе сіїпіса! ошісоте" Вгеавзі Сапсег 19, 170, 2012) і при аденокарциномі стравоходу (Див., наприклад, Т. У. Опаегмооса еї аї. "апсег-аззосіаїтей Пргобіавів ргедісї роог ошісоте апа рготоїє реповііп-дерепадепі іпмазіоп іп езорпадєа! адепосагсіпота"

Уоигаї ої Раїпої., 235, 466, 2015). Також повідомлялося, що САЕ корелюють зі стійкістю в різних пухлинах, таких як, наприклад, рак молочної залози (див., наприклад, Р. Раптег еї аї. "А вігота- геіатед депе зідпаїшиге ргедісібє гевзівїапсе то пеоадіимапі спетоїПпегару іп ргеазі сапсег Майшге

Меаісіпе., 151), 68, 2009), а також рак голови і шиї (див., наприклад, 5. Зсптії еї аї.. "Сешхітар рюотоїез еріїпеїЇйаІ ю тезепспутаї їгапзйоп апа сапсег аззосіаївєа ТБгобіавів іп райепів м/йй Неай апа песК сапсег" Опсоїаговеї, 6 (33), 34288, 2015; У. Маївцока вї аї. "Те Шштог зіготаї їєайштгез аге аззосіаїєд мій гевібїапсе о 5-РО-разей спетогадіоїпегару апа а роог ргодповів іп райепів мін ога! здпатоизвг сеї! сагсіпота" АРМІЗ 123(3), 205, 2015). бо Таким чином, було виявлено, що ефекти ремоделювання судин пухлини і активність проти

СА призводять до покращення мікросередовища раку, що сприяє лікуванню пухлини.

Кровоносні судини необхідні для росту пухлин. Через реконструйовані кровоносні судини в пухлинах можна вводити протипухлинні засоби агенти в пухлини, на додаток до досягнення полегшення гіпоксії. Повідомляється, що індуковане ерибуліном ремоделювання аномальної пухлинної судинної системи призводить до більш функціонального мікросередовища, що може знизити агресивність пухлин через усунення гіпоксії внутрішньої пухлини. Оскільки мікросередовище аномальної пухлини посилює як стійкість до лікарських препаратів, так і метастазування, очевидна здатність ерибуліну усувати ці агресивні характеристики може сприяти його клінічним перевагам (див., наприклад, У. Еипавабзнпі еї аї. "Егібиїїп тезуїасе гедисев5

Шштог тісгтоепмігоптепі абпоптайу Бу мазсшаг гтетоаеїїпу іп ргесіїпісаї питап Ббгеаві сапсег тоадеї!в" Сапсег осі. 105 (2014), 1334-1342). Про протипухлинні препарати, що мають ефекти ремоделювання судин пухлини і активність проти САБЕ, на сьогоднішній день не повідомлялося.

Незважаючи на досягнутий прогрес, необхідні додаткові сполуки для розвитку досліджень і медичної допомоги при пухлинах і раку.

Суть винаходу

Винахід стосується макроциклічних сполук (наприклад, Сполуки (1)), що мають ефекти ремоделювання судин пухлини і активності проти САКЕ, і їхніх фармацевтично прийнятних солей, а також їхніх мічених ізотопом похідних та їхніх фармацевтичних композицій.

Винахід також включає способи застосування Сполуки (1) для лікування раку, способи оборотного або необоротного інгібування мітозу в клітині і способи інгібування росту пухлини іп мійго, іп мімо або у суб'єкта. В іншому аспекті даний винахід передбачає набори з вмістом

Сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або її фармацевтичної композиції.

В одному аспекті, винахід стосується сполуки, що являє собою Сполуку (1): ї Н Н НН:

НО,,, ІФ) , о о Н

Ве) ОІИО, ОТТО

НМ. де о . Н Н Н І Н хН е ., 2 Ф/р ми 17;

Н па. ло

Сполука (1), та її фармацевтично прийнятну сіль; та її мічені ізотопом похідні.

В одному аспекті винахід передбачає фармацевтичні композиції, які містять Сполуку (1) або її фармацевтично прийнятну сіль або мічене ізотопом похідне. Фармацевтичні композиції

Зо можуть містити один або декілька фармацевтично прийнятних ексципієнтів або носіїв.

Фармацевтичні композиції можуть додатково містити один або декілька додаткових терапевтичних засобів в комбінації, чергуванні або іншому вигляді синхронізованої терапії для досягнення бажаної мети лікування.

Винахід також стосується способів отримання Сполуки (1) або її проміжних продуктів.

Синтетичні проміжні продукти також наведені в даному документі як частина винаходу.

Було виявлено, що Сполука (1) чинить сприятливий ефект на ремоделювання судин пухлини і має активність проти САБЕ, як показано на фігурах і в прикладах. Відповідно, Сполука (1) має потенційне застосування при лікуванні раку (наприклад, плоскоклітинний рак голови та шиї (ЗССНМ), рак молочної залози, рак стравоходу, рак матки, рак яєчників, рак ободової та прямої кишки, рак ендометрія, рак шлунка, рак тонкої кишки, рак сечового міхура, саркоми, рідкісні види раку).

В іншому аспекті даний винахід передбачає способи інгібування будь-якого росту пухлини або раку, які реагують на сполуку за допомогою ефектів ремоделювання судин пухлини і/або активності проти СА, у суб'єкта, зазвичай людини, за допомогою Сполуки (1), або її фармацевтично прийнятної солі, або її міченого ізотопом похідного.

Сполука (1) або її фармацевтично прийнятна сіль, або її мічене ізотопом похідне, або її композиція може вводитися у поєднанні з будь-яким іншою активно діючою речовиною, що надає пацієнту сприятливі результати. У певних варіантах здійснення винаходу, Сполука (1) застосовується у поєднанні з антитілом (наприклад, моноклональним антитілом). В одному варіанті здійснення винаходу Сполука (1) застосовується в комбінації, чергуванні або іншій синхронізованій терапії з імунотерапією, такою як антитіло проти ЕСЕК (рецептор епідермального фактора росту), антитіло до НЕК2 (рецептор епідермального фактора росту людини), антитіло проти РО-1 або антитіло проти РО-1І 1, як більш детально описано нижче.

Наприклад, передбачається спосіб лікування плоскоклітинного раку голови і шиї (ЗССНМ) у суб'єкта, зазвичай людини, яка цього потребує, що включає введення суб'єкту ефективної кількості Сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або її міченого ізотопом похідного або її композиції в поєднанні з терапією моноклональними антитілами (тАбБ) проти ЕСЕК (рецептор епідермального фактора росту). У деяких варіантах здійснення винаходу, тАб проти

ЕСЕР (рецептора епідермального фактора росту) являє собою цетуксимаб.

Як інший приклад, спосіб лікування раку молочної залози у суб'єкта, зазвичай людину, яка цього потребує, що включає введення зазначеному суб'єкту ефективної кількості сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або міченого ізотопом похідного, або її композиції в комбінації з терапією тАБ проти НЕК2 (рецептора епідермального фактора росту людини). У деяких варіантах здійснення тАр проти НЕК2 (рецептора епідермального фактора росту людини) являє собою трастузумаб. В інших варіантах здійснення винаходу, Сполука (1) може застосовуватися для лікування раку молочної залози в поєднанні з традиційною хіміотерапією, зокрема адріаміцином, циклофосфамідом, таксолом тощо або з антиестрогеном, таким як селективний модулятор рецептора естрогену (ЗЕКМ), селективний деградатор рецепторів естрогену (БЕКО), частковий або повний інгібітор естрогену (такий як фулвестрант) або інгібітор

СОК 4/6, такий як палбоцикліб (Рії7ег).

В іншому аспекті винаходу передбачена Сполука (1) або її фармацевтично прийнятна сіль або її мічене ізотопом похідне, що може бути у формі гідрату, сольвату, поліморфу або її композиція в наборі, який може бути упаковкою для лікарської форми. Набори, описані в даному документі, можуть включати одноразову дозу або багаторазові дози сполуки або її фармацевтичної композиції. Набір за винаходом може включати інструкції із застосування наданих терапевтичних лікарських форм (наприклад, інструкції із застосування сполуки або фармацевтичної композиції, включеної в набір).

Отже, даний винахід, включає в себе, щонайменше, наступні ознаки:

Зо () Сполука (1), або її фармацевтично прийнятна сіль або мічене ізотопом похідне, що необов'язково може бути у формі гідрату, сольвату або поліморфу; (і) Спосіб лікування, який включає введення ефективної кількості суб'єкту, такому як людина, Сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або міченого ізотопом похідного, що необов'язково може бути у формі гідрату, сольвату або поліморфу, для лікування раку голови і шиї (наприклад, плоскоклітинного раку голови та шиї (ЗССНМ), аденокістозної карциноми), раку молочної залози (наприклад, НЕК2-негативного раку молочної залози, тричі негативного раку молочної залози), раку стравоходу (наприклад, аденокарциноми стравоходу), раку матки (наприклад, саркоми матки), раку яєчників, раку ободової та прямої кишки, саркоми (наприклад, синовіальної саркоми, ангіосаркоми, саркоми м'яких тканин, фібросаркоми, саркоми матки), раку сечового міхура (наприклад, раку уротелія), раку шлунка, раку тонкої кишки (наприклад, аденокарциноми тонкої кишки), раку ендометрія або рідкісного виду раку; (ії) Спосіб лікування, який включає введення ефективної кількості суб'єкту, такому як людина, Сполуки (1), або її фармацевтично прийнятної солі або міченого ізотопом похідного, що необов'язково може бути у формі гідрату, сольвату або поліморфу, для застосування при лікуванні захворювання, такого як рак або пухлина, що реагує на ефекти ремоделювання судин і/або активність проти САКЕ; (м) Сполука (1) або її фармацевтично прийнятна сіль або мічене ізотопами похідне, що необов'язково може бути у формі гідрату, сольвату або поліморфу, для застосування при лікуванні плоскоклітинного раку голови і шиї (ЗССНМ), раку молочної залози, раку стравоходу, раку матки, раку яєчників, раку ободової та прямої кишки, саркоми, раку сечового міхура, раку шлунка, раку тонкої кишки, раку ендометрія або рідкісних видів раку; (м) Сполука (1) або її фармацевтично прийнятна сіль або мічене ізотопами похідне, що необов'язково може бути у формі гідрату, сольвату або поліморфу, для застосування при лікуванні захворювання, такого як рак або пухлина, що реагує на ефекти ремоделювання судин і/або активність проти САКЕ; (м) Дейтероване похідне Сполуки (1); (мі) Спосіб виготовлення лікарського засобу, призначеного для терапевтичного застосування при лікуванні або профілактиці захворювання, таких як рак або пухлина, які реагують на ефекти ремоделювання судин і/або активність проти САЕ, який відрізняється тим, що при його бо виготовленні застосовується Сполука (1) або її фармацевтично прийнятна сіль або позначене ізотопом похідне, що може бути необов'язково у формі гідрату, сольвату або поліморфу, описаного вище, або варіант активної сполуки; (мії) Сполука (1), або її фармацевтично прийнятна сіль або мічене ізотопом похідне є по суті в чистій формі (наприклад, щонайменше 90 або 95 9б); (їх) Фармацевтично прийнятна композиція Сполуки (1) або її фармацевтично прийнятна сіль або мічене ізотопом похідне, що може бути необов'язково у формі гідрату, сольвату або поліморфу, у фармацевтично прийнятному носії або допоміжному засобі; (х) Фармацевтично прийнятна лікарська форма Сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або міченого ізотопом похідного, що може бути необов'язково у формі гідрату, сольвату або поліморфу, необов'язково у фармацевтичо прийнятному носії або допоміжному засобі; (хі) Сполука (1) або її фармацевтично прийнятна сіль або мічене ізотопом похідне, для лікування захворювання, що описується в даному документі, де вона діє за допомогою механізму, який відрізняється від ефектів ремоделювання судин і/або активності дії проти САКЕ; і (хі) Способи виготовлення сполук, описаних в даному документі, і проміжних сполук в синтезі

Короткий опис креслень

Додані креслення, які включені в даний опис і становлять його частину, ілюструють декілька варіантів здійснення винаходу і спільно з описом надають необмежувальні приклади винаходу.

На Фігурі 1 показані протипухлинні ефекти Сполуки (1) на моделі підшкірного ксенотрансплантата Раби (рак голови і шиї) у мишей як монотерапії, що описується в Прикладі 4 фармакологічного тесту.

На Фігурі 2 показані протипухлинні ефекти Сполуки (1) на моделі підшкірного ксенотрансплантата О5С0-19 (рак голови і шиї) у мишей як монотерапії, що описується в

Прикладі 5 фармакологічного тесту.

На Фігурі З показана протипухлинна активність Сполуки (1) на моделі підшкірного ксенотрансплантата (рак молочної залози) НСС-1806 у мишей як монотерапії, як описується в

Прикладі 6 фармакологічного тесту.

На Фігурі 4 показані протипухлинні ефекти Сполуки (1) на моделі підшкірного

Зо ксенотрансплантата Раби в комбінації з цетгуксимабом у мишей, як описується в Прикладі 7 фармакологічного тесту.

На Фігурі 5 показана протипухлинна активність Сполуки (1) на моделі підшкірного ксенотрансплантата КРІ-4 (рак молочної залози) в комбінації з трастузумабом у мишей, як описано в Прикладі 8 фармакологічного тесту.

На Фігурі 6-68 показана протипухлинна дія Сполуки (1) на мишачій моделі ортотопічної трансплантації НеС-2. Фігура бА. Безтимусним мишам у язик імплантували трансдукований люциферазою НОС-2 (1х105 клітин/ямку). Кількість трансдукованої люциферазою НЗС-2 аналізували за допомогою системи візуалізації іп мімо (п Мімо Ітадіпд Зувіет) (ІМІ5). Дані показують рівні біолюмінесценції в язику у кожної миші. Фігура 6В. Типові зображення біолюмінесценції у 16 мишей. СООР, СТХ, СООР «я СТХ застосовувалися як компаратори, які на даний момент застосовуються при лікуванні пацієнтів, хворих на плоскоклітинний рак голови та шиї. СООР « цисплатин, СТХ - цетуксимаб.

На Фігурах 7А-7В показано перевагу виживаності внаслідок застосування Сполуки (1) в комбінації з цетуксимабом на мишачій моделі ортотопічної трансплантації НеС-2. Фігура 7А.

Безтимусним мишам імплантували трансдукований люциферазою Н5ЗС-2 (1х106 клітин/ямку) у язик. Дані показують криву виживаності до 100-го дня після лікування лікарськими засобами (п - 16). "Р «0,0001 порівняно зі Сполукою (1) або лише СТХ (логарифмічний ранговий критерій (Мантела-Кокса)). Фігура 7В. Кількість трансдукованого люциферазою НЗС-2, аналізували за допомогою системи візуалізації іп мімо (п Мімо Ітадіпд 5Зуз(ет) (ІМІ5). Біолюмінесцентні зображення 10 мишей, що вижили, з комбінованої групи Сполуки (1) ї- СТХ на день 100. ЕВМУ - відносна маса тіла. СЮОР - цисплатин, СТХ - цетуксимаб.

На Фігурі 8-88 показана протипухлинна дія Сполуки (1) в комбінації з променевою терапією на мишачій моделі ксенотрансплантата Раби. Фігура 8А. Безтимусним мишам підшкірно імплантували трансдукований люциферазою Раби (5х106 клітин/'ямку) в праві стегна. Через тринадцять днів після щеплення, мишам довільно призначали (п - 6) і внутрішньовенно вводили

Сполуку (1) в дозі 90 мкг/кг у 1-й і 8-й день з або без КТ з 18 Су на 4-й і 11-й день. Кількість трансдукованої люциферазою Раби аналізували за допомогою системи візуалізації іп мімо (Іп

Мімо Ітадіпд Зубіет) (ІМІ5). Дані показують середній відносний рівень біолюмінесценції до 1-го дня і 5ЕМ (п - 6). ЗЕМ - стандартна похибка середнього значення. "Р«е0,05 порівняно з 60 необробленим матеріалом на 29-й день (двовибірковий і-критерій). Фігура 8В. Типові біолюмінесцентні зображення 6 мишей в кожній групі на 29 день. КТ - променева терапія.

На Фігурі 9 показана протипухлинна активність Сполуки (1) в поєднанні з антитілом проти тРО-1. Сингенну мишачу модель СТ26 5.65. (рак товстої кишки) обробляли Сполукою (1) і антитілом проти тРО-1 за графіком 270 і двічі на тиждень, відповідно, протягом З тижнів.

Результати показують середнє хх ЗЕМ об'ємів пухлини (мм3) (п - 8).

На Фігурі ТО0А показаний безклітинний аналіз полімеризації тубуліну. Сполука (1) має інгібуючу активність відносно полімеризації тубуліну. На Фігурі 10В показаний аналіз динаміки мікротрубочок. Сполука (1) також має інгібуючу активність відносно динаміки мікротрубочок.

На Фігурі 11 показано, що Сполука (1) являє собою сильнодіючий антипроліферативний агент в клітинних лініях раку стравоходу (ОЕ21, ОЕЗЗ і ТЕ-8) і раку матки (МЕ5-5БА, МЕ5-

ЗА/Ох5-ВХ1).

На Фігурі 12 показано, що Сполука (1) має потужну протипухлинну активність в підшкірних ксенотрансплантатних моделях раку молочної залози і яєчників (КРІ -4 ії СОЇ О-704, відповідно) як монотерапія.

На Фігурі 13 показаний вплив сполуки (1) на мікросередовища пухлини. Як показано,

Сполука (1) підвищує щільність мікросудинної мережі. "Р«0,05, Р«0,01, и Р«О0,0001 порівняно з необробленим матеріалом (критерій множинних порівнянь Даннетта).

На Фігурі 14 показаний вплив сполуки (1) на мікросередовища пухлини. Як показано,

Сполука (1) знижує а-ЗМА-позитивні САКЕ.

На Фігурі 15 показано, що Сполука (1) знижує білюи ЕСМ з САЕ в моделі підшкірного ксенотрансплантата Баби. Пухлини ксенотрансплантата Бари збирали на 6-й день після одноразового введення сполуки (1) 180 мкг/ кг ї цетуксимаб в 1-й день.

На Фігурі 16 показано, що Сполука (1) демонструє дозозалежний комбінаційний ефект з цетуксимабом в моделі підшкірного ксенотрансплантата Бари. Разова доза, п - 6. Сполуку (1) і цетуксимаб (СТХ) вводили в перший день в модель ксенотрансплантата Бари.

На Фігурі 17 показані протипухлинні ефекти на моделях ксенотрансплантата саркоми м'яких тканин у мишей як монотерапія. Показані МЕ5-5А (саркома матки людини), НТ-1080 (фібросаркома людини) і СТО-2041 (ангіосаркома людини).

На Фігурі 18 показані протипухлинні ефекти на моделях ксенотрансплантата раку

Зо ендометрія у мишей як монотерапія. Показані НЕС-108 ії АМЗСА (рак ендометрія).

Визначення

Термін «сіль», що вживається в даному документі, стосується будь-якої і всіх солей та включає фармацевтично прийнятні солі. Термін "фармацевтично прийнятна сіль" стосується тих солей, які, в рамках здорового медичного судження, придатні для застосування в контакті з тканинами людей і нижчих тварин без надмірної токсичності, подразнення, алергічної реакції тощо, і відповідають розумному співвідношенню користь/ризик. Фармацевтично прийнятні солі є добре відомими в даній галузі техніки. Наприклад, Берге зі співавторами (Вегоде еї аЇ.) детально описує фармацевтично прийнятні солі у У. РПаппасешіса! Зсіепсе5, 1977, 66, 1-19, який включений в даний документ шляхом посилання. Фармацевтично прийнятні солі сполук за даним винаходом включають солі, отримані з придатних неорганічних і органічних кислот і основ. Прикладами фармацевтично прийнятних солей приєднання нетоксичних кислот є солі аміногрупи, утвореної з неорганічними кислотами, такими як соляна кислота, бромистоводнева кислота, фосфорна кислота, сірчана кислота і перхлорна кислота, або з органічними кислотами, такими як оцтова кислота, щавлева кислота, малеїнова кислота, винна кислота, лимонна кислота, бурштинова кислота або малонова кислота або за допомогою інших способів, відомих в даній галузі техніки, таких як іонний обмін. Інші фармацевтично прийнятні солі включають адипат, альгінат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бісульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропіонат, диглюконат, додецилсульфат, етансульфонат, формат, фумарат, глюкогептонат, гліцерофосфат, глюконат, гемісульфат, гептаноат, гексаноат, гідройодид, 2-гідроксі-етансульфонат, лактобіонат, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталінсульфонат, нікотинат, нітрат, олеат, оксалат, пальмітат, памоат, пектинат, персульфат, З-фенілпропіонат, фосфат, пікрат, півалат, пропіонат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тіоціанат, п-толуолсульфонат, ундеканаоат, солі валеріанової кислоти тощо. Солі, отримані з відповідних основ, включають солі лужних металів, лужноземельних металів, амонію і М(С:1-4залкіл)є. Типові солі лужних або лужноземельних металів включають натрій, літій, калій, кальцій, магній тощо. Інші фармацевтично прийнятні солі включають, у відповідних випадках, нетоксичні катіони амонію, четвертинного амонію і аміну, утворені з використанням протиіонів, таких як галід, гідроксид, карбоксилат, сульфат, фосфат, нітрат, нижчий алкілсульфонат і арилсульфонат. Передбачається бо також Сполука (1), що може вводитися у вигляді вільної основи.

Також слід розуміти, що сполуки, які мають однакову молекулярну формулу, але відрізняються за своєю природою або послідовність зв'язування їхніх атомів або розташування їхніх атомів в просторі, називаються "ізомерами". Ізомери, які відрізняються розташуванням їхніх атомів в просторі, називаються "стереоізомерами".

Терміни "композиція" і "лікарська форма" вживаються взаємозамінно. "Суб'єкт", якому передбачається введення, стосується людини (тобто чоловіка або жінки будь-якої вікової групи, наприклад, педіатричного пацієнта (наприклад, немовляти, дитини або підлітка) або дорослого пацієнта (наприклад, молодого дорослого пацієнта, дорослого пацієнта середнього віку або похилого віку)) або нелюдиноподібної тварини. У певних варіантах здійснення винаходу, нелюдиноподібна тварина є ссавцем (наприклад, приматом (наприклад, яванський макак або макак резус), комерційно значущим ссавцем (наприклад, велика рогата худоба, свиня, кінь, вівця, коза, кішка або собака) або птахом (наприклад, комерційно значущим птахом, таким як курка, качка, гусак або індик). У певних варіантах здійснення винаходу, нелюдиноподібний ссавець являє собою рибу, рептилії або земноводні. Нелюдиноподібна тварина може бути самцем або самицею на будь-якій стадії розвитку. Нелюдиноподібна тварина може бути трансгенною твариною або генно-інженерною твариною. Термін "пацієнт" стосується суб'єкта людини, який потребує лікування захворювання.

Термін "вводити", "що вводиться" або "введення" стосується імплантації, вбирання, прийому всередину, ін'єкції, вдихання або іншого введення сполуки, що описується в даному документі, або її композиції, суб'єкту.

Терміни "лікування", "лікувати" і "що лікує" стосуються усунення, полегшення, затримки або уповільнення розвитку захворювання, описаного в даному документі. У деяких варіантах здійснення винаходу, лікування можна призначати після того, як розвинулися або спостерігалися одна або декілька ознак або симптомів захворювання. В інших варіантах здійснення винаходу, лікування можна призначати за відсутності ознак або симптомів захворювання. Наприклад, лікування може бути призначено сприйнятливому суб'єкту до появи симптомів. Лікування також може бути продовжено після усунення симптомів, наприклад, для затримки або запобігання рецидиву. "Ефективна кількість" сполуки, що описується в даному документі, стосується кількості,

Зо достатньої для того, щоб викликати бажану біологічну реакцію. Ефективна кількість сполуки, що описується в даному документі, може змінюватися залежно від таких факторів, як бажана біологічна кінцева точка, фармакокінетика сполуки, патологічний стан, що піддається лікуванню, спосіб введення, а також вік і стан здоров'я суб'єкта. В деяких варіантах здійснення винаходу, ефективною кількістю є терапевтично ефективна кількість. В альтернативному варіанті, в окремому способі або застосуванні винахід може використовуватися у випадках, де він показаний та ефективний як профілактичне лікування. В деяких варіантах здійснення винаходу, ефективною кількістю є кількість сполуки, що описується в даному документі, в одноразовій дозі. В деяких варіантах здійснення винаходу, ефективною кількістю є комбіновані кількості сполуки, що описуються в даному документі, в багаторазових дозах. "Терапевтично ефективна кількість" сполуки, що описується в даному документі, являє собою кількість, достатню для забезпечення терапевтичного ефекту при лікуванні патологічного стану або для затримки або мінімізації одного або декількох симптомів, пов'язаних з патологічним станом. Терапевтично ефективна кількість сполуки означає кількість терапевтичного засобу, окремо або в комбінації з іншими видами терапії, що забезпечує терапевтичний ефект при лікуванні патологічного стану. Термін "терапевтично ефективна кількість" може охоплювати кількість, що покращує загальну терапію, зменшує або усуває симптоми, ознаки або причини патологічного стану і/або підвищує терапевтичну ефективність іншого терапевтичного засобу. В окремих варіантах здійснення винаходу, терапевтично ефективна кількість є кількістю, достатньою для лікування будь-якого описаного захворювання або патологічного стану.

Термін "інгібування", "інгібуючий", "інгібувати" та "інгібітор", тощо стосується здатності сполуки знижувати, уповільнювати, зупиняти або запобігати активності біологічного процесу (наприклад, росту пухлини). У деяких варіантах здійснення винаходу, інгібування становить приблизно від 45 95 до 50 95. У деяких варіантах здійснення винаходу, інгібування становить приблизно 5 95, 10 95, 15 95, 20 95, 25 95, 30 Фо, 35 90, 40 Фо, 45 Зо, 50 95, 55 Зо, 60 95, 65 Фо, 70 95, 75 95, 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 99,9 95, або 100 95.

Терміни «новоутворення» і «пухлина» вживаються в даному документі як взаємозамінні і стосуються аномальної маси тканини, де ріст маси перевищує ріст нормальної тканини і не узгоджується з її ростом. Новоутворення або пухлина можуть бути «доброякісними» або бо «злоякісними» залежно від наступних характеристик: ступеня клітинного диференціювання

(включаючи морфологію і функціональність), швидкості росту, місцевого проростання пухлини і метастазування. «Доброякісне новоутворення», як правило, є високодиференційованим, має характерно більш повільний ріст, ніж злоякісне новоутворення, і залишається локалізованим в місці походження. Крім того, доброякісне новоутворення не має здатності проникати, інвазувати або метастазувати у віддалені місця. На відміну від нього, «злоякісне новоутворення», як правило, є низькодиференційованим (анаплазія) і характеризується характерно швидким ростом, що супроводжується прогресуючою інфільтрацією, інвазією і руйнуванням оточуючої тканини. Крім того, злоякісне новоутворення зазвичай має здатність метастазувати у віддалені місця. Термін «метастазування», «метастатичний» або «метастазувати» стосується поширення або міграції ракових клітин з первинної або вихідної пухлини у інший орган або тканину і зазвичай визначається за наявністю «вторинної пухлини» або «вторинної клітинної маси». типу тканини первинної або вихідної пухлини, а не маси органу або тканини, в якій розташована вторинна (метастатична) пухлина.

Термін "рак" стосується класу захворювань, що характеризуються розвитком аномальних клітин, які неконтрольовано розмножуються і мають здатність проникати у нормальні тканини організму і руйнувати їх.

Термін "рідкісний вид раку" стосується ракових захворювань, які виникають у відносно невеликої кількості пацієнтів. Рідкісні види раку включають, але не обмежуються ними, саркоми (наприклад, саркома м'яких тканин, ліпосаркома, саркома матки, лейоміосаркома, міксофібросаркома, остеосаркома, ангіосаркома, саркома Юінга, синовіальна саркома, рабдоміосаркома), злоякісні лімфоми, рак загрудинної залози (наприклад, тимома), мезотеліома, шлунково-кишкові стромальні пухлини (СІ5Т), нейроендокринний рак, рак ока, пухлини головного мозку, пухлини м'якої кісткової тканини, рак шкіри і герміногенні пухлини.

Термін "протираковий засіб" стосується будь-якого терапевтичного засобу, корисного для лікування раку у суб'єкта (наприклад, для пригнічення раку або росту пухлини у суб'єкта).

Протиракові засоби включають біотерапевтичні протиракові засоби, а також хіміотерапевтичні засоби.

Детальний опис деяких варіантів здійснення

Нижче наведений детальний опис даного винаходу з посиланням на варіанти здійснення

Зо винаходу тощо. Винахід передбачає сполуки (наприклад, Сполуки (1)) та їхні фармацевтично прийнятні солі або мічені ізотопом похідні та їхні фармацевтичні композиції. Винахід також передбачає способи інгібування росту пухлини і/або лікування раку у суб'єкта, що включає введення суб'єкту ефективної кількості сполуки або композиції, наведеної в даному документі.

Сполуку або композицію можна вводити як монотерапію або в комбінації з іншою терапією, як описано в даному документі. У ще одному аспекті даний винахід стосується способів отримання

Сполуки (1) і синтетичних проміжних продуктів, придатних з цією метою.

Даний винахід включає сполуку, що має структуру:

НО,,, о) / о о Н

Вк) ОТИТ, фо

Нам. де о . Н Н Н І Н КТ!

У з ; Оп: н

Пе,

Сполука (1), або її фармацевтично прийнятну сіль або мічене ізотопом похідне, що може бути необов'язково у формі гідрату, сольвату або поліморфу, необов'язково в фармацевтичному прийнятному носії або допоміжному засобі.

Сполука (1) може існувати у вигляді кристалічного поліморфа, і сполука за даним винаходом може знаходитися у будь-якій з монокристалічних форм або в суміші двох або більше кристалічних форм. Сполука (1) може бути у аморфній формі або може являти собою ангідрид або сольват, такий як гідрат.

Даний винахід включає мічені ізотопом похідні Сполуки (1) і їхні фармацевтично прийнятні солі. Мічена ізотопом сполука еквівалентна Сполуці (1) за винятком того, що один або кілька атомів замінені атомом(ами), що має (мають) атомну масу або масове число, що відрізняються від тих, які зазвичай зустрічаються в природі. Приклади ізотопу, які можуть бути включені в сполуку за даним винаходом, включають ізотопи водню, вуглецю, азоту, кисню, фосфору, фтору, йоду, брому і хлору, такі як 2Н, ЗН, "С, 196,10, 18Б, 8555, 128|, і 125І,

Мічена ізотопом сполука, така як сполука, у яку включений радіоактивний ізотоп, наприклад,

ЗН і/або ""С, є корисною для аналізу розподілу тканини для лікарського засобу і/або матриці.

Ізотопи ЗН ї Сб вважаються корисними, оскільки ці ізотопи можуть бути легко отримані і виявлені. Ізотопи "С і 9Е застосовуються в РЕТ (позитронно-емісійна томографія). Ізотоп 725І вважається корисним в 5РЕСТ (однофотонна емісійна комп'ютерна томографія) і може бути корисний для візуалізації мозку. Заміна на важчі ізотопи, такі як 2Н, в зв'язку з вищою метаболічною стабільністю, надає певні переваги при лікуванні, наприклад, збільшення періоду напіввиведення іп мімо або зменшення необхідної дози, і, таким чином, вважається корисною за даних обставин. Мічена ізотопом сполука може бути отримана аналогічним чином за допомогою легко доступного ізотопно-міченого реагента замість неіїзотопно-міченого реагента і шляхом здійснення процесів, наведених в схемах і/або прикладах, описаних нижче.

Сполука (1) може застосовуватися як хімічний зонд для захоплення цільового білка біологічно активної сполуки з низькою молекулярною масою. Зокрема, сполука за даним винаходом може бути перетворена на зонд для афінної хроматографії, фотоафінний зонд тощо шляхом введення групи мічення, лінкера тощо до функціональної групи, яка відрізняється від структурної функціональної групи, необхідної для експресії активності сполуки за допомогою способу, описаного у .). Мав5 бресігит. Боб. Урп. Мої. 51, Мо. 5, 2003, р. 492-498, М/02007/139149 тощо.

Приклади групи мічення, лінкера тощо, що використовуються в такому хімічному зонді, включають групи, що належать до таких груп (1) - (5). (1) Групи мічення білка, такі як групи фотоафінного мічення (такі як бензоїльна група, бензофенонова група, азидна група, карбонілазидна група, діазиридинова група, енонова група, діазогрупа і нітрогрупа) і групи хімічної спорідненості (такі як кетонна група, в якій альфа-вуглецевий атом заміщений атомом галогену, карбамоїльна група, складноефірна група, алкілтіогрупа, акцептор Міхаєля, а,р- ненасиченого кетону, складного ефіру тощо, і оксиранова група); (2) розщеплювані лінкери, такі

Зо як 5-5, 0-51-О, моносахарид (такий як глюкозна група або галактозна група) і дисахарид (такий як лактоза), і олігопептидні лінкери, які можуть бути розщеплені ферментативною реакцією; (3) групи мічення фішингу, такі як біотин і 3-(4,4-дифтор-5,7-диметил-4Н-За 4а-діаза-4-бора-с- індацен-З3-іл)пропіонільна група; (4) групи радіоактивного мічення, такі як 7251, з2Р, ЗН і 1иС; групи флуоресцентного мічення, такі як рлуоресцеїн, родамін, дансил, умбеліферон, 7-нітрофуразаніл і 3-(4,4-дифтор-5,7-диметил-4Н-За,4а-діаза-4-бора-с-індацен-3З-іл) пропіонільна група; хемілюмінесцентні групи, такі як люциферин і люмінол; і маркери, здатні виявляти іони важких металів, такі як іони лантаноїдних металів та іони радію; і (5) групи, пов'язані з твердофазним носієм, такі як скляні кульки, скляний шар, пластина мікротитратора, агарозні кульки, агарозний шар, полістиролові кульки, полістироловий шар, нейлонові кульки і нейлоновий шар.

Коли зонд отримують шляхом введення в сполуку за даним винаходом, групи мічення тощо, вибраних з вищеописаних груп (1) - (5), відповідно до способу, описаного в зазначених вище документах тощо, зонд може застосовуватися як хімічний зонд для ідентифікації мічених білків, корисних для пошуку нових мішеней лікарських засобів.

Приклади «солі», що використовується в даному документі, включають солі з неорганічними кислотами, солі з органічними кислотами і солі з кислими амінокислотами, і, зокрема, переважними є фармацевтично прийнятні солі. Крім того, сіль сполуки за даним винаходом включає ангідрид її фармацевтично прийнятної солі та сольват фармацевтично прийнятної солі, такої як гідрат. Переважні приклади солі з неорганічною кислотою включають солі з хлористоводневою кислотою, бромисто-водневою кислотою, сірчаною кислотою, азотною кислотою, фосфорною кислотою тощо, і переважні приклади солі з органічною кислотою включають солі з оцтовою кислотою, бурштиновою кислотою, фумаровою кислотою, малеїновою кислотою, винною кислотою, лимонною кислотою, молочною кислотою, стеариновою кислотою, бензойною кислотою, метансульфоновою кислотою, етансульфоновою кислотою, бензолсульфоновою кислотою, п-толуолсульфоновою кислотою тощо. Переважні приклади солі з кислою амінокислотою включають солі з аспарагіновою кислотою і глутаміновою кислотою тощо.

У разі, коли Сполуку (1) за даним винаходом отримують у вигляді солі Сполуки (1) або гідрату Сполуки (1), сіль і гідрат можуть бути перетворені на вільну основу Сполуки (1) у стандартний спосіб. бо Фармацевтичні композиції, набори та введення

Даний винахід стосується фармацевтичних композицій, що містить Сполуку (1) або її фармацевтично прийнятну сіль або мічене ізотопом похідне, і фармацевтично прийнятний допоміжний засіб. У деяких варіантах здійснення винаходу, сполука, що описується в даному документі, або її фармацевтично прийнятна сіль або мічене ізотопом похідне, міститься в ефективній кількості у фармацевтичній композиції (наприклад, терапевтично ефективній кількості).

Фармацевтичні композиції, що описуються в даному документі, можуть бути отримані у будь- який спосіб, відомий в сфері фармакології. Загалом, такі способи отримання включають приведення Сполуки (1) (тобто «активного інгредієнта») у контакт з носієм або допоміжною речовиною і/або одним або декількома іншими допоміжними інгредієнтами, а потім, якщо необхідно і/або бажано, надання форми і/або пакування продукту в бажану одноразову або багаторазову одиницю дозування.

Фармацевтична композиція за винаходом може бути отримана у відомий спосіб, такий як спосіб, що описується в загальних правилах щодо препаратів Японської фармакопеї, 16-е видання, Фармакопеї США та Європейської фармакопеї, 9-е видання. Фармацевтичну композицію за даним винаходом можна вводити пацієнтам відповідним чином залежно від лікарської форми.

Фармацевтичні композиції можуть бути отримані, упаковані і/або продані оптом, у вигляді одноразової дози і/або у вигляді множини одноразових доз. "Разова доза» являє собою дискретну кількість фармацевтичної композиції, що містить наперед визначену кількість активного інгредієнта. Кількість активного інгредієнта, як правило, дорівнює дозуванню активного інгредієнта, що вводиться суб'єкту і/або відповідній фракції такого дозування як половина або третина такого дозування.

Відносні кількості активного інгредієнта, фармацевтично прийнятної допоміжної речовини іМабо будь-яких додаткових інгредієнтів у фармацевтичній композиції, описаній в даному документі, будуть змінюватися залежно від ідентичності, розміру і/або стану суб'єкта, якого лікують, а також залежно від шляху, яким має вводитися композиція. Композиція може містити від 0,1 до 100 95 (мас./мас.) активного інгредієнта.

Фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, які застосовуються у виготовленні

Зо передбачених фармацевтичних композицій, включають інертні розріджувачі, диспергувальні іМабо гранулювальні засоби, поверхнево-активні речовини і/або емульгатори, засоби для покращення крихкості таблеток, в'яжучі речовини, консерванти, буферні засоби, мастильні речовини і/або масла. Допоміжні речовини, такі як масло какао і воски для супозиторіїв, барвники, покривні агенти, підсолоджувачі, смакові і ароматизуючі добавки також можуть бути присутніми в композиції.

Сполука, наведена в даному документі, зазвичай приготована у вигляді лікарської формі для простоти введення та однорідності дозування. Проте, слід розуміти, що рішення про загальний щоденний прийом композицій, які описуються в даному документі, приймається лікарем в рамках здорового медичного судження. Конкретний рівень терапевтично ефективної дози для будь-якого конкретного суб'єкта або організму буде залежати від різних факторів, включаючи захворювання, що піддається лікуванню, і тяжкість захворювання; активність конкретного активного інгредієнта, що застосовується; конкретний використовуваний склад; вік, маса тіла, загальний стан здоров'я, стать і харчовий раціон суб'єкта; час введення, спосіб введення та швидкість виведення конкретного активного інгредієнта, що застосовується; тривалість лікування; ліки, які застосовуються в комбінації або одночасно з конкретним активним інгредієнтом; і подібні фактори, добре відомі в галузі медицини.

Сполуку за даним винаходом (Сполука (1)) та її композиції, наведені в даному документі, можна вводити будь-яким шляхом, включаючи ентеральний (наприклад, пероральний), парентеральний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньоартеріальний, інтрамедулярний, інтратекальний, підшкірний інтравентрикулярний, трансдермальний, інтердермальний, ректальний, інтравагінальний, внутрішньочеревний, місцевий (наприклад, за допомогою порошків, мазей, кремів і/або крапель), мукозальний, назальний, трансбукальний, під'язиковий; шляхом інтратрахеального вливання, бронхіального вливання і/або інгаляції; і/або у вигляді перорального спрею, назального спрею і/або аерозолю. Зокрема, передбачуваними шляхами є пероральне введення, внутрішньовенне введення (наприклад, системна внутрішньовенна ін'єкція), введення у певну ділянку за допомогою кровопостачання і/або лімфопостачання і/або пряме введення в уражену ділянку. Загалом, найвідповідніший шлях введення буде залежати від різних факторів, включаючи властивості засобу (наприклад, його стабільність в середовищі шлунково-кишкового тракту) і/або стан суб'єкта (наприклад, здатність бо суб'єкта переносити пероральне введення).

Точна кількість сполуки (1), необхідна для досягнення ефективної кількості, є різною у кожного суб'єкта, наприклад, залежно від виду, віку і загального стану суб'єкта, ступеня вираженості побічних ефектів або захворювання, ідентичності конкретної сполуки, спосіб введення тощо . Ефективна кількість може бути включена в одноразову дозу (наприклад, одноразову пероральну дозу) або багаторазові дози (наприклад, багаторазові пероральні дози).

У деяких варіантах здійснення винаходу, при введенні суб'єкту багаторазових доз або їхньому нанесенні на тканину або клітину, будь-які дві дози з багаторазових доз включають різні або по суті однакові кількості сполуки, що описується в даному документі. У деяких варіантах здійснення винаходу, при введенні суб'єкту багаторазових доз або їхньому нанесенні на тканину або клітину, частота введення багаторазових доз суб'єкту або нанесення багаторазових доз на тканину або клітину може бути, в необмежувальних прикладах, три дози на день, дві дози на день, одна доза на день, одна доза через день, одна доза кожні три дні, одна доза щотижня, одна доза кожні два тижні, одна доза кожні три тижні або одна доза кожні чотири тижні, або навіть повільна контрольована доставка дози протягом вибраного періоду часу за допомогою пристрою для доставки ліків. У деяких варіантах здійснення винаходу, частота введення суб'єкту багаторазових доз або нанесення багаторазових доз на тканини або клітини становить одну дозу на день. У деяких варіантах здійснення винаходу, частота введення суб'єкту багаторазових доз або нанесення багаторазових доз на тканини або клітини становить дві дози на день. У деяких варіантах здійснення винаходу, частота введення суб'єкту багаторазових доз або нанесення багаторазових доз на тканини або клітини становить три дози на день. У деяких варіантах здійснення винаходу, частота введення суб'єкту багаторазових доз або нанесення багаторазових доз на тканини або клітини, тривалість між першою дозою і останньою дозою з багаторазових доз становить приблизно або, щонайменше, один день, два дні, чотири дні, один тиждень, два тижні, три тижні, один місяць, два місяці, три місяці, чотири місяці, шість місяців, дев'ять місяців, один рік, два роки, три роки, чотири роки, п'ять років, сім років, десять років, п'ятнадцять років, двадцять років або все життя суб'єкта, весь період існування тканини або клітини. У деяких варіантах здійснення винаходу, тривалість між першою дозою і останньою дозою з багаторазових доз становить приблизно або, щонайменше, три місяці, шість місяців або один рік. У деяких варіантах здійснення винаходу, тривалість між першою дозою і останньою дозою багаторазових доз є все життя суб'єкта, весь період існування тканини або клітини. У деяких варіантах здійснення винаходу, доза (наприклад, одноразова доза або будь-яка доза з багаторазових доз), що описується в даному документі, незалежно включає від 0,001 до 0,01 мг/кг, від 0,01 до 0,1 мг/кг або від 0,1 мг/кг і 1 мг/кг включно Сполуки (1). Прикладами є лікарські форми з щонайменше приблизно 0,01, 0,05, 01, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 10, 5, 20, 25 або 50 мг активної сполуки, або її солі, в лікарській формі.

Описані в даному документі діапазони доз передбачають рекомендації для введення передбачених фармацевтичних композицій дорослій людині. Кількість, яку вводять, наприклад, дитині або підлітку, може бути визначена практикуючим лікарем або фахівцем в даній галузі і може бути нижчою або такою самою, як і кількість, що вводиться дорослому.

Винахід також включає набори (наприклад, фармацевтичні упаковки). Передбачені набори можуть містити фармацевтичну композицію або Сполуку (1) і ємність (наприклад, флакон, ампулу, пляшечку, шприц і/або дозувальну упаковку або іншу відповідну ємність). У деяких варіантах здійснення винаходу, передбачені набори можуть додатково включати в себе другу ємність, що містить фармацевтичну допоміжну речовину для розбавлення або суспензії фармацевтичної композиції або Сполуки (1). У деяких варіантах здійснення винаходу, фармацевтичну композицію або Сполуку (1), передбачену в першій ємності і другій ємності, поєднують для утворення однієї стандартної лікарської форми. Набір, описаний в даному документі, може включати один або декілька додаткових фармацевтичних агентів, описаних в даному документі, у вигляді окремої композиції.

Способи лікування та застосування

Як показано в даному документі, Сполука (1) має значні ефекти ремоделювання судин пухлини і активність проти САБЕ, і, таким чином, вона потенційно може застосовуватися для лікування раку і/або пригнічення росту пухлини.

У даному документі пропонується спосіб лікування раку у суб'єкта, що включає введення суб'єкту ефективної кількості сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або міченого ізотопом похідного або його фармацевтичної композиції. Даний винахід також стосується

Сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або міченого ізотопом похідного або її фармацевтичної композиції для застосування при лікуванні раку у суб'єкта. Даний винахід також стосується застосування сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або міченого бо ізотопом похідного або її фармацевтичної композиції для виготовлення лікарського засобу для лікування раку.

У даному документі також передбачений спосіб інгібування росту пухлини у суб'єкта, що включає введення суб'єкту Сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або міченого ізотопом похідного або його фармацевтичної композиції. У даному документі також передбачена

Сполука (1) або її фармацевтично прийнятна сіль або мічене ізотопом похідне, або його фармацевтична композиція для застосування з метою пригнічення росту пухлини у суб'єкта.

Даний винахід також стосується застосування сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або міченого ізотопом похідного або її фармацевтичної композиції для виготовлення лікарського засобу з метою пригнічення росту пухлини.

У деяких варіантах способів та застосувань, передбачених в даному документі, рак являє собою рак голови і шиї, рак молочної залози, рак стравоходу, рак матки, рак яєчників, рак ободової та прямої кишки, рак ендометрія, рак шлунка, рак тонкої кишки, рак сечового міхура, або саркому.

У деяких варіантах способів і застосувань, передбачених в даному документі, рак являє собою рак голови і шиї (наприклад, плоскоклітинний рак голови та шиї, рак ротової порожнини, рак горла, рак слинних залоз, рак язика, аденокістозна карцинома). У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою плоскоклітинний рак голови та шиї (ЗССНМ). У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою аденокістозну карциному. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рак молочної залози (наприклад, НЕК2-позитивний рак молочної залози, тричі негативний рак молочної залози). У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою НЕК2-позитивний рак молочної залози. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою тричі негативний рак молочної залози. деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою колоректальний рак (наприклад, рак товстої кишки). У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рак товстої кишки. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рак стравоходу (наприклад, аденокарцинома стравоходу). У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою аденокарциному стравоходу. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рак матки (наприклад, саркому матки). У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою саркому матки. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рак яєчників. У деяких варіантах

Зо здійснення винаходу, рак являє собою саркому (наприклад, саркому матки, фібросаркому, ангіосаркому, синовіальну саркому, карциному м'яких тканин). У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою фібросаркому. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою ангіосаркому. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою синовіальну саркому. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рак м'яких тканин. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рак шлунка. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рак кишечника (наприклад, рак тонкої кишки, аденокарцинома тонкої кишки). У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рак тонкої кишки. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою аденокарциному тонкої кишки. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рак сечового міхура (наприклад, рак уротелія).

У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рак уротелія. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рак ендометрія. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак являє собою рідкісний вид раку.

Комбінована терапія

Крім введення як монотерапії Сполуку (1) можна вводити в поєднанні з іншими терапевтичними засобами або способами лікування. У деяких варіантах здійснення винаходу, додатковий терапевтичний засіб являє собою антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу, додатковий терапевтичний засіб являє собою моноклональне антитіло. Сполуку за даним винаходом можна вводити в комбінації з іншим терапевтичним засобом, зокрема як терапія проти ЕСЕК, терапія проти НЕК2, терапія проти РО-1, терапія проти РО-І/1 або терапія опроміненням.

У деяких варіантах здійснення винаходу, Сполука (1) або її фармацевтично прийнятна сіль або її мічене ізотопом похідне або його фармацевтична композиція вводиться в поєднанні з терапією проти ЕСЕК (наприклад, моноклональним антитілом проти ЕСЕК (тАбБ) таким як цетуксимаб). У деяких варіантах здійснення винаходу, терапія проти ЕСЕК являє собою антитіло проти ЕСЕ. Наприклад, в даному документі наведений спосіб лікування плоскоклітинного раку голови і шиї (ЗССНМ) у суб'єкта, що включає введення зазначеному суб'єкту Сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або міченого ізотопом похідного або його фармацевтичної композиції в поєднанні з терапією із застосуванням тАБр проти ЕСЕК (рецептором епідермального фактора росту). У деяких варіантах здійснення винаходу тА 60 проти ЕСЕК являє собою цетуксимаб (СТХ).

У деяких варіантах здійснення винаходу, Сполуку (1) або її фармацевтично прийнятну сіль або її мічене ізотопом похідне або його фармацевтичну композицію вводять в поєднанні з терапією проти НЕК2 (наприклад, моноклональним антитілом проти НЕК2 (тАБ) таким як трастузумаб). У деяких варіантах здійснення винаходу, терапія проти НЕК2 являє собою антитіло проти НЕК2. Наприклад, в даному документі наведений спосіб лікування раку молочної залози у суб'єкта, який цього потребує, що включає введення зазначеному суб'єкту Сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або міченого ізотопом похідного або його композиції в поєднанні з терапією із застосуванням тАб проти НЕК2 (рецептор епідермального фактора росту людини). У деяких варіантах здійснення винаходу, тАб проти НЕК2 являє собою трастузумаб.

У деяких варіантах здійснення винаходу, Сполуку (1) або її фармацевтично прийнятну сіль або її мічене ізотопом похідне або її фармацевтичну композицію вводять в поєднанні з терапією проти РО-1 або проти РО-1І1 (наприклад, моноклонального антитіла проти РО-1 або проти РО- 1). У деяких варіантах здійснення винаходу, терапія проти РО-1 або проти РО-І1 являє собою антитіло. Наприклад, в даному документі наведений спосіб лікування раку ободової та прямої кишки у суб'єкта, який цього потребує, що включає введення зазначеному суб'єкту Сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі або міченого ізотопом похідного або її композиції в поєднанні з терапією проти РО-1 або проти РО-11 (наприклад, терапія із застосуванням тАБ).

У деяких випадках здійснення винаходу, Сполука (1) або її фармацевтично прийнятна сіль або її мічене ізотопом похідне або його фармацевтична композиція застосовується у поєднанні з променевою терапією (КТ). У деяких варіантах здійснення винаходу, Сполуку вводять у поєднанні з хірургічним втручанням.

Приклади

Синтез сполуки (1)

Загальні процедури та способи

Сполука відповідно до даного винаходу може бути отримана способами, описаними в прикладах нижче. Проте, ці приклади наведені лише для ілюстративних цілей, та сполука за даним винаходом жодним чином не обмежується конкретними прикладами, зазначеними нижче.

У прикладах, якщо конкретно не зазначено інше, силікагель для очищення шляхом

Зо колонкової хроматографії на силікагелі являв собою колонку Ні-РІазп м (силікагель, 30 мкм 60 А або 40 мкм 60 А, Матаеп Согрогайоп), силікагель для очищення шляхом колонкової хроматографії на МН-силікагелі являв собою силікагель Спготаїйогех МН (Еції 5йубіа Спетісаї!

ГО). Аналітичну тонкошарову хроматографію (ТШХ) проводили за допомогою силікагелю для

ТШХ 60 Ег5і, товщиною шару 0,25 мм (МегсК КобаА) або силікагелю для ТШХ МН СПпготаїцогех

Егвл, товщиною шару 0,25 мм (Еції 5йузіа Спетіса! СТО). Пластини для ТШХ візуалізували шляхом забарвлення барвником на основі п-анізальдегіду, барвником на основі фосфомолібденової кислоти або барвником Ханессіана.

Всі реакції, чутливі до вологи, проводилися в інертній атмосфері. Реагенти та розчинники були комерційної категорії і застосовувалися в тому вигляді, в якому вони поставлялися, якщо не зазначено інше.

Спектри ЯМР записували на спектрометрі У"ЕОЇ ЕС25ООК (500 МГц), У/"БЄОЇ ЕС24005 (400

МГЦ), Магіап Іпома 500 (500 МГц), Магіап Мегсигу 400 (400 МГц) або ВгиКег Амапсе (600 МГц).

Хімічні зсуви наведені в частинах на мільйон (ч./млн.). У випадку спектрів ЯМР "Н (СОСіз, 606 або СОзОб) як внутрішній стандарт застосовувався пік залишкового розчинника (7,27 ч./млн. в

СОС»; 7,16 ч./млн. в СвОв; 3,31 ч./млн. в СОзОЮ).

Аналітичні мас-спектри (М5) були отримані за допомогою надефективної рідинної хроматографії Умаїег5 Асдийу, що передбачає оснащення одним квадрапольним детектором (50 Оеїесіог 2) або І ТО Огбіїгар ХІ " (Тнептозсіепійіс).

Високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ) проводили за допомогою Зпітайдли ІсС- 10А0 на УФ-спектрофотометричному детекторі (200 нм, Зпітадли 5РО-10А).

Скорочення, що вживаються в даному документі, є такими: АІВМ: 2,2- азобіс(ізобутиронітрил);. 9-ВВМ:9-борабіциклоЇ3.3.1|Інонан; Виз5пН: три-нормальний-бутилтин гідрид; (ї)-С5А: (15)-(--)-10-камфорсульфонова кислота; ОМАР: 4-диметиламінопіридин; ОСМ: дихлорметан; ОО: 2,3-дихлор-5,6-диціано-1,4-бензохінон; ОІВАЇ: діїзобутілалюмінійгідрид;

ОМЕ: М,М-диметилформамід; ЮОМ5О: диметилсульфоксид; ЕїзМ: триетиламін; ЕюЮАс: етилацетат; НЕ-піридин: піридин фтористого водню; НРІС: високоефективна рідинна хроматографія; ІРА: ізопропіловий спирт; МесСМ: ацетонітрил; МеонН: метанол; МРМ: пара- метоксибензил; РРАз: трифенілфосфін; 1-ВиОнН: монотретбутиловий спирт; ІВиї ї: монотретбутил літій; ТВМЕ: метилтретбутиловий ефір; ТВАЕ: фторид тетрабутиламонію; ТВ5: трет- бо бутилдиметилсиліл; ТНЕ: тертрагідрофуран; ТМ: триметилсиліл; Т5: пара-толуолсульфоніл.

Синтетичні проміжні продукти, наведені в даному документі, вважаються частиною даного винаходу.

Схема А; Отримання сполук А-7 . Бромід метилтрифеніліфосфонію лоно х й й і 5 п а олАто ВАВ вк се не

ГО ше що ТолуслТ з ТНЕ Ор ва нн -т8део Щ тре д-ї А тавоті А он. НЕ-Ру нон, одини нин Піридин! пе нн вн

Лутидинни? -ї щі | рид Й но ї Її рем ан: НН НН я

ЖК НЕ ге Ге дв да тво нн Ї пря ОН і ин аа я 9-ВВМ «Не І Е

Лутидинї . Тв50 | ! НЕ тва ная в ем талии - ОТ и Ж чтвеа по А се Має во ЕЕ ОТВЕ

НОЯ попи; Но», Маон ТО де д- Ав

Перйодинан: «Десса Мартіна! д д тво ОТв5

Ї нин ані мансоз тво, Дону ром НИ я хНн

А-ї

Приклад 1 (4аВ,б5а5,6А,вавз,Зан)-2,2-ди-трет-бутил-б-метилоктагідрофурої|2",375,6|піраної3,2- 9111,3,2|діоксасилін-7-ол

Н Н о о СІВА. о АТ о су до--ж бу ще а й Толуолії (о)

Н Не -78 дед Н Н г дя

В атмосфері азоту до розчину сполуки А-1: протягом 30 хвилин додавали (даВ,б5а5,6А,вавз,Зан)-2,2-ди-трет-бутил-б-метилгексагідрофурої|2",375,6|піраноїЇ3,2- 911,3,2|діоксасилін-7(ванН)-он (А-1 18,5 г, 54,0 ммоль), отриманий способом, описаним в Огдапіс

Ї енегв (2009), 11 (2), 409-412 (САЗ Мо; 1095280-04-8) в толуолі (275 мл) при -78 "С, РІВАГ. (70,2 мл, 70,2 ммоль, 1,0 М розчину толуолу). Потім реакційну суміш перемішували при -78 "С. Через 90 хв реакційну суміш обережно гасили МеонН (4,37 мл) при -78 "С, потім видаляли охолоджувальну баню. До реакційної суміші додавали насичений розчин тетрагідрат тартрату калію-натрію (300 мл), продовжуючи перемішування протягом 2 годин при кімнатній температурі. Реакційну суміш виливали в ділильну лійку, потім розділяли шари. Водний шар екстрагували за допомогою ЕОАс (300 мл). Поєднані органічні екстракти промивали сольовим розчином (300 мл), сушили над Маг250»., фільтрували, концентрували при зниженому тиску.

Неочищений лактол застосовували для наступної реакції без очищення.

Приклад 2 (4аВ8,65,75,вайн)-6-(5)-бут-3-ен-2-ил)-2,2-ди-трет-бутилгексагідропіраної|3,2- 4111,3,2|діоксасилін-7-ол (Сполука А-2)

Бромід: іш І метилтрифенілфосфоніют (3.41 айв вок х о он -В и --О, о чи пери нд и ше ШИ ! о -ОН - тій 7 От» ші ТЕ 1 ОО шо нн нн:

Ай

В атмосфері азоту до суспензії броміду метилтрифосфонію (73,30 г, 205,2 ммоль) в ТНЕ (200 мл) додавали трет-бутоксид калію (17,27 г, 153,9 ммоль) при -5 "С протягом 10 хвилин, а потім перемішували протягом 60 хв при -5 "С. Розчин неочищеного лактолу, описаного в прикладі 1, в

ТНЕ (40 мл) переносили в реакційну суміш при -5 "С протягом 10 хвилин, потім перемішували при -5 "С протягом 1 години та при кімнатній температурі протягом 1 години. Реакційну суміш гасили водою з льодом (400 мл), потім розбавляли ТВМЕ (400 мл), а потім розділяли шари.

Водний шар екстрагували ТВМЕ (400 мл). Поєднані органічні екстракти промивали сольовим розчином (400 мл), висушували над Маг50О», фільтрували і концентрували при зниженому тиску.

Залишок суспендували за допомогою гептану/ЕЮОАс - 1/1 (100 мл). Отриману суспензію фільтрували, промивали гептаном/Е(Ас - 1/1 (100 мл), для видалення матеріалу, отриманого з трифенілфосфіну. Потім фільтрат концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі (400 г, силікагель 60, сферичний, 40-50 мкм, Капіо Спептісаї!), за допомогою 0-20 95 ЕІОАс/гептан, надала вказану в заголовку сполуку (Сполука А-2, 16,7 г, вихід 90 об).

І"Н ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-О) 5 ч./млн. 1,03 (д, У-6,8 Гц, ЗН) 1,05 (с, 9 Н) 1,07 (с, 9 Н) 1,75 (дт, У-14.5, 3,0 Гц, 1Н) 2,37 (дт, 9У-14,5, 2,9 Гц, 1Н) 2,65 - 2,76 (м, 1Н) 3,03 (дд, У-9,8, 1,0 Гу, 1Н) 3,31 (м, 1Н) 3,69 (д, 9У-15,0 Гц, 1Н) 3,75 - 3,79 (м, 1Н) 4,16 - 4,31 (м, 2Н) 4,41 (т, 9-2,9 Гц, 1Н) 4,95 - 5,09 (м, 2Н) 6,02 (ддд, 9У-17.3, 10,5, 6,3 Гц, 1Н).

Приклад З (4аб8,65,75,вайн)-6-(5)-бут-3-ен-2-іл)-2,2-ди-трет-бутил-7-(трет-

Зо бутилдиметилсиліл)окси)гексагідропіраної|3,2-41(1,3,2)діоксасилін (Сполука А-3) ою ДА 0000 тво о де а Лутидині іо вве я ві уж итон рсм раси отв

Еш чи

А-2 А-з

В атмосфері азоту до розчину сполуки А-2: (4аН,65,75,8аН)-6-(5)-бутил-3-ен-2-іл)-2,2-ди- трет-бутилгексагідропіраної/3,2-4111,3,2|діоксасилін-7-ол (9,85 г, 28,8 ммоль), описаний в прикладі 2, в ОСМ (150 мл) при 0 "С і додавали 2,6б-лутидин (6,68 мл, 57,5 ммоль) і трет- бутилдиметилсилілтрифторметансульфонат (9,25 мл, 40,3 ммоль). Реакційну суміш перемішували при 0 "С протягом 30 хвилин, потім при кімнатній температурі протягом 2 годин.

Реакційну суміш розбавляли діетиловим ефіром. Органічний шар промивали 0,5 М водного розчину НОСІЇ, насиченим водним розчином МанНсСоО»з, а потім сольовим розчином. Поєднані органічні шари висушували над Модо5О5, фільтрували (невелика кількість 5іОг) і концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням від 0 95 до 15 до ЕТоАс/гептан надала вказану в заголовку сполуку (Сполука А-3, 12,0 г, вихід 91 905).

ІН ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-О) б ч./млн. 0,10 (с, ЗН) 0,19 (с, ЗН) 0,91 (с, 9 Н) 0,96 (д, 3-6,3 Гц, ЗН) 1,02 (с, 9 Н) 1,06 (с, 9 Н) 1,73 (дт, 9У-15,0, 4,0 Гц, 1Н) 2,26 (дт, У-15,0, 2,5 Гц, 1Н)

2,66 - 2,74 (м, 1Н) 2,95 (дд, 929,5, 2,2 Гц, 1Н) 3,17 (м, 1Н) 3,81 - 3,84 (м, 1Н) 4,12 - 4,22 (м, 2Н) 4,24 (т, 922,7 Гу, 1Н) 4,93 - 5,06 (м, 2Н) 6,08 (ддд, 9У-17,3, 10,5, 6,3 Гц, 1Н).

Приклад 4 (28,38,55,65)-6-((5)-бут-3-ен-2-іл)-5-(трет-бутилдиметилсиліл)окси)-2- (гідроксиметил)тетрагідро-2Н-піран-3-ол (Сполука А-4) ви ДК НЕоРу нові. о ши мескосм нот ЕТОТВВ їх дн

А-ї д-4

В атмосфері азоту до розчину сполуки А-3: (4аН,65,75,8аН)-6-(5)-бутил-3-ен-2-іл)-2,2-ди- трет-бутил-7-(трет-бутилдиметилсиліл)окси)гексагідропіраної|3,2-41(11,3,2|діоксасилін (12 г, 26,3 ммоль), описаний в прикладі 3, в МесМ (120 мл) і ОСМ (40 мл) при -10 "С додавали попередньо змішаний розчин НЕ-піридину (4,0 мл) і піридину (20 мл) в 20 мл МесмМ. Реакційну суміш перемішували при -10 "С протягом 15 хвилин, потім при кімнатній температурі протягом 1 години. Реакційну суміш гасили насиченим водним розчином МансСоОз при 0 "С і розбавляли

ОСМ, потім шари розділяли. Водний шар екстрагували ЮОСМ. Поєднані органічні екстракти промивали сольовим розчином. Поєднаний органічний шар висушували над Моазох, фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням 15-60 956 Е(Ас/гептан надала вказану в заголовку сполуку (сполука А-4, 8,4 г, кількісний вихід).

ІН ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-О) б ч./млн. 0,13 (с, ЗН) 0,19 (с, ЗН) 0,94 (с, 9 Н) 0,96 (д,

У-6,8 Гу, ЗН) 1,72 (дт, 9У-14,6, 2,9 Гц, 1Н) 2,15 (дд, У-9,8, 2,4 Гц, 1Н) 2,23 (дт, 9У-14,6, 2,9 Гц, 1Н) 2,55 - 2,65 (м, 1Н) 3,03 (д, У-9,8 Гц, 1Н) 3,41 - 3,46 (м, 1Н) 3,49 (д, 9У-11,7 гЦ, 1Н) 3,62 - 3,72 (м, 2Н) 3,92 (ддд, 9-11,7, 8,3, 2,4 гЦ, 1Н) 4,02 (т, 9У-2,7 гЦ, 1Н) 5,01 - 5,12 (м, 2Н) 5,93 (ддд, 9У-17,4, 10,4, 7,3 гЦ, 1Н).

Приклад 5 ((25,35,58,6Н8)-2-(5)-бут-3-ен-2-іл)-6-«((трет-бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н- піран-3,5-діїл)біс(окси))біс(трет-бутилдиметилсилан) (Сполука А-5)

Нн Нн ТВБОт Нн Нн

ЕЕ ТОТв5 ром Е-- ЕТО на Я В тв5О Н Я

А-й А-Б5

Зо

В атмосфері азоту до розчину Сполуки А-4: (28,38,55,65)-6-((5)-бутил-3-ен-2-іл)-5-(трет- бутилдиметилсиліл)окси)-2-(гідроксиметил)тетрагідро-2Н-піран-3-ол (997 мг 3,15 ммоль), описаний в Прикладі 4, в ОСМ (10 мл) при 5 "С додавали 2,6-лутидин (1,83 мл, 15,8 ммоль) і трет-бутилдиметилсилілтрифторметансульфонат (2,17 мл, 9,45 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 5 годин. Реакційну суміш розбавляли діетиловим ефіром і гасили насиченим водним розчином МанНсСоОз, потім шари розділяли.

Поєднані органічні екстракти промивали 0,5 М водного розчину НСІЇ, насиченим водним розчином МанНсСоОз, а потім сольовим розчином. Органічний шар висушували над М4о95ох, фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням 0-5 96 Е(ОАс/гептан (що містить 1 906 ЕЇїзМ) надала вказану в заголовку сполуку (Сполука А-5, 1,69 г, вихід 98 905).

І"Н ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-О) 5 ч./млн. 0,02 - 0,08 (м, 15 Н) 0,11 (с, ЗН) 0,89 (с, 9 Н) 0,90 - 0,92 (м, 18 Н) 0,94 (д, У-6,8 Гц, ЗН) 1,82 (дт, У-14,9, 4,68 Гц, 1Н) 2,00 (дт, У-14,9, 2,9 Гц, 1Н) 2,62 - 2,72 (м, 1Н) 2,93 (дд, 9У-9,3, 2,0 Гц, 1Н) 3,27 - 3,34 (м, 1Н) 3,66 - 3,79 (м, ЗН) 3,83 - 3,87 (м, 1Н) 4,91 - 5,07 (м, 2Н) 6,11 (ддд, уУ-17,3,10,7,61 Гц, 1Н).

Приклад 6 (5)-3-(25,35,58,6Н8)-3,5-біс((трет-бутилдиметилсиліл)окси)-6-((трет-

бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)бутан-1-ол (Сполука А-6) он ні ї нн, В Е

ТНЕ

В -7ОоТв5 а - тот Потім НО», Маон 0 ТВ5075775 9785

А-5 А-

До розчину сполуки А-5: (25, 35, 58, 68) -2-(5)-бутил-3-ен-2-іл)-6-((трет- бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-3,5-діїл)біс(окси))біс(трет- бутилдиметилсилан) (1,32 г, 2,42 ммоль), описаної в прикладі 5, в ТНЕ (10 мл) при 0 "С додавали 9-ВВМ (9,69 мл, 0,5 М розчин в ТНЕ, 4,84 ммоль). Реакційну суміш перемішували при 0 "С протягом 1 години та при кімнатній температурі протягом 1,5 годин. 3,0 М водного розчину

Маон (3 мл, 9,00 ммоль) і перекис водню (35 95 у воді, З мл) додавали до реакційної суміші при 0 "С. Реакційну суміш перемішували при 0 "С протягом 30 хвилин, потім при кімнатній температурі протягом 1 години. Реакційну суміш гасили насиченим Маг25Оз, а потім шари розділяли. Водний шар екстрагували ЕІЮАс (З рази). Поєднані органічні екстракти промивали сольовим розчином, висушували над Маг5О4, фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням 0-20 956 ЕІОАс/гептан надала вказану в заголовку сполуку (Сполука А-6, 1,36 г, вихід 100 90).

ІН ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-О) 5 ч./млн. 0,03 (с, ЗН) 0,05 - 0,08 (м, 12Н) 0,10 (с, ЗН) 0,88 (д, У-6,8 Гц, ЗН) 0,89 - 0,93 (м, 27 Н) 1,55 - 1,65 (м, 1Н) 1,82 (дт, 9У-15,4, 4,4 Гц, 1Н) 1,87 - 1,96 (м, 1Н) 1,97 - 2,03 (м, 1Н) 2,17- 2,26 (м, 1Н) 2,67 (дд, У-7,8, 3,9 Гц, 1Н) 2,98 - 3,10 (м, 1Н) 3,34 - 3,40 (м, 1Н) 3,59 - 3,86 (м, 6 Н)

Е5БІ-М5 (Мас-спектрометрія з іонізацією електророзпиленням) (маса/заряд): 563,64 МАНІ", 585,62 |Ма-Ма|"

Приклад 7 (5)-3-(25,35,58,6Н8)-3,5-біс((трет-бутилдиметилсиліл)окси)-6-((трет- бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)бутаналь (Сполука А-7) й СН Перйодинан Десса-Мартіна З; коуч и й Й тв5о. 1 ротве конк алкАдЗ В иреиудтн твБО ОтВ5 ром ї о ї | ц дб А.Т

В атмосфері азоту до розчину сполуки А-6: (5)-3-(25,35,5Н8,6Н)-3,5-біс(трет-

Зо бутилдиметилсиліл)окси)-6-((трет-бутилдиметилсиліл)окси)метил) тетрагідро-2Н-піран-2- іл)бутан-1-ол (1100 мг, 1,954 ммоль), що описується в Прикладі 6, в ОСМ (30 мл) при 5 "С додавали Мансоз (41,0 мг, 0,49 ммоль) і перйодинан Десса-Мартіна (1077 мг, 2,54 ммоль).

Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі. Через З години реакційну суміш розбавляли ОСМ і гасили насиченим водним розчином Мансоз і насиченим водним розчином

Ма?5Оз, потім розділяли шари. Водний шар екстрагували ОСМ. Поєднані органічні екстракти промивали сольовим розчином, висушували над М950О»., фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням 0-25 95

КОАс/гептан надавала вказану в заголовку сполуку (Сполука А-7, 950 мг, вихід 87 90).

ІН ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-а) 5 ч./млн. 0,00 (с, ЗН) 0,03 - 0,08 (м, 12Н) 0,11 (с, ЗН) 0,88 (с, 9 Н) 0,91 - 0,92 (м, 21Н) 1,82 (дт, 9У-15,0, 4,5 Гц, 1Н) 2,01 (дт, 9У-15,0, 2,5 Гц, 1Н) 2,28 (ддд, у-16,0, 7,3, 2,4 Гц, 1Н) 2,53 -2,58 (м, 1Н) 2,74 (ддд, 9У-16,0, 5,5, 2,0 Гц, 1Н) 2,94 (дд, У-9,0,1,7 Гц, 1Н) 3,29 (19, У-5,9, 2,0 Гц, 1Н) 3,68 (д, У-5,9 Гц, 2Н) 3,75 - 3,82 (м, 1Н) 3,82 - 3,90 (м, 1Н) 9,73 (т, 9-24 Гц, 1Н).

Схема В; Отримання сполуки В-3

- ТМ5 - ТМ5 ни Т8сі ни Н ТМ но й пе) о :

І ще І ча а

ОМРМ О З82ЗАЗ82ЩБрц о " ОМРМ7УЮ8ЇЮМ ЗИМ рсм ОМЕ ОМРМ в. в-2 8баєед в-з

Приклад 8 (25,35)-3-((4-метоксибензил)окси)-2-метил-5-(триметилсиліл)пент-4-ин-1-іл-4- метилбензолсульфонат (Сполука В-2)

Е ру я Е ру я - - 56в»

ОМРМ ром ОМРМ в в-2

В атмосфері азоту до розчину сполуки В-1: (25,35)-3-(4-метоксибензил)окси)-2-метил-5- (триметилсиліл)пент-4-ин-1-ол (11,08 г, 36,15 ммоль), отриманої у спосіб, що описується у УМО 9317690 А1/05 5436238 А (СА Мо 157323-41-6) у ОСМ (330 мл), ЕМ (12,6 мл, 90,4 ммоль) та п- толуолсульфонілхлорид (8,27 г; 43,4 ммоль) додавали при кімнатній температурі. Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ночі. Суміш промивали насиченим

Мансо:з і сольовим розчином, висушували над Ма5О»5, фільтрували, потім концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі (силікагель 60, сферичний, 40-50 мкм, Капіо Спетісаї), за допомогою 0-10 95 ЕІОАс/гептан, надавала вказану в заголовку сполуку (сполука В-2, 17,7 г, вихід 93 905). "Н ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-О) 5 ч./млн. 0,17 (с, 9 Н) 1,02 (д, 9-6,8 Гц, ЗН) 2,10 - 2,18 (м, 1Н) 2,44 (с, ЗН) 3,82 (с, ЗН) 3,99 (д, У-6,8 Гц, 1Н) 4,04 - 4,07(м, 2Н) 4,33 (д, 9-11,2 Гц, 1Н) 4,66 (д, 20. уЕ11,2 Гц, 1Н) 6,87 (д, 9-83 Гц, 2Н) 7,21 (д, 9У-8,3 Гц, 2Н) 7,33 (д, 9-8,68 Гц, 2Н) 7,77 (д, У-8,8 Гц, 2Н).

Приклад 9 ((35,48)-5-йодо-3-((4-метоксибензил)окси)-4-метилпент-1-ин-1-ілутриметилсилан (Сполука

В-3) : а Ма! : шк З то тет т ран : КК. р нн Сай і зх ОМ Й :

ОМеМ ОМмеМ в-» в

В атмосфері азоту до розчину сполуки В-2: (25,35)-3-(4-метоксибензил)окси)-2-метил-5- (триметилсиліл)пент-4-ин-1-іл 4-метилбензонсульфонат (17,7 г, 38,4 ммоль), що описується в

Зо Прикладі 8 у ОМЕ (360 мл), Ма! (7,49 г 50,0 ммоль) додавали при кімнатній температурі.

Реакційну суміш перемішували при 80 "С протягом 2 годин. Ще 2,0 г МаїЇ додавали до реакційної суміші. Реакційну суміш перемішували протягом 1,5 годин при 80 "С, потім охолоджували до кімнатної температури. Суміш розбавляли діетиловим ефіром, промивали водою і сольовим розчином, висушували над Ма5О5, фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Флеш- хроматографія залишку на силікагелі (силікагель 60, сферичний, 40-50 мкм, Капіо СпептісаїЇ),, із використанням 10-20 95 ЕІОАс/гептан, надавала вказану в заголовку сполуку (сполука В-3, 14,3 г, вихід 89 90). "Н ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-О) 5 ч./млн. 0,21 (с, 9 Н) 1,10 (д, 9У-6,8 Гц, ЗН) 1,74 - 1,84 (м, 1Н) 3,30 - 3,37 (м, 2Н) 3,82 (с, ЗН) 3,96 (д, 927,3 Гц, 1Н) 4,44 (д, 9-11,2 Гц, 1Н) 4,73 (д, 9-11,2 Гц, 1Н) 6,89 (д, 9У-8,8 Гц, 2Н) 7,30 (д, У-8,8 Гц, 2Н).

Схема С; Отримання сполуки С-8 нн : тво отв5 оон МУ но отв5 «ОоМмиМ кі : 5 ретвутиллтя ТВБО Е тво о --- не

Н а м ЩН ОМРМ ЕФІТ тво тМ5 тн -78ова нн

АЛ в-з с-1 о МмеМ сасАВМ То ОМРМ косоз тв5О -В5 Визапн твео. Я етв8 - - -ю де о --. с

Он Н месон тв50 Толуслт ТВ5О нон Водео нотні шк с-2 сз Й

Перйодинан ДессаїМартіна : Мем

Но Ооте5 е із тво Е ЗА рсм ром тво | ТНЕ-ІРА-ВШОН

Ноні с-4 о аОМРМ о оОМРМ твео. 0818 тес твео. 785 де - «5 (жхью й тп но а | Ру, ОМАР т5о0 а нон ром нні с с

Хо ОМРМ но отв5 щі галі

М ама тв«га е й щ Ре ця «Діаліл дикарбонат

Ї ння сао -33535333333ЙДЦОС---- рмео Ма | Бода ТНЕТ ЕБМ в5дед, 24 НН зодед, теп ТНЕ с-7 о «ОоМеМ твзо Я етве

Н то о. М дних

Лото с Е с-8

Приклад 10 (25,65,75)-2-(25,35,58,68)-3,5-біс(трет-бутилдиметилсиліл)окси)-6-((трет- бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-7-((4-метоксибензил)окси)-6б-метил-9- (триметилсиліл)нон-8-ін-4-ол (Сполука С-1) нн М еОМРМ

Н сотв5 " тво отв5 :000М оивдитнй ТО Е

І третоутилятій -е тво гої» о и о тво о он ув

Е 13) -

І Н ОМеМ тво ЯН

А-ї вз о

В атмосфері аргону до розчину сполуки В-3: ((35, 48)-5-йодо-3- ((4-метоксібензил)окси)-4- метилпент-1-ин-1-іл)утриметилсилан (1408 мг, 3,382 ммоль), що описується в Прикладі 9, в діетиловому ефірі (25 мл) при -78 " С додавали трет-бутиллітій (1,61 М в пентані, 4,11 мл, 6,62 ммоль). Реакційну суміш перемішували при -78 "С протягом 45 хв. Сполуку А-7: (5)-3- (25,35,58,68)-3,5-біс(трет-бутилдиметилсиліл)окси)-6-((трет- бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)убутаналь (825 мг, 1,47 ммоль), що описується в прикладі 7, в 5,0 мл діетилового ефіру додавали до реакційної суміші при -78 "70.

Реакційну суміш перемішували при -78 "С протягом 60 хв. Реакційну суміш гасили насиченим водним розчином МНаАСІ. Органічний шар промивали сольовим розчином, висушували над

Маг?5О», потім концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням 0-25 965 ЕОАс/гептан надала вказану в заголовку сполуку (Сполука С-1, 1167 мг, вихід 93 905).

І"Н ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-О) б ч./млн. 0,00 - 0,12 (м, 21Н) 0,15 - 0,24 (м, 6 Н) 0,82 - 0,96 (м, 30 Н) 1,03 (д, 9У-6,3 Гц, ЗН) 1,38 - 1,55 (м, 1Н) 1,68 - 1,99 (м, 4 Н) 2,10 - 2,30 (м, 2Н) 2,76 - 2,87 (м, 1Н) 3,15 (д, У-9,75 Гц, 1Н) 3,33 - 3,38 (м, 1Н) 3,56 - 4,02 (м, 9 Н) 4,37 - 4,50 (м, 1Н) 4,64 - 4,78 (м, 1Н) 6,83 - 6,88 (м, 2Н) 7,23 - 7,35 (м, 2Н).

Приклад 11 (25,65,75,Е)-2-(25,35,58,68)-3,5-біс(трет-бутилдиметилсиліл)окси)-6-((трет- бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-7-((4-метоксибензил)окси)-6б-метил-9- (трибутилстаніл)нон-8-ен-4-ол (Сполука С-3) - ММ --. «ОМРМ сагА!ВМ твзо. ОТВ5 косо тво 09785 Визепн нд но --- тв5О ї тМм5 мМеон твзо ї тотжол нні ННІ вуаео с с- -. Мем те тво ці (8) но зЗАВиз 0-3

До розчину сполуки б-1: (25, 65, 75)-2-(25,35,58,6Н8)-3,5-біс(трет- бутилдиметилсиліл)окси)-6-((трет-бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-7- ((4-метоксибензил)окси)-6-метил-9-(триметилсиліл)-нон-8-ін-4-ол (1165 мг 1,37 ммоль), описаний в Прикладі 10, в Меон (20 мл) при 20 "С додавали К2СОз (189 мг, 1,37 ммоль).

Реакційну суміш перемішували при 20 " С протягом 2 годин. Реакційну суміш розбавляли ЕАСс і

Зо гасили насиченим водним розчином МНАСІ, потім шари розділяли. Водний шар екстрагували

ЕЮОАс. Поєднані органічні екстракти промивали сольовим розчином, висушували над Ма5О», фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням від 0 95 до 15 95 ЕІОАс/гептан надала сполуку С-2: (25,65,75)-2-(25,35,5Н8,68)-

З3,5-біс(трет-бутилдиметилсиліл)окси)-6-((трет-бутилдиметилсиліл)окси)метил)утетрагідро-2Н- піран-2-іл)-7-((4-метоксибензил)окси)-6-метилнон-8-уин-4-ол (1050 мг, вихід 98 95). ЕБІ-М5 (Мас- спектрометрія з іонізацією електророзпиленням) (маса/заряд): 801,50 (Ма-Ма|"

В атмосфері азоту до розчину сполуки С-2: (25, 65, 75)-2-(25,35,5Н8,6Н)-3,5-біс(трет- бутилдиметилсіліл)окси)-6-((трет-бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-7- ((4-метоксибензил)окси)-6-метілнон-8-ін-4-ол (780 мг, 1,00 ммоль), отриманої вище в толуолі (15 мл) при 20 "С, додавали гідрид три-н-бутилтину (2,5 мл, 9,36 ммоль) і 2,2'-азобіс (ізобутиронітрил) (82 мг, 0,50 ммоль). Реакційну суміш перемішували при 90 "С протягом 15 хв.

Реакційну суміш концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням від 0 95 до 15 956 ЕІАс/гептан надала вказану в заголовку сполуку (сполука С-3, 970 мг, вихід 91 95).

ІН ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-О) 5 ч./млн. 0,02 - 0,13 (м, 18 Н) 0,84 - 0,96 (м, 48 Н) 1,22 - 1,37 (м, 6 Н) 1,47 - 1,56 (м, 7 Н) 1,72 - 1,90 (м, ЗН) 1,95-2,03 (м, 1Н) 2,11 - 2,28 (м, 2Н) 2,82 - 2,86

(м, 1Н) 3,08 - 3,15 (м, 1Н) 3,33 - 3,40 (м, 1Н) 3,43 - 3,53 (м, 1Н) 3,58 - 3,87 (м, 8 Н) 4,25 - 4,31 (м, 1Н) 4,49 - 4,54 (м, 1Н) 5,83 (дд, У-19,3, 7,6Н7, 1Н) 6,05 - 6,13 (м, 1Н) 6,83 - 6,90 (м, 2Н) 7,24 (д, 928,6 Гц, 2Н).

Приклад 12 (25,65,75,Е)-2-(25,35,58,68)-3,5-біс(трет-бутилдиметилсиліл)окси)-6-((трет- бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-9-йодо-7-((4-метоксибензил)окси)-6- метилнон-8-ен-4-он (Сполука С-4)

І Перкодинан: і: ї. ї (ї З хо. й зву оно отв МАМ у Десса- Мартіна но отваи тує МеМ тво е нн аа тво е

Б рем ром (8) - тв5о я ОН дав тво нуніе б нотні сз сі

В атмосфері азоту до розчину сполуки С-3: (25,65,75)-2-(25,35,5Н8,6Н)-3,5-біс(трет- бутилдиметилсиліл)окси)-6-((трет-бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-7- ((4-метоксибензил)окси)-6-метил-9-(трибутилстаніл)нон-8- ен-4-ол (970 мг, 0,91 ммоль), що описується в Прикладі 11, в ЗО мл ОСМ при 5 "С додавали йод (242 мг, 0,95 ммоль) в ОСМ (6 мл) до набуття сполукою кольору йоду. Реакційну суміш гасили насиченим водним розчином

Ма?5Оз і шари розділяли. Водний шар екстрагували ЮСМ. Поєднані органічні екстракти промивали сольовим розчином. Поєднані органічні шари висушували над Маг50О5», фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням 0-25 95 ЕОАс/гептан надала (25, 65, 75, Е)-2-(25,35,58,6Н)-3,5-біс((трет- бутилдиметилсиліл)окси)-6-((трет-бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-9- йод-7-((4-метоксибензил)окси)-6-метилнон-8-ен-4-ол (768 мг, вихід 93 965). в атмосфері азоту до розчину (25,65,75,Е)-2-(25,35,58,6Н8)-3,5-біс(трет- бутилдиметилсиліл)окси)-6-((третбутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-9- йодо-7-((4-метоксибензил)окси)-6-метилнон-8-ен-4-ол (768 мг, 0,85 ммоль), отриманого вище в

ОСМ (25 мл) при кімнатній температурі, додавали Мансоз (17,8 мг, 0,21 ммоль) і перйодинан

Десса-Мартіна (485 мг, 1,14 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі в протягом 4 годин. Реакційну суміш розбавляли ЮОСМ і гасили насиченим водним розчином

МанНсСоОз і насиченим водним розчином Маг5Оз, а потім шари розділяли. Водний шар екстрагували ОСМ. Поєднані органічні екстракти промивали сольовим розчином, висушували

Зо над Мд5О5, фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням 0-20 95 ЕОАс/гептан надала вказану в заголовку сполуку (Сполука С-4, 776 мг, кількісний вихід).

І"Н ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-О) 5 ч./млн. 0,00 (с, ЗН) 0,03 - 0,07 (м, 12Н) 0,10 (с, ЗН) 0,81 (д, 9У-6,3 Гц, ЗН) 0,84 (д, 9У-6,3 Гц, ЗН) 0,89 (с, 9 Н) 0,91 (с, 9 Н) 0,92 (с, 9 Н) 1,80 (дт, 9У-15,0, 4,5

Гц, 1Н) 1,99 (дт, 9У-15,0, 2,5 Гц, 1Н) 2,17 (дд, У-16,6, 10.2 Гц, 1Н) 2,20 - 2,29 (м, 2Н) 2,43 - 2,48 (м, 1Н) 2,54 (д, 9-12,7 Гц, 1Н) 2,87 (дд, У-9,0, 1,7 Гц, 1Н) 2,99 (дд, 9У-16,6, 2,9 Гц, 1Н) 3,27 (Ід, 9-5,8, 2,4 Гц, 1Н) 3,50 - 3,56 (м, 1Н) 3,66 - 3,74 (м, 2Н) 3,75 - 3,78 (м, 1Н) 3,80 (с, ЗН) 3,81 - 3,85 (м, 1Н) 4,26 (д, 9-11,7 Гц, 1Н) 4,50 (д, 9У-11,7 Гц, 1Н) 6,26 (д, 9У-14,6 Гц, 1Н) 6,42 (дд, 9У-14,6, 7,8 Гц, 1Н) 6,87 (д, У-8,3 Гц, 2Н) 7,21 (д, 9У-8,3 Гц, 2Н). ЕБ5БІ-М5 (Мас-спектрометрія з іонізацією електророзпиленням) (маса/заряд): 927,39 |МеМа|"

Приклад 13 (25,65,75,Е)-2-(25,35,58,68)-3,5-біс(трет-бутилдиметилсиліл)окси)-6- (гідроксиметил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-9-йодо-7-((4-метоксибензил)окси)-6-метилнон-8-ен-4- он (Сполука С-5) твзо. 183 «М (бовА твво.ї 58 ш ох ох тв5о | ТНЕ-ІРАА-ВИОН НО о нон нон с-А б-5

До розчину Сполуки Сб-4: (25,65,75,Е)-2-(25,35,58,6Н8)-3,5-біс(трет- бутилдиметилсиліл)окси)-6-((трет-бутилдиметилсиліл)окси)метил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-9- йодо-7-((4-метоксибензил)окси)-6-метилнон-8-ен-4-он (600 мг 0,66 ммоль), що описується в прикладі 12, в ТНЕ (5,0 мл), ІРА (5,0 мл) і 1-ВиОН (5,0 мл) при 4 "С додавали (15)-(-)-10 камфорсульфонову кислоту (154 мг, 0,66 ммоль). Реакційну суміш перемішували при 4 "С протягом 20 годин. Реакційну суміш розбавляли Е(ОАс і гасили насиченим водним розчином

Мансо», потім шари розділяли. Водний шар екстрагували ЕІЮАс. Поєднані органічні екстракти промивали сольовим розчином, висушували над М9504, фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням 0-35 95

ЕКОАс/гептан надала вказану в заголовку сполуку (сполука С-5, 500 мг, вихід 95 90).

І"Н ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-О) 5 ч./млн. 0,01 (с, ЗН) 0,04 (с, ЗН) 0,07 (с, ЗН) 0,11 (с, ЗН) 0,86 - 0,91 (м, 15 Н) 0,93 (с, 9 Н) 1,83 (дт, У-14,9, 4,8 Гц, 1Н) 1,93 - 2,00 (дт, У-14,9, 4,68 Гц, 1Н) 2,19 - 2,26 (м, 1Н) 2,29 (дд, 9У-14,9, 5,6 Гц, 1Н) 2,39 (дд, У-16,6, 8,3 Гц, 1Н) 2,44 - 2,66 (м, 4 Н) 2,91 (дд, 9У-9,5, 1,7 Гу, 1Н) 3,36 - 3,41 (м, 1Н) 3,48 (4, 2-11,5, 2,7 Гц, 1Н) 3,59 (т, 9-71 Гц, 1Н) 3,74 - 3,78 (м, 2Н) 3,80 (с, ЗН) 3,85 (м, 1Н) 4,25 (д, 9-11,2 Гц, 1Н) 4,46 (д, 9У-11,2 Гц, 1Н) 6,28 (д, 9У-14,6 Гц, 1Н) 6,43 (дд, 9У-14,6, 7,8 Гц, 1Н) 6,87 (д, У-8,8 Гц, 2Н) 7,21 (д, 9У-8,8 Гц, 2Н). Е5БІ-М5 (Мас-спектрометрія з іонізацією електророзпиленням) (маса/заряд): 813.30 (М--Ма|"

Приклад 14 (28,38,55,65)-3,5-біс(трет-бутилдиметилсиліл)окси)-6-(25,65,7 5, Е)-9-йодо-7-((4- метоксибензил)окси)-6-метил-4-оксонон-8-ен-2-іл)тетрагідро-2Н-піран-2-ілуметила- метилбензенсульфонат (Сполука С-6)

ОМРМ Х ОМРМ твзо.1 55 т8сї твзо.ї А еТВ5Г

Ге) Ж - 5 5 - --3» Ж (о; но о | Ру, ОМАР Шо) нні рем нн: с-5 с-6

В атмосфері азоту до розчину сполуки С-5: (25, 65, 75, Е) -2-(25, 35, 58,6Н8)-3,5-біс(трет- бутилдиметилсиліл))окси)-6-(гідроксиметил)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-9-йодо-7-((4- метоксибензил)окси)-б-метилнон-8-ен-4-он (500 мг 0,63 ммоль), описаного в Прикладі 13, в

ОСМ (10 мл) при 5 "С додавали піридин (2,54 мл, 31,6 ммоль), п-толуолсульфонілхлорід (723 мг, 3,79 ммоль) і 4-диметиламінопіридин (77 мг, 0,63 ммоль), реакційну суміш перемішували при

Зо кімнатній температурі протягом 24 годин. До реакційної суміші додавали п- толуолсульфонілхлорид (150 мг, 0,79 ммоль) при кімнатній температурі. Потім реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 8 годин. Реакційну суміш розбавляли ОСМ і гасили насиченим водним розчином Мансо»з, потім шари розділяли. Водний шар екстрагували

ОСМ. Поєднані органічні екстракти промивали сольовим розчином, висушували над Маг»50Ох, фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням 0-25 95 ЕІАс/гептан надавала вказану в заголовку сполуку (сполука С-6, 560 мг, вихід 94 905).

ІН ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМЧ-4) 5 ч./млн. 0,01 (с, ЗН) 0,04 (с, ЗН) 0,04 (с, ЗН) 0,08 (с, ЗН) 0,81 (д, 9У-6,8 Гц, ЗН) 0,83 (с, 9 Н) 0,86 (д, 9У-6,8 Гу, ЗН) 0,89 (с, 9 Н) 1,81 (дт, У-14,9, 4,5 Гц, 1Н) 1,91 - 1,96 (м, 1Н) 2,15 - 2,32 (м, ЗН) 2,36 - 2,42 (м, 1Н) 2,43 (с, ЗН) 2,57 (д, 9д9-12,7 Гц, 1Н) 2,77 (дд, 9У-16,6, 3,4 Гц, 1Н) 2,87 (дд, 9У-9,0, 1,7 Гц, 1Н) 3,53 - 3,58 (м, 2Н) 3,70 - 3,75 (м, 1Н) 3,80 - 3,85 (м, 1Н) 3,81 (с, ЗН) 4,06 (дд, 9У-10,0, 5,0 Гц, 1Н) 4,08 - 4,16 (м, 1Н) 4,28 (д, 9-11,2 Гц, 1Н) 4,51 (д, 9-11,2 Гц, 1Н) 6,30 (д, 9У-14,6 Гц, 1Н) 6,45 (дд, 9У-14,6, 7,8 Гц, 1Н) 6,88 (д, 9-88 Гц, 2Н) 7,24 (д, 9-8,68 Гц, 2Н) 7,31 (д, 9-8,3 Гц, 2Н) 7,76 (д, У-8,3 Гц, 2Н).

Приклад 15 (25,65,75,Е)-2-(25,35,58,68)-6-(азидометил)-3,5-біс((трет- бутилдиметилсиліл)окси)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-9-йодо-7-((4-метоксибензил)окси)-6- метилнон-8-ен-4-он (Сполука С-7)

-. «ОМРМ Х «ОМРМ тво в отв Мамз тво Н отвЗ о ж 008ЗШБШ2Щ08-к | я (в)

ШЕ: О) о | ро Мз нні Ба "М с-6 с-7

В атмосфері азоту до розчину сполуки 0-6: ((28,38,55,65)-3,5-біс(трет- бутилдиметилсиліл)окси)-6-((25,65,75,Е)-9-йодо-7-((4-метоксибензіл)окси)-6-метил-4-оксонон-8- ен-2-іл)утетрагідро-2Н-піран-2-іл)уметилі4-метилбензолсульфонат (560 мг, 0,59 ммоль), описаний в

Прикладі 14, в ОМ5О (5,6 мл) при 20 "С додавали азид натрію (385 мг, 5,92 ммоль). Реакційну суміш перемішували при 85 "С. Через 2 години до реакційної суміші додавали азид натрію (100 мг, 1,54 ммоль), потім реакційну суміш перемішували при 85 "С протягом 14 годин. Реакційну суміш розбавляли ЕОАс і гасили НгО, потім шари розділяли. Органічні екстракти промивали водою і сольовим розчином. Поєднані органічні шари висушували над Маг5О», фільтрували і концентрували при зниженому тиску, отримуючи неочищений залишок. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням 0 95 - 15 95 Е(ОАс/гептан надавала вказану в заголовку сполуку (сполука С-7, 298 мг, вихід 62 905).

І"Н ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-О) 5 ч./млн. 0,03 (с, ЗН) 0,06 (с, ЗН) 0,07 (с, ЗН) 0,10 (с, ЗН) 0,84 (д, 9У-6,8 Гц, ЗН) 0,85 (д, У-6,8 Гц, ЗН) 0,91 (с, 9 Н) 0,92 (с, 9 Н) 1,86 (дт, У-15,0, 4,7 Гц, 1Н) 1,98 (дт, 9У-15,0, 2,9 Гц, 1Н) 2,19 - 2,32 (м, ЗН) 2,41 - 2,49 (м, 1Н) 2,58 (д, 9-12,7 Гц, 1Н) 2,94 (дд, у16,6, 2,9 Гц, 1Н) 2,98 (дд, У-8,8, 2,0 Гц, 1Н) 3,02 (дд, 9У-12,7, 2,9 Гц, 1Н) 3,47 (дт, 9-88, 2,7 Гц, 1Н) 3,49 - 3,54 (м, 1Н) 3,63 (дд, 9У-12,7, 8,8 Гц, 1Н) 3,69 - 3,73 (м, 1Н) 3,81 (с, ЗН) 3,83 - 3,88 (м, 1Н) 4,26 (д, У-11,7 Гц, 1Н) 4,50 (д, 9У-11,7 Гц, 1Н) 6,26 (д, 9У-14.6 Гц, 1Н) 6,42 (дд, 9У-14,6, 7,8 Гц, 1Н) 6,87 (д, 9У-8,8 Гц, 2Н) 7,22 (д, 9-8,8 Гц, 2Н).

Приклад 16 ((28,38,55,65)-3,5-біс(трет-бутилдиметилсиліл)окси)-6-(25,65,75,Е)-9-йодо-7-((4- метоксибензил)окси)-6-метил-4-оксонон-8-ен-2-іл)тетрагідро-2Н-піран-2-ілуметилукарбамат (Сполука С-8) ї ші ОМРМ оно отвБи У ОМЕМ рр, Піалілдикирбонат тво

ТВО роя ц ві нн, п н о се

М ; . хе Ще Бода ТНЕ БМ на оо ш ше до ! трат Ї 90 дед, Тов НЕО Й - :

А ЕВ) й Я і Нв ТНЕ у пні

С-7 С-8

До розчину сполуки С-7: (25,65,75,Е)-2-(25,35,58,68)-6-(азидометил)-3,5-біс(трет- бутилдиметилсиліл)окси)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-9-йодо-7-((4-метоксибензіил)окси)-6-

Зо метилнон-8-ен-4-он (298 мг, 0,37 ммоль), що описується в Прикладі 15 в ТОК (10 мл) і воді (1,0 мл) при 20 "С додавали трифенілфосфін (1437 мг, 5,478 ммоль). Реакційну суміш перемішували при 70 "С протягом 1,5 годин. Реакційну суміш концентрували при зниженому тиску, отримуючи неочищений амін. До розчину неочищеного аміну, отриманого вище, в ТОЕ (10 мл) при 5 С додавали ЕМ (0,51 мл, 3,66 ммоль) і діалілдикарбонат (341 мг, 1,83 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 60 хвилин. Реакційну суміш концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням 0-25 9о

КОАс/гептан надавала вказану в заголовку сполуку (Сполука С-8, 300 мг, вихід 94 905).

ІН ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМЧ-О) б ч./млн. 0,05 - 0,07 (м, 9 Н) 0,11 (с, ЗН) 0,85 (д, 9У-6,3 Гц,

ЗН) 0,87 (д, 9У-6,3 Гц, ЗН) 0,90 (с, 9 Н) 0,93 (с, 9 Н) 1,80 (дт, 9У-15,0, 4,4 Гц, 1Н) 1,96 (дт, 9У-15,0, 2,68 Гу, 1Н) 2,16 - 2,29 (м, 2Н) 2,32 - 2,39 (м, 1Н) 2,53 - 2,60 (м, ЗН) 2,86 (д, 9-7,3 Гц, 1Н) 3,04 - 3,11 (м, 1Н) 3,30 - 3,34 (м, 1Н) 3,38 - 3,48 (м, 1Н) 3,58 (т, У-7,1 Гц, 1Н) 3,70 - 3,76 (м, 1Н) 3,80 (с,

ЗН) 3,81 - 3,84 (м, 1Н) 4,25 (д, 9-11,2 Гц, 1Н) 4,46 (д, 9-11,2 Гу, 1Н) 4,53 - 4,63 (м, 2Н) 5,19 (дд, уе10,7, 1,5 Гу, 1Н) 5,32 (д, 917,1 Гу, 1Н) 5,47 (д, 9-6,8 Гу, 1Н) 5,88 - 5,99 (м, 1Н) 6,28 (д, 9У-14,6

Гц, 1Н) 6,43 (дд, 9У-14,6, 7,8 Гц, 1Н) 6,87 (д, 9У-8,8 Гц, 2Н) 7,21 (д, 9-8,68 Гц, 2Н). Е5І-М5 (Мас- спектрометрія з іонізацією електророзпиленням) (маса/заряд): 896,34 |М'-Ма|:

Схема р; Отримання Сполуки 0-7

Нав ни : . й он ат се ак й тв. ОМ і Ї | Н ШЕ: ше ьІа т На і НІ де м, шк ст, 9); о р

ТВО а о. НИ ТВО І іч Її тк. ше Я о я й : в їн

У оф в Ї КУ ан би

ГО і Зо

ШЕ: ЯН: 4 Її 4 їх З же «З. «М що Ще мання с вус , о с-8 Дині й х- ше р ол, 1,8-бісідиметиламіної, Кі т й чи па) хх Е й найталін МЕСМ а її" ОВ ва

Код Ожено

СА-АСЕ х і нн КК ет»,

КА Ше

ЕЕ! «РА ї- 1 й

Ж ей

ШІ де ц ц твЗ : ОМРМ Перйодинан Десся Мартіна тво ге Мансо»з с ж

Що но ром

Е бот 8) дл тих ше Н': я ц о т « (о. о тво ЕТО, т

Н Е н ен 0-4 о о от яе з т Ста іо цоонтве м ОМРМ тво о

Ох

ТОВ - т

НЕ о о, о 1 . ГО о тво шо ш Це о

Н І Н еН 0-5 щи бо се Щй т Ст

СЯ з, рю

ІН нон:

ТВАЕ ц х о, І тя (о

Імідазол гідрохлорид ро НО, (о) ; о о Н

ОМЕ-ТНЕ Бхфев ОСМ-А-ВОСН- т о . : ан рН? є ие в; ба яр 0-6 З з, х Се, о | й пп

ІН Не о

РІ(РРНз) Н биття ші НО, о еще Н о Піролідин ши С о СІ Тед це (8) осм НОМ. ето : Н нн : Н ен дсОН с а ие А, н бик, о 0- й

Приклад 17

Сполука 0-4 тв5.. ММ АНІ, вона пра о ць я тра їі ОВО зни з г.

МН і нн : А їн с 5 зе о Два ї с-8 А ян рани : г й І ї.. А ! ши -е я

Що 3,в- роя

Біб диметиляжміно інафталін х ЇЙ ще ні ща О---0 352 месм сі-ст - га сом СІ

Мі;

Ки Ку зе вз тв5.-А ОМеМ

Н Ні 7 тво о нон Н ска - по Н". я цН о ь - па р-4 тво дО а не О сн с Ор ще з Ів Си

Н

В атмосфері азоту (в рукавичному боксі) до розчину сполуки 0-2: (5)-М-(2-(4-ізопропіл-4,5- дігідрооксазол-2-іл)-бЄ-метоксифенілуметансульфонамід (155 мг 0,497 ммоль), отриманий способом, написаним в Огдапіс І ецеге (2002), 4 (25), 4431-4434 (САБ Мо; 546141-34-8) і 1,8- бісі(ідиметиламіно)нафталін(107 мг, 0,497 ммоль) в МесМ (0,75 мл) додавали хлорид хрому (Ії) (55,5 мг, 0,452 ммоль), а потім отриману суміш перемішували в рукавичному боксі при кімнатній температурі протягом 1 години. Отриманий зелений розчин додавали до суміші сполуки С-8: аліл((2К, ЗК, 55, 65)-3,5-біс(трет-бутилдиметилсиліл)окси)-6-((25, 65,75,Е)-9-йодо-7-((4- метоксибензил)окси)-6-метил-4-оксонон-8-ен-2-іл)тетрагідро-2Н-піран-2-іл)уметил)карбамат (99,0 мг, 0,113 ммоль), описаної в Прикладі 16, Сполуки 0-1 (80,0 мг, 0,09 ммоль), отриманої у спосіб, який описується в дошгпа! ої Атегісап Спетіса! Зосієїу (1992), 114 (8), 3162-3164 (САБ Мо; 157322-23-1), Сполуки 0-3: дихлор (2,9-диметил-1,10-фенантролін)нікель (0,46 мг, 1,36 мкмоль), отриманої у спосіб, що описується в дошгпаї ої Атегісап Спетіса! Зосієїу (2009), 131 (42), 15387 - 15393 (САБ Мо; 21361-04-6) і хлориду літію (3,83 мг 0,09 ммоль). Реакційну суміш перемішували в рукавичному боксі при кімнатній температурі протягом 60 хвилин. Потім реакційну суміш виймали з рукавичному боксу, розбавляли сумішшю діетилового ефіру-ЕЮАс (5,0 мл - 5,0 мл), потім до суміші додавали Ріогізік» (1600 мг, 15,94 ммоль) (САЗ Мо; 1343-88-0).

Потім суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Суміш фільтрували (СеШеФ), промивали Е(Ас/гептан - 2/1, потім фільтрат концентрували при зниженому тиску.

Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням від З 96 до 55 956 ЕІОАс/гептан надавала вказану в заголовку сполуку (сполука 0-4, 140 мг, вихід 95 905).

Приклад 18

Сполука 0-5 тв5.-.. ОМРМ

А На ви

ТТ -о іш Певрйодинан: т о я ні Ммансо»з нн: не кв рол код «МН Щ но нео тт п ши: ши шин о поем о і нан ке р-є во : нон о бо ше -ч; ї Сіпе а і пий тв5 : «ОМеМ твзо о

Ок (8) : х

НІ о А: де т Н. о я о (8) (8) А о тво ге : 05 ДЕ НО Ден це й т ГО ПО

ШО і пи

В атмосфері азоту до розчину сполуки 0-4 (140 мг, 0,09 ммоль), описаного в прикладі 17, в

ОСМ (5,0 мл) при 5 "С додавали Мансо»з (28,8 мг, 0,34 ммоль) і перйодинан Десса-Мартіна (72,7 мг, 0,17 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 60 хвилин.

Реакційну суміш розбавляли ОСМ і гасили насиченим водним розчином МансСоз та насиченим водним розчином Ма»5Оз, а потім шари розділяли. Водний шар екстрагували ОСМ. Поєднані органічні екстракти промивали сольовим розчином, висушували над Ма25О»4, фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Флеш-хроматографія залишку на силікагелі з використанням від 2 95 до 60 9о ЕІОАс/гептан надавала вказану в заголовку сполуку (Сполука О- 5, 120 мг, 86 95).

ІН ЯМР (500 МГц, БЕНЗОЛ-аб) б ч./млн. 0,01 - 0,05 (м, 9 Н) 0,10 - 0,12 (м, 6 Н) 0,15 (с, ЗН) 0,76 (д, 9У-6,1 Гц, ЗН) 0,96 (с, 9 Н) 1,02 (с, 9 Н) 1,04 (с, 9 Н) 0,95 - 1,10 (м, 7Н) 1,20 (д, 9-73 Гц,

ЗН) 1,91 - 1,37 (м, ЗН) 1,41 (дд, У-12,8, 4,9 Гц, 1Н) 1,40 - 1,58 (м, 4 Н) 1,59 - 1,64 (м, 1Н) 1,69 - 1,89 (м, ЗН) 1,90 - 1,99 (м, 2Н) 2,02 - 2,25 (м, 8 Н) 2,26 - 2,48 (м, 6 Н) 2,49 - 2,70 (м, 6 Н) 2,71 - 2,84 (м, 2Н) 3,00 - 3,07 (м, 1Н) 3,12 - 3,30 (м, 4 Н) 3,36 (с, ЗН) 3,40 (широкий синглет, 1Н) 3,44 - 3,53 (м, 2Н) 3,65 (дд, У-6,4, 4,0 Гц, 1Н) 3,69 - 3,84 (м, 4Н) 3,86 - 4,03 (м, 4Н) 4,07 - 4,17 (м, ЗН) 4,27 - 4,29 (м, 1Н) 4,27 (д, 9У-11,0 Гц, 1Н) 4,48 - 4,58 (м, 1Н) 4,49 (д, 9У-11,0 Гц, 1Н) 4,65 - 4,70 (м, 2Н) 4,68 (д, 9-5,5 Гц, 1Н) 4,74 - 4,86 (м, 2Н) 4,78 (с, 1Н) 4,93 (с, 1Н) 5,05 (д, 9У-10,4 Гц, 1Н) 5,09 (широкий синглет, 1Н) 5,19 (широкий синглет, 1Н) 5.30 (дд, 9У-17,1, 1,2 Гц, 1Н) 5,82 (д, У-8,0 Гц, 1Н) 5,86 - 5,96 (м, 1Н) 6,46 (д, У-15,9 Гц, 1Н) 6,84 - 6,92 (м, ЗН) 7,31 (д, У-8,6 Гц, 2Н).

Приклад 19

Сполука 0-6

00 ТВ5,А. ОМеМ тво. я яра ри за З ТВАЄ ко чі НІ о Год А и. й ш-. Імідазол гідрохлорид пора

М нт ши НЕ Ве Я як ек з

І 1 АХА що ДІ ш" о осмавозя три ак - зи - й й - ТА ще твБО до - не гий ТНЕ Буфер ВНт. о о о ще що т Спи лю ! сн о. В а й тд

НО, Ів) ; Н я хНн нн н н' АН не о б я Я ОК о | І Н 0-6 па

Імідазол гідрохлорид (155 мг, 1,48 ммоль) розчиняли в ОМЕ (2,9 мл), отримуючи 0,5 М розчину імідазолу гідрохлориду в ОМЕ. 1,0 мл цього розчину змішували з 1,0 мл ТВАБЕ (1,0 М, розчин ТНЕ) з отриманням попередньо змішаного розчину 0,5 М ТВАБЕ і 0,25 М гідрохлориду імідазолу в ТНЕ-ОМЕ (1:1). В атмосфері азоту до розчину сполуки 0-5 (80,0 мг, 0,05 ммоль), описаного в прикладі 18, в ОМЕ (7,0 мл) при 20 "С додавали 0,588 мл попередньо змішаного розчину ТВАЕ (0,5 М) ії гідрохлориду імідазолу. (0,25 М) в ТНЕ-ОМЕ (1:71), отриманому вище.

Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 14 годин. 1,6 г СаСсОзі 4,0 г

МБожшехе 50УУХ8 (воднева форма, 200-400 меш, 5БІСМА-АГОКІСН) додавали до реакпійної суміші. Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 2 годин. Поті.. .,міш розбавляли ЕІОАСс, потім фільтрували (СеїШеФф), промивали ЕОАс. Фільтрат концентрували при зниженому тиску, отримуючи неочищений залишок. 1000 мг СаСОз і 2,25 г Юожшехе 50МУХ8 додавали до ЕІАс (6,0 мл) розчину неочищеного залишку. Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 2,5 годин. Потім суміш розбавляли ЕОАс, фільтрували (Сеїйефт), промивали ЕАс. Фільтрат концентрували при зниженому тиску, отримуючи неочищений залишок (63,0 мг). До розчину неочищеного залишку (63,0 мг), отриманого вище, в ОСМ (6,0 мл), 1-ВиОН (0,6 мл) і фосфатному буфері з рН 7 (0,6 мл, 1/15 М) при кімнатній температурі додавали ЮБО (111 мг, 0,49 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 45 хвилин. Реакційну суміш гасили насиченим розчином Мансо»з, потім розбавляли

ОСМ ії шари розділяли. Водний шар екстрагували за допомогою ОСМ (3 рази). Поєднані органічні екстракти висушували над Маг250О5, фільтрували і концентрували при зниженому тиску.

Флеш-хроматографія залишку на МН силікагелі з використанням 10-100 95 ЕАс/гептан, потім 10 956 МЕеЕОН/ЕІЮАс надавала по суті очищену вказану в заголовку сполуку (Сполука 0-6, 15,0 мг, 25. 27595).

ІН ЯМР (500 МГц, МЕТАНОЛ-а4) 5 ч./млн. 0,97 (д, 9У-7,0 Гц, ЗН) 0,97 (д, 927,0 Гц, ЗН) 1,00 - 1,02 (м, 1Н) 1,05 (д, 9У-7,3 Гц, ЗН) 1,09 (д, 9У-6,3 Гц, ЗН) 1,31 - 1,45 (м, 6Н) 1,46 - 1,63 (м, 5Н) 1,64 - 1,75 (м, ЗН) 1,80 - 1,86 (м, 2Н) 1,87 - 1,93 (м, 2Н) 1,94 - 2,11 (м, 9Н) 2,13 - 2,27 (м, 8Н) 2,33 (д, 9-24 Гц, 2Н) 2,39 (дд, 9У-13,4, 6,1 Гц, 1Н) 2,44 (дд, 9У-17,6, 2,0 Гц, 1Н) 2,55 (дд, У-17,6, 9,3 Гц,

Зо 1Н) 2,75 - 2,84 (м, 1Н) 2,97 (дд, 9У-9,3, 2,0 Гц, 1Н) 3,21 (дд, У-6,6, 4,6 Гц, 1Н) 3,32 (м, 1Н) 3,41 - 3,46 (м, 1Н) 3,57 (широкий синглет, 1Н) 3,60 (д, 9У-11,7 Гц, 1Н) 3,67 - 3,74 (м, 2Н) 3,78 (широкий синглет, 1Н) 3,86 - 3,90 (м, 2Н) 3,97 (д, 9У-2,4 Гц, 1Н) 4,02 - 4,11 (м, 4 Н) 4,17 (дд, У-6,6, 4,6 Гц, 1Н) 4,23 (дд, 9У-11,5, 2,2 Гц, 1Н) 4,29 (широкий синглет, 1Н) 4,31 (14, 9У-9,3, 3,9 Гц, 1Н) 4,44 (д,

У-10,2 Гц, 1Н) 4,51 (д, 9У-5,4 Гц, 2Н) 4,59 (т, У-4,9 Гц, 1Н) 4,61 (дд, 9У-7,3, 4,9 Гц, 1Н) 4,69 (т, 9-46 Гц, 1Н) 4,80 (с, 1Н) 4.85 - 4.87 (м, 1Н) 5,01 (с, 1Н) 5,05 (с, 1Н) 5,16 (дд, У-10,7, 1,0 Гц, 1Н)

5,28 (дд, 9У-17,1, 2,0 Гц, 71Н) 5,929 (м, 1Н). Е5І-М5 (Мас-спектрометрія з іонізацією електророзпиленням) (маса/заряд): 1172,57 |Ма-МаЇ|:

Приклад 20

Сполука 0-7 вх НА а на вот нити и Н - Н нн А Н ен дн КО о ою р-є

ІН нон: . . нО,, 2 Н

Піролідин - Й т в В ЩО о о пем НМ шо Н нн т не ен

Но: й Ос

АСОН ке з жо

Н по В р-т

В атмосфері азоту до розчину Сполуки 0-6 (15,0 мг, 0,013 ммоль), що описується в Прикладі 19, піролідин (10,8 мкл, 0,13 ммоль) в ОСМ (2,0 мл) при кімнатній температурі додавали тетракіс (трифенілфосфін)паладій (0) (7,53 мг 6,52 мкмоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Реакційну суміш концентрували при зниженому тиску.

Флеш-хроматографія залишку на МН силікагелі з використанням 50 95 Е(ОАс/гептану, потім 0-20 до МЕеОнН/ЕЮАс надала злегка очищений продукт. Отриманий злегка очищений продукт повністю очищали за допомогою ВЕРХ з отриманням титульної сполуки (0-7, 7,0 мг, 47 9, час утримування - 13,8 хв).

Умови ВЕРХ:

Колонка: УМС Рак Рго С18 (20 ммх250 мм)

Довжина хвилі детектування: 200 нм

Температура колонки: кімнатна температура

Рухома фаза: МесСМ-вода (0,05 956 АСОН)

Витрата потоку: 8 мл/хв.

Елюат: мМесм/Вода 25 95 (ізо, 2 хв.), потім мМесм/Вода від 25 95 до 60 95 (Градієнт, 20 хв.)

ІН ЯМР (500 МГц, МЕТАНОЛ-а4) 5 ч./млн. 0,99 (д, 9У-6,7 Гц, ЗН) 1,00 - 1,03 (м, 1Н) 1,04 (д, уУ-7,3 Гц, ЗН) 1,06 (д, 9У-7,3 Гц, ЗН) 1,10 (д, 9У-6,1 Гц, ЗН) 1,29 - 1,63 (м, 10 Н) 1,65 - 1,78 (м, ЗН) 1,79 - 1,89 (м, 2Н) 1,92 - 2,12 (м, 10 Н) 1,93 (с, ЗН) 2,13 - 2,36 (м, 9 Н) 2,41 (дд, У-13,5, 6,1 Гц, 1Н) 2,45 (дд, 9-17,6, 2,2 Гц, 1Н) 2,56 (дд, У-17,6, 9,8 Гц, 1Н) 2,75 - 2,84 (м, 1Н) 2,98 (дд, У-9,8,1,8 Гу, 1Н) 3,12 (дд, У-12,8, 3,7 Гц, 1Н) 3,22 (дд, У-6,4, 4,6 Гц, 1Н) 3,26 (дд, 9У-13,2, 7,8 Гц, 1Н) 3,39 (д,

Зо У-1,8 Гу, 1ТН) 3,61 (д, У-12,8 Гц, 1Н) 3,63 - 3,68 (м, 2Н) 3,68 - 3,76 (м, 2Н) 3,81 - 3,94 (м, ЗН) 4,00 (д, 922,5 Гц, 1Н) 4,03 - 4,15 (м, 4 Н) 4,18 (дд, У-6,4, 4,6 Гц, 1Н) 4,25 (ддд, 9У-11,0, 4,3, 1,8 Гц, 1Н) 4,27 - 4,36 (м, 2Н) 4,46 (д, 9У-11,0 Гц, 1Н) 4,57 - 4,65 (м, 2Н) 4,70 (т, 9-46 Гц, 1Н) 4,81 (д, 9У-1,2 Гу, 1Н) 5,02 (широкий синглет, 1Н) 5,06 (д, 9У-1,8 Гц, 1Н). Е5БІ-М5 (Мас-спектрометрія з іонізацією електророзпиленням) (маса/заряд): 1066,96 (МАНІ, 1090,19 (М--Ма|"

Сполука (1) (безсольова форма Сполуки 0-7): "Н ЯМР (600 МГц, МЕТАНОЛ-Я4) 5 ч./млн. 0,98 (д, 9-7,2 Гц, ЗН) 1,00 (д, 9У-6,8 Гц, ЗН) 1,02 (м, 1Н) 1,05 (д, У-6,8 Гц, ЗН) 1,09 (д, У-64 Гу,

ЗН) 1,28 - 1,45 (м, 5 Н) 1,46 - 1,59 (м, 4 Н) 1,57 - 1,63 (м, 1Н) 1,65 - 1,71 (м, 1Н) 1,70 - 1,75 (м, 2Н) 1,79 - 1,686 (м, 2Н) 1,91 (дт, 9У-14,9, 3,1 Гц, 1Н) 1,94 - 2,11 (м, 8 Н) 2,14 - 2,34 (м, 9 Н) 2,39 (дд, 9у13,2,6,0 Гц, 1Н) 2,44 (дд, 9У-17,4, 1,9 Гц, 1Н) 2,56 (дд, 9У-17,6, 9,6 Гу, 1Н) 2,69 (дд, У-13,2,42

Гц, 1Н) 2,79 (аад, 9У-15,9, 7,6, 2,0 Гц, 1Н) 2,92 (дд, У-13,2, 8,3 Гц, 1Н) 2,97 (дд, 9У-9,6, 1,7 Гц, 1Н) 3,21 (дд, 9У-6,4, 4,9 Гц, 1Н) 3,29 (м, 1Н) 3.34 (дд, 9У-8,3, 4,15 Гц, 1Н) 3,58 (широкий синглет, 1Н) 3,60 (широкий синглет, У-11,3 Гц, 1Н) 3,68 - 3,73 (м, 2Н) 3,80 (широкий синглет, 1Н) 3,84 - 3,90 (м, 2Н) 3,98 (д, 9-2,3 Гц, 1Н) 4,03 - 4,13 (м, 4 Н) 4,17 (дд, У-6,4, 4,9 Гц, 1Н) 4,24 (ддд, 9У-11,3, 4,5, 1,5 Гу, 1Н) 4,29 (дд, 9У-4,0, 1,9 Гц, 1Н) 4,32 (1д, 9У-10,2, 4,2 Гу, 1Н) 4,44 (широкий синглет, .)-11,0

Гц, 1 Н) 4,59 (т, У-4,5 Гц, 1Н) 4,62 (дд, 9У-7,4, 4,7 Гу, 1Н) 4,69 (т, 9У-4,7 Гу, 1Н) 4,80 (широкий синглет, 1Н) 4,87 (с, 1Н) 5,00 (широкий синглет, 1Н) 5,05 (широкий синглет, 9У-1,1 Гу, 1Н)

ЕБІ-М5 (Мас-спектрометрія з іонізацією електророзпиленням) (маса/заряд): 1066,57 МАНІ, 1088,55 |М-Ма|"

Приклади фармакологічних тестів

Загальна інформація

Природні сполуки галіхондрину та їхні модифіковані сполуки є відомими в літературі (Див., наприклад, О. Оетига еї аї. "Могпаїїспопагіп А: Ап Апійштог Роїуеїйег Мастоїїде їот а Магіпе зропде".). Ат. Спет. 5о0с., 107, 4796 (1985); Магс І пацдоп еї аІ. "Апійштог РоїуеШег Масгоїідев:

Мем апа Нетізупіпеїйс Наїїспопагіпв5 їгтот Те Мем 7еаіапа Оєер-УмМасег 5ропде І іззодепадогух зр.

У. Ога. Спет., 1997, 62, 1868-1871). Проте, більшість з них не є легкодоступними. Наприклад, доктор Уемура зі співавторами виділив 12,5 мг галіхондрину В, 35,0 мг норгаліхондрину А і 17,2 мг гомогаліхондрину А з 600 кг Наїїспопагіа оКадаї Кадоїа (Див., наприклад, Ю. Оетига еї аї. "Мотаїїспопагіп А: Ап Апійштог Роїуеїпег Масгоїїде їот а Магіпе 5ропде" 9. Ат. Спет. 5ос., 107, 4796 (1985)). Серед природних сполук галіхондрину, галіхондрин В проявляє найбільшу протипухлинну активність проти клітин меланоми В-16 іп міїго і має високу активність відносно лейкемії /-1210 іп мімо (Див., наприклад, Ю. Оетига еї аї. "Могпаїйспопагіп А: Ап Апійштог

РоїуеШег Масгоїїде їтот а Магіпе 5ропде" У. Ат. Спет. 50ос., 107, 4796 (1985)). Галіхондрин С також є активним в різних моделях іп мімо, але не є стабільним у водному розчині порівняно з

Галіхондрином В. Норхаліхондрин В значно слабкіший, ніж галіхондрін В, не лише іп міїго, але й іп мімо. Див, наприклад, О. Оетига еї аї. "Могпаїїспопагіп А: Ап Апійштог РоїЇуеїпег Масгоїїде їот

Зо а Магіпе 5ропде" У. Ат. Спет. 5обс., 107, 4796 (1985)). В наступних фармакологічних тестах застосовується Галіхондрин В (Наїї-В) як контрольна сполука в міру необхідності.

Приклад фармакологічного тесту 1. Аналіз інгібування росту Гари.

У цьому аналізі визначали інгібуючу активність щодо росту клітинних ліній Баби за допомогою тестованих сполук при плоскоклітинному раку голови і шиї (ЗССНМ). Клітини Бари утримували в середовищі КРМІ-1640 (УуаКо Рите СПпетіса! Іпдивійєв5, а. 187-02021), що містить 10 95 фетальної бичачої сироватки (ЕВ5: Міспігеї, 120168), і пеніцилін та стрептоміцин в інкубаторі з 5 956 СО» (37 "С). У кожну ямку 9б-ямкового планшета (Весіоп, Ріскіпбоп апа

Сотрапу, 353219) додавали 75 мкл клітинної суспензії Раби, доведеної до концентрації 4х107 клітин/мл в середовищі для культивування клітин, і клітини інкубували протягом ночі в інкубаторі з 5 95 СО» (37 "С). Наступного дня в кожну ямку додавали 25 мкл сполуки (1) або галіхондрину В в серії триразових розбавлень, суспендованих в середовищі для культивування клітин, і отриманий продукт інкубували протягом З днів в інкубаторі з 5 956 СО» (37 "С). Потім життєздатність клітин визначали за допомогою люмінесцентного аналізу життєздатності клітин

СеППіег-Ссіо? (Рготеда) з багатоканальним зчитувачем Епмізіоп 2103 (РегКіп-ЕІтег, У/еїПезієу,

Массачусетс). Значення ямок, що містили клітини без додавання тестованих сполук, було визначено як 100 95, а значення ямок, що не містили клітин, було визначено як 0 95. Була розрахована концентрація тестованої сполуки, необхідна для інгібування росту клітин на 50 95 (тобто значення ІСвхо), що показана в Таблиці 1.

Таблиця 1 11111111 ваби1111

Приклад фармакологічного тесту 2. Аналіз інгібування росту МОА-МВ231

В цьому аналізі, визначали інгібуючу активність за допомогою тестованих сполук щодо росту клітинної лінії МОА-МВ231 при раку молочної залози у людини. Клітини МОА-МВ231 утримували в середовищі Ігла в модифікації Дульбекко (Умако Риге Спетіса! Іпаивігіеєх, Ца., 044-29765) з вмістом 10 95 фетальної бичачої сироватки (ЕВ5: Міспігеї, 120168), і пеніциліну та стрептоміцину в інкубаторі з 5 95 СО» (37 "С). В кожну ямку 96-ямкового планшету (Весіоп, РісКіпбзоп апа

Сотрапу, 353219), додавали 75 мкл клітинної суспензії МОА-МВ231, доведеної до концентрації 4х107 клітин/мл у середовищі для культивування клітин, та клітини інкубували протягом ночі у інкубаторі з 5 95 СО» (37 "С). Наступного дня, 25 мкл Сполуки (1) або галіхондрину В в серії триразових розбавлень, суспендованих в середовищі для культивування клітин, і отриманий продукт інкубували протягом З днів в інкубаторі з 5 95 СО» (37 "С). Потім життєздатність клітин визначали за допомогою люмінесцентного аналізу життєздатності клітин СепТйег-С1іо? (Рготеда) з багатоканальним зчитувачем Епмізіоп 2103 (РегкКкіп-ЕІтег, УмеПевівеу, Массачусетс). Значення ямок, що містили клітини без додавання тестованих сполук, було визначено як 100 95, а значення ямок, що не містили клітин, було визначено як 0 95. Була розрахована концентрація тестованої сполуки, необхідна для пригнічення росту клітин на 50 95 (тобто значення ІСво), Що показана в Таблиці 2.

Таблиця 2 11111111 мМоАмМваМІ С

Приклад фармакологічного тесту 3. Аналіз інгібування росту НСС1954

В цьому аналізі, визначали інгібуючу активність за допомогою тестованих сполук щодо росту клітинної лінії НСС1954 при раку молочної залози. Клітини НСС1954 утримували у середовищі

ВАРМІ-1640, модифікованого для вмісту 2 мМ І -глутаміну, 10 мМ ГЕПЕС, 1 мМ пірувату натрію, 4500 мг/л глюкози, та 1500 мг/л бікарбонату натрію (АТС 30-2001) з вмістом 10 95 фетальної бичачої сироватки (ЕВ5: Міспігеї, 120168), та пеніциліну і стрептоміцину у інкубаторі з 5 956 СО»2 (37 "С). У кожну ямку 96-ямкового планшету (Весіоп, бісКіпхоп апа Сотрапу, 353219), додавали 75 мкл клітинної суспензії НСС1954, доведеної до концентрації 4х102 клітин/мл у середовищі для культивування клітин, та клітини інкубували протягом ночі у інкубаторі з 5 956 СО» (37 "С).

Наступного дня, 25 мкл Сполуки (1) або галіхондрину В в серії триразових розбавлень, суспендованих в середовищі для культивування клітин, і отриманий продукт інкубували протягом З днів в інкубаторі з 5 956 СО» (37 "С). Потім життєздатність клітин визначали за допомогою люмінесцентного аналізу життєздатності клітин СейТіег-Сіо? (Рготеда) з багатоканальним зчитувачем Епмізіоп 2103 (РегКіп-ЕІтег, УмеПевівєу, Массачусетс). Значення ямок, що містили клітини без додавання тестованих сполук, було визначено як 100 95, а значення ямок, що не містили клітин, було визначено як 0 95. Була розрахована концентрація тестованої сполуки, необхідна для інгібування росту клітин на 50 95 (тобто значення ІСво), що показана в Таблиці 3.

Таблиця З 11111111 носія 7777777

Приклад фармакологічного тесту 4. Протипухлинні ефекти у моделі підшкірних ксенотрансплантатів Раби у мишей як монотерапія

Клітинна лінія Раби плоскоклітинного раку голови та шиї (ЗССНМ), яку культивували в середовищі ЕРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну і стрептоміцину, була доведена до концентрації 4,8х107 клітин/мл за допомогою збалансованого сольового розчину Хенкса.

Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну ділянку правого боку безтимусних мишей віком 7 тижнів (САпПМ.Сд-Рохпіпи/СтісСті), самиці, Спапез Кімег Гарогайгіез дарап Іпо.).

Через дев'ять днів після введення клітини, за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (Оідітаййс" саїїрег, Мішоуо Согрогайоп) у кожної миші вимірювали найкоротший та найдовший діаметр пухлини для розрахунку об'єму пухлини за наступною формулою розрахунку:

Об'єм пухлини (мм3) - Найдовший діаметр (мм)хНайкоротший діаметр (тт)хНайкоротший діаметр (мм)/2

Зо

Відносний об'єм пухлини (КТМ) - Об'єм пухлини (день Х) / Об'єм пухлини (перший день)

Регресія пухлини ( 95) - (1 - мінімальний КТУ) х 100

На основі об'ємів пухлин, отриманих в перший день введення, мишей згрупували таким чином, щоб середні об'єми пухлин були по суті рівними серед груп. Кожну тестовану сполуку розчиняли в ЮОМ5О і розчин зберігали в морозильній камері перед використанням.

Безпосередньо перед введенням основний розчин розбавляли фізіологічним розчином з 100 мкм гідроксипропіл-В-циклодекстрину. Кожен випробуваний зразок вводили внутрішньовенно в максимально переносимій дозі (МТО). До речі, експеримент проводився в групах, кожна з яких складалася з 4 мишей. Регресія пухлини (95) кожної тестованої сполуки показана в Таблиці 4.

Таблиця 4

ГалхонддринВ./////Ї77777777110005.711111111111111111111110111111сСсС

Приклад фармакологічного тесту 5. Протипухлинна активність відносно О5С-19 у моделі підшкірних ксенотрансплантатів у мишей як монотерапії

Клітинна лінія О50-19А плоскоклітинного раку голови та шиї (5ССНМ), яку культивували в середовищі ОМЕМ/Нат Е-12 (1:11) з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну і стрептоміцину, була доведена до концентрації 1х109 клітин/мл за допомогою РВ5 для отримання клітинної суспензії та суспензію перемішували Маїйгіде!" (ВО Віозсіеєпсе, 2366237) у співвідношенні 1:1 для отримання клітинної суспензії у концентрації 5х107 клітин/мл. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну ділянку правого боку безтимусних мишей віком 5 тижнів (САпМ.Сд-

Еохпіпиш/СтісСті), самиці, Спагіе5 Кімег І арогафгіе5 дарап, Іпс.). Через шість днів після введення клітини, найкоротший та найдовший діаметр пухлини у кожної миші вимірювали за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (Оідітайс"мМ саїїрег, Мішоуо Согрогайоп), для розрахунку об'єму пухлини за наступною формулою розрахунку:

Об'єм пухлини (мм3) - Найдовший діаметр (мм) х Найкоротший діаметр (мм)хНайкоротший діаметр (мм)/2

На основі об'ємів пухлин, отриманих в перший день введення, мишей згрупували таким чином, щоб середні об'єми пухлин були по суті рівними серед груп. Експеримент проводився в

Зо групах, кожна з яких складалася з б мишей. Тестовану сполуку розчиняли в сольовому розчині та внутрішньовенно вводили в дозах від 0,06 мг/кг до 0,18 мг/кг раз на тиждень протягом 2 тижнів (режим введення 07Ох2). Регресія пухлини (95) кожної тестованої дози показана в

Таблиці 5.

Таблиця 5

Сполука() ///////7СЇ77717171717171170006771111111111111111111115981111сСсСсСсСсСС

Сполука) ///////СЇ7771717171717110МВ87 11111119

Приклад фармакологічного тесту 6. Протипухлинна активність відносно НСС1806 у моделі підшкірних ксенотрансплантатів у мишей як монотерапії

Клітинна лінія НСС1806 раку молочної залози людини, яку культивували в середовищі

ВРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну і стрептоміцину, була доведена до концентрації 1х108 клітин/мл за допомогою РВ5 для отримання клітинної суспензії та суспензію перемішували Маїгіде!" (ВО Віозсіепсе, 2366237) у співвідношенні 1:1 для отримання клітинної суспензії у концентрації 5х107 клітин/мл. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну ділянку правого боку безтимусних мишей віком 5 тижнів (САпМ.Са-Рохпіпи/Стісті|, самиці, Спагіе5 Кімег І арогаюгіев5 дарап, Іпс.). Через дванадцять днів після введення клітини, найкоротший та найдовший діаметр пухлини у кожної миші вимірювали за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (Оідітайс"мМ саїїрег, Мішоуо Согрогайоп), для розрахунку об'єму пухлини за наступною формулою розрахунку:

Об'єм пухлини (мм3у) - Найдовший діаметр (мм) х Найкоротший діаметр (мм) х Найкоротший діаметр (мм)/2

Відносний об'єм пухлини (КТУ) - Об'єм пухлини (день Х) / Об'єм пухлини (перший день)

На основі об'ємів пухлин, отриманих в перший день введення, мишей згрупували таким чином, щоб середні об'єми пухлин були по суті рівними серед груп. Експеримент проводився в групах, кожна з яких складалася з б мишей. Тестовану сполуку розчиняли в сольовому розчині та внутрішньовенно вводили в дозі 0,18 мг/кг один раз на тиждень протягом 2 тижнів (режим введення 207Ох2). Регресія пухлини (95) у разі застосування Сполуки (1) показана в Таблиці 6.

Таблиця 6

Сполука) ///////СЇ7771717171717110МВ87 11111119

Приклад фармакологічного тесту 7. Протипухлинні ефекти Баби у моделі підшкірних ксенотрансплантатів в комбінації з цетуксимабом у мишей

Клітинна лінія Раби плоскоклітинного раку голови та шиї (ЗССНМ), яку культивували в середовищі ЕРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну і стрептоміцину, була доведена до концентрації 5х107 клітин/мл за допомогою збалансованого сольового розчину Хенкса. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну ділянку правого боку безтимусних мишей віком 7 тижнів (САпМ.Сд-Бохпіпи/Стісті), самиці, Спагіев Кімег Гарогайюгіез дарап Іпс.). Через десять днів після введення клітини, найкоротший та найдовший діаметр пухлини у кожної миші вимірювали за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (Оідітаїйіс " саїїрег, Мішоуо

Согрогаїйоп) для розрахунку об'єму пухлини за наступною формулою розрахунку:

Об'єм пухлини (мм3) - Найдовший діаметр (мм) х Найкоротший діаметр (мм) х Найкоротший діаметр (мм)/2

Регресія пухлини 35 (95) - (1- КТМ на 35-й день) х 100

Безпосередньо перед введенням основний розчин розбавляли фізіологічним розчином з 100 мкм гідроксипропіл-В-циклодекстрину. Кожен тестований зразок вводили внутрішньовенно в дозах від 1/4 МТО до 1/2 МТО в комбінації з цетуксимабом (Егрійх, МегоК Зегопо Со., ца.) В даному випадку експеримент проводився в групах, кожна з яких складалася з 4 мишей. Регресія

Зо пухлини на 35-й день (95) застосування кожної тестованої сполуки показана в Таблиці 7.

Таблиця 7 нижня жининининш нини 1100 |10025 | (МБ 20... | 77777727 пил и о т Я От ПО

Приклад фармакологічного тесту 8. Протипухлинна активність відносно КРІ-4 у моделі підшкірних ксенотрансплантатів в комбінації з трастузумабом у мишей

Клітинна лінія КРІ-4 НЕН-2 позитивного раку молочної залози, яку культивували в середовищі ЕРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну і стрептоміцину, була доведена до концентрації 1х108 клітин/мл за допомогою збалансованого сольового розчину Хенкса для отримання клітинної суспензії. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну ділянку правого боку безтимусних мишей віком 7 тижнів (САпПМ.Сд-Рохпіпи/СтісСті), самиці, Спагіеєв5 Кімег

І арогагогіех Одарап, Іпс.). Через шістнадцять днів після введення клітини, найкоротший та найдовший діаметр пухлини у кожної миші вимірювали за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (Оідіптайіс" саїїрег, Мішіоуо Согрогайоп) для розрахунку об'єму пухлини за наступною формулою розрахунку:

На основі об'ємів пухлин, отриманих в перший день введення, мишей згрупували таким чином, щоб середні об'єми пухлин були по суті рівними серед груп. Експеримент проводився в групах, кожна з яких складалася з б мишей. Кожну тестовану сполуку розчиняли в ОМ5О і розчин зберігали в морозильній камері перед використанням. Безпосередньо перед введенням основний розчин розбавляли фізіологічним розчином . Тестовану сполуку внутрішньовенно вводили в дозі 0,09 мг/кг або 0,18 мг/кг в комбінації з трастузумабом (Негсеріїйп, Сепепіеснп, Іпс.).

Регресія пухлини у випадку застосування Сполуки (1) показана в Таблиці 8.

Таблиця 8 лого

Сполука) ///////17777171110009. ЇЇ ни тт: Я ПО ТО ПО: ХТО вм 11111111 -11111117111111111111871 них Ж Я ПО Те пох ПО т по

Приклад фармакологічного тесту 9. Вплив на СОЗ31-позитивну судину на підшкірній моделі

Еаби у мишей

Клітинна лінія Раби плоскоклітинного раку голови та шиї (ЗССНМ), яку культивували в середовищі ЕРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну і стрептоміцину, була доведена до концентрації 5х107 клітин/імл за допомогою РВ5 для отримання клітинної суспензії. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну ділянку правого боку безтимусних мишей віком 7 тижнів (САпПМ.Сд-Бохп1пи/СтісСті), самиця, Спагез Кімег І арогайогіез дарап, Іпс.). Через десять днів після введення клітини, тестовану сполуку у фізіологічному розчині з 100 мкм гідроксипропіл-В-дциклодекстрину внутрішньовенно вводили в дозах від 1/2 МТО до МТО.

Експеримент проводився у групах, кожна з яких складалася з З мишей. Через п'ять днів після введення зразки пухлини збирали і фіксували за допомогою фіксатора ІНС 7іпс Ріхайїме (ВО

РПпапгтіпдеп) при 4 "С протягом 24 годин. Залиті парафіном зразки тканини розрізали (3 мкм), встановлювали на позитивно заряджені предметні скельця і сушили на повітрі. Імуногістохімічне забарвлення СОЗ31 здійснювалося за допомогою моделі Мепіапа ашовіаїпег бібхсомег ХТ (Коспе

Ріадповіїс5) відповідно до протоколу виробника. Зрізи депарафінізували, кондиціонували і антигени витягували за допомогою СС1 (Мепіапа Медіса! Зузіет5). Предметні скельця блокували за допомогою Блокатора А і Блокатора В (набір для блокування ендогенного біотину,

Коспе Оіадповііс5). Анти-мишаче антитіло щура дс СО31 (Оіапома СтрН) застосовували в концентрації 2 мкг/ мл. Зрізи інкубували за допомогою антитіла протягом 6 годин з наступною

З2-хвилинною інкубацією біотинільованим антищурячим оантитілом ІдсС /(Часк5оп

ІптітипоКезеагсп Іарогаїогіе5) в концентрації 2,2 мкг/мл. Виявлення здійснювалося за

Зо допомогою стрептавідину-«НКР О протягом 16 хвилин з подальшою інкубацією з ПОАВ О і ВАВ

НО» 0 (набір ОАВМар, Мепіапа Медіса! Зузіетв, Іпс) протягом 8 хвилин. Предметні скельця дозабарвлювали гематоксиліном І (Коспе Оіадповіїс5) протягом 16 хвилин з подальшою інкубацією реагентом Віціпд протягом 4 хвилин. Зрізи зневоднювали у фракціях етанолу, знежирювали при заміні ксилолу і покривали ОРХ (Мегск КоаА).

Імунозабарвлені предметні скельця сканували за допомогою автоматичної візуалізації предметного скла Месіга 2 (РегКіп ЕІтег Іпс.). Кількість кровоносних судин у всій пухлини визначали кількісно шляхом підрахунку СОЗ31-позитивних об'єктів з використанням програмного забезпечення іпРопт 2 (РегкіпЕІтег Іпс.). Площу ділянки пухлини вимірювали шляхом оцінки площі забарвлення гематоксиліном за допомогою програмного забезпечення Іпїогт 2 (РегкіпЕІптег Іпс.). Кількість кровоносних судин нормалізувався, виходячи з площі ділянки пухлини. Швидкість збільшення кількості кровоносних судин в групі, що отримувала тестовану сполуку, була розрахована за наведеною нижче формулою і показана в Таблиці 9.

Коефіцієнт збільшення кількості кровоносних судин (95) - (кількість кровоносних судин в групі що приймала тестовану сполуку - кількість кровоносних судин в контрольній групі)кількість кровоносних судин в контрольній групі)х100

Таблиця 9 судин (95) 1 00511171111111111111111189111111

Сполука) ///////СЇ7777171110Мо 7 17777111111111111111111691111111ссСсС2С нншинижниннинишиш упишили

Приклад фармакологічного тесту 10. Вплив на 6-ЗМА позитивні-САЕ в підшкірній моделі

Еаби

Клітинна лінія Раби плоскоклітинного раку голови та шиї (ЗССНМ), яку культивували в середовищі ЕРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну і стрептоміцину, була доведена до концентрації 5х107 клітин/імл за допомогою РВ5 для отримання клітинної суспензії. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну ділянку правого боку безтимусних мишей віком 5 - 6 тижнів (САпПМ.Сд-Бохпіпи/СтіСті), самиці, Спагіез Кімег Гарогаїогіеєз дарап, Іпс.). Через десять днів після введення клітини, тестовану сполуку в сольовому розчині з 100 мкм гідроксипропіл-В-дциклодекстрину внутрішньовенно вводили в дозі 1/2 МТО апа мто.

Експеримент проводився у групах, кожна з яких складалася з З мишей. Через два дні після введення, зразки пухлини збирали і фіксували за допомогою фіксатора ІНС 7іпс Ріхаїме (ВО

Рпаптіпдеп) при 4 "С протягом 24 години. Залиті парафіном зразки тканини розрізали (З мкм), встановлювали на позитивно заряджені предметні скельця і сушили на повітрі протягом 6 годин.

Імуногістохімічне забарвлення а-5МА здійснювалося за допомогою моделі Мепіапа ашовзіаїіїпег

Оізсомег ХТ (Коспе Оіадпозвіїс5). Зрізи депарафінізували, кондиціонували і антигени витягували за допомогою патентованих буферів, ЕРгер і СС1 (Мепіапа Медіса! Зувіет5). Мишаче моноклональне антитіло проти 4-ЗМА, кон'юговане лужною фосфатазою (клон 1А4, 5ідта), застосовували в концентрації 5 мкг/мл. Зрізи інкубували за допомогою антитіла протягом 6 годин. Виявлення здійснювалося за допомогою набору Кеамар (Мепіапа Медіса! Зуєіетв, Іпс).

Зрізи зневоднювали у фракціях етанолу, знежирювали при заміні ксилолу і покривали ОРХ (Мегск Коса). Серійні пухлинні зрізи депарафінізували та забарвлювали гематоксиліном

Майєра (Мшо Риге СпетісаІ5) протягом 1 хвилини. Зрізи зневоднювали у фракціях етанолу, знежирювали при заміні ксилолу і покривали ОРХ (Мегск Коад).

Імунозабарвлені предметні скельця сканували за допомогою автоматичної системи візуалізації предметного скла Месіга 2 (РегКкіп ЕІтег Іпс.). Площа а-5МА-позитивної ділянки у всій пухлині визначалася кількісно шляхом підрахунку а-ЗМА-позитивних об'єктів за допомогою програмного забезпечення іпРогт 2 (РегкіпЕІтег Іпс.). Площу ділянки пухлини вимірювали

Зо шляхом оцінки площі забарвлення гематоксиліном за допомогою програмного забезпечення іпРогт 2 (РежіпЕЇІтег Іпс.). Площа а-5МА-позитивної ділянки була нормалізована, виходячи з площі ділянки пухлини. Ступінь пригнічення а-ЗМА-позитивної ділянки в групі, що приймала тестовані сполуки, була розрахована за наведеною нижче формулою, що показана в Таблиці 10.

Таблиця 10 о 60611113 ве 11111128

Коефіцієнт пригнічення а-5МА позитивної ділянки (о) - - (4-ЗМА позитивна ділянка в групі, що приймала тестовану сполуку - а-ЗМА позитивна ділянка в контрольній групі) / С-З5МА позитивна ділянка в контрольній групі) х 100

Приклад фармакологічного тесту 11. Модель ортотопічної трансплантації НеС-2 у мишей

Трансдуковані люциферазою клітини НеС-2-їис були створені шляхом ретровірусного перенесення генів. Спочатку фрагмент ДНК, що кодує люциферазу світлячка, був отриманий з плазміди рої З-енхансера (СепВапк Ж: 047297) і субклонований у ретровірусний вектор реХ4риг (СепВапк Ж: АВО86386). Потім були отримані рекомбінантні ретровіруси без хелперів шляхом трансфекції вищезазначеної ретровирусної експресії вектора разом з плазмідами роОР і рЕ-

Атрпо (Такага Віо; Зпіда, Японія) в клітини 2937 (АТСОС; Мапаззаз, США). Потім клітини НЗСОС-2 інфікували рекомбінантними ретровірусами і культивували протягом двох тижнів в присутності пуроміцину (2 мкг/мл). Інфіковані клітини були відібрані з поліклональної проліферативної популяції культури.

Під анестезією клітинну лінію 5ССНМ людини, НеС-2-іис, вводили в язик самиць безтимусних мишей (1х106 клітин в 50 мкл РВ5) віком 6 тижнів (миші САпПМ.Сд-Рохпіпи/Стісті);

Спагіе5 Кімег, Іпс.; Зпі2иоКка, дарап). Через сім днів після трансплантації об'єм пухлини аналізували за допомогою біолюмінесцентного сигналу від клітин Не5С-2-І ис. Для біолюмінесцентної візуалізації 0,1 мл 15-мг/імл ЮО-люциферину (Рготеда, Мааїізоп, УМ) внутрішньоочеревинно вводили безтимусним мишам із застосуванням інгаляційної ізофлуранової анестезії від 1 до 2 95. Біолюмінесцентний сигнал контролювали за допомогою системи візуалізації серії ІМІЗ 5РЕСТКОМ (РегїкіпЕЇІтег, Умайптат, МА), що складається з високочутливої охолоджувальної камери із пристроєм зарядового зв'язку Програмне забезпечення і іміпд Ітаде (РегкіпЕЇІтег, Умакпат, МА) використовувалося для побудови сітки даних візуалізуючих обстежень та поширення загального біолюмінесцентного сигналу на кожну обстежувану ділянку (КОЇ). Всі біолюмінесцентні зображення, були отримані з експозицією 1 секунда. Дані були проаналізовані шляхом повного випромінювання потоку фотонів (фотонів на секунду) у обстежуваних ділянках.

На основі загального випромінювання потоку фотонів, отриманого в перший день введення, мишей згрупували таким чином, щоб середні значення загального випромінювання потоку фотонів були по суті однаковими серед груп. Сполука (1) або цисплатин внутрішньовенно вводили з цетуксимабом або без нього (Егрйих, Мегок Зегопо Со., На.) один раз на тиждень протягом З тижнів (режим введення О7Ох3). Два експерименти були проведені за допомогою ідентичної процедури, і всі дані були зібрані з експериментів. Кожна група складалася з 16 мишей.

Дані візуалізації показали, що лише завдяки лікуванню Сполукою (1) з цетуксимабом, чітко знижувався біолюмінесцентний сигнал у всіх мишей після 14-го дня (Фігура 6-68). Середній час виживання (М5Т) розраховували відносно кожної групи лікування як середнє значення щодо днів смерті. Збільшення тривалості життя (1/5) розраховували за такою формулою: ІЗ (95) -

Зо (М5Т тварин, яких лікували тестованою сполукою - М5Т контрольних тварин) / М5Т контрольних тваринх 100. ІІ. 5 (95) кожної тестованої сполуки показано в Таблиці 11.

Таблиця 11 ниинжишиІшининнннинниншишш:: пиши

Щисплатино/////Ї 175 ЇЇ 77777710 нивпиипшининннининишишишиши сли

Сполука() | 009 | (Мк - ЇЇ 77777777777717171723881 1110 17009 | 11175 | 55оССсСсС

Приклад фармакологічного тесту 12. Підшкірна ксенотрансплантатна модель Баби у поєднанні з випромінюванням

Трансдуковані клітини люциферази Рари- ис були створені за допомогою ретровірусного перенесення генів. Спочатку фрагмент ДНК, що кодує люциферазу світлячка, був отриманий з плазміди рої З-енхансера (База генетичних даних Мо: Ш47297) і субклонований у ретровірусний вектор рСХа4риг (База генетичних даних Мо: АВО86386). Потім були отримані рекомбінантні ретровіруси без хелперів шляхом трансфекції вищезазначеного ретровірусного вектора експресії разом з плазмідами роР і рЕ-Атрпо (ТакКага Віо; Зпіда, Ударап) в клітини 293Т (АТСОС;

Мапаззаз, США). Потім клітини Раби інфікували рекомбінантними ретровірусами і культивували протягом двох тижнів за наявності пуроміцину (2 мкг/мл). Інфіковані клітини були відібрані з поліклональної проліферативної популяції культури.

Трансдукована люциферазою клітинна лінія Рари-Гис 5ССНМ людини, яку культивували в середовищі КРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5 і пеніциліну та стрептоміцину, була доведена до концентрації 5х107 клітин/мл за допомогою збалансованого сольового розчину Хенкса для отримання клітинної суспензії. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили в підшкірну частину правого стегна безтимусних мишей протягом 6 тижнів (САпПМ.Сд-Рохпіпи/Стісті), самиці, Спагієб

Вімег І арогафогіех дарап, Іпс.). Через тринадцять днів після введення клітин об'єм пухлини аналізували за допомогою біолюмінесцентного сигналу від клітин Рари-І ис. Для біолюмінесцентної візуалізації 0,1 мл 15-мг/імл ЮО-люциферину (Рготеда, Мааїізоп, УМ)

внутрішньоочеревинно вводили безтимусним мишам із застосуванням від 1 до 2 95 інгаляційної ізофлуранової анестезії. Біолюмінесцентний сигнал контролювали за допомогою системи візуалізації серії ІМІЗ БРЕСТКИМ (РегкіпЕІтег, Умайпат, МА), що складається з високочутливої охолоджувальної камери із пристроєм зарядового зв'язку. Програмне забезпечення І іміпд Ітаде (РегкіпЕІтег, Умактат, МА) використовувалося для побудови сітки даних візуалізуючих обстежень та поширення загального біолюмінесцентного сигналу на кожну обстежувану ділянку (КОЇ). Всі біолюмінесцентні зображення, були отримані з експозицією 1 секунда. Дані були проаналізовані шляхом повного випромінювання потоку фотонів (фотонів на секунду) у обстежуваних ділянках. Загальне випромінювання потоку фотонів було розраховано за такими формулами розрахунку:

Відносний рівень біолюмінесценції - Загальне випромінювання потоку фотонів (день Х) /

Загальне випромінювання потоку фотонів (перший день)

Регресія пухлини ( 95) - (1 - мінімальний відносний рівень біолюмінесценції) х 100

На основі загального випромінювання потоку фотонів, отриманого в перший день введення, мишей згрупували таким чином, щоб середні значення загального випромінювання потоку фотонів були по суті однаковими серед груп. Експеримент проводився на групах, кожна з яких складалася з б мишей. Сполуку (1) вводили шляхом ін'єкції в хвостову вену на 1-й і 8-й день.

Опромінення проводили на рівні 18 Гр на 4-й їі 11-й день. Регресія пухлини при застосуванні

Сполуки (1) показана в Таблиці 12.

Таблиця 12

Ех НИ ПЕ со НС СН ши я с є ТЯ ПОЛ КС ПО

Сполука) | 7/1 009 1.777770 недо п ПЕ ПО М: ОО ПО У

Приклад фармакологічного тесту 13. Протипухлинна активність у сингенній підшкірній моделі СТ26 у поєднанні з антитілом проти тРО-1 у мишей

Мишача недиференційована клітинна лінія раку товстої кишки СТ26б, яку культивували в середовищі ЕРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну і стрептоміцину, була доведена до концентрації 2х107 клітин/мл за допомогою збалансованого сольового розчину Хенкса для отримання клітинної суспензії. У 1-й день клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили в підшкірну частину правого боку білих мишей віком 6 тижнів (ВАГ! В/сАпМстісСтіЇ, самиці, Спагев

Кімег Гарогайгіе5 дарап, Іпс.). Через два дні після введення клітин, мишей випадковим чином

Зо поділили на чотири групи, і кожна група складалася з 8 мишей. Найкоротший діаметр і найдовший діаметр пухлини у кожної миші вимірювали за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (Оідіптайіс "мМ саїЇїрег, Мішоуо Согрогаїйоп), для розрахунку об'єму пухлини за наступною формулою розрахунку:

Т/С « (середній об'єм пухлини в групі, що проходила лікування)// середній об'єм пухлини в контрольній групі)

Інгібування росту пухлини ( 95) - (1-Т/С)х100

Тестовану сполуку вводили внутрішньовенно в дозі 0,09 мг/кг на 3-й день і на 11-й день.

Антитіло проти тРО-1 (ВЕО146, Віо Х СеїІ) вводили внутрішньовенно в дозі 10 мг/кг на 3-й, 7-й, 11-й ї 15-й день. Інгібування росту пухлини на 15-й день (95) при застосуванні кожної тестованої сполуки показано в Таблиці 13.

Таблиця 13 (мг/кг) до 111 -Г11ло111111111111132с1

Сполука) | 009 | (к - Її 777777777777171717178011111171 недо ж: ПО ГПО ПО с ЗО

Приклад фармакологічного тесту 14. Вплив на полімеризацію тубуліну іп міго (Фігура 10А)

Набір для аналізу полімеризації тубуліну був придбаний у СуїозкКеїенсп, Іпс. (Саї. Ж ВКО11Р).

Набір містив 1 флакон ліофілізованого білка тубуліну, очищеного від головного мозку свині, З пробірки ліофілізованого ГТФ, 2 флакона ліофілізованого аналітичного буферу і 1 флакон тубулін гліцеринового буферу. Аналітичний буфер отримували шляхом розчинення вмісту в 10 мл деїіонізованої і стерилізованої води. Цей розчин містив 80 ммоль/л піперазину-М,М'-біс(2- етансульфонової кислоти|сесквінатрієвої солі, 2,0 ммоль/л хлориду магнію, 0,5 ммоль/л етиленгліколь-біс(2-аміноетілового ефіру) М,М,М',М'-тетраоцтової кислоти, рН 6,9 ії 10 мкмоль/л флуоресцентного репортера. Буфер зберігали при -70 "С до використання. Тубулін гліцериновий буфер складався з 80 ммоль/л піперазину-М,М'-біс|2-етансульфонової кислоти|сесквінатрієвої солі, 2,0 ммоль/л хлориду магнію, 0,5 ммоль/л етиленгліколь-біс(2-аміноетілового ефіру)

М,М,М',М'-тетраоцтової кислоти і 60 95 об./об. гліцерину, рН 6,9. Його зберігали при 4 "С до використання. Основний розчин ГТФ отримували шляхом розчинення вмісту кожної пробірки в 100 мкл деїіонізованої і стерилізованої води до досягнення концентрації 100 ммоль/л ГТФ.

Аліквоти цього основного розчину зберігали при -70 "С до використання. Основний розчин тубуліну (10 мг/мл) отримували шляхом розчинення порошку тубуліну з додаванням 1,1 мл суміші аналітичного буфера і основного розчину ГТФ (100:1, об./06.). Аліквоти заморожували в рідкому азоті, а потім зберігали при -70 "С до використання.

В аналізі полімеризації тубуліну, реакційну суміш отримували шляхом змішування 820 мкл аналітичного буферу, 17,6 мкл вихідного розчину ГТФ і 600 мкл тубулін гліцеринового буферу.

Реакційну суміш (1015 мкл) поєднували з 240 мкл вихідного розчину тубуліну. Цей розчин називали тубулінововою реакційною сумішшю і використовували для вимірювання пробних та контрольних ямок. Тубулінову реакційну суміш не отримували шляхом змішування 89,85 мкл реакційної суміші і 21,25 мкл аналітичного буферу для вимірювання порожніх ямок. Розчин сполуки (1) (6,25-100 мкмоль/л; кінцеві концентрації 0,625-10 мкмоль/л) або носій додавали при 5 мкл в окремі ямки 96-ямкового мікротитраційного планшета з половинним об'ємом ямок.

Тубулінову реакційну суміш або реакційну суміш без тубуліну додавали при 45 мкл в кожну ямку планшета. Випромінювання флуоресценції при 460 нм (довжина хвилі збудження при 360 нм) вимірювали кожні 2 хвилини протягом 90 хвилин за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів зресгаМах? /М5е (МоІесшаг Оемісев). Полімеризація тубуліну супроводжувалася посиленням флуоресценції внаслідок включення репортера флуоресценції в

Зо мікротрубочки в міру того, як відбувалася полімеризація. Аналіз був виконаний в двох паралельних випробуваннях. Аналіз продемонстрував, що Сполука (1) інгібує полімеризацію тубуліну залежним від концентрації чином. Інтенсивність флуоресценції в кожній часовій точці розраховували за такими формулами:

Інтенсивність флуоресценції - вимірювання середньої флуоресценції в пробних або контрольних ямках - - вимірювання середньої флуоресценції в порожніх ямках; порожня ямка: з носієм без тубуліну; контрольна ямка: з носієм і тубуліном; пробна ямка: зі сполуками і тубуліном.

Приклад фармакологічного тесту 15. Аналіз динаміки мікротрубочок на основі клітин (Фігура 108)

Аналіз динаміки мікротрубочок (МТ) на основі клітин проводили за допомогою клітинної лінії остеосаркоми 0205-ЕВ3-АС, в якій злитий білок ЕВЗ |(мікротрубочка плюс кінцевий зв'язувальний білок) і А7аті-стеєп (ЕВЗ-АС) були стабільно експресовані. Клітини 0205-ЕВЗ-

АС культивували в середовищі КРМІ-1640, що містить 10 95 ЕВ5 і пеніцилін-стрептоміцин, при 37 "С в зволоженій атмосфері з 5 95 СО». Динаміка МТ в живих клітинах може бути візуалізована як рух кометоподібної структури ЕВ3-АС. Клітини 0О205-ЕВЗ-АС, поміщені на скляні чашки для культивування (чашка ЕЛМІЕМУ, АОС Тесппо Сіав55, Японія), обробляли сполукою (1) у зазначеній концентрації, а динаміку мікротрубочок контролювали за допомогою покадрової візуалізації з використанням флуоресцентного мікроскопа з імерсійним об'єктивом з 60-кратним збільшенням (82-Х710, КЕУЕМСЕ, Японія). Статичні зображення в зазначені моменти часу були представлені на Фігурі 108. Види з більшим збільшенням закритих ділянок були показані на входах. При обробці Сполукою (1) при 0,5 нМ (значення ІСзо для антипроліферативної активності в клітинах 205-ЕВЗ-АС) кометоподібні структури стає важко помічати приблизно через 60 хвилин після додавання сполуки. Ці результати ясно продемонстрували, що Сполука (1) має здатність пригнічувати динаміку МТ.

Приклад фармакологічного тесту 16. Антипроліферативна активність іп міїго (Рідиге 11)

Антипроліферативні аналізи Сполуки (1) іп міго проводили з використанням невеликої панелі ліній ракових клітин, включаючи плоскоклітинного раку стравоходу людини (ОЕ21, ТЕ-8), аденокарциноми стравоходу людини (ОЕЗ33) і саркоми матки людини (МЕ5З-5А, МЕ5-5А-ОхХ5-

ЕХІ1). Всі клітинні лінії культивували в середовищі КРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніцилін- 60 стрептоміцину (середовище культивування) в інкубаторі з 5 956 СО» (37 "С). У кожну ямку 96-

ямкового планшета (Весіоп, Оіскіпбоп апа Сотрапу, 353219) додавали 75 мкл клітинної суспензії, доведеної до концентрації 4х107 клітин/мл у середовищі для культивування, і клітини інкубували протягом ночі протягом 5 годин в інкубаторі з 5 956 СО» (37 "С). Наступного дня в кожну ямку додавали 25 мкл Сполуки (1) в серіях трикратних розведень, суспендованої в середовищі для культивування, і отриманий продукт інкубували протягом 72 годин в інкубаторі з 5 95 СО (37 "С). Потім життєздатність клітин визначали шляхом люмінесцентного аналізу життєздатності клітин СеїїТйег-СіоФ (Рготеда) за допомогою багатоканального зчитувача

Епмівіоп "м 2013 (Регкіп-ЕІтег, УеПевіеу, МА). Значення ямок, що містять клітини без додавання тестованих сполук, було визначено як 100 95, а значення ямок, що не містять клітин, було визначено як 0 95. Концентрація Сполуки (1), необхідна для інгібування росту клітин на 50 95 (тобто значення Со), була розрахована і показана на Фігурі 11. Чутливість до Р-ар розраховували як співвідношення значення ІСво в клітинах МЕ5-5А-Юх5-ЕХ1, що надекспресує

Р-др, до значення ІСзхо в клітинах МЕ5-5А.

Приклад фармакологічного тесту 17. Протипухлинні ефекти у ксенотранслантатних моделях

КРІ-4 у мишей як монотерапія; Протипухлинні ефекти у ксенотранслантатних моделях СОЇ О- 704 у мишей як монотерапія (Фігура 12)

Клітинна лінія КРІ -4 НЕВ-2 позитивного раку молочної залози людини, яку культивували в середовищі ЕРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну-стрептоміцину, була доведена до концентрації 1х108 клітин/мл за допомогою збалансованого сольового розчину Хенкса для отримання клітинної суспензії. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну ділянку правого боку безтимусних мишей віком 8 тижнів (САпПМ.Сд-Рохпіпи/СтісСті), самиці, Спагіеєв5 Кімег

І арогафогіеєз дарап, Іпс.). Через одинадцять днів після введення клітини (День 1), найкоротший та найдовший діаметр пухлини у кожної миші вимірювали за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (Оідітайіс" саїїрег, Мішіоуо Согрогайоп) для розрахунку об'єму пухлини за наступною формулою розрахунку:

Об'єм пухлини (мму) - Найдовший діаметр (мм) х Найкоротший діаметр (мм) х Найкоротший діаметр (мм)/2

Відносний об'єм пухлини (КТ) - Об'єм пухлини (день Х) / Об'єм пухлини (перший день)

Відносна маса тіла (КВУМ) - Маса тіла (день Х) / Маса тіла (перший день)

На основі об'ємів пухлин, отриманих в 1-й день введення, мишей згрупували таким чином, щоб середні об'єми пухлин були по суті рівними серед груп. Експеримент проводився в групах, кожна з яких складалася з шести мишей. Тестовану сполуку розчиняли в ЮМ5О і розчин зберігали в морозильній камері перед використанням. Безпосередньо перед введенням основний розчин розбавляли фізіологічним розчином. Тестовану сполуку у фізіологічному розчині внутрішньовенно вводили раз на тиждень протягом 2-х тижнів в дозі 20 мкг/кг, 60 мкг/кг або 180 мкг/кг (на 1-й і на 8-й день). Регресія пухлини спостерігалася в групах, що приймали по 60 мкг/кг та 180 мкг/кг сполуки та при введенні 180 мкг/кг сполуки ксенотрансплантатні пухлини повністю усувалися у всіх мишей на 15-й день.

Клітинна лінія СОЇ О-704 раку яєчників людини, яку культивували в середовищі ЕРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну-стрептоміцину, була доведена до концентрації 1 х1089 клітин/мл за допомогою збалансованого сольового розчину Хенкса для отримання клітинної суспензії.

Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну ділянку правого боку безтимусних мишей віком 5 тижнів (САпМ.Сд- Рохпіпи/СтіСті), самиці, Спапез Вімег І арогаюгтез дарап Іпс.).

Через дев'ять днів після введення клітини (День 1), найкоротший та найдовший діаметр пухлини у кожної миші вимірювали за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (Оідітайіс" саїрег, Міїшоуо Согрогайоп) для розрахунку об'єму пухлини за наступною формулою розрахунку:

На основі об'ємів пухлин, отриманих в 1-й день введення, мишей згрупували таким чином, щоб середні об'єми пухлин були по суті рівними серед груп. Експеримент проводився в групах, кожна з яких складалася з шести мишей. Тестовану сполуку розчиняли в ЮМ5О і розчин зберігали в морозильній камері перед використанням. Безпосередньо перед введенням основний розчин розбавляли в сольовому розчині. Тестовану сполуку в сольовому розчині внутрішньовенно вводили раз на тиждень протягом 2-х тижнів в дозі 20 мкг/кг, 60 мкг/кг або 180 мкг/кг (на 1-й і на 8-й день). Лікування сполукою викликало регресію пухлини на рівні 180 мкг/кг та затримку росту пухлини на рівні 6бО мкг/кг При введенні 180 мкг/кг сполуки бо ксенотрансплантатні пухлини повністю усувалися у всіх мишей на 22-й день.

Приклад фармакологічного тесту 18. Вплив на СОЗ31-позитивний посудину на підшкірної моделі Раби у мишей (Фігура 13)

Клітинна лінія Раби плоскоклітинного раку голови та шиї (5ССНМ), яку культивували в середовищі КРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну-стрептоміцину (середовище для культивування), була доведена до концентрації 5х107 клітин/мл за допомогою середовища для культивування з метою отримання клітинної суспензії. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну частину правого боку безтимусних мишей віком б тижнів (САпМ.Са-

Еохпіпиш/СтісСті), самиці, Спагіе5 Кімег І абогафогіе5 Ударап, Іпс.). Через десять днів після введення клітини, мишей згрупували таким чином, щоб середні об'єми пухлин були по суті рівними серед груп. Експеримент проводили в групах, кожна з яких складалася з б мишей. Кожну тестовану сполуку розчиняли в ЮОМ5О і розчин зберігали в морозильній камері перед використанням.

Безпосередньо перед введенням основний розчин розбавляли фізіологічним розчином.

Тестовану сполуку у фізіологічному розчині внутрішньовенно вводили в дозі 20 мкг/кг, 60 мкг/кг або 180 мкг/кг. Через п'ять днів після одноразового введення, зразки пухлини збирали і фіксували за допомогою фіксатора ІНС 2іпс Ріхаїйме (ВО Рпаптіпдеп) при 4 "С протягом 24 годин. Залиті парафіном зразки тканини розрізали (3 мкм), встановлювали на позитивно заряджені предметні скельця і сушили на повітрі. Імуногістохімічне забарвлення СО31 здійснювалося за допомогою моделі Мепіапа ашобіаійпег Оізсомег ХТ (Коспе Оіадповіїсв5) відповідно до протоколу виробника. Зрізи депарафінізували, кондиціонували і антигени витягували за допомогою СС1 (Мепіапа Медіса! Зузіет5). Предметні скельця блокували за допомогою Блокатора А і Блокатора В (набір для блокування ендогенного біотину, Коспе

Оіадповійс5). Анти-мишаче антитіло щура ІдсС СО31 (Оіапома СтрН) застосовували в концентрації 2 мкг/мл. Зрізи інкубували за допомогою антитіла протягом 6 годин з наступною 32- хвилинною інкубацією біотинільованим антищурячим антитілом Ідс (Часкбоп ІттипоКезеагсп

І арогафогієз) в концентрації 2,2 мкг/мл. Виявлення здійснювалося за допомогою стрептавідину-

НЕР О протягом 16 хвилин з подальшою інкубацією з АВ О ії АВ НгО» О (набір ОАВМар,

Мепіапа Медіса! Зуєіет5, Іпс) протягом 8 хвилин. Предметні скла дозабарвлювали гематоксиліном ЇЇ (Коспе Оіадпобвііїс5) протягом 16 хвилин з подальшою інкубацією реагентом

ВіІніпд протягом 4 хвилин. Зрізи зневоднювали у фракціях етанолу, знежирювали при заміні

Зо ксилолу і покривали ОРХ (МегосК КобаА). Імунозабарвлені предметні скельця сканували за допомогою автоматичної системи візуалізації предметного скла МесігаФ 2 (Регкіп ЕІтег Іпс.).

Кількість кровоносних судин у всій пухлини визначали кількісно шляхом підрахунку СОЗ31- позитивних об'єктів за допомогою програмного забезпечення іпіог 2 (РегкіпЕІтег Іпс.). Площу ділянки пухлини вимірювали шляхом оцінки ділянки забарвлення гематоксиліном за допомогою програмного забезпечення іпїог 2 (РегКіпЕІтег Іпс.). Кількість кровоносних судин нормалізувалася, виходячи з площі ділянки пухлини. Завдяки одноразовому введенню тестованої сполуки в дозах 20, 60 і 180 мкг/кг, збільшилася кількість кровоносних судин пухлини.

Співвідношення кількості кровоносних судин в групах, які отримували тестовані сполуки, порівняно з групою, що не отримувала лікування, розраховували за такою формулою:

Співвідношення пухлинних судин - кількість кровоносних судин в групі, що приймала сполуку/ кількість кровоносних судин в групі, що не проходила лікування)

Приклад фармакологічного тесту 19. Вплив на а-5МА-позитивні САЕ у підшкірній моделі

Еаби у мишей (Фігура 14)

Клітинна лінія Раби плоскоклітинного раку голови та шиї (ЗССНМ), яку культивували в середовищі КРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну-стрептоміцину (середовище для культивування), була доведена до концентрації 5 х107 клітин/мл за допомогою середовища для культивування з метою отримання клітинної суспензії. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну частину правого боку безтимусних мишей віком б тижнів (САпМ.Сд-

Еохпіпиш/СтісСті), самиці, Спагіе5 Кімег І абогафогіе5 Ударап, Іпс.). Через десять днів після введення клітини, мишей згрупували таким чином, щоб середні об'єми пухлин були по суті рівними серед груп. Експеримент проводили в групах, кожна з яких складалася з 5 мишей. Кожну тестовану сполуку розчиняли в ЮОМ5О і розчин зберігали в морозильній камері перед використанням.

Безпосередньо перед введенням основний розчин розбавляли в сольовому розчині. Тестовану сполуку в сольовому розчині внутрішньовенно вводили в дозі 20 мкг/кг, 60 мкг/кг або 180 мкг/кг.

Через два дні або через 5 днів після одноразового введення, зразки пухлини збирали і фіксували за допомогою фіксатора ІНС 7іпс Ріхайме (ВО РІіаптіпдеп) при 4 "С протягом 24 годин. Залиті парафіном зразки тканини розрізали (3 мкм), встановлювали на позитивно заряджені предметні скельця і сушили на повітрі. Зрізи депарафінізували, кондиціонували і антигени витягували за допомогою мікрохвилі з 1 мМ ЕОТА при рн 6,0. Зрізи були блоковані за 60 допомогою 1 956 ВЗА в ТВ5. Мишаче моноклональне антитіло проти а0-З5МА, кон'юговане з лужною фосфатазою (клон 1А4, Зідта), застосовували в концентрації 5 мкг/мл. Зрізи інкубували за допомогою антитіла протягом 2,5 годин. Виявлення здійснювалося за допомогою набору субстратів Рабі гей ІІ! (Міспігеї Віозсіепсе Іпс.). Зрізи дозабарвлювали гематоксиліном Майєра (Мшо Риге СПетісаі5) протягом 50 секунд. Зрізи зневоднювали у фракціях етанолу, знежирювали при заміні ксилолу і покривали ОРХ (МегсК КсаА). Імунозабарвлені предметні скельця сканували за допомогою автоматичної системи візуалізації предметного скла Месіга 2 (Регкіп ЕІтег Іпс.о. Площа а-5МА-позитивної ділянки у всій пухлини визначалася кількісно шляхом підрахунку а-ЗМА-позитивних об'єктів за допомогою програмного забезпечення іпгог 2 (РегкіпЕЇІтег Іпс.). Площа пухлинної ділянки вимірювалася шляхом оцінки ділянки, забарвленої гематоксиліном, за допомогою програмного забезпечення іпіопт 2 (РегкіпЕЇІтег Іпс.). Площа а-

ЗМА-позитивної ділянки була нормалізована, виходячи з площі ділянки пухлини. Завдяки одноразовому введенню тестованої сполуки, значно зменшилася а-5МА-позитивна ділянка, при введенні доз 60 і 180 мкг/кг на день З і доз 180 мкг/кг на день 6. Рівень пригнічення а-5МА- позитивної ділянки у групі, що приймала тестовану сполуку, розраховували за наведеною нижче формулою:

Співвідношення с-5МА - Ділянка а-5МА в групі тестованої сполуки/ділянка а-ЗМА в групі, що не проходила лікування

Приклад фармакологічного тесту 20. Вплив на Тенасцин-С та ЕСА-фібронектин у підшкірній моделі Раби у мишей (Фігура 15)

Клітинна лінія Раби плоскоклітинного раку голови та шиї (ЗССНМ), яку культивували в середовищі КРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну-стрептоміцину (середовище для культивування), була доведена до концентрації 5х107 клітин/мл за допомогою середовища для культивування з метою отримання клітинної суспензії. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну частину правого боку безтимусних мишей віком б тижнів (САпМ.Са-

Еохпіпиш/СтісСті), самиці, Спагіе5 Кімег І абогафогіе5 Ударап, Іпс.). Через десять днів після введення клітин, Через десять днів після введення клітини, мишей згрупували таким чином, щоб середні об'єми пухлин були по суті рівними серед груп. Експеримент проводили в групах, кожна з яких складалася з 5 мишей. Сполуку (1) розчиняли в ОМ5О і розчин зберігали в морозильній камері перед використанням. Сполуку (1) (180 мкг/кг) і цетуксимаб (СТХ, ЕгойихФ, МетгсК Зегопо Со.

Зо Ма.) (10 мг/кг) розбавляли фізіологічним розчином і внутрішньовенно вводили в 1-й день 1.

Через п'ять днів після одноразового введення, зразки пухлини збирали і фіксували за допомогою фіксатора ІНС 7іпс Ріхайме (ВО РПпагтіпдеп) при 4 "С протягом 24 годин. Залиті парафіном зразки тканини розрізали (З мкм), встановлювали на позитивно заряджені предметні скельця і сушили на повітрі. Зрізи депарафінізували, кондиціонували і антигени витягували за допомогою мікрохвилі з 1 мМ ЕОТА при рН 6,0 відносно Тенасцину-С. У випадку ЕВА- фібронектину, процедура витягування антигенів не була потрібною. Зрізи інкубували за допомогою блокувального розчину ВОХАЇ ЇЇ (Месіог арх) протягом 10 хв. для блокування ендогенної пероксидази, та за допомогою блокуючого реагента для мишачого Ід (мМесіог І арз) протягом 1 години, а потім за допомогою 2,5 95 звичайної кінської сироватки протягом 30 хвилин.

Для імуногістохімічного забарвлення Тенасцину-С, наносили 5 мкг/мл мишачого моноклонального антитіла проти Тенасцину-С (клон 4С8М5, ІВІ). Зрізи інкубували за допомогою антитіла протягом ночі при 4 "С. Для імуногістохімічного забарвлення ЕВА- фібронектину, наносили 1,5 мкг/мл мишачого моноклонального антитіла проти ЕОА- фібронектину (клон І5Т-9, Арсат). Зрізи інкубували за допомогою антитіла протягом 1 години при кімнатній температурі. Виявлення здійснювалося за допомогою пероксидазного полімерного набору ІтптРКЕ55 "М (Месіог І ар). Зрізи дозабарвлювали гематоксиліном Майєра (Мшо Риге

Спетіса!5) протягом 50 секунд. Зрізи зневоднювали у фракціях етанолу, знежирювали при заміні ксилолу і покривали ОРХ (Мегок КсаА). Імунозабарвлені предметні скельця сканували за допомогою автоматичної системи візуалізації предметного скла Месіга 2 (Регкіп ЕІптег Іпс.). Рівні експресії як Тенасцину-С, так і ЕО-А-фібронектину знижувалися при пухлинах, що піддавалися лікуванню Сполукою (1) та СТХ порівняно з контрольними пухлинами.

Приклад фармакологічного тесту 21. Протипухлинні ефекти в моделі підшкірного ксенотрансплантата Бари в поєднанні з цетуксимабом у мишей (Фігура 16)

Клітинна лінія Раби плоскоклітинного раку голови та шиї (ЗССНМ), яку культивували в середовищі КЕРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, та пеніциліну-стрептоміцину, була доведена до концентрації 5х107 клітин/мл за допомогою за допомогою збалансованого сольового розчину

Хенкса для отримання клітинної суспензії. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну ділянку правого боку бестимусних мишей (САпМ.Сд-Рохпіпи/стісті), самиці, віком 7 тижнів, Спагіе5 Кімег дарап Іпс.). Через десять днів після введення клітини (День 1), довжину та 60 ширину пухлини у кожної миші вимірювали за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (Мішоуо Согрогаїййоп), для розрахунку об'єму пухлини за наступною формулою розрахунку:

На основі об'єму пухлини, миші були були згруповані випадковим чином (день 1). Кожна група складалася з шести мишей. Сполуку (1) розчиняли в ЮМ5О і розчин зберігали в морозильній камері перед використанням. Сполуку (1) (20, 60 або 180 мкг/кг) і цетуксимаб (СТХ,

ЕгрійихФ, Мегск обБегопо Со., 14.) (10 мг/кгу розбавляли фізіологічним розчином (і внутрішньовенно вводили в 1-й день. Зміни КТМ в кожній групі показані на Фігурі 16. При дозах 180 мкг/кг і 60 мкг/кг протипухлинна ефективність Сполуки (1) з СТХ була вищою, ніж при монотерапії СТХ з регресією пухлини. Протипухлинна ефективність Сполуки (1) в дозах 20 мкг/кг в комбінації з СТХ, як правило, була вищою, ніж при монотерапії СТХ.

Приклад фармакологічного тесту 22. Протипухлинні ефекти в моделях ксенотрансплантата саркоми м'яких тканин у мишей як монотерапія (Фігура 17)

МЕ5-5А

Клітинна лінія МЕ5-5А саркоми матки людини, яку культивували в КРМІ-1640 з вмістом 10 95

ЕВ5, та пеніциліну-стрептоміцину, була доведена до концентрації 2х109 клітин/мл за допомогою за допомогою збалансованого сольового розчину Хенкса для отримання клітинної суспензії і суспензію змішували з Сейгехжб (Тпепто Різпег зсіепійіс Іпс., ЖА1413202) в співвідношенні 1:1 для отримання клітинної суспензії в концентрації 1х108 клітин/мл. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну частину правого боку безтимусних мишей, віком б тижнів (САпМ.Са-Рохпіпи/Стісті), самиці, Спагіез Кімег І арогайогієз дарап Іпс.). Через шість днів після введення клітини (День 1), найкоротший діаметр та найдовший діаметр пухлини у кожної міши вимірювали за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (Оідітайіс "м саїїрег, Мішоуо

Согрогаїйоп), для розрахунку об'єму пухлини за наступними формулами розрахунку:

Об'єм пухлини (мм) - Найдовший діаметр (мм) х Найкоротший діаметр (мм) х Найкоротший діаметр (мм)/2

Відносний об'єм пухлини (КТМ) - Об'єм пухлини (день Х)/Об'єм пухлини (перший день)

Зо На основі об'ємів пухлин, отриманих в 1-й день, мишей згрупували таким чином, щоб середні об'єми пухлин були по суті рівними серед груп. Експеримент проводився в групах, кожна з яких складалася з б мишей. Тестовану сполуку розчиняли в ОМ5О і розчин зберігали в морозильній камері перед використанням. Безпосередньо перед введенням основний розчин розбавляли фізіологічним розчином. Тестовану сполуку в фізіологічному розчині внутрішньовенно вводили раз на тиждень протягом 2 тижнів в дозі 180 мкг/кг (на 1-й і на 8-й день). Протипухлинна активність спостерігалася із затримкою росту пухлини в групі, що проходила лікування. нт-1080

Клітинна лінія НТ-1080 фібросаркоми людини, яку культивували у Е-МЕМ з вмістом 10 95

ЕВ5, МЕАА та антибіотиків, була доведена до концентрації 3х107 клітин/мл у середовищі для отримання клітинної суспензії. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну частину правого боку безтимусних мишей (САпМ.Сд-Рохпіпи/стісті), самиці, віком 6 тижнів, Спагієб5 Кімег

Уарап Іпс.). Через шість днів після введення клітин (День 1), довжину та ширину пухлини у кожної миші вимірювали за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (Міїшоуо

Согрогайіоп), для розрахунку об'єму пухлини за наступною формулою розрахунку:

На основі об'ємів пухлин, мишей згрупували випадковим чином (День 1). Кожна група складалася з шести мишей. Сполуку (1) розчиняли в ЮОМ5О і розчин зберігали в морозильній камері перед використанням. Сполуку (1) (180 мкг/кг) розбавляли фізіологічним розчином і внутрішньовенно вводили в 1-й день і на 8-й день. Зміни КТМ в кожній групі показані на Фігурі 17. Протипухлинна активність спостерігалася з регресією пухлини в групі, що проходила лікування.

Ста-2041

Фрагменти пухлини ангіосаркоми людини СТО-2041 були підшкірно імплантовані в лівий бік мишей-самиць. Ріст пухлини контролювали два рази в тиждень за допомогою цифрового штангенциркуля для розрахунку об'єму пухлини за наступною формулою розрахунку:

Об'єм пухлини (мм3) - Найдовший діаметр (мм) х Найкоротший діаметр (мм) х Найкоротший бо діаметр (мм)/2

Коли об'єм пухлин досягав приблизно 200 мм3, тварин відбирали за об'ємом пухлини в групу, що проходить лікування або контрольну групу і починали введення доз в перший день.

Кожна група складалася з п'яти мишей. Сполуку (1) розчиняли в ЮОМ5О і розчин зберігали в морозильній камері перед використанням. Сполуку (1) (100 мкг/кг) розбавляли фізіологічним розчином і внутрішньовенно вводили в 1-й день і на 8-й день. Зміни КТМ в кожній групі показані на Фігурі 17. Протипухлинна активність спостерігалася з регресією пухлини в групі, що проходила лікування.

Приклад фармакологічного тесту 23. Протипухлинні ефекти на моделях ксенотрансплантату саркоми раку ендометрія у мишей як монотерапія (Фігура 18)

НЕС-108

Клітинна лінія НЕС-108 раку ендометрія людини, яку культивували в Е-МЕМ, з вмістом 15 90

ЕВ5 і антибіотиків, була доведена до концентрації 7,14х107 клітин/мл в середовищі для отримання клітинної суспензії. Клітинну суспензію об'ємом 150 мкл вводили в підшкірну частину правого боку безтимусних мишей (САпМ.Сд-Рохпіпи / СтіСті), самиці, віком б тижнів, Спагіеб5

Кімег Ударап Іпс.). Через тринадцять днів після введення клітин (день 1) довжину і ширину пухлини у кожної миші вимірювали за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (Мішоуо Согрогаїййоп), для розрахунку об'єму пухлини за наступною формулою розрахунку:

На основі об'ємів пухлин, миші були випадковим чином згруповані (День 1). Кожна група складалася з шести мишей. Сполуку (1) розчиняли у ОМ5О та розчин зберігали у морозильній камері перед використанням. Сполуку (1) (180 мг/кг) розбавляли фізіологічним розчином і внутрішньовенно вводили в 1-й та 8-й день. Зміни КТМ у кожній групі показані на Фігурі 18.

Протипухлинна активність спостерігалася із затримкою росту пухлини в групі, що проходила лікування.

АМЗСА

Клітинна лінія АМЗСА раку ендометрія людини, яку культивували в Е-МЕМ з вмістом 10 95

Зо ЕВ5, та пеніциліну-стрептоміцину, була доведена до концентрації 1,4х1085 клітин/мл за допомогою збалансованого сольового розчину Хенкса для отримання клітинної суспензії та суспензію змішували Ссейгех? (Тпепто Різпег Зсіепійіс Іпс., ЖА1413202) у співвідношенні 1:1 для отримання клітинної суспензії в концентрації 7х107 клітин/мл. Клітинну суспензію об'ємом 100 мкл вводили у підшкірну частину правого боку безтимусних мишей, віком б років (САпМ.Са-

Еохпіпи/СтіСті), самиці, Спапев Кімег І арогаїогіеєє Чдарап Іпс.). Через дванадцять днів після введення клітини (День 1), найкоротший діаметр та найдовший діаметр пухлини у кожної миші вимірювали за допомогою електронного цифрового штангенциркуля (штангенциркуль

Оідітаййстм, Мішоуо Согрогаїйоп), для розрахунку об'єму пухлини за наступними формулами розрахунку:

На основі об'ємів пухлин, отриманих в 1-й день, мишей згрупували таким чином, щоб середні об'єми пухлин були по суті рівними серед груп. Експеримент проводився в групах, кожна з яких складалася з п'яти мишей. Тестовану сполуку розчиняли в ОМ5О і розчин зберігали в морозильній камері перед використанням. Безпосередньо перед введенням, основний розчин розбавляли фізіологічним розчином. Тестовану сполуку у фізіологічному розчині внутрішньовенно вводили один раз на тиждень в дозі 180 мг/кг протягом 2 тижнів (в 1-й день і на 8-й день). Протипухлинна активність спостерігалася з регресією пухлини в групі, що проходила лікування.

Приклад фармакологічного тесту 24. Аналіз інгібування росту МСІ-М87 та МКМ-28

У цьому аналізі вимірювали інгібуючу активність тестованих сполук в клітинних лініях МСІ-

М87 ії МКМ-28 раку шлунка людини, відповідно. Клітини МСІ-М87 і МКМ-28 вміщали в середовище КРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, пеніциліну і стрептоміцину, в інкубаторі з 5 95 СО»2 (37 "С). У кожну ямку 96-ямкового планшета (Весіоп, ОісКіпзоп апа Сотрапу, 353219) додавали 100 мкл клітинної суспензії МСІ-М87 або МКМ-28, доведеної до концентрації 3х1027 клітин/мл в середовищі для культивування, і клітини інкубували протягом ночі в інкубаторі з 5 956 СО» (37 С).

Наступного дня в кожну ямку додавали 100 мкл сполуки (1) або галіхондину В в серіях триразових розбавлень, суспендованих в середовищі для культивування, і отриманий продукт 60 інкубували протягом З днів в інкубаторі з 5 95 СО» (37 "С). Потім життєздатність клітин визначали шляхом люмінесцентного аналізу життєздатності клітин СейПТйег-сІотФ (Рготеда) за допомогою багатоканального зчитувача Епмізіоп 2103 (Регкіп-ЕІтег, УмеПевіІіеу, МА). Значення ямок, що містять клітини без додавання тестованих сполук, було визначено як 100 95, а значення ямок, що не містять клітин, було визначено як 0 95. Концентрації тестованої сполуки, необхідні для інгібування росту клітин на 50 95 (тобто значення ІСво), були розраховані і показані в Таблиці 14.

Таблиця 14 11101111 моенмву | мМкм28 7

Приклад фармакологічного тесту 25. Аналіз інгібування росту НиТи 80

У цьому аналізі була визначена інгібуюча активність тестованих сполук в клітинній лінії НиТи 80 раку тонкої кишки людини, яка була виділена з тканини дванадцятипалої кишки. Клітини

НиТи 80 вміщували в середовище ЕМЕМ з вмістом 10 95 ЕВ5, пеніциліну і стрептоміцину, в інкубаторі з 5 956 СО» (37 "С). У кожну ямку 9б-ямкового планшета (Весіоп, Ріскіпбоп апа

Сотрапу, 353219) додавали 100 мкл клітинної суспензії НиТи80, доведеної до концентрації

З3х107 клітин/мл у середовищі для культивування, і клітини інкубували протягом ночі в інкубаторі з 5 956 СО» (37 "С). Наступного дня в кожну ямку додавали 100 мкл сполуки (1) або галіхондрину

В в серіях триразових розбавлень, суспендованих в середовищі для культивування, і отриманий продукт інкубували протягом З днів в інкубаторі з 5 95 СО» (37 "С). Потім життєздатність клітин визначали шляхом люмінесцентного аналізу життєздатності клітин СейПТйег-Сіо?б (Рготеда) за допомогою багатошарового зчитувача Епмізіоп 2103 (РегКкіп-ЕІтег, У/еПевзієу, МА). Значення ямок з вмістом клітин без додавання тестованих сполук, було визначено як 100 95, а значення ямок без вмісту клітин було визначено як 0 95. Концентрації тестованих сполук, необхідні для інгібування росту клітин на 50 95 (тобто значення ІСво), були розраховані і показані в Таблиці 15.

Таблиця 15 11111111 нитиво777771

Приклад фармакологічного тесту 26. Аналіз інгібування росту ЗУУ780

У цьому аналізі була визначена інгібуюча активність тестованих сполук в клітинній лінії

ЗУУ780 раку уротелія. Клітини 5МУ780 вміщували в середовище АРМІ-1640 з вмістом 10 95 ЕВ5, пеніциліну та стрептоміцину в інкубаторі з 5 95 СО» (37 "С). У кожну ямку 96-ямкового планшета (Весіоп, ОісКіпбоп апа Сотрапу, 353219) додавали 100 мкл клітинної суспензії 5УУ780,

Зо доведеної до концентрації 3х107 клітин/мл у середовищі для культивування, і клітини інкубували протягом ночі у інкубаторі з 5 956 СО» (37 "С). Наступного дня, 100 мкл Сполуки (1) або

Галіхондрину В в серіях триразових розбавлень, суспендованих в середовищі для культивування, і отриманий продукт інкубували протягом З днів у інкубаторі з 5 956 СО» (37 "С).

Потім життєздатність визначали шляхом люмінесцентного аналізу життєздатності клітин сеї

Се Тпег-Сіо? (Рготеда) за допомогою багатоканального зчитувача Епмізіоп 2103 Миїшабеї

Веадег (Режіп-ЕЇІтег, УуеПезієу, МА). Значення ямок з вмістом клітин без додавання тестованих сполук, було визначено як 100 95, а значення ямок без вмісту клітин було визначено як 0 95.

Концентрації тестованих сполук, необхідні для інгібування росту клітин на 50 95 (тобто значення

ІСво), були розраховані і показані в Таблиці 16.

Таблиця 16 нІнн6НИТТЬТЬТЬТЬТЬТЬТООООВОВОВОИВОООЛВОЛВОВИВООЛВЛОВОВОВВОВОВОЬТТ ІННИ

Приклад фармакологічного тесту 27. Аналіз інгібування росту НЗ-5У-1Ї

У цьому аналізі була визначена інгібуюча активність тестованих сполук в клітинній лінії Н5-

ЗУ-ІЇ синовіальної саркоми. Клітини ЗН-5Х-ІЇ вміщували в середовище ЮОМЕМ з вмістом 10 95

ЕВ5, пеніциліну та стрептоміцину в інкубаторі з 5 95 СО» (37 "С). У кожну ямку 96-ямкового планшета (Весіоп, ріскіпвоп апа Сотрапу, 353219) додавали 100 мкл клітинної суспензії Не-5У-

І, доведеної до концентрації З3х107 клітин/мл у середовищі для культивування, і клітини інкубували протягом ночі у інкубаторі з 5 96 СО» (37 "С). Наступного дня, 100 мкл Сполуки (1) або Галіхондрину В в серіях триразових розбавлень, суспендованих в середовищі для культивування, і отриманий продукт інкубували протягом З днів у інкубаторі з 5 956 СО» (37 "С).

Потім життєздатність визначали шляхом люмінесцентного аналізу життєздатності клітин

СеПТпег-Сстіоє (Рготеда) за допомогою багатоканального зчитувача Епмізіоп 2103 (Регкіп-ЕІтег,

МУеїІезієу, МА). Значення ямок з вмістом клітин без додавання тестованих сполук, було визначено як 100 95, а значення ямок без вмісту клітин було визначено як 0 95. Концентрації тестованих сполук, необхідні для інгібування росту клітин на 50 95 (тобто значення ІСво), були розраховані і показані в Таблиці 1 7.

Таблиця 17 нем

Еквіваленти та сфера застосування

У формулі винаходу форми у однині можуть включати в себе і форми у множині, якщо не зазначено інше або якщо інше не випливає з контексту. Формула винаходу або опис, що включають сполучник «або» між одним або декількома компонентами групи, вважаються відповідними, якщо один, більше одного або всі компоненти групи присутні, включені у даний продукт або процес або іншим чином його стосуються, якщо не зазначено інше або якщо інше не є очевидним відповідно до контексту. Винахід включає варіанти здійснення, в яких присутній, включений у відповідний продукт або процес або стосується відповідного продукту або процесу лише один компонент групи. Винахід включає варіанти здійснення, в яких більше одного або всі компоненти групи присутні, включені у відповідний продукт або процес або іншим чином його стосуються.

Крім того, винахід охоплює всі варіанти, комбінації і поєднання, в яких один або декілька варіантів, елементів, пунктів і описових термінів з однієї або декількох перерахованих пунктів

Зо формули винаходу включені у інший пункт формули винаходу. Наприклад, будь-який пункт формули, який залежить від іншого пункту формули, може бути змінений для включення одного або декількох обмежень, виявлених в будь-якому іншому пункті формули, який залежить від того ж основного пункту формули. Якщо елементи наведені у вигляді переліків, наприклад, у форматі групи Маркуша, то також розкривається кожна підгрупа елементів, і будь-який елемент (и) може (можуть) бути видалений (і) з групи. Слід розуміти, що, в цілому, якщо винахід або аспекти винаходу зазначаються як такі, що включають в себе конкретні елементи і/або ознаки, певні варіанти здійснення винаходу або аспекти винаходу складаються або по суті складаються з таких елементів і/або ознак. З метою спрощення, ці варіанти здійснення не зазначаються в цьому документі тими самими виразами. Також слід зазначити, що терміни «містить/включає» і «що містить/включає» є відкритими і допускають включення додаткових елементів або стадій.

Там, де вказані діапазони, включені й кінцеві точки. Крім того, якщо інше не зазначено або не випливає з контексту і не грунтується на розумінні фахівця в даній галузі техніки, значення, які виражені у вигляді діапазонів, можуть мати будь-яке конкретне значення або піддіапазон в межах зазначених діапазонів в різних варіантах здійснення винаходу до десятої частини нижньої межі діапазону, якщо контекст явно не вказує інше.

Фахівці в цій галузі техніки розпізнають або здатні встановити, застосовуючи не більше ніж звичайні експерименти, множину еквівалентів конкретних варіантів здійснення, описаних в даному документі. Обсяг наведених варіантів здійснення, описаних в даному документі, не обмежує вищенаведений опис, а відповідає викладеному у доданій формулі винаходу.

Фахівцям в даній галузі техніки буде зрозуміло, що різні зміни і модифікації цього опису можуть бути здійснені без відхилення від суті або обсягу винаходу, як визначено в такій формулі винаходу.

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Сполука, що має наступну структуру: ї Н Н Н: НО,,, в) / о о Н ке; ОТО, прриоо о «що Н Н Н Я Н ЖК! є «г, 2 о: У 1; Н пи. ло або її фармацевтично прийнятна сіль.

2. Фармацевтична композиція, яка містить сполуку за п. 1 або її фармацевтично прийнятну сіль, у фармацевтично прийнятному носії.

3. Сполука або її фармацевтично прийнятна сіль за п. 1 для застосування при інгібуванні росту пухлини або раку.

4. Сполука для застосування за п. 3, де пухлина або рак характеризуються ангіогенезом, інвазією або метастазуванням.

5. Сполука або її фармацевтично прийнятна сіль за п. 1 для застосування при лікуванні пухлини або раку.

б. Сполука для застосування за п. 5, де пухлина або рак характеризуються ангіогенезом, інвазією або метастазуванням.

7. Сполука для застосування за будь-яким з пп. 3-6, де рак або пухлина являє собою рак голови та шиї, рак молочної залози, рак стравоходу, рак матки, рак яєчників, рак товстої та прямої кишки, рак ендометрія, рак шлунка, рак тонкої кишки, рак сечового міхура або саркому.

8. Сполука для застосування за п. 7, де рак або пухлина являє собою рак голови та шиї.

9. Сполука для застосування за п. 8, де рак голови і шиї являє собою плоскоклітинну карциному голови та шиї (ЗССНМ).

10. Сполука для застосування за п. 8, де рак голови і шиї являє собою аденокістозну карциному.

11. Сполука для застосування за п. 7, де рак або пухлина являє собою рак молочної залози.

12. Сполука для застосування за п. 11, де рак молочної залози являє собою НЕК2-позитивний рак молочної залози.

13. Сполука для застосування за п. 11, де рак молочної залози являє собою НЕК2-негативний рак молочної залози. Зо

14. Сполука для застосування за п. 11, де рак молочної залози являє собою тричі негативний рак молочної залози.

15. Сполука для застосування за п. 7, де рак або пухлина являє собою рак товстої та прямої кишки.

16.Сполука для застосування за п. 7, де рак або пухлина являє собою рак стравоходу.

17. Сполука для застосування за п. 16, де рак стравоходу являє собою аденокарциному стравоходу.

18. Сполука для застосування за п. 7, де рак або пухлина являє собою рак матки.

19. Сполука для застосування за п. 7, де рак або пухлина являє собою рак яєчників.

20. Сполука для застосування за п. 7, де рак або пухлина являє собою саркому.

21. Сполука для застосування за п. 20, де саркома являє собою саркому матки, фібросаркому, синовіальну саркому, саркому м'яких тканин або ангіосаркому.

22. Сполука для застосування за п. 7, де рак або пухлина являє собою рак шлунка.

23. Сполука для застосування за п. 7, де рак або пухлина являє собою рак тонкої кишки.

24. Сполука для застосування за п. 23, де рак тонкої кишки являє собою аденокарциному тонкої кишки.

25. Сполука для застосування за п. 7, де рак або пухлина являє собою рак сечового міхура.

26. Сполука для застосування за п. 25, де рак сечового міхура являє собою уротеліальний рак.

27. Сполука для застосування за п. 7, де рак або пухлина являють собою рак ендометрія.

28. Сполука для застосування за будь-яким з пп. 3-27 для застосування в комбінації з антитілом до білка 1 програмованої смерті (РО-1).

29. Сполука для застосування за будь-яким з пп. 3-27 для застосування в комбінації з антитілом до білка І 1 програмованої смерті (РО-Ї 1).

30. Сполука для застосування за будь-яким з пп. 3-27 для застосування в комбінації з антитілом до ЕСЕК (рецептора епідермального фактора росту).

31. Сполука для застосування за п. 30, де антитіло проти ЕСЕК являє собою моноклональне антитіло до ЕСЕ.

32. Сполука для застосування за п. 30 або 31, де рак або пухлина являє собою рак голови та шиї.

33. Сполука для застосування за п. 32, де рак голови і шиї являє собою плоскоклітинну карциному голови та шиї (ЗССНМ).

34. Сполука для застосування за будь-яким з пп. 31-33, де моноклональним антитілом до ЕСЕК є цетуксимаб.

35. Сполука для застосування за будь-яким з пп. 3-27 для застосування у поєднанні з антитілом до НЕКЗ (рецептора людського епідермального фактора росту).

36. Сполука для застосування за п. 35, де антитіло до НЕК2 являє собою моноклональне антитіло до НЕК2.

37. Сполука для застосування за п. 35 або 36, де рак являє собою рак молочної залози.

38. Сполука для застосування за п. 35 або 36, де моноклональним антитілом до НЕК2 є трастузумаб.

39. Сполука для застосування за будь-яким з пп. 3-38 для застосування у поєднанні з променевою терапією.

40. Сполука для застосування за будь-яким з пп. 3-38 для застосування у поєднанні з хірургічним втручанням.

41. Спосіб лікування пухлини або раку у суб'єкта, що включає введення суб'єкту сполуки за п. 1 або її фармацевтично прийнятної солі, необов'язково, у фармацевтично прийнятному носії.

42. Спосіб за п. 41, де пухлина або рак характеризуються ангіогенезом, інвазією або метастазуванням.

43. Спосіб за п. 41 або 42, де рак або пухлина являє собою рак голови та шиї, рак молочної Зо залози, рак стравоходу, рак матки, рак яєчників, рак товстої та прямої кишки, рак ендометрія, рак шлунка, рак тонкої кишки, рак сечового міхура або саркому.

44. Спосіб за п. 43, де рак або пухлина являє собою рак голови та шиї.

45. Спосіб за п. 44, де рак голови і шиї являє собою плоскоклітинну карциному голови та шиї (ЗССНМ).

46. Спосіб за п. 44, де рак голови і шиї являє собою аденокістозну карциному.

47. Спосіб за п. 43, де рак або пухлина являє собою рак молочної залози.

48. Спосіб за п. 47, де рак молочної залози являє собою НЕК2-позитивний рак молочної залози.

49. Спосіб за п. 47, де рак молочної залози являє собою НЕК2-негативний рак молочної залози.

50. Спосіб за п. 47, де рак молочної залози являє собою тричі негативний рак молочної залози.

51. Спосіб за п. 43, де рак або пухлина являє собою рак товстої та прямої кишки.

52. Спосіб за п. 43, де рак або пухлина являє собою рак стравоходу.

53. Спосіб за п. 52, де рак стравоходу являє собою аденокарциному стравоходу.

54. Спосіб за п. 43, де рак або пухлина являє собою рак матки.

55. Спосіб за п. 43, де рак або пухлина являє собою рак яєчника.

56. Спосіб за п. 43, де рак або пухлина являє собою саркому.

57. Спосіб за п. 56, де саркома являє собою саркому матки, фібросаркому, синовіальну саркому, саркому м'яких тканин або ангіосаркому.

58. Спосіб за п. 43, де рак або пухлина являє собою рак шлунка.

59. Спосіб за п. 43, де рак або пухлина являє собою рак тонкої кишки.

60. Спосіб за п. 59, де рак тонкої кишки являє собою аденокарциному тонкої кишки.

61. Спосіб за п. 43, де рак або пухлина являє собою рак сечового міхура.

62. Спосіб за п. 61, де рак сечового міхура являє собою рак уротеліальний рак.

63. Спосіб за п. 43, де рак або пухлина являє собою рак ендометрія.

64. Спосіб за будь-яким з пп. 41-63, який додатково включає лікування суб'єкта за допомогою антитіла до білка 1 програмованої смерті (РО-1).

65. Спосіб за будь-яким з пп. 41-63, який додатково включає лікування суб'єкта за допомогою антитіла до білка І 1 програмованої смерті (РО-Ї 1).

66. Спосіб за будь-яким з пп. 41-63, який додатково включає лікування суб'єкта за допомогою антитіла до ЕСЕК (рецептора епідермального фактора росту). 60

67. Спосіб за п. 66, де антитіло до ЕСЕЕ являє собою моноклональне антитіло до ЕСЕК.

68. Спосіб за п. 66 або 67, де рак або пухлина являє собою рак голови та шиї.

69. Спосіб за п. 63, де рак голови і шиї являє собою плоскоклітинну карциному голови та шиї (ЗССНМ).

70. Спосіб за будь-яким з пп. 67-69, де моноклональним антитілом до ЕСЕК є цетуксимаб.

71. Спосіб за будь-яким з пп. 41-63, який додатково включає лікування суб'єкта за допомогою антитіла до НЕКЗ2 (рецептора людського епідермального фактора росту).

72. Спосіб за п. 71, де антитіло до НЕК2 являє собою моноклональне антитіло до НЕК2.

73. Спосіб за п. 71 або 72, де рак являє собою рак молочної залози.

74. Спосіб за п. 72 або 73, де моноклональним антитілом до НЕКЗ є трастузумаб.

75. Спосіб лікування НЕК2-негативного раку молочної залози або плоскоклітинної карциноми голови та шиї (5ССНМ) у суб'єкта, який включає введення суб'єкту сполуки за п. 1 або її фармацевтично прийнятної солі.

76. Спосіб за будь-яким з пп. 41-75, який додатково включає лікування суб'єкта променевою терапією.

77. Спосіб за будь-яким з пп. 41-76, який додатково включає лікування суб'єкта шляхом хірургічного втручання.

78. Спосіб за будь-яким з пп. 41-77, де суб'єктом є людина.

79. Застосування сполуки або її фармацевтично прийнятної солі за п. 1 для виготовлення лікарського засобу з метою інгібування росту пухлини або раку.

80. Застосування сполуки або її фармацевтично прийнятної солі за п. 17 для виготовлення лікарського засобу для лікування пухлини або раку. , До денне няття» З ї Деві удо ще МЕТ КЕ : о 10 20 зо

Фіг. 1

! З пря рин и ки нн : ха ї ох Е г Ж : Н хх з З Ж Е І ех й ПЕ АНА зшігііііітатіві тні. ннкжанинивититиннях. Ж Н У Її : ке х ї їж й І й су х Н - Її ї Ж є не: 4 Х . Її і де 0 ЯМ г. коффех ЗОЗ НГ ДКТЬ : рок нн а ї Н хай 5 ї Ж ї Н ях Я Ж КЗ х шен Е. Кк. «щеспОолукаїї) : Н я мк ї ІЗ щ- й з аа г. Е ПИ: и нн нн нн Об гг В и Ж ; КЗ КУ їх М а, ще Я Ї : РУ мно в и сан ж ї ШІ ше у ї | со СТВ КА І ї ї шт іудеї й а т, ; Ж ши и ши ШИ ВЛ може . ї - п «болняняя сікежелнкнвсятякя ПК ва се кни ї роя : о 20 до во Е Н

Фіг. 2 х Я ї ї Її нин анна р м нові нон : Ї ї і : Е й ; ї ї Х І . в 5 т пуття шо ни дгллічкччатинт тт тт т як : : У ї й : : - х Ка ї Е м «4 якуучеєтиинямк ит я и и а а ння ї : до 7 ка ї : Ж ї Ї с : : Е ; Є веде» ОН ДССТЬ : і Ко в. в нн нн В ВО В хх шк! : : роя т г сах : І ї Е ш Дей теп ека її : : с Я «Фееспалука її) : Е ке ПЕН ЗНИК нн є Ше Ії : ше її 015 мгокг : ї ха ї с т ї Н - : Е хх. Я бо пон вовна х і а ї Мовчан, як рей : Е Бач і сх з ща : ї і ї До Ї : Ой з: 5 ДИНИ х " й Її г -- в ї : 0 ж 40 Во : х « т .

Фіг. З ї : КЗ І ; : ЕУ і ! Е ї в ; і Її ще ше : ї Ї «Бе СТХ ЗО мг ! Н щ : У щ щЕ ча їх ї гм В я ї зе Най-В 01925 мг/кг ! То : су су Мой Щ я ; і ше : ї Її СТХ ЗО мг : ОКО перен К зано Ной В 0035 мг/кг їж : з ко з з Щ що й і В ще ли що ; -СТХ Зо мг : що й а ке М «ее СполУкає1 05 мгбкг . є ж а вч - т ких ним ух МЕ - й у ї оо "Ве М и ср ся ще оон ВЕУГМУ Зб вюріют В НЕ У " оо й Коко МИХ що г зе ІК : ни а Н свеч ля од : шк с «ве Спалука (110 мг/кг : щ х Ме кі шиш каменя СТХ 20 мглюг / й що 40

Фіг. 4 . я ОО пре Ше: я «Ва«трастузумай 10 мг і Ха ; Кй Кв і ї Щ сей ПОЛУуКА МАК У КЕ і : їх з В о нн нен нн нн і ож і їх КЕ же трякека 15 0 ПО кегівт ! мА, я, де що щу Еш пиття ло ТО УКа 1 ОЗ мМгже : 1Оожя Жов ВК рю ння снення соус у, й : се 15 : гі ги і і Кі Ка - тристузумаб 10 мг/кг : Ко ск їж Є я ШК пиши. що то ; я. і тож І Коб они ри анна е І І й | в. :

А 0.5 : Ть ми ов «йно ная уУКЮВІЇ 10 В мговх Е їн : Б Й міс ким дл йо. - ния пу і о 20 40 во

Фіг. 5

Ж Ба їх я Й . й в шіч ж їй ! Бе проходнин ікування і : Ек ЕІ Кк. і а ї і МЕ п НМ ж ЗЕ заг з 1 З 252 55 З я їі ж 38 і ЗБ хв о МЕ, ме я ї ; Сх Е св СТЕ и а ї МО й Б 5 ї Ес З НУ - ра у. Я Ж ей ня с ко їу я т ї хх ткож т х їх 7 ій ЗУ КУ З в В ВЕН | ху ех ИН: івне у Коней -о сни й ай ай З од укдуфет мент «ОЇ їх Шк ЗЕ щи уч з У Ж - 1 вЩЕжоВ Ба МЕНЯ рн І со З 4 - р У КУ ке Ин док іч х ще ; с 1 5 3421 28 35 85 29 і 7142128 3545 55 -- че пи УМ Ж ОАЕ ке а Е Ко ; Сполука (1) ї Спалукай 1 СІХ ЯНВ в. у ве Е З Я я ре: с досто дю ХХ КО, сни що кову ОС А ВЕН В ЕУКЯ із Зенніи 134 у ї ех, ЕЕ Б їз Я дови щі вх ох я вони З Ох ть, З БЕК 5 ч ке БА ЗНО я ія Ей жк За те Е з 5. х Е з щ шк КУ рве Я : х ж Е: ж со ИЙ яке ши ше ее клон ох ес МЕНЕ і У ШЕ В Маг КІ 1 А ее і : у З : МК кн Жоосжоокхою оку. Бо под сюовк о вх х Ше шк нн тн: ка: НИ ДАХ ї т 3 51 88 55 ау А Ж 16 ЗІ ВО ЗБ я ЖЕ Днів після введення

Фіг. БА

В Я содіккмкрди хклоюдкн ххх хеовинно КО ВК А Ви ВО щ УК о; В Ох 5 я А НИ ОКО КН ще же - - В МО В п хо - ОО ВХ й го ж ж БОБ Он Я сих М з з УА ДВК хе судин: Я

Я М. З ОБУ ОК У 5. КО: НН КВ МКК ОХ З --к ХЕ МО ОДН ОБ 5 ООН ЗМУ -х Ж ВИ ОХ о. п м 0 ОБО у и В ЗОВ СЕЗ п о в о ХА КОН лік о ХУ УМ І В КК ОН Ки Ка д ще С с оо о ще т жк Ма У М КВ Сх ДК ву ШЕ БО ОВ В: ЗЕ пе УК МН В ОХ МК КХ чже ОККО ОН КК В МКМ я ш й ЕН ОО НО и о щ МОХ ПК ШУ ШИШН ТЯ Я ШІНШех «ЕЕ вай По КІ НВК ЕІ ОС КО НВ щих т о Б НЕ Ж ВІН Ве Мен май Ач я УВУ хо шт ж В до ОО ОКУ ЯК ЖОЯ, Он В В В ЕДНкоя а КО п ХЕВЗУКНЙ У 25 жи ПО ВО М д о о КОКО КН МОЛ ЖОВ КН М Зх ЖК Н ОК М Ж ОЙ КО Я зе Ж ВИКО ОО о Я ВМ я ож- МОВ 0 ПК ООН МЛИФ ї-ч. 55 ЖОВ МКМ ЗА А М КК Я МО 3 щЖ В о СХ СОН Хо шле Хай КО о ПУ МТК Й й т х М ОВ І Я Ми уме о І МО КО ХТО УМ ОО я СУКА ВАХ МО У МІЖ СУ Мав ДО го ЗИ ЕК ЗНУ НЯ АК ЗЕМЖ сф я й р вк оди пе оон июя Клео А 2 ЗИ СЕМ МОБ ІМ із ОХ си ан у о о ЖЕ й ОА он шо. КО УКХ АК ВХ ХУ МЕЖ сю ОХ ОК ПО ХК МУ Б -квюод ОО Й АК хх жиЖ Ме ВО ОА МОЗ Зз-е ВМО КК ам МИ КУ КК С ОК ЖИТ Жх ем, МК ОО ТА І А ОЙ МІГ що ЛКК МАК Хо І ОК ЖЕ ж ох о. У ВХ МКМ: С ПІ р УНН д-Ш Б ВОНО М В А ОО ШИК б р МАК Я ВЖЕ ІІІ ТИ ММК Не КЕ я с ЕКО ВАК ХНН ЖІ - є ВМО о п НН о КЕ З шо МЕМ В МО о ПНО ОК ПОМ. НЕ ВИХ С СОМ зо КУН ПІ Не В КИ чи І о в КО еВ ОКО Пн З са а в і ПЕК щих КОи ик що Мн а М Б ВОНО МОВ МОМ МОХ АХ я КОКО Б ХК, МО ТОБІ КК З х - о о о с ХО он В ОА ОК ОЖКОАКК Я ЕС М М М Я х. ВО» а Б ОО Кай : БОКОМ ОХ МН КН Б ко МО ВН В КК ок: ОВО БЕХ ех по ООН ОВ Кол нь КЗ НА КА ОКА ОН НК ча ш ВЕК ЖК КО с лю МОЯ хя ще п я МІХ Зх ПУ ОН 0 З ва Я ти щ ОХ В рих ПАК о Жах ЗУ - її й ОУН МОДА т АН Зх скол ЕЕ О 0 су Ох ПООЕУ УК кр по о яи я ОН М и В ОО ЕК Я ПЕЖО У АК ЖЕ 7 и В ОВО ї п оо УК ВАЗ ЕХ КИ Пн А, ММК ше су я и ПОМ МН ИН моло Кольорова ШИТИ ПМ СТОПИ МЕ СТПЖИ ЗМО ІМК ОО ОТ о я КО В В ВКот ОК Я МАВ В Я ЕК ЯКУ ДУНОКОУ» ООН А І МК 5 І ту бр и о І Я Міві -3 КУ о що ЗОВ . ОН ІН КВН; им ще ОМ, ОСТ МК сукня с хх - че ХО МЕ ОК ЕХ кг - РМ ОХ В Жуло --й й - - с ОК 5 таке о еВ Мін В. ПО М ЗО щО й да ж о саке З ОО ВХ КИ КК МН Я се ЧИМ А В КОКО ДІ я З й ЖК КО АХ у ОО В и КК се: АК -щ- ж в ВХ 7 В НН ВК КК ОО В І ТУХЛЯ МУКА Ки КТК В ДК Ме А Нв в А оо и Он о В З НЦИШШИ вис пвевнх пев оо Я Соки в іврит ДЕК КОКОН ВИК ЕВ: Я -щх Я ОКО Ох " В: ОЗ ОО о о КЗ о У КІНА С ЕМО Ин ОХ ВЕ пи МО З ТЕМІ ЗО ТО ОК ВК ВН Я В Ка МКК ВИКО МК МКК ВО ОВК КО А Ж КК ИН СОКИ МА НАВ М В М В В З ВО КТК хоКу пек МЕУКУОХ . Ох ї п М В п КОХ ПОМ Кк - с р о г п ЕЕ м СВК й КЛІ ПИ М КО о ОО ОО ОО КК Зони - о еВ о. г ОО ЕІ ПМ ВК Ам сов я ВАК І ОХ ПОЗ ННЯ ВАК ОК ОК Во МК Й о, ж. ВОК п: Ж щ ХА ЖІ 221 кое ДЕМО пи, Я М Ки ОХ т М М В ВК о ОВ ЗО ІА В КВ СЛОВ ЕН 5 НО НК А ОА и ОВ що А По мА, ДЕКО - за МИСОК ОХ ВА КК ще ИН о НИ НН МИ ОТУАХ У ще МО МИ: В ММК В: В ПІВ Ж ТМ ПІП ЕЕИ АНЯ - ЕЕ М и КН Я ТОК ПИВ КК ОО п ВК В НОВУ В ОО НН В ї 3 ОО и дО ОХ ПОЛПНЛИй ОКО - шини Вино в нн в ООН МУ МІУ СТУК ЖК КТ ТУТ з с си - ТП КУ т т. 1 Нень Ї День? день 14 День

НЖ-е пінних 1 З в З, і І « щук з 1 їх з 3 чи їх : Є ї 1 і, зе же 3 е В ще ат 3 З ї Е як Й - 1 с Я Е Вілссток виживаності оре Шан пиши МИ і : ! чек ши : 1 Ше Ки : Ям В ха Яне чен бере пн лету ї е Е ї : і х й фев хх ул лях В з й " - і с Фр ско вже вчу зе ї й . і 3 ЖК годоляннтттнляки Вени оостчучннюююттня тютюн трнякют ост стт кт тктуня ююттья тт нт тт ут тет як еютюючя ння щ- ї І т : Ї а ак 2-5 о З ЕЕ ще й «о БО щО в: тек ти ; зів 'іНСлЛЯ ВВЕДЕННЯ рану тут сетх стику скомокюмтвскюме Ті ПООХОлЛИТИ ПІЖУНЗІННЯ ак а КС АШ ще мезмегнаюювмютюютвмсх З МГТКЕ М, ка КИ їх К Я щ. Ки «охо» СЕІЮЛУКаЇЇ 90 мес кг зи т 5 рххжвнкнкхх я кхххюююююх ОА З МТВ В; хх Кия те ев ВЧ Як тата т. ко потен ОІВ ЧКВ ІЗ ЗИ мкткК З СХ 5 мткг Зах с ни а а б: сем сек хх хе СЛР З МКК ОЗ СА З МТК

Фіг. 7А т дж я - жк ще: якст Не Я ЖЕ 5 5 І ї у сл ск юн сек ск жим - ос во ких сітесжва сх - КИ сякх ОО УУКОКоя Кук т СВ ОК хх ОЗ о ве С ОВ що ховав ОА. ХХ ОК Я ВХ МО ОК ЗО М ОХ лХ. сс, . о СС(С( ії п . п х о. пн ЗУ ХК АВ ММА М МІХ и МО МИ Мис ОЗ З ОО УКХ ик Мих ОВ ЕК о Ду и или АК ВИ

1. п о. ММ п 0 Б СО КЕ В аа В Б ОС МО о ВВ 0. со о А Б З ІЕНКИ АК ем В КК КВ М ХО ННЯ БОКУ п ОВК ЗМК тм: ЛИН ОХ Я ПлоВОМУВИ и ХХ КО Оп ОаЩ ЗЕ КК оши ТОНУ Не ЗХ ОКО Ви ХХХ Я З я кН п, хво о КОНЯ я ПОЕМ ОСИ І С о ВХ ДИЛИ ун КВ МЕ ШИМИ Ух ПИ ДЕК У Мт ЕК ЗИ? й г МЕ . З МО. КЕ : у. Ех ЗЕ. до ВЕЖ а ча 48 їм 338 Скоояв ях й що Мк. пк Я Я ще дз ж ше пит ж ВУЖ З ВО а ОЖЕ ж що кю ж чььчн нь НьАч чНнНнч чн НН НН М Ми ММ М ММ МНН: 0 МОХ о КК ех ОО ОВ КК ШК ОО то І п. ше о: В БО ЗХ п МОВА и ОО ОН КК М В Кс Б з о о. 000 и З ОН А Ми ЗК ОККО и р З САМОК АНК и

КО . я с Ох М Ж ж А М КК х ОМ ХО ЗМУ АК М КС ВАК ОКО МАВКИ ЮК ОВЯ ХО и Ж ДЕ о. 5 її 00 и, ВК ЗВ оо и ОМА ЗК Он В М ЖИКЕТИЧЕТе ВК УКХ ХХ ХЕ дит ЕК ЕХ КК ММК С: ВО х ОКУ ОКО УЖ Мт МК ВВ У КК медики ЛОМОМММММКши е иии и ВВКХ МКММЕМ ХМ ди В щх ХХ ОО СУМИ код ви я че ЕКЗ її УЗ Ме х й У ке : : ях БВ Ім ЕК

Фіг. 78

В - В с дьмеюя бунти» они МИ З ще ві ні, хх і Н а з МЕОеу» я Ух ку 4 Дно баки «б» ши НН ИН, МОНЕ в: с: В. «3 «х Й ще стр Ше І ІЗ р ок ой, 4 -к. Ед дк щи ї м я т КУ ; 5 х - і х З. я що зе і ня НУ ої ! ро ї ча 50 КІ Та ду й є понос Ще прохолнлм лікування пеноокнтко й дннюмнох М ЗВ У пен уся СЛЮКТЕУВА І) 90 мкг/кг пнткнфоснсяю ВІЇ 5 Су Сполука Їй11 90 мег/кг

Фіг. ЗА

ЕК рр от сток рекет ОБО ПЕ КЕ и ик, по З Ов ТО НАМИ ХІКПЕННН ВО сгисятит, ОС КА Ки хх МКУ вик ен ПЛАСТ ПЕ МЕ а Б БІ ВВ ПЕОМ СІК ОКЯ ОС дит В Оса В ово еВ Ох хх ВК ОК: НВ С. ХК и Пежо наааюмя ПИШИ пКлюКА ПККОК в нн Ос ННЯ ВИШІ ттето ПІШЛИ КЛИМ ВОМ хх в ПКУ 5 а: НН ин я ох ПЕКУН ПОВ у ВО в ЯН МКК и ЕК ОХ звЖнкжЖення Кео С НН я ше я раження БО С МК стос ПИ ня М ша ЗУ: ТКУ ЕЖЕ Ен ТЕ Я М ї з а ОДНІ ІНЕ КК ос ОВО ПЕОМ КЕ ТЕ. Я У о У и п в НН я В с ЗШ вію ЕН Б и ОО НН ОО ее НЕ : ШЕ ТАК с ООН ОН ОО ОНИ ДЕК ЕТ КК ПОЕМ Мізко- 1 тей Доти ОК НИ Пи ОО СІНА ЕН ня МВВ т ТЕ . с І що ох М СХДОНЯ Он ДЖ КМ КУ ІЕЕ 7 іх МИТ СК М о а ПИ АХ е Й щ У ий о |! щя ОО ММ оте дитя І КУ КО о МАХИ Менш А КУКА КОМИ ТИ ЖК МЕ УК схннннрной ЖК я Я ЗО По: НН КК КАМ КО Доки и Ки Оп СУМ МД их й Вих о КЕ а КК ЗХ Ес . ре Ко на ЕН в. Ос : ! Вон: З ВНННН о п ЩЕ КОВО ва ОКУ 5 Ж ДИ ХЖЖКиХ Пл. КК ВО Кан ПЕК КК жо Кк ВОВК ло ВЕ нет хдмю, ММТЖЛЮТКИХ, ІМК Вик ВУ АК Б ще вени ще зве зей ОККО и ЗВ Бо ЗМК ВИ ХК КВК УА в п ЗК Ос о ХЛ 5 ШИК са оо ОО ва комин с Мова с ен еВ МЕНІ В ОКО ЗВ З З о ко ОО о Я ЩЕ ОКО МО УНН З ОВ НН МИ ХОМ ЕЕ и ЕУУ со ЗаНе них 5 Й ПОЛ У КО КА НИЙ В ом М МОМ Ос Во С КК пипд их ПОЖККК ов Арт ре ХО ж В ятки о З . ПИ МК о Бе КЕ й Я ПОБИВ Моск х дО Нед ВИННІ Іхе ОАЕ ГУ о ВО а шк В 0: з Сх с оВККесеке ІІ о НЯ НК хо и Я СЕ ше Кк ОО ВОМ ОКНН в ак Ох х с ли і: он ее ЯН в щі пев ВН Би т ЕН Я ПОД ЗБК МОХ У ЗА км ВХ и ОО ї Ох З сосни ЩО х 5 КО КВ ОН Я ок В ВН ока ДКЗ М ан ще ЕК У ж: ВУ що 5 п і г ШИ ДО ОО Ин а ХЕ о Ко ОМ З Ме ее МКК МО В У ОХ о з С 0 Кот М З КУ АККОЮ КН ОКО дер В Я ме Тюдеорки и о В Зав о ЕЕ ОВК о х. я нт ттивех ТОВ сови нш ніну 5 НН й ши ЗУ ПЕШІАНяоКоя, НА в МИХ Пи ек КАК, ДЕК В КО НК шт СУ ЕН СТО ЕВШТЕ Ен вату ЗЕД т шик КОДОМ хи в МИЖЦЕ А І ВН КВ В а НН: МЕЖІ МІЖ їх тот ЕК шт вай ших е по МВВ: ОН вва пом КУН шля ДІ бос кое кВ я ПИШНЕ ТІ ря Гн ОХЕ Ве МИНЕ ее ОА ПУ они п. п 5 ОО о ТЕО Ба ДНІ пт ЩІ 0 БИК КК ; ах М Я и Не ПИШЕ У о в. о я ПСИ ву Уж КЕ ХАМОКК КК Е ДЕ ОН ПЕ УК КВН: ОНИ НН ЕК ТК У У ЕК Ви ких Кок МІ МОМ я КАЖУ ММА ММ ЕЛЕН КЕ» ПЕ ОК ОНИ ПТМ МЕ ЗХ Б Кл УК КК Пух УЛОКЕ Кв У щІХЕх СЕК е ЗОМ дн о ВО ООН в ХАТІ М ШНх КЕ Кто МК о 0 о Нв, Он Ф орав ПЕД ххх ДЕ ЕКО БЕ . ОНИ НУ В ї- ких: М ши 00. ОНИ - Б ШІ ши «вт ДЕ В БИЛИ ІЕЕ МУ МОМ ех ПЕЛЕШ КЕ ЕВ ВУ Й х ОК Я УК пШЕ еВ ОК С ТІК ПЕК Оу Зх М ще п пеня 0 В я г . Шу УК о Я ЕК КВ КК КВН Х ПИ ЕК ЖЕК ЕК В и ОКУ ООН я КМ о КВН Зх с При ЕН ОЗ ФОСЮЖАЬ ВИН ХМК ОО ООДХ ОО Ко хх дя ЕЕ КН У МКМ СКАЖЕ Ван ть Ко ВИ СО ря ЕМ ОККО ЕК КМ. КЕКВ КЕКВ ВЕ Щ «ХХ ДИДНИИИВ ЕН К НВ М няння КА МОЖЕ 5. ТЕ 5 що и я о и - УНН т В ШИ «А ПИШИ АК КВ ДНО ах КК МОМОш СС - ВЕЖ МКК и дош н м ЕК КУ Бох а плини п В а КОН ПЕЕЕЕНННЕ о ет ун прин СУ щк с ше малою о ШИ. як ОС НН а МН ОВ п ЕНН ще БО: ННЯ ПЕ ВОВК по на НН 5 5 еВ ПД ЕЕ НН ПЕРОМ РИХ ЕЕ і С ПЕК: ЕЕ т ЕК МОВІ ке не ВІНІНННННЄ ПОН п. ОО пе я п Б ЕНН ХЕ 5 ПО в ОВ ХК чн АД ЛЕ КК КАК КК. МКК КЕ ВУ МЕВКИСК ПОВ ак Кох Ко : МЕС УВК дк КА М КА В КИ - Я о. пови ли ие о їй ЛОЖЕ МО ЕНй ОО Зоя ка о її | пн и ПЕК КО ЕВ РЕ ВК МЕ КВ о КО - й В одИККя МКК ок БО ПЕВ ПММ МТК КВ ПММ ШИЛО нини д ТЕМ Те у жи З КО 5. Но З ОКО и ІЕМ іх і ї пи яиНЮ пеоолооове Міх ох ше мольорова КУМ КИ КПК мое КК, ШЕ Мир Ве ТК : В ОА е вен о ПИТ ЕУО ВК о - труть пана ОО с ТЕ ко лекала ПЕК НВ ИН МКК Под ОО НУ КК Кия хх кд ОО ох шив В ММ Я -к ВЛЕННЯ ОХ ДЕ М стн МК пк КВ М ПОЛЕ ЖЕ ЕСН ІНК КК ОН і -к ще ее В БО ОХ п З ще ил Ме В КЕ КМ. СА А дек ПОВ Ми: М ХО МЕ А є МК ДК щи М МКМ ке Ж МК КЗ де - Кай Пи МКМ В ИИи КОКО ЗК пав. ЗЕ Хто жнжж я вве еВ ке У ній т. їй ІМКСМЧАЖ. ММ. ОН

Фіг. 88 і ї Е Е Я я виру, : що Я сх ї оо : ун Е че - ! ши мМ | ще, що ве ВІ Ка пе ш- вза 3 МО В вне Е оон ки очну 3 Є У ; їж, Е Не оиси кн і олив рин 1 КМ обдння 3 даю» с і ОО най 3 ов Пра пен пен пн нн нн кх є з "Б рек ї Не 10 15 - днів Сполукаїі!) Б я антитіла проти аг а м с в Дні після введення несе Ден» Бе щшюохолипни лікування хесоннокі Дфеннеюьья (стаз л ув ХО марлю хенекнецііннясян ВетУтілЛО прати РАІ 10 мг/кт песо роснсскох КООЗНВЦЯ

Фіг. 9 і Сполукдіїї і Сполукаї її М и ИЙ ; Е Кк ше 5 ОО : см. еконтроль до і шк ще оо КК Кс ще ШИК бони жа. ММ т хофеік пла МЕ -е МК Ст ваш ХКЮЄ й ПЕК МУК У «У І с и МИ Я як - Н с зе ; Бе ! ді скеля ЕК ще М ЕЕ ШК. сайте однеюй МЕМ т : ОО МАУ й - щк м ! ща й сени ЇМ МЕМ "ХЕ Н п НК дя Цих ж Н Ж дик щь ЩО» щи ще ОЗ АННИ ооо ВК ко - Вик о Кн о КВН Тед вир З їв іхва

Фіг. 10А ср ПС М се -к її х мох в Де ЗК І) Б щ ох г сша КОД ех ЕКО КЕ нн г

4 о. ОО й с по й МН сКеКих СКК ОК СУЯ І : нед о Ох КЕКВ КО В ЖЕ нед: : с й 5 с ОВ с с х З хх о. що 0 о і п с! о. о КО о с . 5 0 ОЗ о. ОО СКК ККр За с А - с ОХ шу : с у що с г : с о. о с А де Зх о Зх ще й с МО ОКХ зх СХ її Б. З З с Коси й с ОВ с БМВ зов о о. ще що щеща СХ ПАХИИИ КО с - КК Ж ч ОХ око З 5 Май п п. . пон не Б КЕ Б КУХНЯ лива шорх і : машин с Е зр : о і - Хо їі ша: Її бо хв с В с с Нх ОХ що п СН г КУ с с с Е с о о Нео с ЗУ х о. х - В п ХХ шо. с с о я п ок Бех висо о А с Ко о ОВ шо. с ЗУ с С 5 о. с ОО о М шо шок с се с З и ща рен ря о. СОЯ - СЯ ЗЕ подо ОКУ Зх МО ХХ І : ЗХ КО зх їх ж с Ух с се Б ОХ ов

Фіг. 1 їх в. і З рР-ї я х ї БЕТУ га м тКВІСтЬ ке ІС х плллллллллля щ ІК . 4 ВОУЩІ длллннллляняня спириик ЕН: полян зткн сте КІ підло Іа ння Кт пиляння диф т с кй чатжс ННЯ ши с соя наоуж ШИ хв. сл Її тах підт т МЕБ-ЗАДІ 423 -ш- - МК --вк т кестрав МЕЯея ще ак. Х Ж Е ТЕЗ ї, щі х

УЖ. х Я сСІККТУКа. ОЕХХ й те ЗУ ЕК при 7 з тк Ед Й) зе м ОПпОЛУК іг.

точ щі Е ет а с деки тив КРІ-З (Рак молочної залозі) СОЦО-Т04 (Рак яєчнниюв) і і хе ї нео й А 5 УА зи ХЕ : Т дер денс ї й - й з Кч ще? а оо ОА Як ВО свое ЩО 00 В то З м А Я й Водний 4 й ї ї і Ї о і: і М т : Ка ш З кі кіжтут і А гутти а Н щі ЖЕКу ї х ЕУНЕКУ ІН у й т ї ке ї Е пев ; уо- ; а 1 : і ї т 1 4 х я У я й і У Я кон нення ДАЙ ВВ ДК фену ннннне нн орки ро щ Б. АХ їх Ки я Б хі МО Б о юж я В ш х . ї Ох ї ме ТК В ІД я д.є : кий че Ж : пс її ос и ав : - р ВО ото не ТАС ша ко а Я До - ще як дибфснннн КУ нн а о я Жах їв онняннй, Я З : Змао 0 ий ОІК Ге х ДК сп, ее я УА Клен У фе ї п і Ме К КУ й офрртектн ПК жує ЩО з де МЕ ще що Й їв : 0 8 х Не її з ж а 1 св ЕЗУ Дні Дн же КОНТДВОЛЬ осо ЗО МКГ шкфне СО МЕРТІВТО оз ЗМО мЕгЛю

Фіг. 12 й кове ст в в ПИЙОВИВИЩНЬ ДТИМИЕ ШИНИ и, Вих ЛИ ХЕ, ЕПЕШЕНКЮВИ ТІ у и ДЕК М КВ ПДК ор дин, ЖЕК ІК ВИННУ, Еко ї- І с ш вени нн ана вся ї МвКУвзх КОКО СКУ Ю ДИН НК КЕ Ж М ти КВК ВЖК ЕК я ЕНН МОМ КВ ПКД Ж ях ЛЕК . ПИЖ ДИКИМ ПЕ Мен ВИЯВИ Аня Кк о ПЕКУН Пенн ЗЕдеЕНИЙ с КЕ М - ПО пек о се НН а Пет в ех Ж По СИ ЕК КО Я ЕЕ меж ПОЛИЖИИИИЕ ЛИ оМотНТХ шив РИТА оо, СЕЖИЕК НКИ Гоа СЕДЖОДЛЯ КУ МО вики я ММА БЕ в Ж ня ин о МВ КУ Ме ЕЕ ПУВЕ Я ОО КЕ В ЕК МЕЖ ж й ОДН и я ОВО р кв, т ПЕ ІМИЙ ЖІНКОЮ ПО и мит, САН реж «А ит де Худ и ПЕЛЕХ ами сього КД одн, АВ овен Мов ПОЖЕЖ оо я ХОМИЖЕН Ко в КЕ ОН В аа й яко ве а о опорну я-те Винна ння сема ? Пити о рн и и ЕК ЕХ Пежо? ПМ І Ох ЗОУШЕЯЖ ЛЕВ ЕЕ КЕ пЖ Вена поса пд ДЖОН КЕ ПЕК Коди МКК, дих МЕМ я ОУН ТЕХ ЛВ Е М Е ПОН полк тя пи Е Ж КОМ ТЕМЕ мес ПЕКИ я кв ВУ ПЕК й ЗЕМЕТК КІМ ПЕТ вк ДК КН УЖ и я Кен. пЕО ТОВ ук М КК Кн ЗЕ в ЕЕ о ОН ШЕДор нин КИРИК В ВОК вки ПЕК ЕК вне КЛЯМ ям а ЯК кети пе ПУУВІШЕКУ Ки ПО нн Ви уко пх ВШ ЕШНЬЯ І ГІЛКДЖ ЖЕК ше Мои - Ж Мо В ше шо що в У Бан я шЕНа: ОК КИ КА ОК, Зе Ж СЕК ЕЕ ЕЕ НО СЯ КО Ше Ж ПЕКТИ Км Еш ДЕК па пЕКкр о ЖК Ки о ОК м п М ен УВК ХМ ВО ера м ЕЕ ПОЕМИ ПОС НКУВВи КЕ б Б Не ШККИЖЕЮ и КК Куди Еш - ДИТ ОЕ М ж кеВ ЕК а КК, ЕЕ юкет нене ПЕН Ен ПШШи ж я КН ПЕ КК ЕАКЕКИ МИ овен КК о ооо Мак ПЕПЖКХ Прукмн т АК КК в еВ Ки Я ЕЕ ОЕМ НМ ВХ Здноразова доз: гри (ЗССНІМ) Одноразова доза ганів тт. зу Ценьо шо ди ї : щи дже ; з є ж пи : ШИ | КК ! о х 1 КОМИ З В ! АК ща ММ ще ОКУ 2 ВУХО Ж ОХ М КОСА Е у Я : : Я : й р м Хм і х Е ОО, х Е МЕ Е Е І в, Е М ШОУ Е: я М, В : с я Я Я - ох І Оу я Е ек БО 0 рез пе Е МОЗ ТОВ с Я Ж ! КиОЄ ХО Б м, й Е КЕ У Я вай Е КО кое 0 КО З М Е КЕ що п Жов ре: ще тех со МАК МОМ в: УК КККУ с щи КОКО -ко Х КО г ОК ОК ше : о. о що К КЕ МОЯ ПОМ. Сена Е КЕ МОМ Я я Е оо хе Е: о ХО ОКА ге Ї 1 КЕ НЯ ХО в | ОО КО МКК М БЖ Б о ВО "ях МОВ с щ хо БЕХ г Я ВО Б Е о МИ хе як Ж Ї в ов у хх г хз і У сх Й щ їх: Б : їх Бе з Ж їх вх З шт Ж ХЕ -Щк о дО Ти де С Б ех щ т о, пеня Я ве я і ке ЖОВ раса ще що рише - че ш--к ВО - хін

Фіг. 13

ЕК рати пе нж вот о ЕК іДеньЗ бо брате ї її ПМК ТИНИ ВМ ТЕ ЖИТИ Н ох Ходи жд ВВНИК ШЛУНОК КК Н Р з ТК ниви ни м - ; ен в ОО ЗВНН хх Ека ЖЕ м Поки у я о НН я М АКОНІТ ТИ ТМ ПЕКИ МЕН ТЕ или СТИ, що о и НН 2 Ж Ж ишящин. мо Ше І перу ил т ППС и и пу и Ж о а КМИН Ж и ок 00 пло я о вв ше (ДЖ кН тах фе РО нн ши -о п що В НН ї Е и НК ще ж ІД я В В ОН що в що и в ще В в КК А В І з а й ВЕССТИКА С КК Кк секс ту Жак ч ж Ж ВК. їх ЕвОш БССНМІ ТА Сх Тося КЛАДЕ АТ ВАТА, День З щу : І шок х Ше пах зо Ж х че М М г хя ра Ж

Ж Б. і Ж ХК Й КЗ Бе - тех ої ї- г ЕВ ж ш й - т Пот 5 і Ха т Деньй 5 Е шОСУ хв т Кк М 2 о ЕК ще Б ВООЗ аа с ші ШО чек Ж ОХ КО КОХ ОХ КЕ КВ | КО ОБ ї о ш. В жу ВХ трюк пеох і Ж ШК ОХ

В. вах поряняно З пияню, пе зн хх, диня й еВ З дЕТУ ВК за -еккя ШКО іа шЕ З іч пнНиМ КОМІ Ро щ я «А я поршняння Дуннетці зх 5 і: М нос; порвнянезтрупею, о 5 о Ж х щ г з тосту тт ке пр щен ідВОавнОцаВня ЕЕ КОНТеВІН ля

: ї і - лк ї т вже лик вв ніраль ЕКНТЯ етан Контградль Сполука Ек МЕ 150 мкг кг Бетуюс май і | с ТУ ВІ З ЕТ У КС ЕВ ЗиММекют те я Ус ДИКО ЮК кое КОМ ; в в НН ВЕК ж рт стра туя ОО Ки в КН КК СОдноразанадоза 1 ен и, з ОО М НЯ ПЕ ША МЕККА ДН КК Жя п я о.

ПЕККК КМУ АК и и и МКК ДУ и ТК о КК ДАК Кн и День 5 ехо Ов я пі с тат и М ЗОН А В ТУКА МЕ ї ОПИКД МЕ МК и КОМУ Мел КК, ОХ НО А Ме Мі МЕС КОКС я ЕКО МЕЕТОВао МЛМ ММ ик МЖК еи А ТУ Е и в ММКАК КАМ и не и и я п А Ки КОСУ ОКЬКЕ ПО БО МОН у Іона я КЕ ха ПІШЛО ВВЕ а я о а М КН ЗОН КК, ЗО Я З ОР у ТЕМ Жито У я в Я й ПТО КМ їх о. о с -к ОВЕН ОВО аа еВ ВИДОВЕ п КЕКВ кн х хе Ко ВН КК Я КТК КВ КК рЕФАККЯ ; МНВК КО ВІ МЖК и я ТММ В пи Я с М У в и о КК ЕХ ПО хе По КВ ЕЕ ПУ КК пох м и в в ШМК ЕНИЖИНИ ПУШОК ОХ ПКЕЕ ие КЕ ї2 ПЕДИШИ ОК КЕ М я Зя ГЯ В я М ЗО ше Но ПВЕК ОН ве ОК Ем не о я КОЯ пе в щЕ ХА ПМК МЖК о В я о М ПОД па и КАК УСЕ ПЕВНЕ ЕЕ КК в х ІЩУК талии и НК КК ТК ПЕ ПМЖ ЖЕКи йнх А син АЮ п З НК Н КК КК НЯ КО В Ір о ПОТУ МК ВКА А Кк ПАОХН я и КМ ЕУКУТАЙО.

ПН КК АВ Я СМІХОМ ВІ ик ММК ОМ Я ОКОМ ПОХКОо С ДОЗИ МОКІЯ МК АКА ЕК по КК ОМ ТОВ Ве ОО ІК БО с ЗЕД МИ ВИМ ЕВ КК о пра КК КЕН ВК кров МОЖЕ ЕНН о АН о с п, На х СЕБЕ КК ЖК КК КЕ ЕК ДЕК КК М НКИ Ж ДА МАВ Я ОО м КЕКВ М КК Та А Б Кк АВК КЛЕМ КИМ.

АХ ши ПЕН ох сйОТеК ЕІ ВЕК У ПІ Х ІНК о КАНА Не КК В КО Кн во оКЯ в и М Я КО ИН ня шк : и нн: З І І ПВ сяк вно ен мине Х ЛУ я КУМ У ВИ КК, о В ПИЛ я МКС ІД КЕ ОМЖХКК КИ ШИТИ КМ ТЕ У КК КК а а М Я Б и В БУ з о и о ОН М о я в с Ох шо х шо що НК ПМ КВК ІК ВК и, ї- СК кВ Мо п їі М я ЕОМ Пекин АК ум ММ КЕН КАК УК АКА ЕК А ОВ Я - ДОЖИВ УК МЖК ОВК МКК СЕМА х в М МЕ ТКА ЕК ОАЕ ча в М ЕВ я ОО : І КК ВК ВМ ЖЕ АКА ПЕК я КАК, ко СКМ ий НМА УК К КО І Ов я КЕНЕ їх ТУХИЛЕТКЕ КОС о и ДЕЩО ЗЕЛКФ ЕКО КЕ В КК я ей Пе Кк ЕМО ПЕК ОМ й о в Х КЕ ПЕК КК тк ЕОМ зЗ- о поши НВ КЕ ЕХ ай; В АХ ОН мо в «ха ПЕЕНЕ Я ММК КАК ОО и ДНА ККУ пли ЕЕ Ж КК КК и ПОВІКИ в ПО о ПОЕТ М Ка КОМА Я ПЕфИ КК Х ее ПХТ КК КО щу БМ М ОО Кия ЖЕ т Б а С М ВОК КАК ЗИ КЕ ї ОН сх МОВ МКК САКЕ о ЕК Я - ШИН яв М КК Ед ПК НН -Е Мов о я ПК КЕ ех а СМ Сн ОХ КК СК М іх КИ МЖЕМ Ж ЕН, НІЙ ОО ОК МКК КЕ р НИ сІщЕ в п : с КН.

У а ТО Ки ту ЕДЕМ ми и ви ОК ЛЕЛЕК КОХ ПОШИ ЕК З ПЕОМ КК КВК ВЕК ЕЕ М -- НО НМ ТИМ МЕМ ие Он ПКМУ КАК и и КК ХХКЕКАУ Ки им АЮ МИТА, ТИКИ и МК Оу ОО В В Я КЕКВ ДУ ЕКО ОО КО ОК В ОН Я ня МОЗ М я М Я КАП К АВ Микити М М ОХ и ТЕМАХ ши о А З ОеВЯ ЕУВІВШН те ЕЕ Я УК ВО п а В 5 ПКТ Е КК ЕВ ПЕОМ Е КВ ПЕК ЕК Со ОХ ПИВ нн НЯ ПЕК По КЕ УВК У ЯХ Ен ДИ ПИШИ КЕ МИ ИИИВИИЬ во Ки ТЯ ЕКО МКМ