ES2931533T3 - Compuesto macrocíclico y usos del mismo - Google Patents
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Abstract
La presente invención proporciona un nuevo Compuesto (1) que tiene un efecto de remodelación vascular tumoral y/o actividad anti-CAF (fibroblastos asociados al cáncer), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente en usos médicos y farmacéuticamente aceptables del mismo. Compuesto (1) (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Compuesto macrocíclico y usos del mismo
Campo técnico
La presente invención proporciona un compuesto macrocíclico novedoso que tiene efectos de remodelación vascular tumoral y actividad anti-CAF (fibroblastos asociados al cáncer). El compuesto se puede usar para tratar el cáncer o inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto.
Antecedentes
Las halicondrinas, tales como la halicondrina B, son agentes anticancerosos aislados originariamente de la esponja marina Halichondria okadai (véase, por ejemplo, D. Uemura et al. "Norhalichondrin A: An Antitumor Polyether Macrolide from a Marine Sponge" J. Am. Chem. Soc., 107, 4796 (1985)), y posteriormente hallados en Axinella sp., Phakellia carteri y Lissondendryx sp. En 1992 se publicó una síntesis total de halicondrina B (véase, por ejemplo, Y. Kishi et al. "Total Synthesis of Halichondrin B and Norhalichondrin B" J. Am. Chem. Soc., 114, 3162 (1992)). La halicondrina B ha demostrado ejercer la inhibición in vitro de la polimerización de tubulina, del ensamblaje de microtúbulos, de la reticulación de beta 5-tubulina, de la unión de GTP y vinblastina a tubulina y de la hidrólisis de GTP dependiente de tubulina, y ha mostrado in vitro e in vivo propiedades anticancerosas (véase, por ejemplo, Y. Hirata et al. "Halichondrins-antitumor polyether macrolides from a marine sponge" Pure Appl. Chem., 58, 701 (1986); Fodstad et al. "Comparative antitumor activities of halichondrins and vinblastine against human tumor xenografts" J. of Experimental Therapeutics & Oncology 1996; 1: 119, 125).
El mesilato de eribulina (Halaven™), que se desarrolló basándose en halicondrina B (véase, por ejemplo, la publicación internacional N° WO 1999/065894, publicada el 23 de diciembre de 1999; la publicación internacional N° WO 2005/118565, publicada el 15 de diciembre de 2005; y W.Zheng et al. "Macrocyclic ketone analogues of halichondrin B" Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14, 5551-5554 (2004)), se encuentra actualmente en uso clínico en muchos países para el tratamiento de, por ejemplo, cáncer de mama metastásico y liposarcoma avanzado.
Otras publicaciones de patentes que describen halicondrinas incluyen la patente de Estados Unidos N° 5.436.238 de Kishi et al., publicada el 25 de julio de 1995, la patente de Estados Unidos N° 5.338.865 de Kishi et al., publicada el 16 de agosto de 1994, y el documento WO 2016/003975, presentado por Kishi, et al., todas las cuales se asignan a President and Fellows of Harvard College.
Véanse también, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.786.492, la patente de Estados Unidos N° 8.598.373, la patente de Estados Unidos N° 9.206.194, la patente de Estados Unidos N° 9.469.651, el documento WO/2009/124237A1, el documento WO/1993/017690A1, el documento WO/2012/147900A1, la patente de Estados Unidos N° 7.982.060, la patente de Estados Unidos N° 8.618.313, la patente de Estados Unidos N° 9.303.050, la patente de Estados Unidos N° 8.093.410, la patente de Estados Unidos N° 8.350.067, la patente de Estados Unidos N° 8.975.422, la patente de Estados Unidos N° 8.987.479, la patente de Estados Unidos N° 8.203.010, la patente de Estados Unidos N° 8.445.701, la patente de Estados Unidos N° 8.884.031, la patente de Estados Unidos N° RE45.324, la patente de Estados Unidos N° 8.927.597, la patente de Estados Unidos N° 9.382.262, la patente de Estados Unidos N° 9.303.039, el documento WO/2009/046308A1, el documento WO/2006/076100A3, el documento WO/2006/076100A2, el documento WO/2015/085193A1, el documento WO/2016/176560A1, la patente de Estados Unidos N° 9.278.979, la patente de Estados Unidos N° 9.029.573, el documento WO/2011/094339A1, el documento WO/2016/179607A1, el documento WO/2009/064029A1, el documento WO/2013/142999A1, el documento WO/2015/066729A1, el documento WO/2016/038624A1 y el documento WO/2015/000070A1.
Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), que se encuentran generalmente en una diversidad de tumores sólidos, son células del estroma. Es bien sabido que los CAF desempeñan un papel importante en la angiogénesis, la invasión y la metástasis. Se ha informado que existe una estrecha correlación entre las cantidades de CAF y el pronóstico clínico, por ejemplo, en cáncer de mama invasivo (véase, por ejemplo, M. Yamashita et al. "Role of stromal myofibroblasts in invasive breast cancer: stromal expression of alpha-smooth muscle actin correlates with worse clinical outcome" Breast Cancer 19, 170, 2012) y adenocarcinoma esofágico (véase, por ejemplo, TJ Underwood et al. "Cancer-associated fibroblasts predict poor outcome and promote periostin-dependent invasion in esophageal adenocarcinoma" Journal of Pathol., 235, 466, 2015). También se ha informado que los CAF se correlacionan con la resistencia en una diversidad de tumores tales como, por ejemplo, cáncer de mama (véase, por ejemplo, P. Farmer et al. "A stroma-related gene signature predicts resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer" Nature Medicine., 15(1), 68, 2009), y cáncer de cabeza y cuello (véanse, por ejemplo, S. Schmitz et al. "Cetuximab promotes epithelial to mesenchymal transition and cancer associated fibroblasts in patients with head and neck cancer" Oncotarget, 6 (33), 34288, 2015; Y. Matsuoka et al. "The tumor stromal features are associated with resistance to 5-FU-based chemoradiotherapy and a poor prognosis in patients with oral squamous cell carcinoma" APMIS 123(3), 205, 2015).
Por lo tanto, se ha observado que los efectos de remodelación vascular del tumor y la actividad anti-CAF dan como
resultado una mejora del microentorno de cáncer, lo que ayuda al tratamiento del tumor. Los vasos sanguíneos son esenciales para el crecimiento de los tumores. Los vasos sanguíneos reconstruidos en los tumores pueden administrar agentes anticancerosos a los tumores, además de lograr el alivio de la hipoxia. Se ha informado que la remodelación inducida por eribulina de la vasculatura tumoral anormal da lugar a un microentorno más funcional que puede reducir la agresividad de los tumores debido a la eliminación de la hipoxia tumoral interna. Debido a que los microentornos tumorales anormales potencian tanto la resistencia a fármacos como la metástasis, la aparente capacidad de la eribulina para revertir estas características agresivas puede contribuir a sus beneficios clínicos (véase, por ejemplo, Y. Funahashi et al. "Eribulin mesylate reduces tumor microenvironment abnormality by vascular remodeling in preclinical human breast cancer models" Cancer Sci. 105 (2014), 1334-1342). Hasta la fecha no se ha informado de fármacos anticancerosos que tengan efectos de remodelación vascular tumoral y actividades anti-CAF. Francis G. Fang et al., "Synthetic Studies Towards Halichondrins: Synthesis of the Left Halves of Norhalichondrins and Homohalichondrins", Tetrahedron Letters, 33(12), 1557-1560, 1992, divulgan halicondrinas, norhalicondrinas y homohalicondrinas A, B y C. Hickford SJ H et al., "Antitumour polyether macrolides: Four new halichondrins from the New Zealand deep-water marine sponge Lissodendoryx sp", Bioorganic & Medicinal Chemistry, 17(6), 2199-2203, 2009, divulgan halicondrina B, isohomohalicondrina B y análogos de las mismas.
A pesar de los progresos logrados, se necesitan compuestos adicionales para avanzar en la investigación y la atención médica de los tumores y el cáncer. Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas o medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto macrocíclico (por ejemplo, el Compuesto (1)) que tiene efectos de remodelación vascular tumoral y actividad anti-CAF, y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, y a composiciones farmacéuticas del mismo.
La invención también incluye procedimientos de uso del Compuesto (1) para tratar el cáncer, procedimientos para inhibir de forma reversible o irreversible la mitosis en una célula y procedimientos para inhibir el crecimiento tumoral in vitro, in vivo, o en un sujeto. Se divulgan kits que comprenden el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica del mismo.
En un aspecto, la invención presenta un compuesto que es el Compuesto (1):
y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
En un aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además uno o más agentes terapéuticos adicionales en combinación, alternancia u otro tipo de terapia sincronizada, para lograr el objetivo de tratamiento deseado.
La invención también presenta procedimientos para preparar el Compuesto (1) o sus intermedios. Los intermedios de síntesis también se proporcionan en el presente documento como parte de la invención.
Se ha descubierto que el Compuesto (1) tiene un efecto ventajoso sobre la remodelación vascular tumoral y posee actividad anti-CAF, tal como se demuestra en las figuras y los ejemplos. En consecuencia, el Compuesto (1) tiene un uso potencial en el tratamiento del cáncer (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN), cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, cáncer de vejiga, sarcomas, cánceres raros).
En otro aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para inhibir cualquier crecimiento tumoral o cáncer
que responderá a un compuesto con efectos de remodelación vascular tumoral y/o actividad anti-CAF, en un sujeto, generalmente un ser humano, con el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición del mismo, puede administrarse en combinación con cualquier otro agente activo que proporcione resultados beneficiosos para el paciente. En determinadas formas de realización, el Compuesto (1) se usa en combinación con un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal). En una forma de realización, el Compuesto (1) se usa en combinación, alternancia u otra terapia sincronizada con una inmunoterapia, tal como un anticuerpo anti-EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), un anticuerpo anti-HER2 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano), un anticuerpo anti-PD-1, o un anticuerpo anti-PD-L1, tal como se describe con más detalle más adelante.
Por ejemplo, se proporciona un procedimiento para tratar el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) en un sujeto, generalmente un ser humano, que lo necesite, y que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del Compuesto (1) o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición del mismo, en combinación con una terapia con un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico). En determinadas formas de realización, el mAb anti-EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) es cetuximab.
Como otro ejemplo, un procedimiento para tratar el cáncer de mama en un sujeto, generalmente un ser humano, que lo necesite, comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz del Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición del mismo, en combinación con una terapia con mAb HER2 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano). En determinadas formas de realización, el mAb HER2 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano) es trastuzumab. En otras formas de realización, el Compuesto (1) puede usarse para tratar el cáncer de mama en combinación con quimioterapia tradicional tal como adriamicina, ciclofosfamida, taxol, etc., o un antiestrógeno tal como un modulador selectivo de estrógenos (SERM), un degradador selectivo de estrógenos (SERD), un inhibidor parcial o total de estrógenos (tal como fulvestrant) o un inhibidor de CDK 4/6 tal como palbociclib (Pfizer).
Se divulga el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que puede estar en forma de hidrato, solvato, polimorfo o una composición de los mismos, en un kit, que puede ser un paquete de una forma de dosificación. Los kits descritos en el presente documento pueden incluir una única dosis o múltiples dosis del compuesto o composición farmacéutica del mismo. Un kit de la invención puede incluir instrucciones para usar las formas de dosificación terapéuticas proporcionadas (por ejemplo, instrucciones para usar el compuesto o la composición farmacéutica incluida en el kit).
La presente invención describe así al menos las siguientes características:
(i) El Compuesto (1), o su sal farmacéuticamente aceptable, que puede estar opcionalmente en forma de hidrato, solvato o polimorfo;
(ii) Un procedimiento de tratamiento que incluye la administración de una cantidad eficaz a un sujeto tal como un ser humano del Compuesto (1), o su sal farmacéuticamente aceptable, que puede estar opcionalmente en forma de hidrato, solvato o polimorfo, para tratar el cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN), carcinoma adenoide quístico), cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama negativo para HER2, cáncer de mama triple negativo), cáncer de esófago (por ejemplo, adenocarcinoma esofágico), cáncer de útero (por ejemplo, sarcoma uterino), cáncer de ovario, cáncer colorrectal, sarcoma (por ejemplo, sarcoma sinovial, angiosarcoma, sarcoma de tejidos blandos, fibrosarcoma, sarcoma uterino), cáncer de vejiga (por ejemplo, cáncer urotelial), cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado (por ejemplo, adenocarcinoma de intestino delgado), cáncer de endometrio o un cáncer raro;
(iii) Un procedimiento de tratamiento que incluye la administración de una cantidad eficaz a un sujeto tal como un ser humano del Compuesto (1), o su sal farmacéuticamente aceptable, que puede estar opcionalmente en forma de hidrato, solvato o polimorfo, para su uso en el tratamiento de un trastorno médico tal como un cáncer o un tumor que responde a efectos de remodelación vascular y/o actividad anti-CAF;
(iv) El Compuesto (1), o su sal farmacéuticamente aceptable, que puede estar opcionalmente en forma de hidrato, solvato o polimorfo, para su uso en el tratamiento de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN), cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, sarcoma, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, cáncer de endometrio o un cáncer raro;
(v) El Compuesto (1), o su sal farmacéuticamente aceptable, que puede estar opcionalmente en forma de hidrato, solvato o polimorfo, para su uso en el tratamiento de un trastorno médico tal como un cáncer o un tumor que responde a los efectos de remodelación vascular y/ o actividad anti-CAF;
(vii) Un proceso de fabricación de un medicamento destinado al uso terapéutico para tratar o prevenir trastornos tales como un cáncer o un tumor que responde a efectos de remodelación vascular y/o actividad anti-CAF,
caracterizado por que en la fabricación se usa ese Compuesto (1), o su sal farmacéuticamente aceptable, que puede estar opcionalmente en forma de un hidrato, solvato o polimorfo descrito anteriormente, o una forma de realización del compuesto activo;
(ix) Una composición farmacéuticamente aceptable del Compuesto (1), o su sal farmacéuticamente aceptable, que puede estar opcionalmente en forma de hidrato, solvato o polimorfo, en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable;
(x) Una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable del Compuesto (1), o su sal farmacéuticamente aceptable, que puede estar opcionalmente en forma de hidrato, solvato o polimorfo, opcionalmente en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable;
(xi) El Compuesto (1), o su sal farmacéuticamente aceptable para tratar un trastorno descrito en el presente documento en el que actúa a través de un mecanismo distinto de los efectos de remodelación vascular y/o la actividad de acción anti-CAF; y
(xii) Procedimientos para la fabricación de los compuestos descritos en el presente documento e intermedios de síntesis.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos, que se incorporan a la presente memoria descriptiva y constituyen una parte de la misma, ilustran varias formas de realización de la invención y, junto con la descripción, proporcionan ejemplos no limitantes de la invención.
La figura 1 muestra los efectos antitumorales del Compuesto (1) en un modelo de xenoinjerto subcutáneo FaDu (cáncer de cabeza y cuello) en ratones como monoterapia tal como se describe en el Ejemplo de ensayo farmacológico 4.
La figura 2 muestra la actividad antitumoral del Compuesto (1) frente a un modelo de xenoinjerto subcutáneo OSC-19 (cáncer de cabeza y cuello) en ratones como monoterapia tal como se describe en el Ejemplo de ensayo farmacológico 5.
La figura 3 muestra la actividad antitumoral del Compuesto (1) frente a un modelo de xenoinjerto subcutáneo HCC-1806 (cáncer de mama) en ratones como monoterapia tal como se describe en el Ejemplo de ensayo farmacológico 6.
La figura 4 muestra los efectos antitumorales del Compuesto (1) en un modelo de xenoinjerto subcutáneo FaDu en combinación con cetuximab en ratones tal como se describe en el Ejemplo de ensayo farmacológico 7.
La figura 5 muestra la actividad antitumoral del Compuesto (1) en un modelo de xenoinjerto subcutáneo KPL-4 (cáncer de mama) en combinación con trastuzumab en ratones tal como se describe en el Ejemplo de ensayo farmacológico 8.
Las figuras 6A-6B muestran el efecto antitumoral del Compuesto (1) en un modelo de ratón de trasplante ortotópico HSC-2. Figura 6A. Se les implantó a ratones desnudos HSC-2 transducida con luciferasa (1 x 106 células/dosis) en la lengua. La cantidad de HSC-2 transducida por luciferasa se analizó usando el sistema de obtención de imágenes in vivo (IVIS). Los datos muestran los niveles de bioluminiscencia en la lengua de cada ratón. Figura 6B. Imagen de bioluminiscencia representativa de 16 ratones. Se usaron CDDP, CTX, CDDP+CTX como comparadores, que se usan actualmente en el tratamiento de pacientes con cáncer SCCHN. CDDP = cisplatino, CTX = cetuximab. Las figuras 7A-7B muestran la ventaja en la supervivencia del Compuesto (1) en combinación con cetuximab en un modelo de ratón de trasplante ortotópico HSC-2. Figura 7A. Se les implantó a ratones desnudos HSC-2 transducida con luciferasa (1 x 106 células/dosis) en la lengua. Los datos muestran la curva de supervivencia hasta el Día 100 después del tratamiento con fármacos (n = 16). *P < 0,0001 frente al Compuesto (1) o CTX solo (prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox)). Figura 7B. La cantidad de HSC-2 transducida con luciferasa se analizó usando el sistema de obtención de imágenes in vivo (IVIS). Imágenes de bioluminiscencia de 10 ratones sobrevivientes del grupo de combinación Compuesto (1) CTX el Día 100. RBW = peso corporal relativo. CDDP = cisplatino, CTX = cetuximab. Las figuras 8A-8B muestran el efecto antitumoral del Compuesto (1) en combinación con radioterapia en un modelo de xenoinjerto de ratón FaDu. Figura 8A. Se les implantó a ratones desnudos por vía subcutánea FaDu transducida con luciferasa (5 x 106 células/dosis) en el muslo derecho. Trece días después de la inoculación, los ratones se asignaron aleatoriamente (n = 6) y se les inyectó por vía intravenosa el Compuesto (1) a 90 pg/kg el Día 1 y el Día 8 con o sin RT de 18 Gy el Día 4 y el Día 11. La cantidad de FaDu transducida con luciferasa se analizó utilizando el sistema de obtención de imágenes in vivo (IVIS). Los datos muestran el nivel medio de bioluminiscencia relativa el Día 1 y SEM (n = 6). SEM = error estándar de la media. *P < 0,05 frente a los no tratados el Día 29 (prueba t no
pareada). Figura 8B. Imágenes de bioluminiscencia representativas de 6 ratones de cada grupo el Día 29. RT = radioterapia.
La figura 9 muestra actividades antitumorales del Compuesto (1) en combinación con el anticuerpo anti-mPD-1. Se trató un modelo de ratón singénico CT26 s.c. (carcinoma de colon) con el Compuesto (1) y el anticuerpo anti-mPD-1 en un programa Q7D y un programa de dos veces por semana, respectivamente, durante 3 semanas. Los resultados muestran medias ± SEM de volúmenes tumorales (mm3) (n = 8).
La figura 10A muestra un ensayo de polimerización de tubulina carente de células. El Compuesto (1) tiene actividad inhibidora sobre la polimerización de tubulina. La figura 10B muestra un ensayo de dinámica de microtúbulos. El Compuesto (1) también tiene actividad inhibidora sobre la dinámica de los microtúbulos.
La figura 11 muestra que el Compuesto (1) es un potente agente antiproliferativo en líneas celulares de cáncer de esófago (OE21, OE33 y TE-8) y de cáncer de útero (MES-SA, MES-SA/Dx5-Rx1).
La figura 12 muestra que el Compuesto (1) posee una potente actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto subcutáneo de cáncer de mama y de ovario (KPL-4 y COLO-704, respectivamente) como monoterapia.
La figura 13 muestra el efecto del Compuesto (1) sobre microentornos tumorales. Tal como se muestra, el Compuesto (1) aumenta la densidad de microvasos. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001 frente a los no tratados (prueba de comparación múltiple de Dunnett).
La figura 14 muestra el efecto del Compuesto (1) sobre microentornos tumorales. Tal como se muestra, el Compuesto (1) reduce los CAF positivos para a-SMA.
La figura 15 muestra que el Compuesto (1) reduce las proteínas ECM de los CAF en un modelo de xenoinjerto subcutáneo FaDu. Los tumores de xenoinjerto FaDu se recogieron el día 6 después de una única administración del Compuesto (1) 180 pg/kg cetuximab el Día 1.
La figura 16 muestra que el Compuesto (1) presenta un efecto combinado dependiente de la dosis con cetuximab en un modelo de xenoinjerto subcutáneo FaDu. Una única dosis, n = 6. El Compuesto (1) y cetuximab (CTX) se administraron el Día 1 en el modelo de xenoinjerto FaDu.
La figura 17 muestra efectos antitumorales en modelos de xenoinjerto de sarcoma de tejidos blandos en ratones como monoterapia. Se muestran MES-SA (sarcoma uterino humano), HT-1080 (fibrosarcoma humano) y CTG-2041 (angiosarcoma humano).
La figura 18 muestra efectos antitumorales en modelos de xenoinjerto de cáncer de endometrio en ratones como monoterapia. Se muestran HEC-108 y AN3CA (cáncer de endometrio).
Definiciones
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sal" se refiere a todas las sales y a cualquiera de las mismas, y abarca las sales farmacéuticamente aceptables. El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que son, dentro del alcance de un juicio médico razonable, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares indebidas, y que se corresponden con una relación beneficio/riesgo razonable. Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, Berge et al. describen sales farmacéuticamente aceptables en detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, que se incorpora al presente documento por referencia. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la presente invención incluyen las derivadas de ácidos y bases orgánicos e inorgánicos adecuados. Ejemplos de sales de adición de ácido no tóxicas farmacéuticamente aceptables son sales de un grupo amino formadas con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o utilizando otros procedimientos conocidos en la técnica tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos, de metales alcalinotérreos, de amonio y de N+(alquilo C1-4)4-. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, cationes amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos formados utilizando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquilo inferior-sulfonato y arilsulfonato. El Compuesto (1) también se proporciona, y puede
administrarse, como una base libre.
También debe entenderse que los compuestos que tienen la misma fórmula molecular pero difieren en la naturaleza o la secuencia de unión de sus átomos o en la disposición de sus átomos en el espacio se denominan "isómeros". Los isómeros que difieren en la disposición de sus átomos en el espacio se denominan "estereoisómeros".
Los términos "composición" y "formulación" se utilizan indistintamente.
Un "sujeto" al que se contempla para la administración se refiere a un ser humano (es decir, varón o mujer de cualquier grupo de edad, por ejemplo, un sujeto pediátrico (por ejemplo, un neonato, un niño o un adolescente) o un sujeto adulto (por ejemplo, un adulto joven, un adulto de mediana edad o un adulto anciano)) o un animal no humano. En determinadas formas de realización, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un primate (por ejemplo, mono cynomolgus o mono rhesus), un mamífero de importancia comercial (por ejemplo, ganado vacuno, cerdo, caballo, oveja, cabra, gato o perro) o un ave (por ejemplo, un ave de importancia comercial, tal como pollo, pato, ganso o pavo)). En determinadas formas de realización, el animal no humano es un pez, un reptil o un anfibio. El animal no humano puede ser macho o hembra en cualquier etapa de desarrollo. El animal no humano puede ser un animal transgénico o un animal manipulado genéticamente. El término "paciente" se refiere a un sujeto humano que necesita el tratamiento de una enfermedad.
Los términos "administrar", "que se administra" o "administración" se refieren a implantar, absorber, ingerir, inyectar, inhalar o introducir de otro modo un compuesto descrito en el presente documento, o una composición del mismo, en un sujeto.
Los términos "tratamiento", "tratar" y "que trata" se refieren a revertir, aliviar, retrasar la aparición o inhibir el progreso de una enfermedad descrita en el presente documento. En algunas formas de realización, el tratamiento puede administrarse después de que se hayan desarrollado o se hayan observado uno o más signos o síntomas de la enfermedad. En otras formas de realización, el tratamiento puede administrarse en ausencia de signos o síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento puede administrarse a un sujeto susceptible antes de la aparición de los síntomas. El tratamiento también se puede continuar después de que los síntomas hayan desaparecido, por ejemplo, para retrasar o prevenir la recurrencia.
Una "cantidad eficaz" de un compuesto descrito en el presente documento se refiere a una cantidad suficiente para provocar la respuesta biológica deseada. Una cantidad eficaz de un compuesto descrito en el presente documento puede variar dependiendo de factores tales como el resultado biológico deseado, la farmacocinética del compuesto, la afección que se está tratando, el modo de administración y la edad y la salud del sujeto. En determinadas formas de realización, una cantidad eficaz es una cantidad terapéuticamente eficaz. Alternativamente, en un procedimiento o uso separado, la invención se puede utilizar, cuando esté indicado y sea eficaz, como un tratamiento profiláctico. En determinadas formas de realización, una cantidad eficaz es la cantidad de un compuesto descrito en el presente documento en una sola dosis. En determinadas formas de realización, una cantidad eficaz son las cantidades combinadas de un compuesto descrito en el presente documento en múltiples dosis.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto descrito en el presente documento es una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento de una afección o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con la afección. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto significa una cantidad de agente terapéutico, solo o en combinación con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento de la afección. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" puede abarcar una cantidad que mejora la terapia en general, reduce o evita los síntomas, signos o causas de la afección y/o mejora la eficacia terapéutica de otro agente terapéutico. En determinadas formas de realización, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para tratar cualquier enfermedad o afección descrita.
Tal como se utilizan en el presente documento, "inhibición", "que inhibe", "inhibir" e "inhibidor", y similares, se refieren a la capacidad de un compuesto para reducir, ralentizar, detener o prevenir la actividad de un proceso biológico (por ejemplo, el crecimiento tumoral). En determinadas formas de realización, la inhibición es de aproximadamente el 45% al 50%. En determinadas formas de realización, la inhibición es de aproximadamente el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99,9% o 100%.
Los términos "neoplasia" y "tumor" se utilizan en el presente documento indistintamente y se refieren a una masa anormal de tejido en la que el crecimiento de la masa excede el crecimiento de un tejido normal y no está coordinado con el mismo. Una neoplasia o tumor puede ser "benigno" o "maligno", dependiendo de las siguientes características: grado de diferenciación celular (incluidas morfología y funcionalidad), velocidad de crecimiento, invasión local y metástasis. Una "neoplasia benigna" generalmente está bien diferenciada, tiene un crecimiento de forma característica más lento que una neoplasia maligna y permanece localizada en el sitio de origen. Además, una neoplasia benigna no tiene la capacidad de infiltrarse en, invadir o metastatizarse en sitios distantes. Por el contrario, una "neoplasia maligna" generalmente está poco diferenciada (anaplasia) y presenta un crecimiento de forma característica rápido acompañado de infiltración, invasión y destrucción progresivas del tejido circundante. Además, una neoplasia maligna generalmente tiene la capacidad de metastarizarse en sitios distantes. Los términos "metástasis", "metastásico" o
"metastatizarse" se refieren a la propagación o la migración de células cancerosas desde un tumor primario u original a otro órgano o tejido y, por lo general, se identifica por la presencia de un "tumor secundario" o "masa celular secundaria" del tipo de tejido del tumor primario u original y no del del órgano o tejido en el que se localiza el tumor secundario (metastásico).
El término "cáncer" se refiere a una clase de enfermedades caracterizadas por el desarrollo de células anormales que proliferan sin control y tienen la capacidad de infiltrarse en tejidos corporales normales y destruirlos.
El término "cáncer raro" se refiere a los cánceres que se producen en un número relativamente reducido de pacientes. Los cánceres raros incluyen, entre otros, sarcomas (por ejemplo, sarcoma de tejidos blandos, liposarcoma, sarcoma uterino, leiomiosarcoma, mixofibrosarcoma, osteosarcoma, angiosarcoma, sarcoma de Ewing, sarcoma sinovial, rabdomiosarcoma), linfomas malignos, cáncer tímico (por ejemplo, timomas), mesotelioma, tumores del estroma gastrointestinal (GIST), cáncer neuroendocrino, cáncer ocular, tumores cerebrales, tumores de tejidos blandos y óseos, cáncer de piel y tumores de células germinales.
El término "anticanceroso" se refiere a cualquier agente terapéutico que sea útil para tratar el cáncer en un sujeto (por ejemplo, inhibir el crecimiento del cáncer o del tumor en un sujeto). Los agentes anticancerosos abarcan agentes anticancerosos bioterapéuticos, así como agentes quimioterapéuticos.
Descripción detallada de determinadas formas de realización
La presente invención se describe en detalle a continuación con referencia a formas de realización y similares de la presente invención. La invención proporciona compuestos (por ejemplo, el Compuesto (1)) y sales farmacéuticamente aceptables y composiciones farmacéuticas del mismo. La invención también proporciona procedimientos para inhibir el crecimiento tumoral y/o tratar el cáncer en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz al sujeto de un compuesto o una composición proporcionada en el presente documento. El compuesto o la composición pueden administrarse como monoterapia o en combinación con otra terapia, tal como se describe en el presente documento. En otro aspecto más, la presente invención proporciona procedimientos para preparar el Compuesto (1) y los intermedios de síntesis útiles para tal fin.
La invención incluye un compuesto con la estructura:
o su sal farmacéuticamente aceptable, que puede estar opcionalmente en forma de hidrato, solvato o polimorfo, opcionalmente en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
El Compuesto (1) puede existir como polimorfo cristalino, y el compuesto de la presente invención puede encontrarse en cualquiera de las formas monocristalinas o en una mezcla de dos o más formas cristalinas. El Compuesto (1) puede encontrarse en forma amorfa o puede ser un anhídrido o un solvato, tal como un hidrato.
La presente invención incluye sales farmacéuticamente aceptables del Compuesto (1). Un compuesto marcado isotópicamente es equivalente al Compuesto (1) excepto que uno o más de los átomos están reemplazados por átomos que tienen una masa atómica o un número másico diferente de los que se encuentran normalmente en la naturaleza. Los ejemplos de un isótopo que se puede incorporar al compuesto de la presente invención incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor, yodo, bromo y cloro, tales como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 18F, 35S, 1231 y 1251.
El compuesto marcado isotópicamente, tal como un compuesto en el que se ha incorporado un isótopo radiactivo, por ejemplo, 3H y/o 14C, es útil para un ensayo de distribución tisular para un medicamento y/o una matriz. Los isótopos 3H y 14C se consideran útiles dado que estos isótopos se pueden preparar y detectar fácilmente. Los isótopos 11C y 18F son útiles en PET (tomografía por emisión de positrones). El isótopo 125I se considera útil en SPECT (tomografía computarizada por emisión de fotón único) y puede ser útil en la obtención de imágenes cerebrales. El reemplazo por un isótopo más pesado tal como 2H conlleva, debido a su mayor estabilidad metabólica, algunas ventajas, en un
tratamiento, de, por ejemplo, la prolongación de la semivida in vivo o la reducción de la dosis necesaria y, por lo tanto, se considera útil en determinadas circunstancias. El compuesto marcado isotópicamente se puede preparar de forma similar utilizando un reactivo marcado isotópicamente fácilmente disponible en lugar de un reactivo no marcado isotópicamente y realizando los procesos divulgados en los esquemas y/o ejemplos que se describen a continuación.
El Compuesto (1) se puede utilizar como sonda química para capturar una proteína diana de un compuesto de bajo peso molecular biológicamente activo. Específicamente, el compuesto de la presente invención se puede transformar en una sonda de cromatografía de afinidad, una sonda de fotoafinidad o similar mediante la introducción de un grupo marcador, un enlazador o similar en un resto que no sea un resto estructural indispensable para la expresión de la actividad del compuesto mediante un procedimiento descrito en J. Mass Spectrum. Soc. Jpn. Vol. 51, N° 5, 2003, páginas 492-498, el documento WO2007/139149, o similares.
Los ejemplos del grupo marcador, el enlazador o similares usados en una sonda química de este tipo incluyen grupos que pertenecen a los grupos (1) a (5) siguientes. (1) Grupos marcadores de proteínas, tales como grupos marcadores de fotoafinidad (tales como un grupo benzoílo, un grupo benzofenona, un grupo azida, un grupo carbonil-azida, un grupo diaziridina, un grupo enona, un grupo diazo y un grupo nitro) y grupos de afinidad química (tales como un grupo cetona en el que un átomo de carbono alfa está sustituido con un átomo de halógeno, un grupo carbamoílo, un grupo éster, un grupo alquiltio, un aceptor de Michael de una cetona, éster o similares a,p-insaturados, y un grupo oxirano); (2) enlazadores escindibles tales como S-S, O-Si-O, un monosacárido (tal como un grupo glucosa o un grupo galactosa) y un disacárido (tal como lactosa) y enlazadores oligopeptídicos que pueden escindirse mediante una reacción enzimática; (3) grupos de etiquetado mediante FISH tales como biotina y un grupo 3-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4H-3a,4a-diaza-4-bora-s-indacen-3-il)propionilo; (4) grupos marcadores radioactivos tales como 125I, 32P, 3H y 14C; grupos marcadores de fluorescencia tales como fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferona, 7-nitrofurazanilo y un grupo 3-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4H-3a,4a-diaza-4-bora-s-indacen-3-il)propionilo; grupos quimioluminiscentes tales como luciferina y luminol; y marcadores capaces de detectar iones de metales pesados tales como iones de metales lantánidos e iones de radio; y (5) grupos que se van a unir a un vehículo de fase sólida tal como perlas de vidrio, un lecho de vidrio, una placa de microvaloración, perlas de agarosa, un lecho de agarosa, perlas de poliestireno, un lecho de poliestireno, perlas de nailon y un lecho de nailon.
Se puede utilizar una sonda preparada introduciendo, en el compuesto de la presente invención, un grupo marcador o similar seleccionado de los grupos (1) a (5) descritos anteriormente mediante el procedimiento descrito en cualquiera de las publicaciones mencionadas anteriormente o similares como sonda química para identificar una proteína marcadora útil para la investigación de una diana farmacológica potencial novedosa.
Los ejemplos de una "sal" que se utiliza en el presente documento incluyen sales con ácidos inorgánicos, sales con ácidos orgánicos y sales con aminoácidos ácidos y, en particular, se prefieren las sales farmacéuticamente aceptables. Además, una sal del compuesto de la presente invención abarca un anhídrido de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un solvato, tal como un hidrato, de la sal farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos preferidos de una sal con un ácido inorgánico incluyen sales con ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y los ejemplos preferidos de una sal con un ácido orgánico incluyen sales con ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido esteárico, ácido benzoico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico y similares. Los ejemplos preferidos de una sal con un aminoácido ácido incluyen sales con ácido aspártico y ácido glutámico y similares.
En el caso de que el Compuesto (1) según la presente invención se obtenga como una sal del Compuesto (1) o un hidrato del Compuesto (1), la sal y el hidrato se pueden convertir en un cuerpo libre del Compuesto (1) por medio de un procedimiento convencional.
Composiciones farmacéuticas, kits y administración
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En determinadas formas de realización, el compuesto descrito en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se proporciona en una cantidad eficaz en la composición farmacéutica (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz).
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica de la farmacología. En general, dichos procedimientos preparatorios incluyen asociar el Compuesto (1) (es decir, el "principio activo") con un vehículo o excipiente, y/o uno o más ingredientes accesorios, y después, si es necesario y/o deseable, conformar y/o envasar el producto en una unidad monodosis o multidosis deseada. Una composición farmacéutica de la invención podría prepararse según un procedimiento conocido, tal como un procedimiento descrito en las normas generales para preparaciones de la Farmacopea japonesa, 16a edición, la Farmacopea de los Estados Unidos, y la Farmacopea Europea, 9a edición. Una composición farmacéutica de la invención podría administrarse a los pacientes de manera apropiada dependiendo de la forma de dosificación.
Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar, envasar y/o vender a granel, como una dosis unitaria sencilla y/o como una pluralidad de dosis unitarias sencillas. Una "dosis unitaria" es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del principio activo. La cantidad del principio activo es generalmente igual a la dosis del principio activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de dicha dosis, tal como la mitad o un tercio de dicha dosis.
Las cantidades relativas del principio activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica descrita en el presente documento variarán, dependiendo de la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto tratado y dependiendo además de la vía por la que se va a administrar la composición. La composición puede comprender entre el 0,1% y el 100% (p/p) de principio activo.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables utilizados en la fabricación de las composiciones farmacéuticas proporcionadas incluyen diluyentes inertes, agentes dispersantes y/o de granulación, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes y/o aceites. También pueden estar presentes en la composición excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y perfumantes.
El compuesto proporcionado en el presente documento se formula normalmente en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de las composiciones descritas en el presente documento lo decidirá un médico dentro del alcance de un juicio médico razonable. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier sujeto u organismo en particular dependerá de una diversidad de factores que incluyen la enfermedad que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del principio activo específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto; el tiempo de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción del principio activo específico empleado; la duración del tratamiento; medicamentos utilizados en combinación o de forma coincidente con el principio activo específico empleado; y factores similares bien conocidos en la técnica médica.
El compuesto de la presente invención (Compuesto (1)) y las composiciones del mismo proporcionadas en el presente documento se pueden administrar por cualquier vía, incluida la vía enteral (por ejemplo, oral), parenteral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, subcutánea, intraventricular, transdérmica, interdérmica, rectal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (tal como mediante polvos, ungüentos, cremas y/o gotas), mucosal, nasal, bucal, sublingual; por instilación intratraqueal, instilación bronquial y/o inhalación; y/o como pulverización oral, pulverización nasal y/o aerosol. Las vías específicamente contempladas son la administración oral, la administración intravenosa (por ejemplo, inyección intravenosa sistémica), la administración regional a través del suministro de sangre y/o linfa y/o la administración directa en un sitio afectado. En general, la vía de administración más apropiada dependerá de una diversidad de factores, incluida la naturaleza del agente (por ejemplo, su estabilidad en el entorno del aparato gastrointestinal), y/o la condición del sujeto (por ejemplo, si el sujeto es capaz de tolerar la administración oral).
La cantidad exacta de Compuesto (1) requerida para lograr una cantidad eficaz variará de un sujeto a otro, dependiendo, por ejemplo, de la especie, la edad y la condición general de un sujeto, la gravedad de los efectos secundarios o el trastorno, la identidad del compuesto particular, el modo de administración, y similares. Se puede incluir una cantidad eficaz en una única dosis (por ejemplo, dosis única de administración oral) o dosis múltiples (por ejemplo, dosis múltiples de administración oral). En determinadas formas de realización, cuando se administran dosis múltiples a un sujeto o se aplican a un tejido o célula, dos dosis cualquiera de las dosis múltiples incluyen cantidades diferentes o sustancialmente iguales de un compuesto descrito en el presente documento. En determinadas formas de realización, cuando se administran dosis múltiples a un sujeto o se aplican a un tejido o célula, la frecuencia de administración de las dosis múltiples al sujeto o de la aplicación de las dosis múltiples al tejido o célula puede ser, en ejemplos no limitantes, de tres dosis al día, dos dosis al día, una dosis al día, una dosis cada dos días, una dosis cada tres días, una dosis cada semana, una dosis cada dos semanas, una dosis cada tres semanas o una dosis cada cuatro semanas, o incluso una administración controlada de dosis lenta durante un periodo de tiempo seleccionado utilizando un dispositivo de administración de fármacos. En determinadas formas de realización, la frecuencia de administración de dosis múltiples al sujeto o de aplicación de dosis múltiples al tejido o célula es una dosis por día. En determinadas formas de realización, la frecuencia de administración de dosis múltiples al sujeto o de aplicación de dosis múltiples al tejido o célula es de dos dosis por día. En determinadas formas de realización, la frecuencia de administración de dosis múltiples al sujeto o de aplicación de dosis múltiples al tejido o célula es de tres dosis por día. En determinadas formas de realización, cuando se administran dosis múltiples a un sujeto o se aplican a un tejido o célula, la duración entre la primera dosis y la última dosis de las dosis múltiples es aproximadamente o al menos un día, dos días, cuatro días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, seis meses, nueve meses, un año, dos años, tres años, cuatro años, cinco años, siete años, diez años, quince años, veinte años, o el resto de la vida del sujeto, tejido o célula. En determinadas formas de realización, la duración entre la primera dosis y la última dosis de las dosis múltiples es de al menos tres meses, seis meses o un año. En determinadas formas de realización, la duración entre la primera dosis y la última dosis de las dosis múltiples el resto de la vida del sujeto, tejido o célula. En determinadas formas de realización, una dosis (por ejemplo, una dosis única, o cualquier dosis de dosis múltiples) descrita en el presente documento incluye independientemente entre 0,001 mg/kg y 0,01 mg/kg, entre
0,01 mg/kg y 0,1 mg/kg, o entre 0,1 mg/kg y 1 mg/kg, inclusive, del Compuesto (1). Los ejemplos son formas de dosificación con al menos aproximadamente 0,01,0,05, 0,1,0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 10, 5, 20, 25 o 50 mg de compuesto activo, o su sal, en forma de dosificación.
Los intervalos de dosis que se describen en el presente documento proporcionan una guía para la administración de las composiciones farmacéuticas proporcionadas a un adulto. La cantidad que hay que administrar a, por ejemplo, un niño o un adolescente puede determinarla un médico o un experto en la técnica y puede ser inferior o igual a la administrada a un adulto.
La divulgación también abarca kits (por ejemplo, paquetes farmacéuticos). Los kits provistos pueden comprender una composición farmacéutica o Compuesto (1) y un recipiente (por ejemplo, un vial, una ampolla, una botella, una jeringa y/o un paquete dispensador u otro recipiente adecuado). En algunas formas de realización, los kits proporcionados pueden incluir opcionalmente además un segundo recipiente que comprende un excipiente farmacéutico para la dilución o suspensión de una composición farmacéutica o Compuesto (1). En algunas formas de realización, la composición farmacéutica o el Compuesto (1) proporcionado en el primer recipiente y el segundo recipiente se combinan para formar una forma de dosificación unitaria. Un kit descrito en el presente documento puede incluir uno o más agentes farmacéuticos adicionales descritos en el presente documento en forma de una composición separada.
Procedimientos de tratamiento y usos
Tal como se muestra en el presente documento, el Compuesto (1) tiene efectos significativos de remodelación vascular tumoral y actividad anti-CAF y, por lo tanto, tiene un uso potencial para el tratamiento del cáncer y/o la inhibición del crecimiento tumoral.
En el presente documento se proporciona un procedimiento para tratar el cáncer en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad eficaz de un Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición farmacéutica del mismo. La presente invención también proporciona el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición farmacéutica del mismo, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto. La presente invención también proporciona el uso del Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición farmacéutica del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
También se proporciona en el presente documento un procedimiento para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición farmacéutica del mismo. También se proporciona en el presente documento el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición farmacéutica del mismo, para su uso en la inhibición del crecimiento tumoral en un sujeto. La presente invención también proporciona el uso del Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición farmacéutica del mismo, para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento tumoral.
En determinadas formas de realización de los procedimientos y usos proporcionados en el presente documento, el cáncer es cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, cáncer de vejiga o un sarcoma.
En determinadas formas de realización de los procedimientos y usos proporcionados en el presente documento, el cáncer es cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer bucal, cáncer de garganta, cáncer de glándulas salivales, cáncer de lengua, carcinoma adenoide quístico). En determinadas formas de realización, el cáncer es carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN). En determinadas formas de realización, el cáncer es carcinoma quístico adenoide. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama positivo para HER2, cáncer de mama triple negativo). En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de mama positivo para HER2. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de mama triple negativo. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer colorrectal (por ejemplo, carcinoma de colon). En determinadas formas de realización, el cáncer es carcinoma de colon. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de esófago (por ejemplo, adenocarcinoma de esófago). En determinadas formas de realización, el cáncer es adenocarcinoma de esófago. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de útero (por ejemplo, sarcoma uterino). En determinadas formas de realización, el cáncer es un sarcoma uterino. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de ovario. En determinadas formas de realización, el cáncer es un sarcoma (por ejemplo, sarcoma uterino, fibrosarcoma, angiosarcoma, sarcoma sinovial, carcinoma de tejidos blandos). En determinadas formas de realización, el cáncer es fibrosarcoma. En determinadas formas de realización, el cáncer es angiosarcoma. En determinadas formas de realización, el cáncer es un sarcoma sinovial. En determinadas formas de realización, el cáncer es un carcinoma de tejidos blandos. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer gástrico. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de intestino (por ejemplo, cáncer de intestino delgado, adenocarcinoma de intestino delgado). En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de intestino delgado. En determinadas formas de realización, el cáncer es adenocarcinoma de intestino delgado. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de vejiga (por ejemplo, cáncer urotelial). En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer urotelial. En determinadas
formas de realización, el cáncer es cáncer de endometrio. En determinadas formas de realización, el cáncer es un cáncer raro.
Politerapia
Además de la administración como monoterapia, el Compuesto (1) se puede administrar en combinación con otros agentes terapéuticos o modalidades de tratamiento. En determinadas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo. En determinadas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo monoclonal. El compuesto de la presente invención se puede administrar en combinación con otro agente terapéutico, tal como terapia anti-EGFR, terapia anti-HER2, terapia anti-PD-1, terapia anti-PD-L1 o terapia de irradiación.
En determinadas formas de realización, el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición farmacéutica del mismo, se administra en combinación con una terapia anti-EGFR (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-EGFR, tal como cetuximab). En determinadas formas de realización, la terapia anti-EGFR es un anticuerpo anti-EGFR. Por ejemplo, en el presente documento se proporciona un procedimiento para tratar el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición farmacéutica del mismo, en combinación con una terapia con mAb anti-EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico). En determinadas formas de realización, el mAb anti-EGFR es cetuximab (CTX).
En determinadas formas de realización, el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición farmacéutica del mismo, se administra en combinación con una terapia anti-HER2 (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-HER2 como trastuzumab). En determinadas formas de realización, la terapia anti-HER2 es un anticuerpo anti-HER2. Por ejemplo, en el presente documento se proporciona un procedimiento para tratar el cáncer de mama en un sujeto que lo necesite que comprende administrar a dicho sujeto el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición del mismo, en combinación con un HER2 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano) terapia con mAb. En determinadas formas de realización, el mAb anti-HER2 es trastuzumab.
En determinadas formas de realización, el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición farmacéutica del mismo, se administra en combinación con una terapia anti-PD-1 o anti-PD-L1 (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 o anti-PD-L1). En determinadas formas de realización, la terapia anti-PD-1 o anti-PD-L1 es un anticuerpo. Por ejemplo, en el presente documento se proporciona un procedimiento para tratar el cáncer colorrectal en un sujeto que lo necesita que comprende administrar a dicho sujeto el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición del mismo, en combinación con una terapia anti-PD-1 o anti-PD-L1 (por ejemplo, terapia con mAb).
En determinadas formas de realización, el Compuesto (1), o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición farmacéutica del mismo, se usa en combinación con radioterapia (RT). En determinadas formas de realización, el compuesto se administra en combinación con cirugía.
Ejemplos
Síntesis del Compuesto (1)
Procedimientos y métodos generales
El compuesto según la presente invención se puede producir mediante los procedimientos descritos en los Ejemplos siguientes. No obstante, estos ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos, y el compuesto según la presente invención no está limitado de ninguna forma a los ejemplos específicos mencionados a continuación.
En los Ejemplos, a menos que se indique específicamente lo contrario, el gel de sílice para la purificación usando cromatografía en columna de gel de sílice fue la columna Hi-Flash™ (gel de sílice, 30 pm 60 Á o 40 pm 60 Á, Yamazen Corporation), el gel de sílice para la purificación usando cromatografía en columna con gel de sílice NH fue el gel de sílice Chromatorex NH (Fuji Silysia Chemical LTD). La cromatografía analítica en capa fina (TLC) se realizó con gel de sílice de TLC 60 F254, espesor de capa 0,25 mm (Merck KGaA) o gel de sílice de Chromatorex TLC NH F254, espesor de capa 0,25 mm (Fuji Silysia Chemical LTD). Las placas de TLC se visualizaron mediante tinción con tinción de panisaldehído, tinción de ácido fosfomolíbdico o tinción de Hanessian.
Todas las reacciones sensibles a la humedad se realizaron en atmósfera inerte. Los reactivos y disolventes eran de calidad comercial y se usaron tal como se suministraron, a menos que se indique lo contrario.
Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro JEOL ECZ500R (500 MHz), JEOL ECZ400S (400 MHz), Varian Inova 500 (500 MHz), Varian Mercury 400 (400 MHz) o Bruker Avance (600 MHz). Los desplazamientos químicos se notifican en partes por millón (ppm). Para los espectros de RMN de 1H (CDCl3, C6D6 y/o CD3OD), el pico de disolvente residual se usó como referencia interna (7,27 ppm en CDCh; 7,16 ppm en C6D6; 3,31 ppm en CD3OD).
Los resultados de los espectros de masas (EM) analíticos se obtuvieron utilizando un Waters Acquity UPLC equipado con un detector cuadripolar simple (SQ Detector 2) o LTQ Orbitrap XL™ (Thermo scientific).
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se llevó a cabo con Shimadzu LC-10AD en un detector espectrofotométrico Uv (200 nm, Shimadzu SPD-10A).
Las abreviaturas utilizadas en el presente documento son las siguientes: AIBN: 2,2'-azobis(isobutironitrilo); 9-BBN: 9-borabiciclo[3.3.1]nonano; Bu3SnH: hidruro de tri-normal-butilestaño; (+)-CSA: ácido (1S)-(+)-10-canforsulfónico; DMAP: 4-dimetilaminopiridina; DCM: diclorometano; DDQ: 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona; DIBAL: hidruro de diisobutilaluminio; DMF: N,N-dimetilformamida; DMSO: dimetilsulfóxido; Et3N: trietilamina; EtOAc: acetato de etilo; HF-piridina: fluoruro de hidrógeno-piridina; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución; IPA: alcohol isopropílico; MeCN: acetonitrilo; MeOH: metanol; MPM: para-metoxibencilo; PPh3: trifenilfosfina; t-BuOH: alcohol terc-butílico; tBuLi: terc-butil-litio; TBME: metil terc-butil éter; TBAF: fluoruro de tetrabutilamonio; TBS: terc-butildimetilsililo; THF: tetrahidrofurano; TMS: trimetilsililo; Ts: para-toluenosulfonilo.
Los intermedios de síntesis descritos en el presente documento se consideran parte de la presente invención.
Esquema A; Preparación del Compuesto A-7
TBSOTf HF-Py
Lutidina Piridina
TBSOTf
Lutidina 9-BBN
Peryodinano d
Dess-Martin
NaHCO
Ejemplo 1
(4aR,5aS,6R,8aS,9aR)-2,2-Di-terc-butil-6-metiloctahidrofuro[2',3':5,6]pirano[3,2-d][1,3,2]dioxasilin-7-ol
En atmósfera de nitrógeno, a la solución del Compuesto A-1: (4aR,5aS,6R,8aS,9aR)-2,2-di-terc-butil-6-metilhexahidrofuro[2',3':5,6]pirano[3,2-d][1,3,2]dioxasilin-7(8aH)-ona (A-1 18,5 g, 54,0 mmol) obtenido mediante el procedimiento escrito en Organic Letters (2009), 11 (2), 409-412 (N° CAS; 1095280-04-8) en tolueno (275 ml) a -78 °C, se añadió DIBAL (70,2 ml, 70,2 mmol, solución en tolueno 1,0 M) a lo largo de un periodo de 30 min. A continuación, la mezcla de reacción se agitó a -78 °C. Después de 90 min, la reacción se inactivó cuidadosamente con MeOH (4,37 ml) a -78 °C y después se retiró el baño de enfriamiento. Se añadió solución saturada de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado (300 ml) a la mezcla de reacción, se continuó agitando durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se vertió en un embudo de decantación, a continuación se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (300 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (300 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron, se concentraron a presión reducida. El lactol bruto se usó para la siguiente reacción sin purificación.
Ejemplo 2
(4aR,6S,7S,8aR)-6-((S)-but-3-en-2-il)-2,2-Di-terc-butilhexahidropirano[3,2-d][1,3,2]dioxasilin-7-ol (Compuesto A-2)
En atmósfera de nitrógeno, a la suspensión de bromuro de metiltrifenilfosfonio (73,30 g, 205,2 mmol) en THF (200 ml), se añadió terc-butóxido de potasio (17,27 g, 153,9 mmol) a -5 °C a lo largo de un periodo de 10 min y después se agitó durante 60 min a -5 °C. La solución del lactol bruto descrito en el Ejemplo 1 en THF (40 ml) se transfirió a la mezcla de reacción a -5 °C a lo largo de un periodo de 10 min, después se agitó a -5 °C durante 1 h, a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se inactivó con agua helada (400 ml), después se diluyó con TBME (400 ml) y después se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con TBME (400 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (400 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se suspendió con heptano/EtOAc = 1/1 (100 ml). La suspensión resultante se filtró, se enjuagó con heptano/EtOAc = 1/1 (100 ml) para eliminar el material derivado de trifenilfosfina. A continuación, el filtrado se concentró a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo en gel de sílice (400 g, gel de sílice 60, esférico, 40-50 pm, Kanto Chemical) usando del 0% al 20% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto A-2, 16,7 g, 90% de rendimiento).
1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 1,03 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 1,05 (s, 9 H) 1,07 (s, 9 H) 1,75 (dt, J=14,5, 3,0 Hz, 1 H) 2,37 (dt, J=14,5, 2,9 Hz, 1 H) 2,65 - 2,76 (m, 1 H) 3,03 (dd, J=9,8, 1,0 Hz, 1 H) 3,31 (m, 1 H) 3,69 (d, J=15,0 Hz, 1 H) 3,75 - 3,79 (m, 1 H) 4,16 - 4,31 (m, 2 H) 4,41 (t, J=2,9 Hz, 1 H) 4,95 - 5,09 (m, 2 H) 6,02 (ddd, J=17,3, 10,5, 6,3 Hz, 1 H).
Ejemplo 3
(4aR,6S,7S,8aR)-6-((S)-But-3-en-2-il)-2,2-di-terc-butil-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)hexahidropirano[3,2-d][1,3,2]dioxasilina (Compuesto A-3)
En atmósfera de nitrógeno, a una solución del Compuesto A-2: (4aR,6S,7S,8aR)-6-((S)-but-3-en-2-il)-2,2-di-tercbutilhexahidropirano[3,2-d][1,3,2]dioxasilin-7-ol (9,85 g, 28,8 mmol) descrito en el Ejemplo 2 en DCM (150 ml) a 0 °C se añadió 2,6-lutidina (6,68 ml, 57,5 mmol) y trifluorometanosulfonato de terc-butildimetilsililo (9,25 ml, 40,3 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 30 min, después a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla de reacción se diluyó con dietil éter. La capa orgánica se lavó con HCl ac. 0,5 N, NaHCO3 ac. sat. y después salmuera. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron (pequeña cantidad de SiO2) y se concentraron a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice usando del 0% al 15% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto A-3, 12,0 g, 91% de rendimiento).1
1H RMN (500 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,10 (s, 3 H) 0,19 (s, 3 H) 0,91 (s, 9 H) 0,96 (d, J=6,3 Hz, 3 H) 1,02 (s,
9 H) 1,06 (s, 9 H) 1,73 (dt, J=15,0, 4,0 Hz, 1 H) 2,26 (dt, J=15,0, 2,5 Hz, 1 H) 2,66 - 2,74 (m, 1 H) 2,95 (dd, J=9,5, 2,2 Hz, 1 H) 3,17 (m, 1 H) 3,81 - 3,84 (m, 1 H) 4,12 - 4,22 (m, 2 H) 4,24 (t, J=2,7 Hz, 1 H) 4,93 - 5,06 (m, 2 H) 6,08 (ddd, J=17,3, 10,5, 6,3 Hz, 1 H).
Ejemplo 4
(2R,3R,5S,6S)-6-((S)-But-3-en-2-il)-5-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-3-ol (Compuesto A-4)
En atmósfera de nitrógeno, a una solución del Compuesto A-3: (4aR,6S,7S,8aR)-6-((S)-but-3-en-2-il)-2,2-di-terc-butil-7-((terc-butildimetMsilil)oxi)hexahidropirano[3,2-d][1,3,2]dioxasilina (12 g, 26,3 mmol) descrito en el Ejemplo 3 en MeCN (120 ml) y DCM (40 ml) a -10 °C se añadió una solución premezclada de HF-piridina (4,0 ml) y piridina (20 ml) en 20 ml de MeCN. La mezcla de reacción se agitó a -10 °C durante 15 min, después a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se inactivó con NaHCÜ3 ac. sat. a 0 °C y se diluyó con DCM, después se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con DCM. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSÜ4, se filtró y se concentró a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice usando del 15% al 60% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto A-4, 8,4 g, rendimiento cuantitativo).
1H RMN (500 MHz, CLÜRÜFÜRMÜ-d) 5 ppm 0,13 (s, 3 H) 0,19 (s, 3 H) 0,94 (s, 9 H) 0,96 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 1,72 (dt, J=14,6, 2,9 Hz, 1 H) 2,15 (dd, J=9,8, 2,4 Hz, 1 H) 2,23 (dt, J=14,6, 2,9 Hz, 1 H) 2,55 - 2,65 (m, 1 H) 3,03 (d, J=9,8 Hz, 1 H) 3,41 - 3,46 (m, 1 H) 3,49 (d, J=11,7 Hz, 1 H) 3,62 - 3,72 (m, 2 H) 3,92 (ddd, J=11,7, 8,3, 2,4 Hz, 1 H) 4,02 (t, J=2,7 Hz, 1 H) 5,01 - 5,12 (m, 2 H) 5,93 (ddd, J=17,4, 10,4, 7,3 Hz, 1 H).
Ejemplo 5
(((2S,3S,SR,6R)-2-((S)-But-3-en-2-il)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-3,5-diil)bis(oxi))bis(tercbutildimetilsilano) (Compuesto A-5)
En atmósfera de nitrógeno, a una solución del Compuesto A-4: (2R,3R,5S,6S)-6-((S)-but-3-en-2-il)-5-((tercbutildimetilsilil)oxi)-2-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-3-ol (997 mg, 3,15 mmol) descrito en el Ejemplo 4 en DCM (10 ml) a 5 °C se añadió 2,6-lutidina (1,83 ml, 15,8 mmol) y trifluorometanosulfonato de terc-butildimetilsililo (2,17 ml, 9,45 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se diluyó con dietil éter y se inactivó con NaHCÜ3 ac. sat., después se separaron las capas. Los extractos orgánicos combinados se lavaron sucesivamente con HCl ac. 0,5 N, NaHCÜ3 ac. sat. y después salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSÜ4, se filtró y se concentró a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice usando del 0% al 5% de EtÜAc/heptano (que contenía el 1% de Et3N) proporcionó el compuesto del título (Compuesto A-5, 1,69 g, 98% de rendimiento).1
1H RMN (500 MHz, CLÜRÜFÜRMÜ-d) 5 ppm 0,02 - 0,08 (m, 15 H) 0,11 (s, 3 H) 0,89 (s, 9 H) 0,90 - 0,92 (m, 18 H) 0,94 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 1,82 (dt, J=14,9, 4,8 Hz, 1 H) 2,00 (dt, J=14,9, 2,9 Hz, 1 H) 2,62 - 2,72 (m, 1 H) 2,93 (dd, J=9,3, 2,0 Hz, 1 H) 3,27 - 3,34 (m, 1 H) 3,66 - 3,79 (m, 3 H) 3,83 - 3,87 (m, 1 H) 4,91 - 5,07 (m, 2 H) 6,11 (ddd, J=17,3, 10,7, 6,1Hz, 1 H).
Ejemplo 6
(S)-3-((2S,3S,5R,6R)-3,5-Bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)butan-1 -ol (Compuesto A-6)
A una solución de Compuesto A-5: (((2S,3S,5R,6R)-2-((S)-but-3-en-2-il)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-3,5-diil)bis(oxi))bis(terc-butildimetilsilano) (1,32 g, 2,42 mmol) descrito en el Ejemplo 5 en THF (10 ml) a 0 °C se añadió 9-BBN (9,69 ml, solución en THF 0,5 M, 4,84 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 1 hora y a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Se añadieron a la mezcla de reacción NaOH ac. 3,0 M (3 ml, 9,00 mmol) y peróxido de hidrógeno (al 35% en agua, 3 ml) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 30 min, después a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se inactivó con Na2SO3 ac. sat. y después se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 veces). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice usando del 0% al 20% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto A-6, 1,36 g, 100% de rendimiento).
1H RMN (500 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,03 (s, 3 H) 0,05 - 0,08 (m, 12 H) 0,10 (s, 3 H) 0,88 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 0,89 - 0,93 (m, 27 H) 1,55 - 1,65 (m, 1H) 1,82 (dt, J=15,4, 4,4 Hz, 1 H) 1,87 - 1,96 (m, 1 H) 1,97 - 2,03 (m, 1 H) 2,17 2,26 (m, 1H) 2,67 (dd, J=7,8, 3,9 Hz, 1 H) 2,98 - 3,10 (m, 1 H) 3,34 - 3,40 (m, 1 H) 3,59 - 3,86 (m, 6 H) ESI-MS (m/z): 563,64 [M+H]+, 585,62 [M+Na]+.
Ejemplo 7
(S)-3-((2S,3S,5R,6R)-3,5-Bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)butanal (Compuesto A-7)
En atmósfera de nitrógeno, a una solución del Compuesto A-6: (S)-3-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)butan-1-ol (1100 mg, 1,954 mmol) descrito en el Ejemplo 6 en dCm (30 ml) a 5 °C se añadieron NaHCO3 (41,0 mg, 0,49 mmol) y peryodinano de Dess-Martin (1077 mg, 2,54 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 3 h, la mezcla de reacción se diluyó con DCM y se inactivó con NaHCO3 ac. sat. y Na2SO3 ac. sat., después se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con DCM. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice usando del 0% al 25% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto A-7, 950 mg, 87% de rendimiento).
1H RMN (500 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,00 (s, 3 H) 0,03 - 0,08 (m, 12 H) 0,11 (s, 3 H) 0,88 (s, 9 H) 0,91 - 0,92 (m, 21H) 1,82 (dt, J=15,0, 4,5 Hz, 1 H) 2,01 (dt, J=15,0, 2,5 Hz, 1 H) 2,28 (ddd, J=16,0, 7,3, 2,4 Hz, 1 H) 2,53 -2,58 (m, 1 H) 2,74 (ddd, J=16,0, 5,5, 2,0 Hz, 1 H) 2,94 (dd, J=9,0, 1,7 Hz, 1 H) 3,29 (td, J=5,9, 2,0 Hz, 1 H) 3,68 (d, J=5,9 Hz, 2 H) 3,75 - 3,82 (m, 1 H) 3,82 - 3,90 (m, 1 H) 9,73 (t, J=2,4 Hz, 1 H).
Ejemplo 8
4-Metilbencenosulfonato de (2S,3S)-3-((4-metoxibencil)oxi)-2-metil-5-(trimetilsilil)pent-4-in-1-ilo (Compuesto B-2)
En atmósfera de nitrógeno, a la solución del Compuesto B-1: (2S,3S)-3-((4-metoxibencil)oxi)-2-metil-5-(trimetilsilil)pent-4-in-1-ol (11,08 g, 36,15 mmol) obtenido mediante el procedimiento descrito en el documento WO 9317690 A1 /US 5436238 A (N° CAS; 157323-41 -6) en DCM (330 ml), se añadieron Et3N (12,6 ml, 90,4 mmol) y cloruro de p-toluenosulfonilo (8,27 g, 43,4 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se lavó con NaHCO3 sat. y salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y después se concentró a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice (gel de sílice 60, esférico, 40-50 pm, Kanto Chemical) usando del 0% al 10% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto B-2, 17,7 g, 93% de rendimiento).
1H RMN (500 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,17 (s, 9 H) 1,02 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 2,10 - 2,18 (m, 1 H) 2,44 (s, 3 H) 3,82 (s, 3 H) 3,99 (d, J=6,8 Hz, 1 H) 4,04 - 4,07(m, 2 H) 4,33 (d, J=11,2 Hz, 1 H) 4,66 (d, J=11,2 Hz, 1 H) 6,87 (d, J=8,3 Hz, 2 H) 7,21 (d, J=8,3 Hz, 2 H) 7,33 (d, J=8,8 Hz, 2 H) 7,77 (d, J=8,8 Hz, 2 H).
Ejemplo 9
((3S,4R)-5-Yodo-3-((4-metoxibencil)oxi)-4-metilpent-1 -in-1 -il)trimetilsilano (Compuesto B-3)
En atmósfera de nitrógeno, a la solución del Compuesto B-2: 4-metilbencenosulfonato de (2S,3S)-3-((4-metoxibencil)oxi)-2-metil-5-(trimetilsilil)pent-4-in-1-ilo (17,7 g, 38,4 mmol) descrito en el Ejemplo 8 en DMF (360 ml), se añadió Nal (7,49 g, 50,0 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 2 horas. Se añadieron 2,0 g adicionales de Nal a la mezcla de reacción. La reacción se agitó durante 1,5 horas a 80 °C y después se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con dietil éter, se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice (gel de sílice 60, esférico, 40-50 pm, Kanto Chemical) usando del 10% al 20% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto B-3, 14,3 g, 89% de rendimiento).
1H RMN (500 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,21 (s, 9 H) 1,10 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 1,74 - 1,84 (m, 1 H) 3,30 - 3,37 (m, 2 H) 3,82 (s, 3 H) 3,96 (d, J=7,3 Hz, 1 H) 4,44 (d, J=11,2 Hz, 1 H) 4,73 (d, J=11,2 Hz, 1 H) 6,89 (d, J=8,8 Hz, 2 H) 7,30 (d, J=8,8 Hz, 2 H).
Esquema C; Preparación de Compuesto C-8
Ejemplo 10
(2S,6S,7S)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-Bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metil-9-(trimetilsilil)non-8-in-4-ol (Compuesto C-1)
En atmósfera de argón, a una solución de Compuesto B-3: ((3S,4R)-5-yodo-3-((4-metoxibencil)oxi)-4-metilpent-1-in-1-il)trimetilsilano (1408 mg, 3,382 mmol) descrito en el Ejemplo 9 en dietil éter (25 ml) a -78 °C se añadió terc-butillitio (1,61 M en pentano, 4,11 ml, 6,62 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -78 °C durante 45 min. Se añadió Compuesto A-7: (S)-3-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H
piran-2-il)butanal (825 mg, 1,47 mmol) descrito en el Ejemplo 7 en 5,0 ml de dietil éter a la mezcla de reacción a -78 °C. La mezcla de reacción se agitó a -78 °C durante 60 min. La mezcla de reacción se inactivó con NH4Cl ac. sat. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, después se concentró a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice usando del 0% al 25% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto C-1, 1167 mg, 93% de rendimiento).
1H RMN (500 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,00 - 0,12 (m, 21 H) 0,15 - 0,24 (m, 6 H) 0,82 - 0,96 (m, 30 H) 1,03 (d, J=6,3 Hz, 3H) 1,38 - 1,55 (m, 1H) 1,68 - 1,99 (m, 4 H) 2,10 - 2,30 (m, 2 H) 2,76 - 2,87 (m, 1 H) 3,15 (d, J=9,75 Hz, 1 H) 3,33 - 3,38 (m, 1 H) 3,56 - 4,02 (m, 9 H) 4,37 - 4,50 (m, 1 H) 4,64 - 4,78 (m, 1 H) 6,83 - 6,88 (m, 2H) 7,23 - 7,35 (m, 2H).
Ejemplo 11
(2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-Bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metil-9-(tributilestannil)non-8-en-4-ol (Compuesto C-3)
A una solución de Compuesto C-1: (2S,6S,7S)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(((tercbutildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metil-9-(trimetilsilil)non-8-in-4-ol (1165 mg, 1,37 mmol) descrito en el Ejemplo 10 en MeOH (20 ml) a 20 °C se añadió K2CO3 (189 mg, 1,37 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se inactivó con NH4Cl ac. sat., después se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice utilizando del 0% al 15% de EtOAc/heptano proporcionó el Compuesto C-2: (2S,6S,7S)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metilnon-8-in-4-ol (1050 mg, 98% de rendimiento). ESI-eM (m/z): 801,50 [M+Na]+
En atmósfera de nitrógeno, a una solución del Compuesto C-2: (2S,6S,7S)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((tercbutildimetilsilil)oxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metilnon-8-in-4-ol (780 mg, 1,00 mmol) obtenido anteriormente en tolueno (15 ml) a 20 °C se añadieron hidruro de tri-n-butilestaño (2,5 ml, 9,36 mmol) y 2,2'-azobis(isobutironitrilo) (82 mg, 0,50 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 90 °C durante 15 min. La reacción de la mezcla se concentró a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice usando del 0% al 15% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto C-3, 970 mg, 91% de rendimiento).
1H RMN (500 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,02 - 0,13 (m, 18 H) 0,84 - 0,96 (m, 48 H) 1,22 - 1,37 (m, 6 H) 1,47 -1,56 (m, 7 H) 1,72 - 1,90 (m, 3 H) 1,95-2,03 (m, 1 H) 2,11 - 2,28 (m, 2 H) 2,82 - 2,86 (m, 1 H) 3,08 - 3,15 (m, 1 H) 3,33 - 3,40 (m, 1 H) 3,43 - 3,53 (m, 1 H) 3,58 - 3,87 (m, 8 H) 4,25 - 4,31 (m, 1 H) 4,49 - 4,54 (m, 1 H) 5,83 (dd, J=19,3, 7,6Hz, 1 H) 6,05 - 6,13 (m, 1 H) 6,83 - 6,90 (m, 2 H) 7,24 (d, J=8,8 Hz, 2 H).
Ejemplo 12
(2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-Bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)-9-yodo-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metilnon-8-en-4-ona (Compuesto C-4)
En atmósfera de nitrógeno, a una solución del Compuesto C-3: (2S,6S,7S)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((tercbutildimetilsilil)oxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metil-9-(tributilestannil)non-8-en-4-ol (970 mg, 0,91 mmol) descrito en el ejemplo 11 en 30 ml de DCM a 5 °C se añadió yodo (242 mg, 0,95 mmol) en DCM (6 ml) hasta que mantuvo el color del yodo. La mezcla de reacción se inactivó con Na2SO3 ac. sat. y se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con DCM. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice usando del 0% al 25% de EtOAc/heptano proporcionó (2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(((tercbutildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)-9-yodo-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metilnon-8-en-4-ol (768 mg, 93% de rendimiento).
En atmósfera de nitrógeno, a una solución de (2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)-9-yodo-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metilnon-8-en-4-ol (768 mg, 0,85 mmol) obtenido anteriormente en DCM (25 ml) a temperatura ambiente se añadió NaHCO3 (17,8 mg, 0,21 mmol) y peryodinano de Dess-Martin (485 mg, 1,14 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla de reacción se diluyó con DCM y se inactivó con NaHCO3 ac. sat. y Na2SO3 ac. sat., y después se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con DCM. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice usando del 0% al 20% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto C-4, 776 mg, rendimiento cuantitativo).
1H RMN (500 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,00 (s, 3 H) 0,03 - 0,07 (m, 12 H) 0,10 (s, 3 H) 0,81 (d, J=6,3 Hz, 3 H) 0,84 (d, J=6,3 Hz, 3 H) 0,89 (s, 9 H) 0,91 (s, 9 H) 0,92 (s, 9 H) 1,80 (dt, J=15,0, 4,5 Hz, 1 H) 1,99 (dt, J=15,0, 2,5 Hz, 1 H) 2,17 (dd, J=16,6, 10,2 Hz, 1 H) 2,20 - 2,29 (m, 2 H) 2,43 - 2,48 (m, 1 H) 2,54 (d, J=12,7 Hz, 1 H) 2,87 (dd, J=9,0, 1,7 Hz, 1 H) 2,99 (dd, J=16,6, 2,9 Hz, 1 H) 3,27 (td, J=5,8, 2,4 Hz, 1 H) 3,50 - 3,56 (m, 1 H) 3,66 - 3,74 (m, 2H) 3,75 -3,78 (m, 1 H) 3,80 (s, 3 H) 3,81 - 3,85 (m, 1 H) 4,26 (d, J=11,7 Hz, 1 H) 4,50 (d, J=11,7 Hz, 1 H) 6,26 (d, J=14,6 Hz, 1 H) 6,42 (dd, J=14,6, 7,8 Hz, 1 H) 6,87 (d, J=8,3 Hz, 2 H) 7,21 (d, J=8,3 Hz, 2 H). ESI-MS (m/z): 927,39 [M+Na]+
Ejemplo 13
(2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-Bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)-9-yodo-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metilnon-8-en-4-ona (Compuesto C-5)
A una solución de Compuesto C-4: (2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-(((tercbutildimetilosilil)oxi)metil)tetrahidro-2H-piran-2-il)-9-yodo-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metilnon-8-en-4-ona (600 mg, 0,66 mmol) descrito en el Ejemplo 12 en THF (5,0 ml), IPA (5,0 ml) y t-BuOH (5,0 ml) a 4 °C se añadió ácido (1S)-(+)-10-canforsulfónico (154 mg, 0,66 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 4 °C durante 20 horas. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se inactivó con NaHCO3 ac. sat., después se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice utilizando del 0% al 35% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto C-5, 500 mg, 95% de rendimiento).1
1H RMN (500 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,01 (s, 3 H) 0,04 (s, 3 H) 0,07 (s, 3 H) 0,11 (s, 3 H) 0,86 - 0,91 (m, 15 H) 0,93 (s, 9 H) 1,83 (dt, J=14,9, 4,8 Hz, 1 H) 1,93 - 2,00 (dt, J=14,9, 4,8 Hz, 1 H) 2,19 - 2,26 (m, 1 H) 2,29 (dd, J=14,9, 5,6 Hz, 1 H) 2,39 (dd, J=16,6, 8,3 Hz, 1 H) 2,44 - 2,66 (m, 4 H) 2,91 (dd, J=9,5, 1,7 Hz, 1 H) 3,36 - 3,41 (m, 1 H) 3,48 (td, J=11,3, 2,7 Hz, 1 H) 3,59 (t, J=7,1 Hz, 1 H) 3,74 - 3,78 (m, 2 H) 3,80 (s, 3 H) 3,85 (m, 1 H) 4,25 (d, J=11,2 Hz, 1 H) 4,46 (d, J=11,2 Hz, 1 H) 6,28 (d, J=14,6 Hz, 1 H) 6,43 (dd, J=14,6, 7,8 Hz, 1 H) 6,87 (d, J=8,8 Hz, 2 H) 7,21 (d, J=8,8 Hz, 2 H). ESI-MS (m/z): 813,30 [M+Na]+
Ejemplo 14
4-Metilbencenosulfonato de ((2R,3R,5S,6S)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-((2S,6S,7S,E)-9-yodo-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metil-4-oxonon-8-en-2-il)tetrahidro-2H-piran-2-il)metilo (Compuesto C-6)
En atmósfera de nitrógeno, a una solución del Compuesto C-5: (2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((tercbutildimetilsilil)oxi)-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)-9-yodo-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metilnon-8-en-4-ona (500 mg, 0,63 mmol) descrita en el Ejemplo 13 en DCM (10 ml) a 5 °C se añadieron piridina (2,54 ml, 31,6 mmol), cloruro de p-toluenosulfonilo (723 mg, 3,79 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (77 mg, 0,63 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. Se añadió cloruro de p-toluenosulfonilo (150 mg, 0,79 mmol) a la mezcla de reacción a temperatura ambiente. Después, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas. La mezcla de reacción se diluyó con DCM y se inactivó con NaHCÜ3 ac. sat., después se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con DCM. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SÜ4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice usando del 0% al 25% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto C-6, 560 mg, 94% de rendimiento).
1H RMN (500 MHz, CLÜRÜFÜRMÜ-d) 5 ppm 0,01 (s, 3 H) 0,04 (s, 3 H) 0,04 (s, 3 H) 0,08 (s, 3 H) 0,81 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 0,83 (s, 9 H) 0,86 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 0,89 (s, 9 H) 1,81 (dt, J=14,9, 4,5 Hz, 1 H) 1,91 - 1,96 (m, 1 H) 2,15 - 2,32 (m, 3 H) 2,36 - 2,42 (m, 1 H) 2,43 (s, 3 H) 2,57 (d, J=12,7 Hz, 1 H) 2,77 (dd, J=16,6, 3,4 Hz, 1 H) 2,87 (dd, J=9,0, 1,7 Hz, 1 H) 3,53 - 3,58 (m, 2 H) 3,70 - 3,75 (m, 1 H) 3,80 - 3,85 (m, 1H) 3,81 (s, 3 H) 4,06 (dd, J=10,0, 5,0 Hz, 1 H) 4,08 - 4,16 (m, 1 H) 4,28 (d, J=11,2 Hz, 1 H) 4,51 (d, J=11,2 Hz, 1 H) 6,30 (d, J=14,6 Hz, 1 H) 6,45 (dd, J=14,6, 7,8 Hz, 1 H) 6,88 (d, J=8,8 Hz, 2 H) 7,24 (d, J=8,8 Hz, 2 H) 7,31 (d, J=8,3 Hz, 2 H) 7,76 (d, J=8,3 Hz, 2 H).
Ejemplo 15
(2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-6-(Azidometil)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)-9-yodo-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metilnon-8-en-4-ona (Compuesto C-7)
En atmósfera de nitrógeno, a una solución del Compuesto C-6: 4-metilbencenosulfonato de ((2R,3R,5S,6S)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-((2S,6S,7S,E)-9-yodo-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metil-4-oxonon-8-en-2-il)tetrahidro-2H-piran-2-il)metilo (560 mg, 0,59 mmol) descrito en el Ejemplo 14 en Dm Sü (5,6 ml) a 20 °C se añadió azida sódica (385 mg, 5,92 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 85 °C. Después de 2 h, se añadió azida sódica (100 mg, 1,54 mmol) a la mezcla de reacción, después la mezcla de reacción se agitó a 85 °C durante 14 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se inactivó con H2O, después se separaron las capas. Los extractos orgánicos se lavaron sucesivamente con agua y salmuera. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SÜ4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar un residuo bruto. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice usando del 0% al 15% de EtÜAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto C-7, 298 mg, 62% de rendimiento).1
1H RMN (500 MHz, CLÜRÜFÜRMÜ-d) 5 ppm 0,03 (s, 3 H) 0,06 (s, 3 H) 0,07 (s, 3 H) 0,10 (s, 3 H) 0,84 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 0,85 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 0,91 (s, 9 H) 0,92 (s, 9 H) 1,86 (dt, J=15,0, 4,7 Hz, 1 H) 1,98 (dt, J=15,0, 2,9 Hz, 1 H) 2,19 - 2,32 (m, 3 H) 2,41 - 2,49 (m, 1 H) 2,58 (d, J=12,7 Hz, 1 H) 2,94 (dd, J=16,6, 2,9 Hz, 1 H) 2,98 (dd, J=8,8, 2,0 Hz, 1 H) 3,02 (dd, J=12,7, 2,9 Hz, 1 H) 3,47 (dt, J=8,8, 2,7 Hz, 1 H) 3,49 - 3,54 (m, 1 H) 3,63 (dd, J=12,7, 8,8 Hz, 1 H) 3,69 - 3,73 (m, 1 H) 3,81 (s, 3H) 3,83 - 3,88 (m, 1 H) 4,26 (d, J=11,7 Hz, 1 H) 4,50 (d, J=11,7 Hz, 1 H) 6,26 (d, J=14,6 Hz, 1 H) 6,42 (dd, J=14,6, 7,8 Hz, 1 H) 6,87 (d, J=8,8 Hz, 2 H) 7,22 (d, J=8,8 Hz, 2 H).
Ejemplo 16
Carbamato de (((2R,3R,5S,6S)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-((2S,6S,7S,E)-9-yodo-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metil-4-oxonon-8-en-2-il)tetrahidro-2H-piran-2-il)metilo) (Compuesto C-8)
A una solución de Compuesto C-7: (2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-6-(azidometil)-3,5-bis((tercbutildimetilsilil)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)-9-yodo-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metilnon-8-en-4-ona (298 mg, 0,37 mmol) descrito en el Ejemplo 15 en THF (10 ml) y agua (1,0 ml) a 20 °C se añadió trifenilfosfina (1437 mg, 5,478 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 70 °C durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para dar una amina bruta. A una solución de la amina bruta obtenida anteriormente en THF (10 ml) a 5 °C se añadió Et3N (0,51 ml, 3,66 mmol) y dicarbonato de dialilo (341 mg, 1,83 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 60 min. La reacción de la mezcla se concentró a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice usando del 0% al 25% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto C-8, 300 mg, 94% de rendimiento).
1H RMN (500 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,05 - 0,07 (m, 9 H) 0,11 (s, 3 H) 0,85 (d, J=6,3 Hz, 3 H) 0,87 (d, J=6,3 Hz, 3 H) 0,90 (s, 9 H) 0,93 (s, 9 H) 1,80 (dt, J=15,0, 4,4 Hz, 1 H) 1,96 (dt, J=15,0, 2,8 Hz, 1 H) 2,16 - 2,29 (m, 2 H) 2,32 - 2,39 (m, 1 H) 2,53 - 2,60 (m, 3 H) 2,86 (d, J=7,3 Hz, 1 H) 3,04 - 3,11 (m, 1 H) 3,30 - 3,34 (m, 1 H) 3,38 - 3,48 (m, 1 H) 3,58 (t, J=7,1 Hz, 1 H) 3,70 - 3,76 (m, 1 H) 3,80 (s, 3 H) 3,81 - 3,84 (m, 1 H) 4,25 (d, J=11,2 Hz, 1 H) 4,46 (d, J=11,2 Hz, 1 H) 4,53 - 4,63 (m, 2 H) 5,19 (dd, J=10,7, 1,5 Hz, 1 H) 5,32 (d, J=17,1 Hz, 1 H) 5,47 (d, J=6,8 Hz, 1 H) 5,88 - 5,99 (m, 1 H) 6,28 (d, J=14,6 Hz, 1 H) 6,43 (dd, J=14,6, 7,8 Hz, 1 H) 6,87 (d, J=8,8 Hz, 2 H) 7,21 (d, J=8,8 Hz, 2 H). ESI-MS (m/z): 896,34 [M+Na]+
Esquema D; Preparación del Compuesto D-7
Ejemplo 17
Compuesto D-4
En atmósfera de nitrógeno (en una caja de guantes), a una solución del Compuesto D-2: (S)-N-(2-(4-isopropil-4,5-dihidrooxazol-2-il)-6-metoxifenil)metanosulfonamida (155 mg, 0,497 mmol) obtenido mediante el procedimiento escrito en Organic Letters (2002), 4 (25), 4431-4434 (N° CAS; 546141-34-8) y 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno (107 mg, 0,497 mmol) en MeCN (0,75 ml) se añadió cloruro de cromo (II) (55,5 mg, 0,452 mmol) y después la mezcla resultante se agitó en la caja de guantes a temperatura ambiente durante 1 h. La solución verde resultante se añadió a una mezcla de Compuesto C-8: (((2R,3R,5S,6S)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-6-((2S,6S,7S,E)-9-yodo-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metil-4-oxonon-8-en-2-il)tetrahidro-2H-piran-2-il)metil)carbamato de alilo (99,0 mg, 0,113 mmol) descrito en el Ejemplo 16, Compuesto D-1 (80,0 mg, 0,09 mmol) obtenido mediante el procedimiento escrito en Journal of the American Chemical Society (1992), 114 (8), 3162-3164 (N° CAS; 157322-23-1), Compuesto D-3: dicloro(2,9-dimetil-1,10-fenantrolina)níquel (0,46 mg, 1,36 pmol) obtenido mediante el procedimiento descrito en Journal of the American Chemical Society (2009), 131 (42), 15387 - 15393 (N° CAS; 21361-04-6) y cloruro de litio (3,83 mg, 0,09 mmol). La mezcla de reacción se agitó en la caja de guantes a temperatura ambiente durante 60 min. A continuación, la mezcla de reacción se sacó de la caja con guantes, se diluyó con dietil éter-EtOAc (5,0 ml - 5,0 ml), después se añadió Florisil® (1600 mg, 15,94 mmol) (N° CAS; 1343-88-0) a la mezcla. Después, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. La mezcla se filtró (Celite®), se lavó con EtOAc/heptano = 2/1, después el filtrado se concentró a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice utilizando del 3% al 55% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto D-4, 140 mg, 95% de rendimiento).
Ejemplo 18
Compuesto D-5
En atmósfera de nitrógeno, a una solución del Compuesto D-4 (140 mg, 0,09 mmol) descrito en el Ejemplo 17 en DCM (5,0 ml) a 5 °C se añadieron NaHCO3 (28,8 mg, 0,34 mmol) y peryodinano de Dess-Martin (72,7 mg, 0,17 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 60 min. La mezcla de reacción se diluyó con DCM y se inactivó con NaHCO3 ac. sat. y Na2SO3 ac. sat., y después se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con DCM. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice utilizando del 2% al 60% de EtOAc/heptano proporcionó el compuesto del título (Compuesto D-5, 120 mg, 86%).
1H RMN (500 MHz, BENZENE-d8) ó ppm 0,01 - 0,05 (m, 9 H) 0,10 - 0,12 (m, 6 H) 0,15 (s, 3 H) 0,76 (d, J=6,1 Hz, 3 H) 0,96 (s, 9 H) 1,02 (s, 9 H) 1,04 (s, 9 H) 0,95 - 1,10 (m, 7H) 1,20 (d, J=7,3 Hz, 3 H) 1,31 - 1,37 (m, 3 H) 1,41 (dd, J=12,8, 4,9 Hz, 1 H) 1,40 - 1,58 (m, 4 H) 1,59 - 1,64 (m, 1 H) 1,69 - 1,89 (m, 3H) 1,90 - 1,99 (m, 2 H) 2,02 - 2,25 (m, 8 H) 2,26 - 2,48 (m, 6 H) 2,49 - 2,70 (m, 6 H) 2,71 - 2,84 (m, 2 H) 3,00 - 3,07 (m, 1 H) 3,12 - 3,30 (m, 4 H) 3,36 (s, 3 H) 3,40 (a.s, 1 H) 3,44 - 3,53 (m, 2 H) 3,65 (dd, J=6,4, 4,0 Hz, 1 H) 3,69 - 3,84 (m, 4H) 3,86 - 4,03 (m, 4H) 4,07 - 4,17 (m, 3 H) 4,27
- 4,29 (m, 1H) 4,27 (d, J=11,0 Hz, 1H) 4,48 - 4,58 (m, 1 H) 4,49 (d, J=11,0 Hz, 1H) 4,65 - 4,70 (m, 2 H) 4,68 (d, J=5,5 Hz, 1H) 4,74 - 4,86 (m, 2H) 4,78 (s, 1H) 4,93 (s, 1 H) 5,05 (d, J=10,4 Hz, 1 H) 5,09 (s a., 1 H) 5,19 (s a., 1 H) 5,30 (dd, J=17,1, 1,2 Hz, 1 H) 5,82 (d, J=8,0 Hz, 1 H) 5,86 - 5,96 (m, 1 H) 6,46 (d, J=15,9 Hz, 1 H) 6,84 - 6,92 (m, 3 H) 7,31 (d, J=8,6 Hz, 2 H).
Ejemplo 19
Se disolvió clorhidrato de imidazol (155 mg, 1,48 mmol) en DMF (2,9 ml) para dar una solución de clorhidrato de imidazol 0,5 M en DMF. Se mezcló 1,0 ml de esta solución con 1,0 ml de TBAf (solución en THF 1,0 M) para dar una solución premezclada de TBAF 0,5 M y clorhidrato de imidazol 0,25 M en THF-DMF (1:1). En atmósfera de nitrógeno, a una solución del Compuesto D-5 (80,0 mg, 0,05 mmol) descrito en el Ejemplo 18 en DMF (7,0 ml) a 20 °C se añadieron 0,588 ml de solución premezclada de TBAF (0,5 M) y clorhidrato de imidazol (0,25 M) en THF-DMF (1:1) preparada anteriormente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 14 horas. Se añadieron 1,6 g de CaCÜ3 y 4,0 g de Dowex® 50WX8 (forma de hidrógeno, malla de 200-400, SIGMA-ALDRICH) a la mezcla de reacción. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Después, la mezcla se diluyó con EtOAc, después se filtró (Celite®), se lavó con EtOAc. El filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo bruto. Se añadieron 1000 mg de CaCO3 y 2,25 g de Dowex® 50WX8 a la solución en EtOAc (6,0 ml) del residuo bruto. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas. Después, la mezcla se diluyó con EtOAc, se filtró (Celite®), se lavó con EtOAc. El filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo bruto (63,0 mg). A una solución del residuo bruto (63,0 mg) obtenido anteriormente en DCM (6,0 ml), t-BuOH (0,6 ml) y tampón de fosfato de pH 7 (0,6 ml, 1/15 M) a temperatura ambiente, se añadió DDQ (111 mg, 0,49 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 45 min. La mezcla de reacción se inactivó con NaHCO3 ac. sat., después se diluyó con d Cm y las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo con DCM (3 veces). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice NH utilizando del 10% al 100% de EtOAc/heptano, después el 10% de MeOH/EtOAc proporcionó un compuesto del título ligeramente purificado (Compuesto D-6, 15,0 mg, 27%).1
1H RMN (500 MHz, METANOL-d4) 5 ppm 0,97 (d, J=7,0 Hz, 3 H) 0,97 (d, J=7,0 Hz, 3 H) 1,00 - 1,02 (m, 1 H) 1,05 (d, J=7,3 Hz, 3 H) 1,09 (d, J=6,3 Hz, 3 H) 1,31 - 1,45 (m, 6H) 1,46 - 1,63 (m, 5H) 1,64 - 1,75 (m, 3 H) 1,80 - 1,86 (m, 2 H) 1,87 - 1,93 (m, 2 H) 1,94 - 2,11 (m, 9H) 2,13 - 2,27 (m, 8H) 2,33 (d, J=2,4 Hz, 2 H) 2,39 (dd, J=13,4, 6,1 Hz, 1 H) 2,44 (dd, J=17,6, 2,0 Hz, 1 H) 2,55 (dd, J=17,6, 9,3 Hz, 1 H) 2,75 - 2,84 (m, 1 H) 2,97 (dd, J=9,3, 2,0 Hz, 1 H) 3,21 (dd, J=6,6, 4,6 Hz, 1 H) 3,32 (m, 1 H) 3,41 - 3,46 (m, 1 H) 3,57 (s a., 1 H) 3,60 (d, J=11,7 Hz, 1 H) 3,67 - 3,74 (m, 2 H) 3,78 (s a., 1 H) 3,86 - 3,90 (m, 2 H) 3,97 (d, J=2,4 Hz, 1 H) 4,02 - 4,11 (m, 4 H) 4,17 (dd, J=6,6, 4,6 Hz, 1 H) 4,23 (dd, J=11,5, 2,2 Hz, 1 H) 4,29 (a.s, 1 H) 4,31 (td, J=9,3, 3,9 Hz, 1 H) 4,44 (d, J=10,2 Hz, 1 H) 4,51 (d, J=5,4 Hz, 2 H) 4,59 (t, J=4,9 Hz, 1 H) 4,61 (dd, J=7,3, 4,9 Hz, 1 H) 4,69 (t, J=4,6 Hz, 1 H) 4,80 (s, 1 H) 4,85 - 4,87 (m, 1 H) 5,01 (s, 1 H) 5,05 (s, 1 H) 5,16 (dd, J=10,7, 1,0 Hz, 1 H) 5,28 (dd, J=17,1,2,0 Hz, 1 H) 5,92 (m, 1 H). ESI-MS (m/z): 1172,57 [M+Na]+
En atmósfera de nitrógeno, a una solución del Compuesto D-6 (15,0 mg, 0,013 mmol) descrito en el Ejemplo 19, se añadió tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) (7,53 mg, 6,52 pmol) pirrolidina (10,8 pl, 0,13 mmol) en DCM (2,0 ml) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. La reacción de la mezcla se concentró a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo sobre gel de sílice NH usando el 50% de EtOAc/heptano, después del 0% al 20% de MeOH/EtOAc, proporcionó un producto purificado de forma aproximada. El producto apenas purificado obtenido se purificó por HPLC para dar el compuesto del título. (D-7, 7,0 mg, 47%, tiempo de retención = 13,8 min).
Condiciones de HPLC:
Columna: YMC Pak Pro C18 (20 mm x 250 mm)
Longitud de onda de detección: 200 nm
Temperatura de la columna: temperatura ambiente
Fase móvil: MeCN-Agua (0,05% de AcOH)
Caudal: 8 ml/min
Eluido:
MeCN/25% de agua (iso, 2 min), después
MeCN/ del 25% al 60% de agua (gradiente, 20 min)
1H RMN (500 MHz, METANOL-d4) 5 ppm 0,99 (d, J=6,7 Hz, 3 H) 1,00 - 1,03 (m, 1 H) 1,04 (d, J=7,3 Hz, 3 H) 1,06 (d, J=7,3 Hz, 3 H) 1,10 (d, J=6,1 Hz, 3 H) 1,29 - 1,63 (m, 10 H) 1,65 - 1,78 (m, 3 H) 1,79 - 1,89 (m, 2 H) 1,92 - 2,12 (m, 10 H) 1,93 (s, 3 H) 2,13 - 2,36 (m, 9 H) 2,41 (dd, J=13,5, 6,1 Hz, 1 H) 2,45 (dd, J=17,6, 2,2 Hz, 1 H) 2,56 (dd, J=17,6, 9,8 Hz, 1 H) 2,75 - 2,84 (m, 1 H) 2,98 (dd, J=9,8, 1,8 Hz, 1 H) 3,12 (dd, J=12,8, 3,7 Hz, 1 H) 3,22 (dd, J=6,4, 4,6 Hz, 1 H) 3,26 (dd, J= 13,2, 7,8 Hz, 1 H) 3,39 (d, J=1,8 Hz, 1 H) 3,61 (d, J=12,8 Hz, 1 H) 3,63 - 3,68 (m, 2 H) 3,68 - 3,76 (m, 2 H) 3,81 - 3,94 (m, 3 H) 4,00 (d, J=2,5 Hz, 1 H) 4,03 - 4,15 (m, 4 H) 4,18 (dd, J=6,4, 4,6 Hz, 1 H) 4,25 (ddd, J=11,0, 4,3, 1,8 Hz, 1 H) 4,27 - 4,36 (m, 2 H) 4,46 (d, J=11,0 Hz, 1 H) 4,57 - 4,65 (m, 2 H) 4,70 (t, J=4,6 Hz, 1 H) 4,81 (d, J=1,2 Hz, 1 H) 5,02 (s a, 1 H) 5,06 (d, J=1,8 Hz, 1 H). ESI-MS (m/z): 1066,96 [M+H]+, 1090,19 [M+Na]+
Compuesto (1) (forma libre de sal del Compuesto D-7): 1H RMN (600 MHz, METANOL-d4) 5 ppm 0,98 (d, J=7,2 Hz, 3 H) 1,00 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 1,02 (m, 1 H) 1,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 1,09 (d, J=6,4 Hz, 3 H) 1,28 - 1,45 (m, 5 H) 1,46 - 1,59 (m, 4 H) 1,57 - 1,63 (m, 1 H) 1,65 - 1,71 (m, 1 H) 1,70 - 1,75 (m, 2 H) 1,79 - 1,86 (m, 2 H) 1,91 (dt, J=14,9, 3,1 Hz, 1
H) 1,94 - 2,11 (m, 8 H) 2,14 - 2,34 (m, 9 H) 2,39 (dd, J=13,2, 6,0 Hz, 1 H) 2,44 (dd, J=17,4, 1,9 Hz, 1 H) 2,56 (dd, J=17,6, 9,6 Hz, 1 H) 2,69 (dd, J=13,2, 4,2 Hz, 1 H) 2,79 (ddq, J=15,9, 7,6, 2,0 Hz, 1 H) 2,92 (dd, J=13,2, 8,3 Hz, 1 H) 2,97 (dd, J=9,6, 1,7 Hz, 1 H) 3,21 (dd, J=6,4, 4,9 Hz, 1 H) 3,29 (m, 1 H) 3,34 (dd, J=8,3, 4,15 Hz, 1 H) 3,58 (s a., 1 H) 3,60 (a.d, J=11,3 Hz, 1 H) 3,68 - 3,73 (m, 2 H) 3,80 (s a., 1 H) 3,84 - 3,90 (m, 2 H) 3,98 (d, J=2,3 Hz, 1 H) 4,03 - 4,13 (m, 4 H) 4,17 (dd, J=6,4, 4,9 Hz, 1 H) 4,24 (ddd, J=11,3, 4,5, 1,5 Hz, 1 H) 4,29 (dd, J=4,0, 1,9 Hz, 1 H) 4,32 (td, J=10,2, 4,2 Hz, 1 H) 4,44 (a. d, J=11,0 Hz, 1 H) 4,59 (t, J=4,5 Hz, 1 H) 4,62 (dd, J=7,4, 4,7 Hz, 1 H) 4,69 (t, J=4,7 Hz, 1 H) 4,80 (s a., 1 H) 4,87 (s, 1 H) 5,00 (s a., 1 H) 5,05 (a.d, J=1,1 Hz, 1 H)
ESI-MS (m/z): 1066,57 [M+H]+, 1088,55 [M+Na]+
Ejemplos de ensayos farmacológicos
Información general
Se conocen en la literatura compuestos naturales de halicondrina y compuestos modificados de la misma (véanse, por ejemplo, D. Uemura et al. "Norhalichondrin A: An Antitumor Polyether Macrolide from a Marine Sponge" J. Am. Chem. Soc., 107, 4796 (1985); Marc Litaudon et al. "Antitumor Polyether Macrolides: New and Hemisynthetic Halichondrins from the New Zealand Deep-Water Sponge Lissodendoryx sp." J. Org. Chem., 1997, 62, 1868-1871). Sin embargo, la mayor parte de los mismos no están fácilmente disponibles. Por ejemplo, el Dr. Uemura et al. aislaron 12,5 mg de halicondrina B, 35,0 mg de norhalicondrina A y 17,2 mg de homohalicondrina A de una cantidad tan grande como 600 kg de Halichondria okadai Kadota (véase, por ejemplo, Norhalichondrin A: An Antitumor Polyether Macrolide from a Marine Sponge" J. Am. Chem. Soc., 107, 4796 (1985)). De entre los compuestos naturales de halicondrina, la halicondrina B muestra las actividades antitumorales más potentes frente a células de melanoma B-16 in vitro y es muy activa contra la leucemia L-1210 in vivo (véase, por ejemplo, D. Uemura et al. "Norhalichondrin A: An Antitumor Polyether Macrolide from a Marine Sponge" J. Am. Chem. Soc., 107, 4796 (1985)). La halicondrina C también es activa en diversos modelos in vivo, pero inestable en solución acuosa en comparación con la halicondrina B. La norhalicondrina B es mucho más débil que la halicondrina B no solo in vitro sino también in vivo (véase, por ejemplo, D. Uemura et al. "Norhalichondrin A: An Antitumor Polyether Macrolide from a Marine Sponge" J. Am. Chem. Soc., 107, 4796 (1985)). Los ensayos farmacológicos siguientes utilizan halicondrina B (Hali-B) como compuestos de referencia según sea necesario.
Ejemplo de ensayo farmacológico 1. Ensayo de inhibición del crecimiento de FaDu
En este ensayo, se midió la actividad inhibidora del crecimiento de los compuestos de ensayo en una línea celular FaDu de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello humano (SCCHN). Las células FaDu se mantuvieron en un medio RPMI-1640 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 187-02021) que contenía el 10% de suero bovino fetal (FBS: Nichirei, 12D168) y penicilina y estreptomicina en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). A cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Becton, Dickinson and Company, 353219), se añadieron 75 gl de suspensión de células FaDu ajustada a una concentración de 4 x 104 células/ml con el medio de cultivo, y las células se cultivaron durante la noche en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Al día siguiente, se añadieron a cada pocillo 25 gl de Compuesto (1) o halicondrina B en una dilución en serie triple suspendidos en el medio de cultivo, y el resultado se incubó durante 3 días en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Después, se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega) con el lector EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). El valor de los pocillos que contenían células sin la adición de los compuestos de ensayo se definió como el 100% y el valor de los pocillos que no contenían células se definió como el 0%. Se calculó la concentración del compuesto de ensayo necesaria para inhibir el crecimiento celular en un 50% (es decir, el valor de CI50), y se muestra en la tabla 1.
Tabla 1
FaDu
Compuesto de ensayo (CI50 (nM))
Halicondrina B 0,124
Compuesto (1) 0,0714
Ejemplo de ensayo farmacológico 2. Ensayo de inhibición del crecimiento de MDA-MB231
En este ensayo, se midió la actividad inhibidora del crecimiento de los compuestos de ensayos en una línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB231. Las células MDA-MB231 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 044-29765) que contenía el 10% de suero de bovino fetal (FBS: Nichirci, 12D168) y penicilina y estreptomicina en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). A cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Becton, Dickinson and Company, 353219), se añadieron 75 gl de suspensión de células MDA-MB231 ajustada a una concentración de 4 x 104 células/ml con el medio de cultivo, y las células se incubaron durante la noche en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Al día siguiente, se añadieron a cada pocillo 25 gl de Compuesto
(1) o halicondrina B en una dilución en serie triple suspendidos en el medio de cultivo, y el resultado se incubó durante 3 días en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Después, se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega) con el lector EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). El valor de los pocillos que contenían células sin la adición de los compuestos de ensayo se definió como el 100% y el valor de los pocillos que no contenían células se definió como el 0%. Se calculó la concentración del compuesto de ensayo necesaria para inhibir el crecimiento celular en un 50% (es decir, un valor de CI50), y se muestra en la tabla 2.
Tabla 2
MDA-MB231
Compuesto de ensayo (CI50 (nM))
Halicondrina B 1,000
Compuesto (1) 0,109
Ejemplo de ensayo farmacológico 3. Ensayo de inhibición del crecimiento HCC1954
En este ensayo, se midió la actividad inhibidora del crecimiento de los compuestos de ensayo en una línea celular de cáncer de mama humano HCC1954. Las células HCC1954 se mantuvieron en un medio RPMI-1640 modificado para contener L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, glucosa 4500 mg/l y bicarbonato de sodio 1500 mg/l (ATCC 30-2001) que contenía el 10% de suero bovino fetal (FBS: Nichirei, 12D168) y penicilina y estreptomicina en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). A cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Becton, Dickinson and Company, 353219), se añadieron 75 pl de suspensión de células HCC1954 ajustada a una concentración de 4 x 104 células/ml con el medio de cultivo, y las células se incubaron durante la noche en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Al día siguiente, se añadieron a cada pocillo 25 pl de Compuesto (1) o halicondrina B en una dilución en serie triple suspendidos en el medio de cultivo, y el resultado se incubó durante 3 días en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Después, se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega) con el lector EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). El valor de los pocillos que contenían células sin la adición de los compuestos de ensayo se definió como el 100% y el valor de los pocillos que no contenían células se definió como el 0%. Se calculó la concentración del compuesto de ensayo necesaria para inhibir el crecimiento celular en un 50% (es decir, un valor de CI50), y se muestra en la tabla 3.
Tabla 3
HCC1954
Compuesto de ensayo (CI50 (nM))
Halicondrina B 0,154
Compuesto (1) 0,0668
Ejemplo de ensayo farmacológico 4. Efectos antitumorales en un modelo de xenoinjerto subcutáneo FaDu en ratones como monoterapia
Una línea celular FaDu de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) humano, que se había cultivado en un medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina y estreptomicina, se ajustó a una concentración de 4,8 x 107 células/ml con solución salina equilibrada de Hanks para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 7 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan Inc.). Nueve días después de la inoculación de las células, se midieron el diámetro más corto y el diámetro más largo de un tumor en cada ratón usando un calibre digital electrónico (calibre Digimatic™, Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen del tumor de según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2
Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Regresión tumoral (%) = (1-RTV mínimo) x 100
Sobre la base de los volúmenes tumorales obtenidos el primer día de administración, los ratones se agruparon de forma que los promedios de los volúmenes tumorales fueran sustancialmente iguales entre los grupos. Cada compuesto de ensayo se disolvió en DMSO y se almacenó una solución en el congelador antes de su uso. Inmediatamente antes de la administración, la solución madre se diluyó en solución salina con hidroxipropil-pciclodextrina 100 pM. Cada muestra de evaluación se administró por vía intravenosa a una dosis máxima tolerable
(MTD). Por cierto, el experimento se llevó a cabo en grupos que consistían en 4 ratones cada uno. La regresión tumoral (%) de cada compuesto de ensayo se mostró en la tabla 4.
Tabla 4
Compuesto de ensayo Dosis (mg/kg) Regresión tumoral (%) Halicondrina B 0,05 0
Compuesto (1) 0,2 43
Ejemplo de ensayo farmacológico 5. Actividad antitumoral frente a OSC-19 en un modelo de xenoinjerto subcutáneo en ratones como monoterapia
Una línea celular de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) humano OSC-19, que se había cultivada en un medio DMEM/Ham's F-12 (1:1) que contenía el 10% de FBS, y penicilina y estreptomicina, se ajustó a una concentración de 1 x 108 células/ml con PBS para preparar una suspensión celular, y la suspensión se mezcló con Matrigel™ (BD Bioscience, N° de catálogo 366237) en una proporción de 1:1 para preparar una suspensión celular en una concentración de 5 x 107 células/ml. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 5 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Seis días después de la inoculación de las células, se midieron el diámetro más corto y el diámetro más largo de un tumor en cada ratón usando un calibre digital electrónico (calibre Digimatic™, Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen tumoral según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2 Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Regresión tumoral (%) = (1-RTV mínimo) x 100
Sobre la base de los volúmenes de tumores obtenidos el primer día de administración, los ratones se agruparon de forma que los promedios de los volúmenes de los tumores fueran sustancialmente iguales entre los grupos. El experimento se realizó en grupos que consistían en 6 ratones cada uno. El compuesto de ensayo se disolvió en solución salina y se administró por vía intravenosa a una dosis de 0,06 mg/kg a 0,18 mg/kg una vez a la semana durante 2 semanas (programa Q7Dx2). La regresión tumoral (%) de cada dosis de ensayo se muestra en la tabla 5.
Tabla 5
Compuesto de ensayo Dosis (mg/kg) Regresión tumoral (%)
Compuesto (1) 0,06 59
Compuesto (1) 0,18 90
Ejemplo de ensayo farmacológico 6. Actividad antitumoral contra HCC1806 en un modelo de xenoinjerto subcutáneo en ratones como monoterapia
Una línea celular de cáncer de mama humano HCC1806, que se había cultivado en un medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina y estreptomicina, se ajustó a una concentración de 1 x 108 células/ml con PBS para preparar una suspensión celular, y la suspensión se mezcló con Matrigel™ (BD Bioscience, N° de catálogo 366237) en una proporción de 1:1 para preparar una suspensión celular con una concentración de 5 x 107 células/ml. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 5 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Doce días después de la inoculación de las células, se midieron el diámetro más corto y el diámetro más largo de un tumor en cada ratón usando un calibre digital electrónico (calibre Digimatic™, Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen tumoral según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2 Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Regresión tumoral (%) = (1-RTV mínimo) x 100
Sobre la base de los volúmenes tumorales obtenidos el primer día de la administración, los ratones se agruparon de forma que los promedios de los volúmenes de los tumores fueran sustancialmente iguales entre los grupos. El experimento se realizó en grupos que consistían en 6 ratones cada uno. El compuesto de ensayo se disolvió en solución salina y se administró por vía intravenosa a una dosis de 0,18 mg/kg una vez a la semana durante 2 semanas
(programa Q7Dx2). La regresión tumoral (%) para el Compuesto (1) se muestra en la tabla 6.
Tabla 6
Compuesto de ensayo Dosis (mg/kg) Regresión tumoral (%) Compuesto (1) 0,18 90
Ejemplo de ensayo farmacológico 7. Efectos antitumorales en un modelo de xenoinjerto subcutáneo FaDu en combinación con cetuximab en ratones
Una línea celular FaDu de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) humano, que se había cultivado en un medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina y estreptomicina, se ajustó a una concentración de 5 x 107 células/ml con solución salina equilibrada de Hanks para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 7 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan Inc.). Diez días después de la inoculación de las células, se midieron el diámetro más corto y el diámetro más largo de un tumor en cada ratón usando un calibre digital electrónico (calibre Digimatic™, Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen tumoral según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2
Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Regresión tumoral el día 35 (%) = (1 -RTV mínimo) x 100
Sobre la base de los volúmenes tumorales obtenidos el primer día de administración, los ratones se agruparon de forma que los promedios de los volúmenes tumorales fueran sustancialmente iguales entre los grupos. Cada compuesto de ensayo se disolvió en DMSO y se almacenó una solución en el congelador antes de su uso. Inmediatamente antes de la administración, la solución madre se diluyó en solución salina con hidroxipropil-pciclodextrina 100 pM. Cada compuesto de ensayo se administró por vía intravenosa a dosis de 1/4 MTD a 1/2 MTD en combinación con cetuximab (Erbitux, Merck Serono Co., Ltd.). Por cierto, el experimento se llevó a cabo en grupos que consistían en 4 ratones cada uno. La regresión tumoral el día 35 (%) de cada compuesto de ensayo se muestra en la tabla 7.
Tabla 7
Compuesto de ensayo Dosis (mg/kg) Cetuximab (mg/kg) Regresión tumoral el día 35 (%) - - 20 -242
Halicondrina B 0,0125 20 -38
0,025 20 -2
Compuesto (1) 0,05 20 38
0,1 20 60
Ejemplo de ensayo farmacológica 8. Actividad antitumoral en un modelo de xenoinjerto subcutáneo KPL-4 en combinación con trastuzumab en ratones
Una línea celular de cáncer de mama positivo para HER-2 humano KPL-4, que se había cultivado en un medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina y estreptomicina, se ajustó a una concentración de 1 x 108 células/ml con solución salina equilibrada de Hank para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 7 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Dieciséis días después de la inoculación de las células, se midieron el diámetro más corto y el diámetro más largo de un tumor en cada ratón usando un calibre digital electrónico (calibre Digimatic™, Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen tumoral según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2
Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Regresión tumoral (%) = (1-RTV mínimo) x 100
Sobre la base de los volúmenes tumorales obtenidos el primer día de la administración, los ratones se agruparon de
forma que los promedios de los volúmenes tumorales fueran sustancialmente iguales entre los grupos. El experimento se realizó en grupos que consistían en 6 ratones cada uno. Cada compuesto de ensayo se disolvió en DMSO y se almacenó una solución en el congelador antes de su uso. Inmediatamente antes de la administración, la solución madre se diluyó en solución salina. El compuesto de ensayo se administró por vía intravenosa a una dosis de 0,09 mg/kg o 0,18 mg/kg en combinación con trastuzumab (Herceptin, Genentech, Inc.). La regresión tumoral para el Compuesto (1) se muestra en la tabla 8.
Tabla 8
Compuesto de ensayo Dosis (mg/kg) Trastuzumab (mg/kg) Regresión tumoral (%)
- - 10 0
Compuesto (1) 0,09 - 43
0,09 10 83
0,18 - 87
0,18 10 100
Ejemplo de ensayo farmacológico 9. Efecto sobre vasos positivos para CD31 en el modelo subcutáneo FaDu en ratones
Una línea celular FaDu de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) humano, que se había cultivado en un medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina y estreptomicina, se ajustó a una concentración de 5 x 107 células/ml con PBS para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 7 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Diez días después de la inoculación de las células, se administró por vía intravenosa un compuesto de ensayo en solución salina con 100 pM de hidroxipropilp-ciclodextrina a dosis de 1/2 MTD a MTD. El experimento se llevó a cabo en grupos que consistían en 3 ratones cada uno. Cinco días después de la administración, se recogieron muestras tumorales y se fijaron con fijador de zinc IHC (BD Pharmingen) a 4 °C durante 24 horas. Se seccionaron tejidos embebidos en parafina (3 pm), se montaron en portaobjetos cargados positivamente y se secaron al aire. La tinción inmunohistoquímica de CD31 se llevó a cabo usando un autoteñidor Ventana modelo Discover XT (Roche Diagnostics) según el protocolo del fabricante. Las secciones se desparafinaron, se acondicionaron y los antígenos se recuperaron con CC1 (Ventana Medical Systems). Los portaobjetos se bloquearon con Bloqueador A y Bloqueador B (kit de bloqueo de biotina endógena, Roche Diagnostics). Se aplicó anticuerpo IgG CD31 anti-ratón de rata (Dianova GmbH) a una concentración de 2 pg/ml. Las secciones se incubaron con el anticuerpo durante 6 h, seguidas de 32 minutos de incubación con anticuerpo IgG anti rata biotinilado (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a una concentración de 2,2 pg/ml. La detección se realizó con estreptavidina-HRP D durante 16 min, seguidos de incubación con DAB D y DAB H2O2 D (kit DABMap, Ventana Medical Systems, Inc) durante 8 min. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina II (Roche Diagnostics) durante 16 min, seguidos de incubación con reactivo Bluing durante 4 min. Las secciones se deshidrataron en etanoles graduados, se desengrasaron en reemplazo de xileno y se cubrieron con DPX (Merck KGaA).
Los portaobjetos inmunoteñidos se escanearon utilizando el sistema de obtención de imágenes en portaobjetos automatizado Vectra 2 (Perkin Elmer Inc.). El número de vasos sanguíneos en la totalidad del tumor se cuantificó mediante el recuento de objetos positivos para CD31 utilizando el programa informático inForm 2 (PerkinElmer Inc.) El área de la región tumoral se midió evaluando el área con tinción de hematoxilina utilizando el programa informático inform 2 (PerkinElmer Inc.) El número de vasos sanguíneos se normalizó por el área de la región tumoral. Se calculó una tasa de aumento del número de vasos sanguíneos del grupo de dosificación del compuesto de ensayo con la fórmula siguiente, y se muestra en la tabla 9.
Tasa de aumento del número de vasos sanguíneos (%) = (número de vasos sanguíneos del grupo de dosificación con el compuesto de ensayo - número de vasos del grupo de control) / número de vasos del grupo de control) x 100
Tabla 9
Compuesto de ensayo Dosis (mg/kg) Tasa de aumento del número de vasos sanguíneos (%) Halicondrina B 0,025 31
0,05 39
Compuesto (1) 0,10 69
0,20 154
Ejemplo de ensayo farmacológico 10. Efecto sobre los CAF positivos para a-SMA en el modelo subcutáneo FaDu Una línea celular de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) humano FaDu, que se había cultivado en un medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina y estreptomicina, se ajustó a una concentración de 5 x 107 células/ml con PBS para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 5 a 6 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Diez días después de la inoculación de las células, se administró por vía intravenosa un compuesto de ensayo en solución salina con hidroxipropil-pciclodextrina 100 pM a 1/2 MTD y MTD. El experimento se llevó a cabo en grupos que consistían en 3 ratones cada uno. Dos días después de la administración, se recogieron muestras tumorales y se fijaron con fijador de zinc IHC (BD Pharmingen) a 4 °C durante 24 horas. Se seccionaron tejidos embebidos en parafina (3 pm), se montaron en portaobjetos cargados positivamente y se secaron al aire durante 6 horas. La tinción inmunohistoquímica de a-SMA se realizó utilizando el autoteñidor Ventana modelo Discover XT (Roche Diagnostics). Las secciones se desparafinaron, se acondicionaron y los antígenos se recuperaron con tampones patentados, EZPrep y CC1 (Ventana Medical Systems). Se aplicó anticuerpo monoclonal anti-a-SMA de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (clon 1A4, Sigma) a una dosis de 5 pg/ml. Las secciones se incubaron con el anticuerpo durante 6 horas. La detección se realizó con el kit RedMap (Ventana Medical Systems, Inc). Las secciones se deshidrataron en etanoles graduados, se desengrasaron en reemplazo de xileno y se cubrieron con DPX (Merck KGaA). Los cortes de tumor en serie se desparafinizaron y se tiñeron con hematoxilina de Mayer (Muto Pure Chemicals) durante 1 min. Las secciones se deshidrataron en etanoles graduados, se desengrasaron en reemplazo de xileno y se cubrieron con DPX (Merck KGaA).
Los portaobjetos inmunoteñidos se escanearon utilizando el sistema de obtención de imágenes en portaobjetos automatizado Vectra 2 (Perkin Elmer Inc.). El área de la región positiva para a-SMA en la totalidad del tumor se cuantificó mediante el recuento de los objetos positivos para a-SMA utilizando el programa informático inForm 2 (PerkinElmer Inc.). El área de la región tumoral se midió evaluando el área con tinción de hematoxilina utilizando el programa informático inForm 2 (PerkinElmer Inc.). El área de la región positiva para a-SMA se normalizó por el área de la región tumoral. Se calculó una tasa de supresión del área positiva para a-SMA del grupo de dosificación del compuesto de ensayo con la fórmula siguiente, y se muestra en la tabla 10.
Tabla 10
Compuesto de ensayo Dosis (mg/kg) Tasa de supresión del área positiva para a-SMA (%) Halicondrina B 0,025 7
0,05 3
Compuesto (1) 0,10 21
0,20 28
Tasa de supresión de área positiva para a-SMA (%) =-((área positiva para a-SMA del grupo de dosificación con el compuesto de ensayo - área positiva para a-SMA del grupo de control) (área positiva para a-SMA del grupo de control) x 100.
Ejemplo de ensayo farmacológico 11. Modelo de ratón de trasplante ortotópico HSC-2
Se establecieron células HSC-2-Luc transducidas con luciferasa mediante transferencia génica mediada por retrovirus. En primer lugar, el fragmento de ADN que codifica luciferasa de luciérnaga se obtuvo del plásmido potenciador de pGL3 (N° de catálogo de GenBank: U47297) y se subclonó en el vector retroviral pCX4pur (N° de catálogo de GenBank: AB086386). Después, se produjeron retrovirus recombinantes exentos de ayudantes mediante la transfección del vector de expresión retroviral anterior junto con los plásmidos pGP y pE-Ampho (Takara Bio; Shiga, Japón), en células 293T (ATCC; Manassas, Estados Unidos). A continuación, las células HSC-2 se infectaron con los retrovirus recombinantes y se cultivaron durante dos semanas en presencia de puromicina (2 pg/ml). Las células infectadas se seleccionaron de una población proliferativa policlonal del cultivo.
La línea celular humana SCCHN, HSC-2-Luc, se inoculó en la lengua de ratones desnudos hembra anestesiados (1 x 106 células en 50 pl de PBS), 6 semanas de edad (ratones CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj; Charles River, Inc.; Shizuoka, Japón). Siete días después del trasplante, se analizó el volumen tumoral utilizando la señal de bioluminiscencia de las células HSC-2-Luc. Para obtener imágenes de bioluminiscencia, se inyectaron 0,1 ml de 15 mg/ml de D-luciferina (Promega, Madison, WI) por vía intraperitoneal a ratones desnudos anestesiados por inhalación de isoflurano a del 1% al 2%. La señal de bioluminiscencia se monitorizó utilizando la serie IVIS SPECTRUM (PerkinElmer, Waltham, MA), que consiste en una cámara de dispositivo de carga acoplada refrigerado de alta sensibilidad. Se utilizó el programa informático Living Image (PerkinElmer, Waltham, MA) para cuadricular los datos de imágenes e integrar la señal de bioluminiscencia total en cada región de interés (ROI). Todas las imágenes de bioluminiscencia se adquirieron con una exposición de 1 segundo. Los datos se analizaron utilizando emisión total de flujo de fotones (fotones/segundo) en los ROI.
Sobre la base de la emisión total de flujo de fotones obtenida el primer día de administración, los ratones se agruparon de forma que los promedios de la emisión total de flujo de fotones fueran sustancialmente iguales entre los grupos. Se administró Compuesto (1) o cisplatino por vía intravenosa con o sin cetuximab (Erbitux, Merck Serono Co., Ltd.) una vez a la semana durante 3 semanas (programa Q7Dx3). Se realizaron dos experimentos usando un procedimiento idéntico y se recogieron todos los datos de los experimentos. Cada grupo consistía en 16 ratones.
Los datos de las imágenes mostraron que solo el tratamiento del Compuesto (1) con cetuximab redujo claramente la señal de bioluminiscencia en todos los ratones después del Día 14 (figura 6A-6B). Se calculó el tiempo medio de supervivencia (MST) para cada grupo de tratamiento como la mediana de los días de la muerte. El aumento de la duración de vida (ILS) se calculó mediante la fórmula siguiente: ILS (%) = (MST de animales tratados con el compuesto de ensayo - MST de animales de control) / MST de animales de control x 100. El ILS (%) de cada compuesto de ensayo se muestra en la tabla 11.
Tabla 11
Compuesto de ensayo Dosis (mg/kg) Cetuximab (mg/kg) ILS (%)
- - 5 231
Cisplatino 5 - 0
5 5 150
Compuesto (1) 0,09 - 238
0,09 5 >1150
Ejemplo de ensayo farmacológico 12. Modelo de xenoinjerto s.c. FaDu en combinación con radiación
Se establecieron células FaDu-Luc transducidas con luciferasa mediante transferencia génica mediada por retrovirus. En primer lugar, el fragmento de ADN que codifica luciferasa de luciérnaga se obtuvo del plásmido potenciador de pGL3 (N° de catálogo de GenBank: U47297) y se subclonó en el vector retroviral pCX4pur (N° de catálogo de GenBank AB086386). Después, se produjeron retrovirus recombinantes exentos de ayudantes mediante la transfección del vector de expresión retroviral anterior junto con los plásmidos pGP y pE-Ampho (Takara Bio; Shiga, Japón), en células 293T (ATCC; Manassas, Estados Unidos). A continuación, las células FaDu se infectaron con los retrovirus recombinantes y se cultivaron durante dos semanas en presencia de puromicina (2 pg/ml). Las células infectadas se seleccionaron de una población proliferativa policlonal del cultivo.
Una línea de células SCCHN humana transducida con luciferasa FaDu-Luc, que se había cultivado en un medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina y estreptomicina, se ajustó a una concentración de 5 x 107 células/ml con solución salina equilibrada de Hank para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del muslo derecho de ratones desnudos, de 6 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Trece días después de la inoculación de las células, se analizó el volumen tumoral utilizando la señal de bioluminiscencia de las células FaDu-Luc. Para obtener imágenes de bioluminiscencia, se inyectaron 0,1 ml de 15 mg/ml de D-luciferina (Promega, Madison, WI) por vía intraperitoneal a ratones desnudos anestesiados por inhalación de isoflurano a del 1% al 2%. La señal de bioluminiscencia se monitorizó utilizando la serie IVIS SPECTRUM (PerkinElmer, Waltham, MA), que consiste en una cámara de dispositivo de carga acoplada refrigerado de alta sensibilidad. Se utilizó el programa informático Living Image (PerkinElmer, Waltham, MA) para cuadricular los datos de imágenes e integrar la señal de bioluminiscencia total en cada región de interés (ROI). Todas las imágenes de bioluminiscencia se adquirieron con una exposición de 1 segundo. Los datos se analizaron utilizando emisión total de flujo de fotones (fotones/segundo) en los ROI. La emisión total de flujo de fotones se calculó según las fórmulas de cálculo siguientes:
Nivel de bioluminiscencia relativa = Emisión total de flujo de fotones (día X) / Emisión total de flujo de fotones (el primer día)
Regresión tumoral (%) = (1 - nivel de bioluminiscencia relativa mínimo) x 100
Sobre la base de la emisión total de flujo de fotones obtenida el primer día de administración, los ratones se agruparon de forma que los promedios de la emisión total de flujo de fotones fueran sustancialmente iguales entre los grupos. El experimento se realizó en grupos que consistían en 6 ratones cada uno. El Compuesto (1) se administró mediante inyección en la vena de la cola los Días 1 y 8. La irradiación se realizó con 18 Gy los días 4 y 11. La regresión tumoral para el Compuesto (1) se muestra en la tabla 12.
Compuesto de ensayo Dosis (mg/kg) Radiación (Gy) Regresión tumoral (%) - - 18 16
Compuesto (1) 0,09 - 0
0,09 18 97
Ejemplo de ensayo farmacológico 13. Actividad antitumoral en un modelo singénico subcutáneo CT26 en combinación con anticuerpo anti-mPD-1 en ratones
Una línea celular indiferenciada de carcinoma de colon murino CT26, que se había cultivado en un medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina y estreptomicina, se ajustó a una concentración de 2 x 107 células/ml con solución salina equilibrada de Hank para preparar una suspensión celular. El día 1, la suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 gl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones BALB/c, de 6 semanas de edad (BALB/cAnNCrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Dos días después de la inoculación de las células, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos y cada grupo consistía en 8 ratones. Se midieron el diámetro más corto y el diámetro más largo de un tumor en cada ratón utilizando un calibre digital electrónico (calibre Digimatic™, Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen tumoral según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2
T/C = (volumen tumoral medio del grupo tratado)/(volumen tumoral medio del grupo de control)
Inhibición del crecimiento tumoral (%) = (1-(T/C) x 100
El compuesto de ensayo se administró por vía intravenosa a una dosis de 0,09 mg/kg los días 3 y 11. El anticuerpo anti-mPD-1 (BE0146, Bio X Cell) se administró por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg los días 3, 7, 11 y 15. La inhibición de crecimiento tumoral el día 15 (%) de cada compuesto de ensayo se muestra en la tabla 13.
Tabla 13
Compuesto de ensayo Dosis (mg/kg) Anticuerpo anti-mPD-1 (mg/kg) Inhibición del crecimiento tumoral el día 15 (%)
- - 10 32
Compuesto (1) 0,09 - 30
0,09 10 62
Ejemplo de ensayo farmacológico 14. Efecto sobre la polimerización de tubulina in vitro (figura 10A)
Se adquirió el kit de ensayo de polimerización de tubulina de Cytoskeleton, Inc. (N° de catálogo BK011P). El kit contenía 1 botella de proteína tubulina liofilizada purificada de cerebro porcino, 3 tubos de GTP liofilizado, 2 botellas de tampón de ensayo liofilizado y 1 botella de tampón de tubulina-glicerol. El tampón de ensayo se preparó disolviendo el contenido en 10 ml de agua desionizada y esterilizada. Esta solución contenía 80 mmol/l de sal de sesquisodio de piperazina-N,N'-bis[ácido 2-etanosulfónico], 2,0 mmol/l de cloruro de magnesio, 0,5 mmol/l de ácido etilenglicol-bis(2-amino-etil éter)-N,N,N',N-tetraacético, pH 6,9 y 10 gmol/l de reportero fluorescente. El tampón se almacenó a -70 °C hasta su uso. El tampón de tubulina-glicerol consistía en 80 mmol/l de sal de sesquisodio de piperazina-N,N'-bis[ácido 2-etanosulfónico], 2,0 mmol/l de cloruro de magnesio, 0,5 mmol/l de ácido etilenglicol-bis(2-amino-etil éter)-N,N,N',N'-tetraacético y glicerol al 60% v/v, pH 6,9. Se almacenó a 4 °C hasta su uso. La solución madre de GTP se preparó disolviendo el contenido de cada tubo en 100 gl de agua desionizada y se esterilizó para lograr una concentración de 100 mmol/l de GTP. Se almacenaron partes alícuotas de esta solución madre a -70 °C hasta su uso. La solución madre de tubulina (10 mg/ml) se preparó disolviendo el polvo de tubulina mediante la adición de 1,1 ml de la mezcla de tampón de ensayo y solución madre de GTP (100:1, v/v). Las partes alícuotas se congelaron en nitrógeno líquido y después se almacenaron a -70 °C hasta su uso.
En el ensayo de polimerización de tubulina, la mezcla de reacción se preparó mezclando 820 gl de tampón de ensayo, 17,6 gl de solución madre de GTP y 600 gl de tampón de tubulina-glicerol. La mezcla de reacción (1015 gl) se combinó con 240 gl de la solución madre de tubulina. Esta solución se denominó mezcla de reacción de tubulina y se usó para la medición de pocillos de ensayo y de control. Se preparó una mezcla de reacción de no tubulina mezclando 89,85 gl de mezcla de reacción y 21,25 gl de tampón de ensayo para la medición de pocillos en blanco. La solución del Compuesto (1) (6,25-100 gmol/l; concentraciones finales 0,625-10 gmol/l) o vehículo se añadieron a un volumen de 5 gl a pocillos individuales de una placa de microvaloración de media área de 96 pocillos. Se añadió mezcla de reacción de tubulina o mezcla de reacción de no tubulina a un volumen de 45 gl a cada pocillo de la placa. La emisión de fluorescencia a 460 nm (longitud de onda de excitación a 360 nm) se midió cada 2 minutos durante 90 minutos usando el lector de microplacas SpectraMax® M5e (Molecular Devices). A la polimerización de tubulina siguió un aumento de
la fluorescencia debido a la incorporación de un reportero de fluorescencia en los microtúbulos a medida que se producía la polimerización. El ensayo se realizó por duplicado. El ensayo demostró que el Compuesto (1) inhibía la polimerización de tubulina de forma dependiente de la concentración. La intensidad de fluorescencia en cada punto temporal se calculó mediante las fórmulas siguientes:
Intensidad de fluorescencia = medición de fluorescencia media de pocillos de ensayo o pocillos de control - medición de fluorescencia media de pocillos en blanco; pocillo en blanco: con vehículo sin tubulina; pocillo de control: con vehículo y tubulina; pocillo de ensayo: con compuestos y tubulina.
Ejemplo de ensayo farmacológico 15. Ensayo de dinámica de microtúbulos basado en células (figura 10B)
Se realizó un ensayo de dinámica de microtúbulos (MT) basado en células con la línea celular de osteosarcoma U2OS-EB3-AG, en el que la proteína de fusión de EB3 (un microtúbulo más proteína de unión al extremo) y Azami-Green (EB3-AG) se expresaron de forma estable. Las células U2OS-EB3-AG se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina-estreptomicina, a 37 °C en una atmósfera humidificada con el 5% de CO2. La dinámica de MT en las células vivas se puede visualizar como el movimiento de la estructura de tipo cometa de EB3-AG. Las células U2OS-EB3-AG plaqueadas en placas de cultivo con base de vidrio (placa EZVIEW, AGC Techno Glass, Japón) se trataron con el Compuesto (1) a la concentración indicada y la dinámica de los microtúbulos se supervisó mediante la obtención de imágenes en lapsos temporales usando un microscopio fluorescente con lente de objetivo sumergida en aceite con un aumento de 60 veces (BZ-X710, KEYENCE, Japón). Las imágenes fijas en los puntos temporales indicados se presentaron en la figura 10B. Las vistas de mayor aumento de las áreas encuadradas se mostraron en las entradas. Cuando se tratan con el Compuesto (1) a 0,5 nM (valor de CI50 para la actividad antiproliferativa en células U2OS-EB3-AG), las estructuras de tipo cometa se hicieron difíciles de observar aproximadamente 60 minutos después de la adición del compuesto. Estos resultados demostraron claramente que el Compuesto (1) tenía la capacidad de suprimir la dinámica de MT.
Ejemplo de ensayo farmacológico 16. Actividad antiproliferativa in vitro (figura 11)
Se realizaron ensayos antiproliferativos in vitro para el Compuesto (1) utilizando un pequeño panel de líneas celulares cancerosas que incluían carcinoma de células escamosas de esófago humano (OE21, TE-8), adenocarcinoma de esófago humano (OE33) y sarcoma uterino humano (MES-SA, MES-SA-Dx5-Rx1). Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina-estreptomicina (medio de cultivo), en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). A cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Becton, Dickinson and Company, 353219) se añadieron 75 pl de suspensión celular ajustada a una concentración de 4 x 104 células/ml con el medio de cultivo, y las células se incubaron durante la noche en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Al día siguiente, se añadieron a cada pocillo 25 pl del Compuesto (1) en una dilución en serie triple suspendidos en el medio de cultivo, y el resultado se incubó durante 72 horas en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Después, se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega) con el lector EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). El valor de los pocillos que contenían células sin la adición de los compuestos de ensayo se definió como el 100% y el valor de los pocillos que no contenían células se definió como el 0%. Se calculó la concentración del compuesto (1) de ensayo necesaria para inhibir el crecimiento celular en un 50% (es decir, un valor de CI50), y se muestra en la figura 11. La susceptibilidad de la P-gp se calculó como la relación entre el valor de CI50 en células MES-SA-Dx5-Rx1, que sobreexpresan P-gp, y el valor de CI50 en células MES-SA.
Ejemplo de ensayo farmacológico 17. Efectos antitumorales en modelos de xenoinjerto KPL-4 en ratones como monoterapia; efectos antitumorales en modelos de xenoinjerto COLO-704 en ratones como monoterapia (figura 12)
Una línea celular KPL-4 de cáncer de mama positivo para HER-2 humano, que se había cultivado en un DMEM que contenía el 10% de FBS, y penicilina-estreptomicina, se ajustó a una concentración de 1 x 108 células/ml con solución salina equilibrada de Hanks para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 8 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan Inc.). Once días después de la inoculación de las células (Día 1), se midió el diámetro más corto y el diámetro más largo de un tumor en cada ratón usando un calibre digital electrónico (calibre Digimatic™, Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen del tumor según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2
Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Peso corporal relativo (RBW) = Peso corporal (día X)/Peso corporal (el primer día)
Sobre la base de los volúmenes de tumores obtenidos el Día 1, los ratones se agruparon de forma que los promedios de los volúmenes tuorales fueran sustancialmente iguales entre los grupos. El experimento se llevó a cabo en grupos que consistían en seis ratones cada uno. El compuesto de ensayo se disolvió en DMSO y se almacenó una solución en el congelador antes de su uso. Inmediatamente antes de la administración, la solución madre se diluyó con solución
salina. El compuesto de ensayo en solución salina se administró por vía intravenosa una vez por semana a una dosis de 20 pg/kg, 60 pg/kg o 180 pg/kg durante 2 semanas (el Día 1 y el Día 8). La regresión tumoral se observó en los grupos tratados con 60 pg/kg y 180 pg/kg, y la administración a una dosis de 180 pg/kg erradicó por completo los tumores de xenoinjerto en todos los ratones el Día 15.
Una línea celular de cáncer de ovario humano COLO-704, que se había cultivado en un RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina-estreptomicina, se ajustó a una concentración de 1 x 108 células/ml con solución salina equilibrada de Hanks para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 5 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan Inc.). Nueve días después de la inoculación de las células (Día 1), se midió el diámetro más corto y el diámetro más largo de un tumor en cada ratón usando un calibre digital electrónico (calibre Digimatic™, Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen del tumor según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2
Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Peso corporal relativo (RBW) = Peso corporal (día X)/Peso corporal (el primer día)
Sobre la base de los volúmenes tumorales obtenidos el Día 1, los ratones se agruparon de forma que los promedios de los volúmenes tumorales fueran sustancialmente iguales entre los grupos. El experimento se llevó a cabo en grupos que consistían en seis ratones cada uno. El compuesto de ensayo se disolvió en DMSO y se almacenó una solución en el congelador antes de su uso. Inmediatamente antes de la administración, la solución madre se diluyó con solución salina. El compuesto de ensayo en solución salina se administró por vía intravenosa una vez a la semana a una dosis de 20 pg/kg, 60 pg/kg o 180 pg/kg durante 2 semanas (el Día 1 y el Día 8). El tratamiento con el compuesto indujo regresión tumoral a una dosis de 180 pg/kg y un retraso en el crecimiento tumoral a una dosis de 60 pg/kg. La administración a una dosis de 180 pg/kg erradicó por completo los tumores de xenoinjerto en todos los ratones el día 22.
Ejemplo de ensayo farmacológico 18. Efecto sobre vasos positivos para CD31 en el modelo subcutáneo FaDu en ratones (figura 13)
Una línea celular de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) humano FaDu, que se había cultivado en un medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina-estreptomicina (medio de cultivo), se ajustó a una concentración de 5 x 107 células/ml con medio de cultivo para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 6 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Diez días después de la inoculación de las células, los ratones se agruparon de forma que los promedios de los volúmenes tumorales fueran sustancialmente iguales entre los grupos. El experimento se realizó en grupos que consistían en 6 ratones cada uno. Cada compuesto de ensayo se disolvió en DMSO y se almacenó una solución en el congelador antes de su uso. Inmediatamente antes de la administración, la solución madre se diluyó con solución salina. El compuesto de ensayo en solución salina se administró por vía intravenosa a una dosis de 20 pg/kg, 60 pg/kg o 180 pg/kg. Cinco días después de la única administración, se recogieron muestras tumorales y se fijaron con fijador de zinc IHC (BD Pharmingen) a 4 °C durante 24 horas. Se seccionaron tejidos embebidos en parafina (3 pm), se montaron en portaobjetos cargados positivamente y se secaron al aire. La tinción inmunohistoquímica de CD31 se llevó a cabo utilizando un autoteñidor Ventana modelo Discover XT (Roche Diagnostics) según el protocolo del fabricante. Las secciones se desparafinaron, se acondicionaron y los antígenos se recuperaron con CC1 (Ventana Medical Systems). Los portaobjetos se bloquearon con Bloqueador A y Bloqueador B (kit de bloqueo de biotina endógena, Roche Diagnostics). Se aplicó anticuerpo IgG CD31 anti-ratón de rata (Dianova GmbH) a una concentración de 2 pg/ml. Se incubaron secciones con el anticuerpo durante 6 horas, seguidas de 32 minutos de incubación con anticuerpo IgG anti-rata biotinilado (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a una concentración de 2,2 pg/ml. La detección se realizó con estreptavidina-HRP D durante 16 minutos, seguidos de incubación con DAB D y DAB H2O2 D (kit DABMap, Ventana Medical Systems, Inc.) durante 8 minutos. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina II (Roche Diagnostics) durante 16 minutos, seguidos de incubación con reactivo Bluing durante 4 minutos. Las secciones se deshidrataron en etanoles graduados, se desengrasaron en reemplazo de xileno y se cubrieron con DPX® (Merck KGaA). Los portaobjetos inmunoteñidos se escanearon utilizando el sistema de obtención de imágenes en portaobjetos automatizado Vectra®2 (Perkin Elmer Inc.). El número de vasos sanguíneos en la totalidad del tumor se cuantificó mediante recuento de objetos positivos para CD31 utilizando el programa informático inform 2 (PerkinElmer Inc.) El área de la región tumoral se midió evaluando el área con tinción de hematoxilina utilizando el programa informático inform 2 (PerkinElmer Inc.) El número de vasos sanguíneos se normalizó por el área de la región tumoral. La administración única del compuesto de ensayo en dosis de 20, 60 y 180 pg/kg aumentó el número de vasos sanguíneos del tumor. Las relaciones del número de vasos sanguíneos en los grupos de dosificación del compuesto de ensayo en comparación con el grupo no tratado se calcularon con la fórmula siguiente:
Relación de vasos tumorales = números de vasos sanguíneos del grupo de dosificación con el compuesto de ensayo
/ número de vasos sanguíneos del grupo no tratado)
Ejemplo de ensayo farmacológico 19. Efecto sobre CAF positivos para a-SMA en el modelo subcutáneo FaDu en ratones (figura 14)
Una línea celular de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) humano FaDu, que se había cultivado en un medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina-estreptomicina (medio de cultivo), se ajustó a una concentración de 5 x 107 células/ml con medio de cultivo para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 gl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 6 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Diez días después de la inoculación de las células, los ratones se agruparon de forma que los promedios de los volúmenes tumorales fueran sustancialmente iguales entre los grupos. El experimento se llevó a cabo en grupos que consistían en 5 ratones cada uno. Cada compuesto de ensayo se disolvió en DMSO y se almacenó una solución en el congelador antes de su uso. Inmediatamente antes de la administración, la solución madre se diluyó con solución salina. El compuesto de ensayo en solución salina se administró por vía intravenosa a una dosis de 20 gg/kg, 60 gg/kg o 180 gg/kg. Dos días o 5 días después de la única administración, se recogieron muestras tumorales y se fijaron con fijador de zinc IHC (BD Pharmingen) a 4 °C durante 24 horas. Se seccionaron tejidos embebidos en parafina (3 gm), se montaron en portaobjetos cargados positivamente y se secaron al aire. Las secciones se desparafinaron, se acondicionaron y los antígenos se recuperaron utilizando microondas con EDTA 1 mM a pH 6,0. Las secciones se bloquearon con BSA al 1% en TBS. Se aplicó anticuerpo monoclonal anti-a-SMA de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (clon 1A4, Sigma) a 5 gg/ml. Las secciones se incubaron con el anticuerpo durante 2,5 horas. La detección se realizó con el kit de sustrato Fast red II (Nichirei Bioscience Inc.). Las secciones se contratiñeron con hematoxilina de Mayer (Muto Pure Chemicals) durante 50 segundos. Las secciones se deshidrataron en etanoles graduados, se desengrasaron en reemplazo de xileno y se cubrieron con DPX (Merck KGaA). Los portaobjetos inmunoteñidos se escanearon utilizando el sistema de obtención de imágenes en portaobjetos automatizado Vectra 2 (Perkin Elmer Inc.). El área de la región positiva para a-SMA en la totalidad del tumor se cuantificó mediante recuento de objetos positivos para a-SMA utilizando el programa informático inform 2 (PerkinElmer Inc.) El área de la región tumoral se midió evaluando el área con tinción de hematoxilina utilizando el programa informático inform 2 (PerkinElmer Inc.). El área de la región positiva para a-SMA se normalizó con el área de la región tumoral. La única administración del compuesto de ensayo redujo significativamente el área positiva para a-SMA a dosis de 60 y 180 gg/kg el día 3 y a una dosis de 180 gg/kg el día 6. Se calculó la tasa de supresión del área positiva para a-SMA del grupo de dosificación del compuesto de ensayo con la fórmula siguiente:
Relación de a-SMA = Área de a-SMA del grupo de dosificación con el compuesto de ensayo / área de a-SMA del grupo no tratado
Ejemplo de ensayo farmacológico 20. Efectos sobre tenascina-C y EDA-fibronectina en el modelo subcutáneo FaDu en ratones (figura 15)
Una línea celular de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) humano FaDu, que se había cultivado en un medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina-estreptomicina (medio de cultivo), se ajustó a una concentración de 5 x 107 células/ml con medio de cultivo para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 gl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 6 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Diez días después de la inoculación de las células, los ratones se agruparon de forma que los promedios de los volúmenes tumorales fueran sustancialmente iguales entre los grupos. El experimento se llevó a cabo en grupos que consistían en 5 ratones cada uno. El Compuesto (1) se disolvió en DMSO y la solución se almacenó en el congelador antes de su uso. El Compuesto (1) (180 gg/kg) y cetuximab (CTX, Erbitux®, Merck Serono Co. Ltd.) (10 mg/kg) se diluyeron con solución salina y se inyectaron por vía intravenosa el Día 1. Cinco días después de la única administración, se recogieron muestras tumorales y se fijaron con fijador de zinc IHC (BD Pharmingen) a 4 °C durante 24 h. Se seccionaron tejidos embebidos en parafina (3 gm), se montaron en portaobjetos cargados positivamente y se secaron al aire. Las secciones se desparafinaron, se acondicionaron y los antígenos se recuperaron utilizando microondas con EDTA 1 mM a pH 6,0 para tenascina-C. Para EDA-fibronectina, el procedimiento de recuperación de antígenos no fue necesario. Las secciones se incubaron con solución de bloqueo BLOXALL (Vector Labs) durante 10 minutos para bloquear la peroxidasa endógena, y con reactivo de bloqueo de Ig Mouse On Mouse (Vector Labs) durante 1 hora, y después con suero equino normal al 2,5% durante 30 minutos. Para la tinción inmunohistoquímica de tenascina-C, se aplicó anticuerpo monoclonal anti-tenascina-C de ratón (clon 4C8MS, IBL) a una concentración de 5 gg/ml. Las secciones se incubaron con el anticuerpo durante la noche a 4 °C. Para la tinción inmunohistoquímica de EDA-fibronectina, se aplicó anticuerpo monoclonal de ratón anti-EDA-fibronectina (clon IST-9, Abcam) a una concentración de 1,5 gg/ml. Las secciones se incubaron con el anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente. La detección se realizó con kit de polímero de peroxidasa Mouse On Mouse ImmPRESS™ (Vector Labs). Las secciones se contratiñeron con hematoxilina de Mayer (Muto Pure Chemicals) durante 50 segundos. Las secciones se deshidrataron en etanoles graduados, se desengrasaron en reemplazo de xileno y se cubrieron con DPX (Merck KGaA). Los portaobjetos inmunoteñidos se escanearon utilizando el sistema de obtención de imágenes en portaobjetos automatizado Vectra 2 (Perkin Elmer Inc.). Los niveles de expresión tanto de la tenascina-C como de ED-A-fibronectina se redujeron en los tumores tratados con el Compuesto (1) y CTX en comparación con los tumores de control.
Ejemplo de ensayo farmacológico 21. Efectos antitumorales en un modelo de xenoinjerto subcutáneo FaDu en combinación con cetuximab en ratones (figura 16)
Una línea celular de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) humano FaDu, que se había cultivado en un medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina-estreptomicina, se ajustó a una concentración de 5 x 107 células/ml con solución salina equilibrada de Hanks para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones atímicos (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, 7 semanas de edad, Charles River Japan Inc.). Diez días después de la inoculación de las células (Día 1), se midió la longitud y la anchura de un tumor en cada ratón utilizando un calibre digital electrónico (Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen tumoral según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2
Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Sobre la base de TV, los ratones se agruparon aleatoriamente (Día 1). Cada grupo consistía en seis ratones. El Compuesto (1) se disolvió en DMSO y la solución se almacenó en el congelador antes de su uso. El Compuesto (1) (20, 60 o 180 pg/kg) y cetuximab (CTX, Erbitux®, Merck Serono Co., Ltd.) (10 mg/kg) se diluyeron con solución salina y se inyectaron por vía intravenosa el Día 1. Los cambios de RTV de cada grupo se mostraron en la figura 16. A dosis de 180 pg/kg y 60 pg/kg, las eficacias antitumorales del Compuesto (1) con CTX fueron más potentes que las de la monoterapia con CTX con regresión tumoral. La eficacia antitumoral del Compuesto (1) a dosis de 20 pg/kg en combinación con CTX tendió a ser más potente que la de la monoterapia con CTX.
Ejemplo de ensayo farmacológico 22. Efectos antitumorales en modelos de xenoinjerto de sarcoma de tejidos blandos en ratones como monoterapia (figura 17)
MES-SA
Una línea celular de sarcoma uterino humano MES-SA, que se había cultivado en un RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, y penicilina-estreptomicina, se ajustó a una concentración de 2 x 108 células/ml con solución salina equilibrada de Hanks para preparar una suspensión celular, y la suspensión se mezcló con Geltrex® (Thermo Fisher Scientific Inc., N° de catálogo A1413202) en una proporción de 1:1 para preparar una suspensión celular en una concentración de 1 x 108 células/ml. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 6 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan Inc.). Seis días después de la inoculación de las células (Día 1), se midió el diámetro más corto y el diámetro más largo de un tumor en cada ratón usando un calibre digital electrónico (calibre Digimatic™, Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen tumoral según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2
Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Sobre la base de los volúmenes tumorales obtenidos el Día 1, los ratones se agruparon de forma que los promedios de los volúmenes tumorales fueran sustancialmente iguales entre los grupos. El experimento se realizó en grupos que consistían en 6 ratones cada uno. El compuesto de ensayo se disolvió en DMSO y se almacenó una solución en el congelador antes de su uso. Inmediatamente antes de la administración, la solución madre se diluyó con solución salina. El compuesto de ensayo en solución salina se administró por vía intravenosa una vez a la semana a 180 pg/kg durante 2 semanas (el Día 1 y el Día 8). Se observó la actividad antitumoral por el retraso en el crecimiento tumoral en el grupo tratado.
HT-1080
Una línea celular de fibrosarcoma humano HT-1080, que se había cultivada en un E-MEM que contenía el 10% de FBS, NEAA y antibióticos, se ajustó a una concentración de 3 x 107 células/ml con medio para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones atímicos (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, 6 semanas de edad, Charles River Japan Inc.). Seis días después de la inoculación de las células (Día 1), se midió la longitud y la anchura de un tumor en cada ratón utilizando un calibre digital electrónico (Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen tumoral según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2
Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Sobre la base de TV, los ratones se agruparon aleatoriamente (Día 1). Cada grupo consistía en seis ratones. El
Compuesto (1) se disolvió en DMSO y la solución se almacenó en el congelador antes de su uso. El Compuesto (1) (180 pg/kg) se diluyó con solución salina y se inyectó por vía intravenosa el Día 1 y el Día 8. Los cambios de RTV de cada grupo se muestran en la figura 17. Se observó la actividad antitumoral por la regresión tumoral en el grupo tratado.
CTG-2041
Se implantaron s.c. fragmentos de tumor de angiosarcoma humano CTG-2041 en el flanco izquierdo de ratones hembra. El crecimiento del tumor se supervisó dos veces por semana con un calibre digital, para calcular el volumen tumoral según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2 Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Cuando el volumen de los tumores alcanzó aproximadamente 200 mm3, los animales se agruparon según el volumen tumoral en grupos de tratamiento o de control y la dosificación se inició el Día 1. Cada grupo consistía en cinco ratones. El Compuesto (1) se disolvió en DMSO y la solución se almacenó en el congelador antes de su uso. El Compuesto (1) (100 pg/kg) se diluyó en solución salina y se inyectó por vía intravenosa el Día 1 y el Día 8. Los cambios de RTV de cada grupo se muestran en la figura 17. Se observó la actividad antitumoral por la regresión tumoral en el grupo tratado.
Ejemplo de ensayo farmacológico 23. Efectos antitumorales en modelos de xenoinjerto de sarcoma de cáncer de endometrio en ratones como monoterapia (figura 18)
HEC-108
Una línea celular de cáncer de endometrio humano HEC-108, que se había cultivado en un E-MEM que contenía el 15% de FBS y antibióticos, se ajustó a una concentración de 7,14 x 107 células/ml con medio para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 150 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones atímicos (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, 6 semanas de edad, Charles River Japan Inc.). Trece días después de la inoculación de las células (Día 1), se midió la longitud y la anchura de un tumor en cada ratón utilizando un calibre digital electrónico (Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen tumoral según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2 Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Sobre la base de TV, los ratones se agruparon aleatoriamente (Día 1). Cada grupo consistía en seis ratones. El Compuesto (1) se disolvió en DMSO y la solución se almacenó en el congelador antes de su uso. El Compuesto (1) (180 pg/kg) se diluyó en solución salina y se inyectó por vía intravenosa el Día 1 y el Día 8. Los cambios de RTV de cada grupo se muestran en la figura 18. Se observó la actividad antitumoral por el retraso en el crecimiento del tumor en el grupo tratado.
AN3CA
Una línea celular de cáncer de endometrio humano AN3CA, que se había cultivado en un E-MEM que contenía el 10% de FBS, y penicilina-estreptomicina, se ajustó a una concentración de 1,4 x 108 células/ml con solución salina equilibrada de Hanks para preparar una suspensión celular, y la suspensión se mezcló con Geltrex® (Thermo Fisher Scientific Inc., N° de catálogo A1413202) en una relación de 1:1 para preparar una suspensión celular en una concentración de 7 x 107 células/ml. La suspensión celular se inoculó en un volumen de 100 pl en una región subcutánea del flanco derecho de ratones desnudos, de 6 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, hembra, Charles River Laboratories Japan Inc.). Doce días después de la inoculación de las células (Día 1), se midió el diámetro más corto y el diámetro más largo de un tumor en cada ratón usando un calibre digital electrónico (Digimatic™ calibre, Mitutoyo Corporation), para calcular el volumen tumoral según las fórmulas de cálculo siguientes:
Volumen tumoral (mm3) = Diámetro más largo (mm) x Diámetro más corto (mm) x Diámetro más corto (mm)/2 Volumen tumoral relativo (RTV) = Volumen tumoral (día X)/Volumen tumoral (el primer día)
Sobre la base de los volúmenes de tumores obtenidos el Día 1, los ratones se agruparon de forma que los promedios de los volúmenes tumorales fueran sustancialmente iguales entre los grupos. El experimento se llevó a cabo en grupos que consistían en cinco ratones cada uno. El compuesto de ensayo se disolvió en DMSO y se almacenó una solución en el congelador antes de su uso. Inmediatamente antes de la administración, la solución madre se diluyó con solución salina. El compuesto de ensayo en solución salina se administró por vía intravenosa una vez a la semana a una dosis
de 180 Mg/kg durante 2 semanas (el Día 1 y el Día 8). Se observó la actividad antitumoral por la regresión tumoral en el grupo tratado.
Ejemplo de ensayo farmacológico 24. Ensayo de inhibición del crecimiento de NCI-N87 y MKN-28
En este ensayo, se midieron las actividades inhibidoras del crecimiento de los compuestos de ensayo en líneas celulares de cáncer gástrico humano NCI-N87 y MKN-28, respectivamente. Las células NCI-N87 y MKN-28 se mantuvieron en medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, penicilina y estreptomicina en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). A cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Becton, Dickinson and Company, 353219) se añadieron 100 mI de suspensión de células NCI-N87 o MKN-28 ajustada a una concentración de 3 x 104 células/ml con el medio de cultivo, y las células se incubaron durante la noche en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Al día siguiente, se añadieron a cada pocillo 100 mI del Compuesto (1) o halicondrina B en una dilución en serie triple suspendidos en el medio de cultivo, y el resultado se incubó durante 3 días en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Después, se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega) con el lector EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). El valor de los pocillos que contenían células sin la adición de los compuestos de ensayo se definió como el 100% y el valor de los pocillos que no contenían células se definió como el 0%. Se calculó la concentración del compuesto de ensayo necesaria para inhibir el crecimiento celular en un 50% (es decir, un valor de CI50), y se muestra en la tabla 14.
Tabla 14
Compuesto de ensayo NCI-N87 (CI50 (nM)) MKN-28 (CI50 (nM))
Halicondrina B 0,007 0,017
Compuesto (1) 0,002 0,015
Ejemplo de ensayo farmacológico 25. Ensayo de inhibición del crecimiento de HuTu 80
En este ensayo, se midieron las actividades inhibidoras del crecimiento de los compuestos de ensayo en la línea celular de cáncer de intestino delgado humano HuTu 80, que se aisló del tejido duodenal. Las células HuTu 80 se mantuvieron en medio EMEM que contenía el 10% de FBS, penicilina y estreptomicina en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). A cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Becton, Dickinson and Company, 353219) se añadieron 100 mI de una suspensión de células HuTu80 ajustada a una concentración de 3 x 104 células/ml con el medio de cultivo, y las células se incubaron durante la noche en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Al día siguiente, se añadieron a cada pocillo 100 mI del Compuesto (1) o halicondrina B en una dilución en serie triple suspendidos en el medio de cultivo, y el resultado se incubó durante 3 días en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Después, se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega) con el lector EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). El valor de los pocillos que contenían células sin la adición de los compuestos de ensayo se definió como el 100% y el valor de los pocillos que no contenían células se definió como el 0%. Se calculó la concentración del compuesto de ensayo necesaria para inhibir el crecimiento celular en un 50% (es decir, un valor de CI50), y se muestra en la tabla 15.
Tabla 15
Compuesto de ensayo HuTu 80 (CI50 (nM))
Halicondrina B 0,031
Compuesto (1) 0,019
Ejemplo de ensayo farmacológico 26. Ensayo de inhibición del crecimiento de SW780
En este ensayo, se midieron las actividades inhibidoras del crecimiento de los compuestos de ensayo en la línea celular de cáncer urotelial humano SW780. Las células SW780 se mantuvieron en medio RPMI-1640 que contenía el 10% de FBS, penicilina y estreptomicina en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). A cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Becton, Dickinson and Company, 353219) se añadieron 100 mI de una suspensión de células SW780 ajustada a una concentración de 3 x 104 células/ml con el medio de cultivo, y las células se incubaron durante la noche en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Al día siguiente, se añadieron a cada pocillo 100 mI del Compuesto (1) o halicondrina B en una dilución en serie triple suspendidos en el medio de cultivo, y el resultado se incubó durante 3 días en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Después, se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega) con el lector EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). El valor de los pocillos que contenían células sin la adición de los compuestos de ensayo se definió como el 100% y el valor de los pocillos que no contenían células se definió como el 0%. Se calculó la concentración del compuesto de ensayo necesaria para inhibir el crecimiento celular en un 50% (es decir, un valor de CI50), y se muestra en la tabla 16.
Tabla 16
Compuesto de ensayo SW780 (CI50 (nM))
Halicondrina B 0,032
Compuesto (1) 0,017
Ejemplo de ensayo farmacológico 27. Ensayo de inhibición del crecimiento de HS-SY-II
En este ensayo, se midieron las actividades inhibidoras del crecimiento de los compuestos de ensayo en la línea celular de sarcoma sinovial humano HS-SY-II. Las células SH-SY-II se mantuvieron en un medio DMEM que contenía el 10% de FBS, penicilina y estreptomicina en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). A cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Becton, Dickinson and Company, 353219) se añadieron 100 pl de una suspensión de células HS-SY-II ajustada a una concentración de 3 x 104 células/ml con el medio de cultivo, y las células se incubaron durante la noche en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Al día siguiente, se añadieron a cada pocillo 100 pl del Compuesto (1) o halicondrina B en una dilución en serie triple suspendidos en el medio de cultivo, y el resultado se incubó durante 3 días en una incubadora con el 5% de CO2 (37 °C). Después, se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega) con el lector EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). El valor de los pocillos que contenían células sin la adición de los compuestos de ensayo se definió como el 100% y el valor de los pocillos que no contenían células se definió como el 0%. Se calculó la concentración del compuesto de ensayo necesaria para inhibir el crecimiento celular en un 50% (es decir, un valor de CI50), y se muestra en la tabla 17.
Tabla 17
Compuesto de ensayo HS-SY-II (CI50 (nM))
Halicondrina B 0,010
Compuesto (1) 0,002
Equivalentes y alcance
En las reivindicaciones, los artículos tales como "un", "una", "el" y "la" pueden significar uno o más de uno, a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo por el contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean o son relevantes de otro modo con respecto a un producto o proceso determinado, a menos que se indique lo contrario o sea de otro modo evidente por el contexto. La invención incluye formas de realización en las que exactamente un miembro del grupo está presente, se emplea o es relevante de otro modo con respecto a un producto o proceso determinado. La invención incluye formas de realización en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean o son relevantes de otro modo con respecto a un producto o proceso determinado.
Además, la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, cláusulas y términos descriptivos de una o varias de las reivindicaciones enumeradas se introducen en otra reivindicación. Por ejemplo, cualquier reivindicación que dependa de otra reivindicación puede modificarse para que incluya una o más limitaciones que se encuentran en cualquier otra reivindicación que dependa de la misma reivindicación base. Debe entenderse que, en general, cuando se hace referencia a la invención, o a aspectos de la invención, como que comprenden elementos y/o características particulares, determinadas formas de realización de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente en, dichos elementos y/o características. Por motivos de simplicidad, esas formas de realización no se han establecido específicamente in haec verba en el presente documento. También cabe indicar que se pretende que los términos "que comprende" y "que contiene" sean abiertos y permitan la inclusión de elementos o etapas adicionales. Cuando se proporcionan intervalos, están incluidos los puntos finales. Además, a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo a partir del contexto y la comprensión de un experto en la técnica, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor específico o subintervalo dentro de los intervalos establecidos en diferentes formas de realización de la invención, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de determinar utilizando solo experimentación de rutina muchos equivalentes a las formas de realización específicas descritas en el presente documento. El alcance de las presentes formas de realización descritas en el presente documento no pretende limitarse a la descripción anterior, sino que se establece en las reivindicaciones adjuntas. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones a la presente descripción sin apartarse del alcance de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones siguientes.
Claims (15)
2. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1 para su uso en la inhibición del crecimiento de un tumor o cáncer caracterizado por angiogénesis, invasión o metástasis.
4. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de un tumor o cáncer caracterizado por angiogénesis, invasión o metástasis.
5. El compuesto para su uso de la reivindicación 3 o 4, en el que el cáncer es cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, cáncer de vejiga o un sarcoma.
6. El compuesto para su uso de la reivindicación 5, en el que el cáncer es:
(a) cáncer de cabeza y cuello, preferentemente en el que el cáncer es carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) o carcinoma quístico adenoide; o
(b) cáncer de mama, preferentemente en el que el cáncer de mama es (i) cáncer de mama positivo para HER2, o (ii) cáncer de mama negativo para HER2, o (iii) cáncer de mama triple negativo; o
(c) cáncer colorrectal; o
(d) cáncer de esófago, preferentemente en el que el cáncer de esófago es adenocarcinoma de esófago; o (e) cáncer de útero; o
(f) cáncer de ovario; o
(g) un sarcoma, preferentemente en el que el sarcoma es sarcoma uterino, fibrosarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma de tejidos blandos o angiosarcoma; o
(h) cáncer gástrico; o
(i) cáncer de intestino delgado, preferentemente en el que el cáncer de intestino delgado es adenocarcinoma de intestino delgado; o
(j) cáncer de vejiga; o
(k) cáncer urotelial.
7. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, para su uso en combinación con un anticuerpo de proteína de muerte programada 1 (PD-1).
8. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, para su uso en combinación con un anticuerpo de proteína de muerte programada L1 (PD-L1).
9. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, para su uso en combinación con un anticuerpo anti-EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), preferentemente en el que el anticuerpo anti-EGFR es un mAb anti-EGFR, y/o el cáncer es cáncer de cabeza y cuello, preferentemente en el que el cáncer es carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN), y/o el mAb anti-EGFR es cetuximab.
10. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, para su uso en combinación con un anticuerpo HER2 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano), preferentemente en el que el anticuerpo HER2 es un mAb HER2 y/o el cáncer es cáncer de mama y/o o el mAb HER2 es trastuzumab.
11. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4-10 en un sujeto, en el que el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se encuentra en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. El compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptables del mismo para su uso según la reivindicación 6, en el que el cáncer es cáncer de mama negativo para HER2 o carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) en un sujeto.
13. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5-10 y 12 para su uso en combinación con radioterapia.
14. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5-10 y 12-13 para su uso en combinación con cirugía.
15. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5-10 y 12-14, en el que el sujeto es un ser humano.
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