BR112019020208A2

BR112019020208A2 - composto macrocíclico e uso do mesmo

Info

Publication number: BR112019020208A2
Application number: BR112019020208A
Authority: BR
Inventors: Kira Kazunobu; Ito Ken; Kishi Yoshito
Original assignee: Eisai R&D Man Co Ltd; Harvard College
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2020-04-22
Also published as: IL269788A; LT3606928T; US11725015B2; PE20200602A1; WO2018187331A8; AU2022291454A1; HUE060466T2; ECSP19075677A; DK3606928T3; IL288991A; CN115093429A; MD3606928T2; JOP20190234B1; JP2022153392A; ES2931533T3; TWI781163B; KR20240023674A; PL3606928T3; MA48027B1; SA519410259B1

Abstract

a presente invenção refere-se a um novo composto (1) tendo efeito de remodelação vascular do tumor e/ou atividade anti-caf (fibroblastos associados ao câncer), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, opcionalmente em um veículo farmaceuticamente aceitável, e uso médico do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSTO MACROCÍCLICO E USO DO MESMO.

PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) aos Pedidos de Patente Provisórios U.S., U.S.S.N. 62/482.030, depositado em 5 de abril de 2017, U.S.S.N. 62/526.677, depositado em 29 de junho de 2017, e U.S.S.N. 62/586.416, depositado em 15 de novembro de 2017, e sob 35 U.S.C. § 120 ao Pedido de Patente U.S., U.S.S.N. 15/814.105, depositado em 15 de novembro de 2017; cujos conteúdos inteiros de cada um é são aqui incorporados por referência. CAMPO TÉCNICO [0002] A presente invenção fornece um novo composto macrocíclico tendo efeitos de remodelação vascular de tumor e atividade antiCAF (fibroblasto associado ao câncer). O composto pode ser utilizado para tratar câncer ou inibir o crescimento de tumores em um indivíduo. ANTECEDENTES [0003] Halicondrinas, tais como Halicondrina B, são agentes anticâncer originalmente isolados da esponja marinha Halichondria okadai (ver, por exemplo, D. Uemura et al. “Norhalichondrin A: An Antitumor Polyether Macrolide from a Marine Sponge” J. Am. Chem. Soc., 107, 4796 (1985)), e subsequentemente encontrados em Axinella sp., Phakellia carteri e Lissondendryx sp. Uma síntese total da Halicondrina B foi publicada em 1992 (Ver, por exemplo, Y. Kishi et al. “Total Synthesis of Halichondrin B and Norhalichondrin B” J. Am. Chem. Soc., 114, 3162 (1992)). A Halicondrina B demonstrou inibição in vitro da polimerização de tubulina, montagem de microtúbulos, reticulação da beta-5-tubulina, ligação de GTP e vinblastina à tubulina e hidrólise de GTP dependente da tubulina, e mostrou propriedades anticâncer in vitro e in vivo (ver, por exemplo, Y. Hirata et al. “Halichondrinsantitumor polyether macrolides from a marine sponge” Pure Appl.

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Chem., 58, 701 (1986); Fodstad et al. “Comparative antitumor activities of halichondrins and vinblastine against human tumor xenografts” J. of Experimental Therapeutics & Oncology 1996; 1: 119, 125).

[0004] O mesilato de eribulina (Halaven™), que foi desenvolvido com base em Halicondrina B (ver, por exemplo, a Publicação Internacional No. WO 1999/065894, publicada em 23 de dezembro de 1999; a Publicação Internacional No. WO 2005/118565, publicada em 15 de dezembro de 2005 e W. Zheng et al. “Macrocyclic ketone analogues of halichondrin B” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14, 55515554 (2004)), está atualmente em uso clínico em muitos países para o tratamento de, por exemplo, câncer de mama metastático e lipossarcoma avançado.

[0005] As publicações de patente adicionais que descrevem Halicondrinas incluem a Patente U.S. No. 5.436.238 de Kishi, et a!., emitida em 25 de julho de 1995; a Patente U.S. No. 5.338.865 de Kishi et al., emitida em 16 de agosto de 1994; e o WO 2016/003975 depositada por Kishi, etal., todos os quais são atribuídos ao President and Fellows of Harvard College.

[0006] Ver também, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.786.492; Patente U.S. No. 8.598.373; Patente U.S. No. 9.206.194; Patente U.S. No. 9.469.651; WO/2009/124237A1; WO/1993/017690A1;

WO/2012/147900A1; Patente U.S. No. 7.982.060; Patente U.S. No. 8.618.313; Patente U.S. No. 9.303.050; Patente U.S. No. 8.093.410; Patente U.S. No. 8.350.067; Patente U.S. No. 8.975.422; Patente U.S. No. 8.987.479; Patente U.S. No. 8.203.010; Patente U.S. No. 8.445.701; Patente U.S. No. 8.884.031; Patente U.S. No. RE45.324; Patente U.S. No. 8.927.597; Patente U.S. No. 9.382.262; Patente U.S. No. 9.303.039; WO/2009/046308A1; WO/2006/076100A3;

WO/2006/076100A2; WO/2015/085193A1; WO/2016/176560A1; Patente U.S. No. 9.278.979; Patente U.S. No. 9.029.573;

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WO/2011/094339A1; WO/2016/179607A1; WO/2009/064029A1;

WO/2013/142999A1; WO/2015/066729A1; WO/2016/038624A1 e WO/2015/000070A1.

[0007] Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs), que são amplamente encontrados em uma variedade de tumores sólidos, são células estromais. Sabe-se que os CAFs desempenham um papel importante na angiogênese, invasão e metástase. É relatado que existe uma estreita correlação entre as quantidades de CAFs e o prognóstico clínico, por exemplo, no câncer de mama invasivo (ver, por exemplo, M. Yamashita et al. “Role of stromal myofibroblasts in invasive breast cancer: stromal expression of alpha-smooth muscle actin correlates with worse clinical outcome” Breast Cancer 19, 170, 2012) e adenocarcinoma esofágico (ver, por exemplo, T. J. Underwood et al. “Cancer-associated fibroblasts predict poor outcome and promote periostindependent invasion in esophageal adenocarcinoma” Journal of Pathol., 235, 466, 2015). Também foi relatado que os CAFs se correlacionam com a resistência em uma variedade de tumores tais como, por exemplo, câncer de mama (ver, por exemplo, P. Farmer et al. “A stromarelated gene signature predicts resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer” Nature Medicine., 15(1), 68, 2009) e câncer de cabeça e pescoço (ver, por exemplo, S. Schmitz et al. “Cetuximab promotes epithelial to mesenchymal transition and cancer associated fibroblasts in patients with head and neck cancer” Oncotarget, 6 (33), 34288, 2015; Y. Matsuoka et al. “The tumor stromal features are associated with resistance to 5-FU-based chemoradiotherapy and a poor prognosis in patients with oral squamous cell carcinoma” APMIS 123(3), 205, 2015).

[0008] Foi assim observado que os efeitos de remodelação vascular do tumor e a atividade anti-CAF resultam na melhora do microambiente do câncer, que auxilia o tratamento do tumor. Os vasos sangui

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4/101 neos são essenciais para o crescimento de tumores. Os vasos sanguíneos reconstruídos nos tumores podem liberar agentes anticancerígenos aos tumores, além de alcançar o alívio da hipoxia. É relatado que a remodelação induzida por eribulina da vasculatura tumoral anormal leva a um microambiente mais funcional que pode reduzir a agressividade dos tumores devido à eliminação da hipoxia interna do tumor. Visto que os microambientes anormais de tumores aumentam tanto a resistência ao fármaco quanto as metástases, a evidente capacidade da eribulina de reverter essas características agressivas pode contribuir com os seus benefícios clínicos (ver, por exemplo, Y. Funahashi et al. “Eribulin mesylate reduces tumor microenvironment abnormality by vascular remodeling in preclinical human breast cancer models” Cancer Sci. 105 (2014), 1334-1342). Os fármacos anticâncer tendo efeitos de remodelação vascular do tumor e atividades anti-CAF não foram relatados até hoje.

[0009] Apesar dos progressos estabelecidos, compostos adicionais são necessários para avançar a pesquisa e os cuidados médicos de tumores e câncer.

SUMARIO DA INVENÇÃO [0010] A presente invenção refere-se a um composto macrocíclico (por exemplo, Composto (1)) tendo efeitos de remodelação vascular de tumor e atividade anti-CAF, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e seus derivados isotopicamente marcados e suas composições farmacêuticas.

[0011] A invenção também inclui métodos de uso do Composto (1) para o tratamento de câncer, métodos para inibir reversível ou irreversivelmente a mitose em uma célula e métodos para inibir o crescimento tumoral in vitro, in vivo ou em um indivíduo. Em outro aspecto, a presente invenção fornece kits compreendendo o Composto (1), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou sua composição farmaPetição 870190096531, de 26/09/2019, pág. 50/156

5/101 cêutica.

[0012] Em um aspecto, a invenção apresenta um composto que é o Composto (1):

e seus sais farmaceuticamente aceitáveis; e seus derivados isotopicamente marcados.

[0013] Em um aspecto, a invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo o Composto (1), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou seu derivado isotopicamente marcado. As composições farmacêuticas podem compreender um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. As composições farmacêuticas podem ainda compreender um ou mais agentes terapêuticos adicionais em combinação, alternação ou outro tipo de terapia sincronizada, para alcançar o objetivo desejado de tratamento.

[0014] A invenção também apresenta métodos de produção do Composto (1) ou seus intermediários. Os intermediários sintéticos também são aqui fornecidos como parte da invenção.

[0015] Foi descoberto que o Composto (1) possui um efeito vantajoso na remodelação vascular do tumor e possui atividade anti-CAF, conforme demonstrado nas Figuras e Exemplos. Consequentemente, o Composto (1) tem uso potencial no tratamento de câncer (por exemplo, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (SCCHN), câncer de mama, câncer de esôfago, câncer uterino, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer gástrico, câncer do intestino delgado, câncer de bexiga, sarcomas, cânceres raros).

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6/101 [0016] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para a inibição de qualquer crescimento de tumor ou câncer que irá responder a um composto com efeitos de remodelação vascular do tumor e/ou atividade anti-CAF, em um indivíduo, tipicamente um ser humano, com o Composto (1) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado do mesmo.

[0017] O Composto (1), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou seu derivado isotopicamente marcado do mesmo, ou sua composição, pode ser administrado em combinação com qualquer outro agente ativo que forneça resultados benéficos para o paciente. Em certas modalidades, o composto (1) é utilizado em combinação com um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal). Em uma modalidade, o composto (1) é utilizado em combinação, alternação ou outra terapia sincronizada com uma imunoterapia, como um anticorpo anti-EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico), um anticorpo anti-HER2 (receptor do fator de crescimento epidérmico humano), um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1, conforme descrito com maiores detalhes abaixo.

[0018] Por exemplo, é fornecido um método para tratar o carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN) em um indivíduo, tipicamente um ser humano, com necessidade, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do Composto (1) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado do mesmo, ou sua composição, em combinação com uma terapia de anticorpo monoclonal (mAb) anti-EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico). Em certas modalidades, o mAb anti-EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) é cetuximab.

[0019] Como outro exemplo, um método para tratar o câncer de mama em um indivíduo, tipicamente um ser humano, com sua necessidade compreendendo a administração ao dito indivíduo de uma

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7/101 quantidade eficaz de Composto (1), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado do mesmo, ou sua composição, em combinação com uma terapia de mAb do HER2 (receptor do fator de crescimento epidérmico humano). Em certas modalidades, o mAb do HER2 (receptor do fator de crescimento epidérmico humano) é trastuzumab. Em outras modalidades, o Composto (1) pode ser utilizado para tratar câncer de mama em combinação com quimioterapia tradicional, tal como adriamicina, ciclofosfamida, taxol, etc., ou um antiestrogênio tal como um modulador seletivo de estrogênio (SERM), um degradante seletivo de estrogênio (SERD), um inibidor parcial ou total do estrogênio (tal como fulvestrant) ou um inibidor da CDK 4/6, tal como palbociclib (Pfizer).

[0020] Outro aspecto da presente invenção fornece o Composto (1), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado do mesmo, que pode estar na forma de um hidrato, solvato, polimorfo ou uma composição do mesmos, em um kit, que pode ser uma embalagem de forma de dosagem. Os kits aqui descritos podem incluir uma dose única ou múltiplas doses do composto ou sua composição farmacêutica. Um kit da invenção pode incluir instruções para utilizar as formas de dosagem terapêuticas fornecidas (por exemplo, instruções para uso do composto ou composição farmacêutica incluídas no kit).

[0021] A presente invenção inclui assim pelo menos os seguintes aspectos:

(i) Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, que pode estar opcionalmente na forma de um hidrato, solvato ou polimorfo;

(ii) Um método para tratamento que inclui a administração de uma quantidade eficaz a um indivíduo tal como um ser humano do Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopi

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8/101 camente marcado, que pode estar opcionalmente na forma de um hidrato, solvato ou polimorfo, para tratar câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (SCCHN), carcinoma adenoide cístico), câncer de mama (por exemplo, câncer de mama negativo para HER2, câncer de mama triplo negativo), câncer de esôfago (por exemplo, adenocarcinoma de esôfago), câncer uterino (por exemplo, sarcoma uterino), câncer de ovário, câncer colorretal, sarcoma (por exemplo, sarcoma sinovial, angiossarcoma, sarcoma de tecidos moles, fibrossarcoma, sarcoma uterino), câncer de bexiga (por exemplo, câncer urotelial), câncer gástrico, câncer do intestino delgado (por exemplo, adenocarcinoma do intestino delgado), câncer do endométrio ou um câncer raro;

(iii) Um método para tratamento que inclui a administração de uma quantidade eficaz a um indivíduo tal como um ser humano do Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, que pode estar opcionalmente na forma de um hidrato, solvato ou polimorfo, para uso no tratamento de um distúrbio médico tal como câncer ou tumor, que responde aos efeitos de remodelação vascular e/ou atividade anti-CAF;

(iv) Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, que pode estar opcionalmente na forma de um hidrato, solvato ou polimorfo, para uso no tratamento de carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN), câncer de mama, câncer de esôfago, câncer uterino, câncer de ovário, câncer colorretal, sarcoma, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer do intestino delgado, câncer de endométrio ou um câncer raro;

(v) O composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, que pode estar opcionalmente na forma de um hidrato, solvato ou polimorfo, para uso no tratamento de um distúrbio médico tal como um câncer ou tumor que responde aos efeitos

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9/101 de remodelação vascular e/ou atividade anti-CAF;

(vi) Um derivado deuterado do Composto (1);

(vii) Processo para a fabricação de um medicamento destinado para o uso terapêutico no tratamento ou prevenção de distúrbios tais como câncer ou tumor que responde aos efeitos de remodelação vascular e/ou atividade anti-CAF, caracterizado pelo fato de que o Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, que pode estar opcionalmente na forma de um hidrato, solvato ou polimorfo descrito acima, ou uma modalidade do composto ativo, é utilizado na fabricação;

(viii) Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, na forma substancialmente pura (por exemplo, pelo menos 90 ou 95%);

(ix) Uma composição farmaceuticamente aceitável do Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, que pode estar opcionalmente na forma de um hidrato, solvato ou polimorfo, em um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável;

(x) Uma forma de dosagem farmaceuticamente aceitável do Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, que pode estar opcionalmente na forma de um hidrato, solvato ou polimorfo, opcionalmente em um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável;

(xi) O composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, para tratar um distúrbio aqui descrito, pelo qual atua através de um mecanismo diferente dos efeitos de remodelação vascular e/ou atividade anti-CAF de ação; e (xii) Métodos para a fabricação dos compostos aqui descritos, e intermediários na síntese.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

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10/101 [0022] Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem uma parte do mesmo relatório descritivo, ilustram várias modalidades da invenção e juntamente com a descrição, fornecem exemplos não limitativos da invenção.

[0023] A Figura 1 mostra os efeitos antitumorais do Composto (1) no modelo de xenoenxerto subcutâneo FaDu (câncer de cabeça e pescoço) em camundongos como monoterapia conforme descrito no Exemplo de Teste Farmacológico 4.

[0024] A Figura 2 mostra a atividade antitumoral do Composto (1) contra o modelo de xenoenxerto subcutâneo OSC-19 (câncer de cabeça e pescoço) em camundongos como monoterapia conforme descrito no Exemplo de Teste Farmacológico 5.

[0025] A Figura 3 mostra a atividade antitumoral do Composto (1) contra o modelo de xenoenxerto subcutâneo HCC-1806 (câncer de mama) em camundongos como monoterapia conforme descrito no Exemplo de Teste Farmacológico 6.

[0026] A Figura 4 mostra os efeitos antitumorais do Composto (1) no modelo de xenoenxerto subcutâneo FaDu em combinação com cetuximab em camundongos conforme descrito no Exemplo de Teste Farmacológico 7.

[0027] A Figura 5 mostra a atividade antitumoral do Composto (1) no modelo de xenoenxerto subcutâneo KPL-4 (câncer de mama) em combinação com trastuzumab em camundongos conforme descrito no Exemplo de Teste Farmacológico 8.

[0028] As Figuras 6A a 6B mostram o efeito antitumoral do Composto (1) no modelo de camundongo de transplante ortotópico HSC-2. Figura 6A. Camundongos nus foram implantados com HSC-2 submetido à transdução por luciferase (1 χ 10⁶ células/marca) na língua. A quantidade de HSC-2 submetido à transdução por luciferase foi analisada utilizando o In Vivo Imaging System (IVIS). Os dados mostram os

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11/101 níveis de bioluminescência na língua em cada mouse. Figura 6B. Imagem de bioluminescência representativa de 16 camundongos. CDDP, CTX, CDDP + CTX foram utilizados como comparadores, os quais são atualmente utilizados no tratamento de pacientes com câncer de SCCHN. CDDP = cisplatina, CTX = cetuximab.

[0029] As Figuras 7A a 7B mostram a vantagem de sobrevivência do Composto (1) em combinação com cetuximab no modelo de camundongo de transplante ortotópico HSC-2. Figura 7A. Camundongos nus foram implantados com HSC-2 submetido à transdução por luciferase (1 x 10⁶ células/marca) na língua. Os dados mostram a curva de sobrevida até o dia 100 após o tratamento de fármacos (n = 16). *P < 0,0001 versus Composto (1) ou CTX isoladamente (teste de Log-rank (Mantel-Cox)). Figura 7B. A quantidade de HSC-2 submetido à transdução por luciferase foi analisada utilizando o In Vivo Imaging System (IVIS). Imagens de bioluminescência de 10 camundongos sobreviventes do grupo de combinação Composto (1) + CTX no dia 100. RBW = peso corporal relativo. CDDP = cisplatina, CTX = cetuximab.

[0030] As Figuras 8A a 8B mostram o efeito antitumoral do Composto (1) em combinação com terapia de radiação no modelo de xenoenxerto de camundongo FaDu. Figura 8A. Camundongos nus foram implantados subcutaneamente com FaDu submetido à transdução por luciferase (5 χ 10⁶ células/marca) nas coxas direitas. Treze dias após a inoculação, os camundongos foram aleatoriamente designados (n = 6) e injetados por via intravenosa com o Composto (1) em 90 pg/kg no dia 1 e no dia 8 com ou sem RT de 18 Gy no dia 4 e no dia 11. A quantidade de FaDu submetido à transdução por luciferase foi analisada utilizando o In Vivo Imaging System (IVIS). Os dados mostram o nível médio de bioluminescência relativo para o dia 1 e SEM (n = 6). SEM = erro padrão da média. *P < 0,05 versus não tratado no dia 29 (teste t não pareado). Figura 8B. Imagens de bioluminescência repre

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12/101 sentativas de 6 camundongos de cada grupo no dia 29. RT = terapia de radiação.

[0031] A Figura 9 mostra as atividades antitumorais do Composto (1) em combinação com o anticorpo anti-mPD-1. O modelo de camundongo singênico CT26 s.c. (carcinoma do cólon) foi tratado com ο Composto (1) e anticorpo anti-mPD-1 no esquema Q7D e no esquema de duas vezes por semana, respectivamente, durante 3 semanas. Os resultados mostram a média ± SEM de volumes tumorais (mm³) (n = 8).

[0032] A Figura 10A mostra um ensaio de polimerização de tubulina livre de células. O Composto (1) possui atividade inibidora sobre a polimerização da tubulina. A Figura 10B mostra um ensaio de dinâmica de microtúbulos. O Composto (1) também possui atividade inibidora na dinâmica dos microtúbulos.

[0033] A Figura 11 mostra que o Composto (1) é um potente agente antiproliferative nas linhagens celulares de câncer de esôfago (OE21, OE33 e TE-8) e de câncer de útero (MES-SA, MES-SA/Dx5Rx1).

[0034] A Figura 12 mostra que o Composto (1) possui atividade antitumoral potente em modelos de xenoenxerto subeutâneo de câncer de mama e ovário (KPL-4 e COLO-704, respectivamente) como uma monoterapia.

[0035] A Figura 13 mostra o efeito do Composto (1) nos microambientes tumorais. Como mostrado, o Composto (1) aumenta a densidade dos microvasos. * P < 0,05, ** P < 0,01, **** P < 0,0001 versus não tratamento (teste de múltiplas comparações Dunnett).

[0036] A Figura 14 mostra o efeito do Composto (1) nos microambientes tumorais. Como mostrado, o Composto (1) reduz os CAFs positivos para a-SMA.

[0037] A Figura 15 mostra que o Composto (1) diminui as proteí

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13/101 nas ECM dos CAFs no modelo de xenoenxerto subcutâneo FaDu. Os tumores de xenoenxerto FaDu foram coletados no dia 6 após a administração isolada do Composto (1) 180 pg/kg + cetuximab no dia 1.

[0038] A Figura 16 mostra que o Composto (1) apresenta um efeito combinatório dependente da dose com cetuximab em um modelo de xenoenxerto subcutâneo FaDu. Dose única, n = 6. O composto (1) e o cetuximab (CTX) foram administrados no dia 1 no modelo de xenoenxerto FaDu.

[0039] A Figura 17 mostra os efeitos antitumorais nos modelos de xenoenxerto de sarcoma de tecidos moles em camundongos como monoterapia. MES-SA (sarcoma uterino humano), HT-1080 (fibrossarcoma humano) e CTG-2041 (angiossarcoma humano) são mostrados.

[0040] A Figura 18 mostra efeitos antitumorais em modelos de xenoenxerto de câncer endometrial em camundongos como monoterapia. HEC-108 e AN3CA (cânceres endometriais) são mostrados.

DEFINIÇÕES [0041] Conforme aqui utilizado, o termo sal refere-se a qualquer um e todos os sais e abrange os sais farmaceuticamente aceitáveis. O termo sal farmaceuticamente aceitável refere-se àqueles sais que são, dentro do escopo de uma perfeita avaliação médica, adequados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais inferiores sem as indevidas toxicidades, irritação, resposta alérgica e similares, e são proporcionais com uma relação de benefício/risco razoável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, Berge et al. descreve sais farmaceuticamente aceitáveis com detalhes em J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, aqui incorporado por referência. Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta invenção incluem aqueles derivados de ácidos e bases inorgânicos e orgânicos adequados. Exemplos de sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos são os sais de um

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14/101 grupo amino formado com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico, ou com ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido oxálico, ácido maléico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malônico, ou através do uso de outros métodos conhecidos na técnica tais como troca iônica. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, formiato, fumarato, glicoeptonato, glicerofosfato, gluconato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, iodidrato, 2-hidróxi-etanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartarato, tiocianato, p-toluenossulfonato, undecanoato, valerato e similares. Os sais derivados de bases apropriadas incluem sais de metal alcalino, metal alcalinoterroso, amônio e N⁺(alquila Ci-4)4^_. Os sais de metal alcalino ou alcalinoterroso representativos incluem sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio, e similares. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, quando apropriado, cátions amônio não tóxico, amônio quaternário e amina formados utilizando contraíons tais como haleto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquil sulfonato inferior e aril sulfonato. O Composto (1) também é fornecido e pode ser administrado como uma base livre.

[0042] Também deve ficar entendido que os compostos que possuem a mesma fórmula molecular, mas diferem na natureza ou sequência de ligação de seus átomos ou na disposição de seus átomos no espaço, são denominados isômeros. Os isômeros que diferem na disposição de seus átomos no espaço são denominados estereoisôPetição 870190096531, de 26/09/2019, pág. 60/156

15/101 meros.

[0043] Os termos composição e formulação são utilizados de modo trocável.

[0044] Um indivíduo ao qual a administração é contemplada refere-se a um ser humano (isto é, homem ou mulher de qualquer faixa etária, por exemplo, indivíduo pediátrico (por exemplo, bebê, criança ou adolescente) ou indivíduo adulto (por exemplo, adulto jovem, adulto de meia idade ou adulto mais velho)) ou animal não humano. Em certas modalidades, o animal não humano é um mamífero (por exemplo, primata (por exemplo, macaco cinomolgo ou macaco reso), mamífero comercialmente relevante (por exemplo, gado, porco, cavalo, ovelha, cabra, gato ou cachorro) ou ave (por exemplo, aves comercialmente relevantes tais como frango, pato, ganso ou peru)). Em certas modalidades, o animal não humano é um peixe, réptil ou anfíbio. O animal não humano pode ser macho ou fêmea em qualquer estágio de desenvolvimento. O animal não humano pode ser um animal transgênico ou animal geneticamente modificado. O termo paciente refere-se a um indivíduo humano que necessita de tratamento de uma doença.

[0045] O termo administrar, administrando ou administração refere-se à implantação, absorção, ingestão, injeção, inalação ou de outra forma introdução de um composto aqui descrito, ou uma composição do mesmo, no ou sobre um indivíduo.

[0046] Os termos tratamento, tratar e tratando se referem a reversão, alívio, retardo do início ou inibição do progresso de uma doença aqui descrita. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser administrado depois que um ou mais sinais ou sintomas da doença se desenvolveram ou foram observados. Em outras modalidades, o tratamento pode ser administrado na ausência de sinais ou sintomas da doença. Por exemplo, o tratamento pode ser administrado a um indivíduo suscetível antes do início dos sintomas. O tratamento também po

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16/101 de continuar após os sintomas terem resolvido, por exemplo, para retardar ou prevenir a recorrência.

[0047] Uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito refere-se a uma quantidade suficiente para provocar a resposta biológica desejada. Uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito pode variar dependendo de fatores tais como o desfecho biológico desejado, a farmacocinética do composto, a condição sendo tratada, o modo de administração e a idade e saúde do indivíduo. Em certas modalidades, uma quantidade eficaz é uma quantidade terapeuticamente eficaz. Alternativamente, em um método ou uso separado, a invenção pode ser utilizada, onde indicada e eficaz, como um tratamento profilático. Em certas modalidades, uma quantidade eficaz é a quantidade de um composto aqui descrito em uma dose única. Em certas modalidades, uma quantidade eficaz é as quantidades combinadas de um composto aqui descrito em múltiplas doses.

[0048] Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto aqui descrito é uma quantidade suficiente para fornecer um benefício terapêutico no tratamento de uma condição ou atrasar ou minimizar um ou mais sintomas associados à condição. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto significa uma quantidade de agente terapêutico, isoladamente ou em combinação com outras terapias, que fornece um benefício terapêutico no tratamento da condição. O termo quantidade terapeuticamente eficaz pode abranger uma quantidade que melhora a terapia geral, reduz ou evita os sintomas, sinais ou causas da condição e/ou intensifica a eficácia terapêutica de outro agente terapêutico. Em certas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade suficiente para o tratamento em qualquer doença ou condição descrita.

[0049] Como utilizado nesta invenção, inibição, inibindo, inibir e inibidor, e similares, referem-se à capacidade de um composto em

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17/101 reduzir, retardar, interromper ou impedir a atividade de um processo biológico (por exemplo, crescimento tumoral). Em certas modalidades, a inibição é ao redor de 45% a 50%. Em certas modalidades, a inibição é ao redor de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99,9% ou 100%.

[0050] Os termos neoplasma e tumor são utilizados nesta invenção de modo trocável e se referem a uma massa anormal de tecido em que o crescimento da massa ultrapassa e não é coordenado com o crescimento de um tecido normal. Um neoplasma ou tumor pode ser benigno ou maligno, dependendo das seguintes características: grau de diferenciação celular (incluindo morfologia e funcionalidade), taxa de crescimento, invasão local e metástase. Um “neoplasma benigno” é geralmente bem diferenciado, possui um crescimento caracteristicamente mais lento do que um neoplasma maligno e permanece localizado no local de origem. Além disso, um neoplasma benigno não tem a capacidade de se infiltrar, invadir ou enviar metástase em locais distantes. Ao contrário, um “neoplasma maligno” é geralmente pouco diferenciado (anaplasia) e possui um crescimento caracteristicamente rápido acompanhado por infiltração progressiva, invasão e destruição do tecido circundante. Além disso, um neoplasma maligno geralmente tem a capacidade de enviar metástase para locais distantes. O termo metástase, metastático ou enviar metástase refere-se à disseminação ou migração de células cancerígenas de um tumor primário ou original para outro órgão ou tecido e é tipicamente identificável pela presença de um tumor secundário ou massa celular secundária do tipo de tecido do tumor primário ou original e não daquele do órgão ou tecido no qual o tumor secundário (metastático) está localizado.

[0051] O termo câncer refere-se a uma classe de doenças caracterizadas pelo desenvolvimento de células anormais que proliferam

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18/101 incontrolavelmente e têm a capacidade de se infiltrar e destruir os tecidos normais do corpo.

[0052] O termo câncer raro refere-se aos cânceres que ocorrem em um número relativamente pequeno de pacientes. Os cânceres raros incluem, mas não são limitados a estes, sarcomas (por exemplo, sarcoma de tecidos moles, lipossarcoma, sarcoma uterino, leiomiossarcoma, mixofibrossarcoma, osteossarcoma, angiossarcoma, sarcoma de Ewing, sarcoma sinovial, rabdomiossarcoma), linfomas malignos, câncer do timo (por exemplo, timomas), mesotelioma, tumores estromais gastrointestinais (GISTs), câncer neuroendócrino, câncer ocular, tumores cerebrais, tumores de tecidos moles dos ossos, câncer de pele e tumores das células germinativas.

[0053] O termo agente anticâncer refere-se a qualquer agente terapêutico que é útil para o tratamento de câncer em um indivíduo (por exemplo, inibição do câncer ou crescimento de tumores em um indivíduo). Os agentes anticancerígenos abrangem agentes anticancerígenos bioterapêuticos, assim como agentes quimioterápicos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES [0054] A presente invenção é descrita com detalhes abaixo com referência às modalidades e similares da presente invenção. A invenção fornece compostos (por exemplo, o Composto (1)) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis ou derivados isotopicamente marcados e composições farmacêuticas do mesmos. A invenção também fornece métodos para inibir o crescimento de tumores e/ou tratar o câncer em um indivíduo que compreende a administração de uma quantidade eficaz ao indivíduo de um composto ou composição aqui fornecido. O composto ou composição pode ser administrado como uma monoterapia ou em combinação com outra terapia, conforme aqui descrito. Em mais outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de preparação do Composto (1) e intermediários sintéticos úteis para esse fim.

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ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, que pode estar opcionalmente na forma de um hidrato, solvato ou polimorfo, opcionalmente em um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0056] O Composto (1) pode existir como um polimorfo de cristal, e o composto da presente invenção pode estar em qualquer uma das formas cristalinas únicas ou uma mistura de duas ou mais formas cristalinas. O Composto (1) pode estar na forma amorfa ou pode ser um anidrido ou um solvato, tal como um hidrato.

[0057] A presente invenção inclui derivados isotopicamente marcados do Composto (1) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. O composto isotopicamente marcado é equivalente ao Composto (1), exceto que um ou mais átomos são substituídos por átomos tendo uma massa atômica ou um número de massa diferente daqueles normalmente encontrados na natureza. Exemplos de um isótopo que pode ser incorporado ao composto da presente invenção incluem isotopes de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, flúor, iodo, bromo e cloro, tais como ²H, ³H, ¹¹C, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁸F, ³⁵S, ¹²³l e ¹²⁵l.

[0058] O composto isotopicamente marcado, tal como um composto no qual um isótopo radioativo de, por exemplo, ³H e/ou ¹⁴C é incorporado, é útil para um ensaio de distribuição de tecido para um medicamento e/ou uma matriz. Os isótopos ³H e ¹⁴C são considerados úteis porque esses isótopos podem ser facilmente preparados e detectados.

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Os isótopos ¹¹C e ¹⁸F são úteis na PET (tomografia de emissão de positrons). O isótopo ¹²⁵l é considerado útil na SPECT (tomografia computadorizada de emissão de fóton único) e pode ser útil na geração de imagens cerebrais. A substituição por um isótopo mais pesado como ²H provoca, devido à sua maior estabilidade metabólica, algumas vantagens, em um tratamento, por exemplo, de prolongamento da meiavida in vivo ou redução de uma dose necessária e, portanto, é considerada útil em dadas circunstâncias. O composto isotopicamente marcado pode ser preparado de maneira semelhante através do uso de um reagente isotopicamente marcado facilmente disponível em vez de um reagente não isotopicamente marcado, e através da execução de processos divulgados nos esquemas e/ou exemplos descritos abaixo. [0059] O Composto (1) pode ser utilizado como uma sonda química para capturar uma proteína alvo de um composto de baixo peso molecular biologicamente ativo. Especificamente, o composto da presente invenção pode ser transformado em uma sonda de cromatografia por afinidade, uma sonda de fotoafinidade ou similar, mediante a introdução de um grupo de marcação, um conector ou similar em um componente diferente de um componente estrutural indispensável para a expressão de atividade do composto por um método descrito em J. Mass Spectrum. Soc. Jpn. Vol. 51, No. 5, 2003, p. 492-498, W02007/139149, ou semelhantes.

[0060] Exemplos do grupo de marcação, do conector ou similar utilizado em uma sonda química incluem grupos que pertencem aos seguintes grupos de (1) a (5). (1) Grupos de marcação de proteína tais como grupos de marcação por fotoafinidade (tais como um grupo de benzoíla, um grupo de benzofenona, um grupo de azida, um grupo de carbonil azida, um grupo de diaziridina, um grupo de enona, um grupo de diazo e um grupo de nitro) e grupos de afinidade química (tais como um grupo de cetona em que um átomo de alfa carbono é substituí

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21/101 do por um átomo de halogênio, um grupo de carbamoíla, um grupo éster, um grupo alquiltio, um aceitante de Michael de uma cetona αβinsaturada, éster, ou coisa parecida, e um grupo de oxirano); (2) conectores cliváveis tais como S-S, O-Si-O, um monossacarídeo (tal como um grupo de glicose ou um grupo de galactose) e um dissacarídeo (tal como lactose) e conectores oligopeptídicos que podem ser clivados por uma reação enzimática; (3) grupos de marca de extração tais como biotina e um grupo de 3-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4H-3a,4a-diaza4-bora-s-indaceno-3-il)propionila; (4) grupos de marcação radioativa tais como ¹²⁵l, ³²P, ³H e ¹⁴C; grupos de marcação de fluorescência tais como fluoresceína, rodamina, dansil, umbeliferona, 7-nitrofurazanil e um grupo de 3-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4H-3a,4a-diaza-4-bora-sindaceno-3-il)propionila; grupos quimioluminescentes tais como luciferina e luminol; e marcadores capazes de detectar íons de metais pesados tais como íons de metais lantanoides e íons de rádio; e (5) grupos a serem ligados a um veículo de fase sólida tais como glóbulos de vidro, um leito de vidro, uma placa de microlitro, glóbulos de agarose, um leito de agarose, glóbulos de poliestireno, um leito de poliestireno, glóbulos de náilon e um leito de náilon.

[0061] Uma sonda preparada pela introdução, no composto da presente invenção, de um grupo de marcação ou similar selecionado dos grupos de (1) a (5) acima descritos pelo método descrito em qualquer uma das literaturas mencionadas ou semelhantes, pode ser utilizada como uma sonda química para identificar uma proteína marcadora útil para pesquisa de um novo alvo potencial de fármaco.

[0062] Exemplos de um sal aqui utilizado incluem sais com ácidos inorgânicos, sais com ácidos orgânicos e sais com aminoácidos acídicos e, em particular, os sais farmaceuticamente aceitáveis são preferidos. Além disso, um sal do composto da presente invenção abrange um anidrido de um sal farmaceuticamente aceitável do mes

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22/101 mo e um solvato, tal como um hidrato, do sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos preferíveis de um sal com um ácido inorgânico incluem sais com ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e similares, e exemplos preferidos de um sal com um ácido orgânico incluem sais com ácido acético, ácido succínico, ácido famárico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido lático, ácido esteárico, ácido benzoico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido p-toluenossulfônico e similares. Exemplos preferíveis de um sal com um aminoácido acídico incluem sais com ácido aspártico e ácido glutâmico, e semelhantes. [0063] No caso em que o Composto (1) de acordo com a presente invenção é obtido como um sal do Composto (1) ou um hidrato do Composto (1), o sal e o hidrato podem ser convertidos em um corpo livre do Composto (1) através de um método convencional. Composições Farmacêuticas, Kits e Administração [0064] A presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo o Composto (1), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado do mesmo, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o composto aqui descrito, ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado marcado isotopicamente, é fornecido em uma quantidade eficaz na composição farmacêutica (por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz).

[0065] As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica de farmacologia. Em geral, esses métodos preparatórios incluem colocar o Composto (1) (isto é, o ingrediente ativo) em associação com um veículo ou excipiente e/ou um ou mais outros ingredientes acessórios, e depois, se necessário e/ou desejável, a moldagem e/ou acondicionamento do produto em uma unidade desejada de dose única ou múltiplas

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23/101 doses. Uma composição farmacêutica da invenção pode ser preparada de acordo com o método conhecido, tal como um método descrito nas regras gerais para preparações da Japanese Pharmacopoeia, 16² edição, da United States Pharmacopoeia e da European Pharmacopoeia, 9² edição. Uma composição farmacêutica da invenção pode ser administrada aos pacientes adequadamente dependendo da forma de dosagem.

[0066] As composições farmacêuticas podem ser preparadas, acondicionadas e/ou vendidas a granel, como uma dose unitária única e/ou como uma pluralidade de doses unitárias únicas. Uma dose unitária é uma quantidade discreta da composição farmacêutica compreendendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo. A quantidade do ingrediente ativo é geralmente igual à dosagem do ingrediente ativo que seria administrada a um indivíduo e/ou a uma fração conveniente de uma tal dosagem, tal como metade ou um terço dessa dose.

[0067] As quantidades relativas do ingrediente ativo, do excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou de quaisquer ingredientes adicionais em uma composição farmacêutica descrita nesta invenção irão variar, dependendo da identidade, tamanho e/ou condição do indivíduo tratado e ainda mais dependendo da via pela qual a composição deve ser administrada. A composição pode compreender entre 0,1% e 100% (p/p) de ingrediente ativo.

[0068] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis utilizados na fabricação de composições farmacêuticas fornecidas incluem diluentes inertes, agentes de dispersão e/ou granulação, agentes tensoativos e/ou emulsificantes, agentes desintegrantes, agentes de ligação, conservantes, agentes tamponantes, agentes lubrificantes e/ou óleos. Excipientes como manteiga de cacau e ceras para supositórios, agentes corantes, agentes de revestimento, adoçantes, aromatizantes e agen

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24/101 tes perfumantes também podem estar presentes na composição. [0069] O composto aqui fornecido é tipicamente formulado na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. Ficará entendido, no entanto, que o uso diário total das composições aqui descritas será decidido por um médico dentro do escopo da perfeita avaliação médica. O nível de dose terapeuticamente eficaz específico para qualquer indivíduo ou organismo em particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a doença a ser tratada e a gravidade do distúrbio; a atividade do ingrediente ativo específico empregado; a composição específica empregada; a idade, peso corporal, estado geral de saúde, sexo e dieta do indivíduo; o tempo de administração, via de administração e taxa de excreção do ingrediente ativo específico empregado; a duração do tratamento; fármacos utilizados em combinação ou coincidentes com o ingrediente ativo específico empregado; e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.

[0070] O composto da presente invenção (Composto (1)) e suas composições aqui fornecidas podem ser administradas por qualquer via, incluindo enteral (por exemplo, oral), parenteral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, subcutânea intraventricular, transdérmica, interdérmica, retal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como por pós, pomadas, cremes e/ou gotas), mucosal, nasal, bucal, sublingual; por instilação intratraqueal, instilação brônquica e/ou inalação; e/ou como uma pulverização oral, pulverização nasal e/ou aerossol. As vias especificamente contempladas são a administração oral, administração intravenosa (por exemplo, injeção intravenosa sistêmica), administração regional por meio do fornecimento de sangue e/ou linfa e/ou a administração direta a um local afetado. Em geral, a via de administração mais apropriada dependerá de vários fatores incluindo a natureza do agente (por exemplo, sua estabilidade no

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25/101 ambiente do trato gastrointestinal) e/ou a condição do indivíduo (por exemplo, se o indivíduo é capaz de tolerar a administração oral). [0071] A quantidade exata de Composto (1) necessária para atingir uma quantidade eficaz variará de indivíduo para indivíduo, dependendo, por exemplo, da espécie, idade e condição gerais de um indivíduo, gravidade dos efeitos colaterais ou distúrbio, identidade do composto particular, modo de administração, e similares. Uma quantidade eficaz pode ser incluída em uma dose única (por exemplo, dose oral única) ou múltiplas doses (por exemplo, doses orais múltiplas). Em certas modalidades, quando as doses múltiplas são administradas a um indivíduo ou aplicadas a um tecido ou célula, quaisquer duas doses das doses múltiplas incluem quantidades diferentes ou substancialmente as mesmas de um composto aqui descrito. Em certas modalidades, quando doses múltiplas são administradas a um indivíduo ou aplicadas a um tecido ou célula, a frequência de administração das doses múltiplas ao indivíduo ou de aplicação das doses múltiplas ao tecido ou célula pode ser, em exemplos não limitativos, três doses por dia, duas doses por dia, uma dose por dia, uma dose a cada dois dias, uma dose a cada três dias, uma dose a cada semana, uma dose a cada duas semanas, uma dose a cada três semanas ou uma dose a cada quatro semanas, ou mesmo a liberação controlada de dose lenta durante um período de tempo selecionado, utilizando um dispositivo de administração de fármacos. Em certas modalidades, a frequência de administração das múltiplas doses ao indivíduo ou de aplicação das múltiplas doses ao tecido ou célula é de uma dose por dia. Em certas modalidades, a frequência de administração das múltiplas doses ao indivíduo ou de aplicação das múltiplas doses ao tecido ou célula é de duas doses por dia. Em certas modalidades, a frequência de administração das múltiplas doses ao indivíduo ou de aplicação das múltiplas doses ao tecido ou célula é de três doses por dia. Em certas modali

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26/101 dades, quando múltiplas doses são administradas a um indivíduo ou aplicadas a um tecido ou célula, a duração entre a primeira dose e a última dose das múltiplas doses é de aproximadamente ou pelo menos um dia, dois dias, quatro dias, uma semana, duas semanas, três semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, seis meses, nove meses, um ano, dois anos, três anos, quatro anos, cinco anos, sete anos, dez anos, quinze anos, vinte anos ou por toda a vida do indivíduo, tecido ou célula. Em certas modalidades, a duração entre a primeira dose e a última dose das múltiplas doses é de aproximadamente ou pelo menos três meses, seis meses ou um ano. Em certas modalidades, a duração entre a primeira dose e a última dose das múltiplas doses é por toda a vida do indivíduo, tecido ou célula. Em certas modalidades, uma dose (por exemplo, uma dose única, ou qualquer dose de múltiplas doses) aqui descrita inclui independentemente entre 0,001 mg/kg e 0,01 mg/kg, entre 0,01 mg/kg e 0,1 mg/kg ou entre 0,1 mg/kg e 1 mg/kg, inclusive, do Composto (1). Exemplos são as formas de dosagem com pelo menos cerca de 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2,

2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 10, 5, 20, 25 ou 50 mg de composto ativo, ou seu sal, em uma forma de dosagem.

[0072] As faixas de doses conforme aqui descritas, fornecem orientação para a administração das composições farmacêuticas fornecidas a um adulto. A quantidade a ser administrada, por exemplo, a uma criança ou um adolescente pode ser determinada por um profissional médico ou pessoa versada na técnica e pode ser menor ou igual àquela administrada a um adulto.

[0073] Também incluídos pela divulgação estão os kits (por exemplo, embalagens farmacêuticas). Os kits fornecidos podem compreender uma composição farmacêutica ou Composto (1) e um recipiente (por exemplo, um frasco, ampola, garrafa, seringa e/ou embalagem dispensadora, ou outro recipiente adequado). Em algumas modalida

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27/101 des, os kits fornecidos podem opcionalmente incluir ainda um segundo recipiente compreendendo um excipiente farmacêutico para diluição ou suspensão de uma composição farmacêutica ou um Composto (1). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica ou o Composto (1) fornecido no primeiro recipiente e no segundo recipiente são combinados para formar uma forma de dosagem unitária. Um kit descrito nesta invenção pode incluir um ou mais agentes farmacêuticos adicionais aqui descritos como uma composição separada.

Métodos de Tratamento e Uso [0074] Conforme mostrado nesta invenção, o Composto (1) possui efeitos significativos de remodelação vascular do tumor e atividade anti-CAF e, portanto, possui uso potencial para o tratamento de câncer e/ou inibição do crescimento tumoral.

[0075] É aqui fornecido um método de tratamento de câncer em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um Composto (1) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado do mesmo ou sua composição farmacêutica. A presente invenção também fornece o Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, ou uma composição farmacêutica do mesmo, para uso no tratamento de câncer em um indivíduo. A presente invenção também fornece o uso do Composto (1), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado do mesmo, ou sua composição farmacêutica, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[0076] Da mesma forma é aqui fornecido um método para inibir o crescimento de tumores em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo do Composto (1) do indivíduo, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado do mesmo, ou sua composição farmacêutica. Também é aqui fornecido o

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Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, ou uma composição farmacêutica do mesmo, para uso na inibição do crescimento de tumores em um indivíduo. A presente invenção também fornece o uso do Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, ou uma sua composição farmacêutica do mesmo, para a fabricação de um medicamento para inibir o crescimento de tumores.

[0077] Em certas modalidades dos métodos e uso aqui fornecidos, o câncer é câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer uterino, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer gástrico, câncer do intestino delgado, câncer de bexiga ou um sarcoma.

[0078] Em certas modalidades dos métodos e uso aqui fornecidos, o câncer é câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer oral, câncer de garganta, câncer da glândula salivar, câncer da língua, carcinoma cístico das adenoides). Em certas modalidades, o câncer é carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN). Em certas modalidades, o câncer é carcinoma cístico das adenoides. Em certas modalidades, o câncer é câncer de mama (por exemplo, câncer de mama positivo para HER2, câncer de mama triplo negativo). Em certas modalidades, o câncer é um câncer de mama positivo para HER2. Em certas modalidades, o câncer é um câncer de mama triplo negativo. Em certas modalidades, o câncer é câncer colorretal (por exemplo, carcinoma do cólon). Em certas modalidades, o câncer é carcinoma do cólon. Em certas modalidades, o câncer é câncer de esôfago (por exemplo, adenocarcinoma de esôfago). Em certas modalidades, o câncer é adenocarcinoma de esôfago. Em certas modalidades, o câncer é câncer uterino (por exemplo, sarcoma uterino). Em certas modalidades, o câncer é sarcoma uterino. Em certas modalidades, o câncer é câncer de ová

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29/101 rio. Em certas modalidades, o câncer é um sarcoma (por exemplo, sarcoma uterino, fibrossarcoma, angiossarcoma, sarcoma sinovial, carcinoma de tecidos moles). Em certas modalidades, o câncer é fibrossarcoma. Em certas modalidades, o câncer é angiossarcoma. Em certas modalidades, o câncer é sarcoma sinovial. Em certas modalidades, o câncer é carcinoma de tecidos moles. Em certas modalidades, o câncer é câncer gástrico. Em certas modalidades, o câncer é câncer do intestino (por exemplo, câncer do intestino delgado, adenocarcinoma do intestino delgado). Em certas modalidades, o câncer é câncer do intestino delgado. Em certas modalidades, o câncer é adenocarcinoma do intestino delgado. Em certas modalidades, o câncer é câncer de bexiga (por exemplo, câncer urotelial). Em certas modalidades, o câncer é câncer urotelial. Em certas modalidades, o câncer é câncer endometrial. Em certas modalidades, o câncer é um câncer raro. Terapia de Combinação [0079] Além da administração como monoterapia, o Composto (1) pode ser administrado em combinação com outros agentes terapêuticos ou modalidades de tratamento. Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo. Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo monoclonal. O composto da presente invenção pode ser administrado em combinação com outro agente terapêutico, tal como terapia anti-EGFR, terapia anti-HER2, terapia anti-PD-1, terapia anti-PD-L1 ou terapia de irradiação.

[0080] Em certas modalidades, o Composto (1), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado do mesmo, ou sua composição farmacêutica, é administrado em combinação com uma terapia anti-EGFR (por exemplo, anticorpo monoclonal (mAb) anti-EGFR, tal como cetuximab). Em certas modalidades, a terapia anti-EGFR é um anticorpo anti-EGFR. Por exemplo, é aqui fornecido um método de tratamento de carcinoma de células escamosas

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30/101 da cabeça e pescoço (SCCHN) em um indivíduo que compreende a administração a dito indivíduo do Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado ou uma composição farmacêutica do mesmo, em combinação com uma terapia com mAb anti-EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico). Em certas modalidades, o mAb anti-EGFR é cetuximab (CTX).

[0081] Em certas modalidades, o Composto (1), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado do mesmo, ou sua composição farmacêutica, é administrado em combinação com uma terapia anti-HER2 (por exemplo, anticorpo monoclonal (mAb) anti-HER2 tal como o trastuzumab). Em certas modalidades, a terapia anti-HER2 é um anticorpo anti-HER2. Por exemplo, é aqui fornecido um método de tratamento de câncer de mama em um indivíduo com sua necessidade que compreende a administração a dito indivíduo do Composto (1), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado do mesmo ou sua composição, em combinação com uma terapia de mAb de HER2 (receptor do fator de crescimento epidérmico humano). Em certas modalidades, o mAb anti-HER2 é trastuzumab.

[0082] Em certas modalidades, o Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, ou uma composição farmacêutica do mesmo, é administrado em combinação com uma terapia anti-PD-1 ou anti-PD-L1 (por exemplo, anticorpo monoclonal anti-PD-1 ou anti-PD-L1). Em certas modalidades, a terapia anti-PD-1 ou anti-PD-L1 é um anticorpo. Por exemplo, é aqui fornecido um método de tratamento de câncer colorretal em um indivíduo com sua necessidade compreendendo a administração a dito indivíduo do Composto (1), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado ou sua composição, em combinação com uma terapia anti-PD-1 ou anti-PD-L1 (por exemplo, terapia com mAb).

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31/101 [0083] Em certas modalidades, o Composto (1), ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou derivado isotopicamente marcado, ou uma composição farmacêutica do mesmo, é utilizado em combinação com a terapia de radiação (RT). Em certas modalidades, o composto é administrado em combinação com a cirurgia.

EXEMPLOS

Síntese do Composto (1)

Procedimentos e métodos gerais [0084] O composto de acordo com a presente invenção pode ser produzido pelos métodos descritos nos Exemplos abaixo. No entanto, estes exemplos são apenas para propósitos ilustrativos, e o composto de acordo com a presente invenção não está limitado aos exemplos específicos mencionados abaixo de qualquer maneira.

[0085] Nos exemplos, a menos que especificamente mencionado de outra forma, o gel de silica para purificação utilizando a cromatografia em coluna de silica gel era Hi-Flash™ Column (Silica Gel, 30 pm 60 Á ou 40 pm 60 Á, Yamazen Corporation), a silica gel para a purificação através do uso de cromatografia em coluna de silica gel NH foi gel de silica Chromatorex NH (Fuji Silysia Chemical LTD). A cromatografia analítica em camada fina (TLC) foi executada com TLC silica gel 60 F254, espessura da camada 0,25 mm (Merck KGaA) ou Chromatorex TLC NH silica gel F254, espessura da camada 0,25 mm (Fuji Silysia Chemical LTD). As placas de TLC foram visualizadas através da coloração com corante de p-anisaldeído, colorante de ácido fosfomolibdico ou corante de Hanessian.

[0086] Todas as reações sensíveis à umidade foram conduzidas sob uma atmosfera inerte. Os reagentes e solventes eram de qualidade comercial e foram utilizados como fornecidos, a não ser que de outra maneira mencionada.

[0087] Os espectros de RMN foram registrados em um espectrô

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32/101 metro JEOL ECZ500R (500 MHz), JEOL ECZ400S (400 MHz), Varian Inova 500 (500 MHz), Varian Mercury 400 (400 MHz) ou Bruker Avance (600 MHz). Os desvios químicos são relatados em partes por milhão (ppm). Para os espectros de ¹H RMN (CDCI3, CeDe e/ou CD3OD), 0 pico de solvente residual foi utilizado como referência interna (7,27 ppm em CDCI3; 7,16 ppm em CeDe; 3,31 ppm em CD3OD).

[0088] Os resultados analíticos do espectro de massa (MS) foram obtidos utilizando um Waters Acquity UPLC equipado com um único detector quadripolar (SQ Detector 2) ou LTQ Orbitrap XL™ (Thermoscientific).

[0089] A cromatografia em fase líquida de alta eficiência (HPLC) foi realizada com Shimadzu LC-10AD em urn detector espectrofotométrico UV (200 nm, Shimadzu SPD-10A).

[0090] As abreviações aqui utilizadas são como se segue: AIBN: 2,2'-azobis(isobutironitrila); 9-BBN: 9-borabiciclo[3.3.1]nonano; BusSnH: hidreto de tri-normal-butilestanho; (+)-CSA: ácido (1 S)-(+)-10canforossulfônico; DMAP: 4-dimetilaminopiridina; DCM: diclorometano; DDQ: 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona; DIBAL: hidreto de diisobutilalumínio; DMF: Ν,Ν-dimetilformamida; DMSO: sulfóxido de dimetila; EtsN: trietilamina; EtOAc: acetato de etila; HF-Piridina: fluoreto de hidrogênio piridina; HPLC: cromatografia em fase líquida de alta eficiência; IPA: álcool isopropílico; MeCN: acetonitrila; MeOH: metanol; MPM: para-metoxibenzila; PPhs: trifenilfosfina; t-BuOH: álcool terciáriobutílico; tBuLi: terciário-butil lítio; TBME: éter metil terciário-butílico; TBAF: fluoreto de tetrabutilamônio; TBS: terciária-butildimetilsilila; THF: tetra-hidrofurano; TMS: trimetilsilila; Ts: para-toluenossulfonila.

[0091] Os intermediários sintéticos aqui divulgados são considerados parte da presente invenção.

Esquema A; Preparação do Composto A-7

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33/101

THF

TBSOTf lutidina brometo de metiltrifenil fosfônio t-BuOK

OH H

DCM

O

OTBS A

O ?^Lo

TBSOTf lutidina

DCM

CH₃CN-DCM

HF-Py piridina

periodinano

Dess-Martin

NaHCO₃DCM

Exemplo 1 (4aR,5aS,6R,8aS,9aR)-2,2-di-ferc-butil-6metiloctaidrofuro[2',3':5,6]pirano[3,2-dl[1,3,21dioxassilin-7-ol

Sob uma atmosfera

H

Si I

O

OH de nitrogênio, à solução de Composto A-1:

(4aR,5aS,6R,8aS,9aR)-2,2-di-terc-butil-6-metil-hexa-hidrofuro[2',3':5,6] pirano[3,2-d][1,3,2]dioxassilin-7(8aH)-ona (A-1 18,5 g, 54,0 mmol) ob tida pelo método escrito em Organic Letters (2009), 11(2), 409-412 (CAS No; 1095280-04-8) em tolueno (275 mL) a -78°C, DIBAL (70,2 ml, 70,2 mmol, solução de tolueno 1,0 M) foi adicionada durante 30

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34/101 min. Depois a mistura de reação foi agitada a -78°C. Após 90 min, a reação foi suprimida com MeOH (4,37 ml) cuidadosamente a -78°C, depois removido o banho de esfriamento. Solução saturada de tartarato tetra-hidrato de potássio sódio (300 ml) foi adicionada à mistura de reação, a agitação continuou durante 2 h na temperatura ambiente. A mistura de reação foi despejada dentro de um funil separador, então as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com EtOAc (300 ml). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura (300 ml), secados por Na2SO4, filtrados, concentrados sob pressão reduzida. O lactol bruto foi utilizado para a próxima reação sem purificação.

Exemplo 2 (4aR,6S,7S,8aR)-6-((S)-but-3-en-2-il)-2,2-di-terc-butil-hexahidropirano[3,2-d1[1,3,2]dioxassilin-7-ol (Composto A-2)

brometo de metiltrifenil fosfônio t-BuOK

THF

Sob uma atmosfera de nitrogênio, à suspensão de brometo de metiltrifenilfosfônio (73,30 g, 205,2 mmol) em THF (200 ml), terc-butóxido de potássio (17,27 g, 153,9 mmol) foi adicionado a -5°C durante 10 min, e depois agitada durante 60 min a -5°C. A solução do lactol bruto descrito no Exemplo 1 em THF (40 ml) foi transferida para a mistura de reação a -5°C durante 10 min, depois agitada a -5°C durante 1 h, em temperatura ambiente durante 1 h. A mistura de reação foi suprimida com água gelada (400 ml), depois diluída com TBME (400 ml) e então as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com TBME (400 ml). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura (400 ml), secados por Na2SO4, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. O resíduo foi colocado em suspensão com Hepta

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35/101 πο/EtOAc = 1/1 (100 ml). A suspensão resultante foi filtrada, enxaguada com Heptano/EtOAc = 1/1 (100 ml) para remover o material derivado de trifenilfosfina. Depois o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel (400 g, Silica Gel 60, esférica, 40-50 pm, Kanto Chemical) utilizando 0% a 20% EtOAc/Heptano forneceu o composto do título (Composto A-2, 16,7 g, 90% de rendimento).

¹H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ ppm 1,03 (d, J = 6,8 Hz, 3 H) 1,05 (s, 9 H) 1,07 (s, 9 H) 1,75 (dt, J = 14,5, 3,0 Hz, 1 H) 2,37 (dt, J =

14,5, 2,9 Hz, 1 H) 2,65 - 2,76 (m, 1 H) 3,03 (dd, J = 9,8, 1,0 Hz, 1 H) 3,31 (m, 1 H) 3,69 (d, J = 15,0 Hz, 1 H) 3,75 - 3,79 (m, 1 H) 4,16 - 4,31 (m, 2 H) 4,41 (t, J = 2,9 Hz, 1 H) 4,95 - 5,09 (m, 2 H) 6,02 (ddd, J =

17,3, 10,5, 6,3 Hz, 1 H).

Exemplo 3 (4aR,6S,7S,8aR)-6-((S)-but-3-en-2-il)-2,2-di-ferc-butil-7-((fercbutildimetilsilil)óxi)h-hexa-hidroDirano[3,2-d][1,3,2]dioxassilina (Composto A-3)

A-2

TBSOTf lutidina

DCM

A-3

Sob uma atmosfera de nitrogênio, a uma solução de Composto A-2: (4aR,6S,7S,8aR)-6-((S)-but-3-en-2-il)-2,2-di-terc-butil-hexahidropirano[3,2-d][1,3,2]dioxassilin-7-ol (9,85 g, 28,8 mmol) descrito no Exemplo 2 em DCM (150 ml) a 0°C foram adicionados 2,6-lutidina (6,68 ml, 57,5 mmol) e terc-butildimetilsilil trifluorometanossulfonato (9,25 ml, 40,3 mmol). A mistura de reação foi agitada a 0°C durante 30 min, depois na temperatura ambiente durante 2 h. A mistura de reação foi diluída com éter dietílico. A camada orgânica foi lavada com 0,5 N HCI aq, NaHCOs aq sat. e depois salmoura. As camadas orgânicas

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36/101 combinadas foram secadas por MgSCri, filtradas (pequena quantidade de S1O2) e concentradas sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 15% EtOAc/Heptano forneceu 0 composto do título (Composto A-3, 12,0 g, 91% de rendimento).

¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-c/) δ ppm 0,10 (s, 3 H) 0,19 (s, 3 H) 0,91 (s, 9 H) 0,96 (d, J = 6,3 Hz, 3 H) 1,02 (s, 9 H) 1,06 (s, 9 H) 1,73 (dt, J = 15,0, 4,0 Hz, 1 H) 2,26 (dt, J = 15,0, 2,5 Hz, 1 H) 2,66 - 2,74 (m, 1 H) 2,95 (dd, J = 9,5, 2,2 Hz, 1 H) 3,17 (m, 1 H) 3,81 - 3,84 (m, 1 H) 4,12 - 4,22 (m, 2 H) 4,24 (t, J = 2,7 Hz, 1 H) 4,93 - 5,06 (m, 2 H) 6,08 (ddd, J = 17,3, 10,5, 6,3 Hz, 1 H).

Exemplo 4 (2R,3R,5S,6S)-6-((S)-but-3-en-2-il)-5-((ferc-butildimetilsilil)óxi)-2(hidroximetil)tetra-hidro-2H-piran-3-ol (Composto A-4)

A-3

HF-Py Piridina

MeCN-DCM

HO

OTBS

Η H

A-4

Sob uma atmosfera de nitrogênio, a uma solução de Composto A-3: (4aR,6S,7S,8aR)-6-((S)-but-3-en-2-il)-2,2-di-terc-butil-7-((tercbutildimetilsilil)óxi)h-hexa-hidropirano[3,2-d][1,3,2]dioxassilina (12 g,

26,3 mmol) descrita no Exemplo 3 em MeCN (120 ml) e DCM (40 ml) a -10°C foi adicionada solução pré-misturada de HF-Pyridine (4,0 ml) e piridina (20 ml) em 20 ml de MeCN. A mistura de reação foi agitada a 10°C durante 15 min, depois na temperatura ambiente durante 1 h. A mistura de reação foi suprimida com NaHCOs aq sat. a 0°C e diluída com DCM, então as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com DCM. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura. A camada orgânica combinada foi secada por MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do

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37/101 resíduo em silica gel utilizando 15% a 60% EtOAc/Heptano forneceu ο composto do título (Composto A-4, 8,4 g, Rendimento quant.).

¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-c/) δ ppm 0,13 (s, 3 H) 0,19 (s, 3 H) 0,94 (s, 9 H) 0,96 (d, J = 6,8 Hz, 3 H) 1,72 (dt, J = 14,6, 2,9 Hz, 1 H)

2,15 (dd, J = 9,8, 2,4 Hz, 1 H) 2,23 (dt, J = 14,6, 2,9 Hz, 1 H) 2,55 2,65 (m, 1 H) 3,03 (d, J = 9,8 Hz, 1 H) 3,41 - 3,46 (m, 1 H) 3,49 (d, J =

11,7 Hz, 1 H) 3,62 - 3,72 (m, 2 H) 3,92 (ddd, J = 11,7, 8,3, 2,4 Hz, 1 H)

4,02 (t, J = 2,7 Hz, 1 H) 5,01 - 5,12 (m, 2 H) 5,93 (ddd, J = 17,4, 10,4,

7,3 Hz, 1 H).

Exemplo 5 (((2S,3S,5R,6R)-2-((S)-but-3-en-2-il)-6-(((fercbutildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2H-DÍran-3,5-diil)bis(óxi))bis(fercbutildimetilsilano) (Composto A-5)

TBSOTf lutidina

aa uma

DCM solução de Composto A-4:

Sob uma atmosfera de nitrogênio, (2R,3R,5S,6S)-6-((S)-but-3-en-2-il)-5-((terc-butildimetilsilil)óxi)-2(hidroximetil)tetra-hidro-2H-piran-3-ol (997 mg, 3,15 mmol) descrito no Exemplo 4 em DCM (10 ml) a 5°C foi adicionada 2,6-lutidina (1,83 ml,

15,8 mmol) e ferc-butildimetilsilil trifluorometanossulfonato (2,17 ml, 9,45 mmol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 5 h. A mistura de reação foi diluída com éter dietílico e suprimida com NaHCOs aq sat., depois as camadas foram separadas. Os extratos orgânicos combinados foram lavados de modo sucessivo com 0,5 N HCI aq, NaHCOs aq sat., e depois salmoura. A camada orgânica foi secada por MgSOzí, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 5% EtO

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Ac/Heptano (contendo 1% EtsN) forneceu o composto do título (Composto A-5, 1,69 g, 98% de rendimento).

¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-d) δ ppm 0,02 - 0,08 (m, 15 H) 0,11 (s, 3 H) 0,89 (s, 9 H) 0,90 - 0,92 (m, 18 H) 0,94 (d, J = 6,8 Hz, 3 H) 1,82 (dt, J = 14,9, 4,8 Hz, 1 H) 2,00 (dt, J = 14,9, 2,9 Hz, 1 H) 2,62 2,72 (m, 1 H) 2,93 (dd, J = 9,3, 2,0 Hz, 1 H) 3,27 - 3,34 (m, 1 H) 3,66 3,79 (m, 3 H) 3,83 - 3,87 (m, 1 H) 4,91 - 5,07 (m, 2 H) 6,11 (ddd, J =

17,3, 10,7, 6,1 Hz, 1 H).

Exemplo 6 (S)-3-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((ferc-butildimetilsilil)óxi)-6-(((fercbutildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2H-DÍran-2-il)butan-1-ol (Composto

A uma solução de Composto A-5: (((2S,3S,5R,6R)-2-((S)-but-3-en-2il)-6-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-3,5diil)bis(óxi))bis(fórc-butildimetilsilano) (1,32 g, 2,42 mmol) descrito no Exemplo 5 em THF (10 ml) a 0°C foi adicionado 9-BBN (9,69 ml, solução de THF 0,5 M, 4,84 mmol). A mistura de reação foi agitada a 0°C durante 1 h e na temperatura ambiente durante 1,5 h. NaOH aq 3,0 M (3 ml, 9,00 mmol) e peróxido de hidrogênio (35% em água, 3 ml) foram adicionados à mistura de reação a 0°C. A mistura de reação foi agitada a 0°C durante 30 min, depois na temperatura ambiente durante 1 h. A mistura de reação foi suprimida com Na2SOs aq sat. e então as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com EtOAc (3 vezes). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secados por Na2SO4, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 20%

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EtOAc/Heptano forneceu o composto do título (Composto A-6, 1,36 g, 100% de rendimento).

¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-d) δ ppm 0,03 (s, 3 H) 0,05 - 0,08 (m, 12 H) 0,10 (s, 3 H) 0,88 (d, J = 6,8 Hz, 3 H) 0,89 - 0,93 (m, 27 H) 1,55 - 1,65 (m, 1H) 1,82 (dt, J = 15,4, 4,4 Hz, 1 H) 1,87 - 1,96 (m, 1 H)

1.97 - 2,03 (m, 1 H) 2,17- 2,26 (m, 1H) 2,67 (dd, J = 7,8, 3,9 Hz, 1 H)

2.98 - 3,10 (m, 1 H) 3,34 - 3,40 (m, 1 H) 3,59 - 3,86 (m, 6 H) ESI-MS (m/z): 563,64 [M + H]⁺, 585,62 [M + Na]⁺

Exemplo 7 (S)-3-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((ferc-butildimetilsilil)óxi)-6-(((fercbutildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)butanal (Composto AOH periodinano Dess-Martin

TBSO

1\^OTBS

Η H

NaHCO₃DCM

TBSO.

.O

A-6

Sob uma atmosfera de nitrogênio, a uma solução de Composto A-6: (S)-3-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)óxi)-6(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)butan-1 -ol (1100 mg, 1,954 mmol) descrito no Exemplo 6 em DCM (30 ml) a 5°C foram adicionados NaHCOs (41,0 mg, 0,49 mmol) e periodinano Dess-Martin (1077 mg, 2,54 mmol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente. Após 3 h, a mistura de reação foi diluída com DCM e suprimida com NaHCOs aq sat. e NasSOsaq sat., depois as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com DCM. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secados por MgSO4, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 25% EtOAc/Heptano forneceu o composto do título (Composto A-7, 950 mg, 87% de rendimento).

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40/101 ¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-c/) δ ppm 0,00 (s, 3 H) 0,03 - 0,08 (m, 12 H) 0,11 (s, 3 H) 0,88 (s, 9 H) 0,91 - 0,92 (m, 21H) 1,82 (dt, J = 15,0, 4,5 Hz, 1 H) 2,01 (dt, J = 15,0, 2,5 Hz, 1 H) 2,28 (ddd, J = 16,0,

7,3, 2,4 Hz, 1 H) 2,53 -2,58 (m, 1 H) 2,74 (ddd, J = 16,0, 5,5, 2,0 Hz, 1 H) 2,94 (dd, J = 9,0, 1,7 Hz, 1 H) 3,29 (td, J = 5,9, 2,0 Hz, 1 H) 3,68 (d,

J = 5,9 Hz, 2 H) 3,75 - 3,82 (m, 1 H) 3,82 - 3,90 (m, 1 H) 9,73 (t, J = 2,4

Hz, 1 H).

Esquema B; Preparação do Composto B-3

	„TMS = -TMS TsCI _T Ξ /TMS Et₃N γ Nal
OMPM	* OMPM * Ãmdm DCM DMF OMPM
B-1	B-2 80deg 3.3

Exemplo 8

4-metilbenzenossulfonato de (2S,3S)-3-((4-metoxibenzil)óxi)-2-metil-5(trimetilsilil)pent-4-in-1-ila (Composto B-2)

ho^/xX	JTMS = -TMS TsCI, Et₃N, DMAP _TsQ ;
OMPM	DCM OMPM
B-1	B-2

Sob uma atmosfera de nitrogênio, à solução de Composto B-1: (2S,3S)-3-((4-metoxibenzil)óxi)-2-metil-5-(trimetilsilil)pent-4-in-1 -ol (11,08 g, 36,15 mmol) obtida pelo método escrito na WO 9317690 A1/US 5436238 A (CAS No; 157323-41-6) em DCM (330 ml), Et₃N (12,6 ml, 90,4 mmol) e cloreto de p-toluenossulfonila (8,27 g, 43,4 mmol) foram adicionados na temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi lavada com NaHCOs sat. e salmoura, secada por MgSCri, filtrada, depois concentrada sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel (Silica Gel 60, esférica, 40 a 50 pm, Kanto Chemical) utilizando 0% a 10% EtOAc/Heptano forneceu o composto do título (Composto B-2, 17,7 g, 93% de rendimento).

Petição 870190096531, de 26/09/2019, pág. 86/156

41/101 ¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-d) δ ppm 0,17 (s, 9 H) 1,02 (d, J=

6,8 Hz, 3 H) 2,10 - 2,18 (m, 1 H) 2,44 (s, 3 H) 3,82 (s, 3 H) 3,99 (d, J=

6,8 Hz, 1 H) 4,04 - 4,07(m, 2 H) 4,33 (d, J = 11,2 Hz, 1 H) 4,66 (d, J=

11,2 Hz, 1 H) 6,87 (d, J = 8,3 Hz, 2 H) 7,21 (d, J = 8,3 Hz, 2 H) 7,33(d,

J = 8,8 Hz, 2 H) 7,77 (d, J = 8,8 Hz, 2 H).

Exemplo 9 ((3S,4R)-5-iodo-3-((4-metoxibenzil)óxi)-4-metilpent-1 -in-1 iDtrimetilsilano (Composto B-3)

OMPM ^DMF OMPM

B-2 B-3

Sob uma atmosfera de nitrogênio, à solução de Composto B-2: 4-metilbenzenossulfonato de (2S,3S)-3-((4-metoxibenzil)óxi)-2metil-5-(trimetilsilil)pent-4-in-1 -ila (17,7 g, 38,4 mmol) descrito no Exemplo 8 em DMF (360 ml), Nal (7,49 g, 50,0 mmol) foi adicionado na temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada a 80°C durante 2 h. Mais 2,0 g de Nal foram adicionados à mistura de reação. A reação foi agitada durante 1,5 h a 80°C, depois esfriada para a temperatura ambiente. A mistura foi diluída com éter dietílico, lavada com água e salmoura, secada por MgSCri, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel (Silica Gel 60, esférica, 40 a 50 pm, Kanto Chemical) utilizando 10% a 20% EtOAc/Heptano forneceu o composto do título (Composto B-3, 14,3g, 89% de rendimento).

¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-d) δ ppm 0,21 (s, 9 H) 1,10 (d, J =

6,8 Hz, 3 H) 1,74 - 1,84 (m, 1 H) 3,30 - 3,37 (m, 2 H) 3,82 (s, 3 H) 3,96 (d, J = 7,3 Hz, 1 H) 4,44 (d, J = 11,2 Hz, 1 H) 4,73 (d, J = 11,2 Hz, 1 H) 6,89 (d, J = 8,8 Hz, 2 H) 7,30 (d, J = 8,8 Hz, 2 H).

Petição 870190096531, de 26/09/2019, pág. 87/156

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Esquema C; Preparação do Composto C-8

dicarbonato de dialila

NaN₃

DMSO 85deg, 24h

Et₃N THF

C-7

Exemplo 10 (2S,6S,7S)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((ferc-butildimetilsilil)óxi)-6-(((fercbutildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)-7-((4metoxibenzil)óxi)-6-metil-9-(trimetilsilil)non-8-in-4-ol (Composto C-1)

Petição 870190096531, de 26/09/2019, pág. 88/156

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Sob uma atmosfera de argônio, aa uma solução de Composto B-3: ((3S,4R)-5-iodo-3-((4-metoxibenzil)óxi)-4-metilpent-1 -in-1 il)trimetilsilano (1408 mg, 3,382 mmol) descrito no Exemplo 9 em éter dietílico (25 ml) a -78°C foi adicionado terc-butilítio (1,61M em pentano, 4,11 ml, 6,62 mmol). A mistura de reação foi agitada a -78°C durante 45 min. Composto A-7: (S)-3-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((tercbutildimetilsilil)óxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2Hpiran-2-il)butanal (825 mg, 1,47 mmol) descrito no Exemplo 7 em 5,0 ml de éter dietílico foi adicionado à mistura de reação a -78°C. A mistura de reação foi agitada a -78°C durante 60 min. A mistura de reação foi suprimida com NH4CI aq sat. A camada orgânica foi lavada com salmoura, secada por Na2SO4, depois concentrada sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 25% EtOAc/Heptano forneceu 0 composto do título (Composto C-1, 1167 mg, 93% de rendimento).

¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-c/) δ ppm 0,00 - 0,12 (m, 21 H) 0,15 - 0,24 (m, 6 H) 0,82 - 0,96 (m, 30 H) 1,03 (d, J = 6,3 Hz, 3H) 1,38 1,55 (m, 1H) 1,68 - 1,99 (m, 4 H) 2,10 - 2,30 (m, 2 H) 2,76 - 2,87 (m, 1 H) 3,15 (d, J = 9,75 Hz, 1 H) 3,33 - 3,38 (m, 1 H) 3,56 - 4,02 (m, 9 H) 4,37 - 4,50 (m, 1 H) 4,64 - 4,78 (m, 1 H) 6,83 - 6,88 (m, 2H) 7,23 - 7,35 (m, 2H).

Exemplo 11 (2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((ferc-butildimetilsilil)óxi)-6(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2H-DÍran-2-il)-7-((4metoxibenzil)óxi)-6-metil-9-(tributilestanil)non-8-en-4-ol (Composto C3)

Petição 870190096531, de 26/09/2019, pág. 89/156

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A uma solução de Composto

C-1: (2S,6S,7S)-2((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)óxi)-6-(((tercbutildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)-7-((4metoxibenzil)óxi)-6-metil-9-(trimetilsilil)non-8-in-4-ol (1165 mg, 1,37 mmol) descrito no Exemplo 10 em MeOH (20 ml) a 20°C foi adicionado K2CO3 (189 mg, 1,37 mmol). A mistura de reação foi agitada a 20°C durante 2 h. A mistura de reação foi diluída com EtOAc e suprimida com NH4CI aq sat., depois as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secados por MgSCri, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 15% EtOAc/Heptano forneceu 0 Composto C2: (2S,6S,7S)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)óxi)-6 (((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)-7-((4metoxibenzil)óxi)-6-metilnon-8-in-4-ol (1050 mg, 98% de rendimento).

ESI-MS (m/z): 801,50 [M + Na]⁺

Sob uma atmosfera de nitrogênio, aa uma solução de

Composto C-2: (2S,6S,7S)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((tercbutildimetilsilil)óxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2Hpiran-2-il)-7-((4-metoxibenzil)óxi)-6-metilnon-8-in-4-ol (780 mg, 1,00 mmol) obtido acima em tolueno (15 ml) a 20°C foram adicionados hi dreto de tri-/?-butilestanho (2,5 ml, 9,36 mmol) e 2,2'azobis(isobutironitrila) (82 mg, 0,50 mmol). A mistura de reação foi agi

Petição 870190096531, de 26/09/2019, pág. 90/156

45/101 tada a 90°C durante 15 min. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 15% EtOAc/Heptano forneceu o composto do título (Composto C-3, 970 mg, 91% de rendimento).

¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-d) δ ppm 0,02 - 0,13 (m, 18 H) 0,84 - 0,96 (m, 48 H) 1,22 - 1,37 (m, 6 H) 1,47 - 1,56 (m, 7 H) 1,72 - 1,90 (m, 3 H) 1,95-2,03 (m, 1 H) 2,11 - 2,28 (m, 2 H) 2,82 - 2,86 (m, 1 H) 3,08 - 3,15 (m, 1 H) 3,33 - 3,40 (m, 1 H) 3,43 - 3,53 (m, 1 H) 3,58 3,87 (m, 8 H) 4,25 - 4,31 (m, 1 H) 4,49 - 4,54 (m, 1 H) 5,83 (dd, J =

19,3, 7,6Hz, 1 H) 6,05 - 6,13 (m, 1 H) 6,83 - 6,90 (m, 2 H) 7,24 (d, J =

8,8 Hz, 2 H).

Exemplo 12 (2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((ferc-butildimetilsilil)óxi)-6(((ferc-butildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)-9-iodo-7-((4metoxibenzil)óxi)-6-metilnon-8-en-4-ona (Composto C-4)

Sob uma atmosfera de nitrogênio, a uma solução de Composto C-3: (2S,6S,7S)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((tercbutildimetilsilil)óxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2Hpiran-2-il)-7-((4-metoxibenzil)óxi)-6-metil-9-(tributilstanil)non-8-en-4-ol (970 mg, 0,91 mmol) descrito no Exemplo 11 em 30 ml de DCM a 5°C foi adicionado iodo (242 mg, 0,95 mmol) em DCM (6 ml) até que mantida a cor do iodo. A mistura de reação foi suprimida com Na2SOs aq sat. e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com DCM. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura. As camadas orgânicas combinadas foram secadas por Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida. A cromatograPetição 870190096531, de 26/09/2019, pág. 91/156

46/101 fia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 25% EtOAc/Heptano forneceu (2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((tercbutildimetilsilil)óxi)-6-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2Hpiran-2-il)-9-iodo-7-((4-metoxibenzil)óxi)-6-metilnon-8-en-4-ol (768 mg, 93% de rendimento).

Sob uma atmosfera de nitrogênio, a uma solução de (2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((íerc-butildimetilsilil)óxi)-6(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)-9-iodo-7-((4metoxibenzil)óxi)-6-metilnon-8-en-4-ol (768 mg, 0,85 mmol) obtida acima em DCM (25 ml) na temperatura ambiente foi adicionado NaHCOs (17,8 mg, 0,21 mmol) e periodinano Dess-Martin (485 mg, 1,14 mmol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 4 h. A mistura de reação foi diluída com DCM e suprimida com NaHCOs aq sat. e NasSOsaq sat., e depois as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com DCM. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secados por MgSO4, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 20% EtOAc/Heptano forneceu o composto do título (Composto C-4, 776 mg, Rendimento quant.).

¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-c/) δ ppm 0,00 (s, 3 H) 0,03 - 0,07 (m, 12 H) 0,10 (s, 3 H) 0,81 (d, J = 6,3 Hz, 3 H) 0,84 (d, J = 6,3 Hz, 3 H) 0,89 (s, 9 H) 0,91 (s, 9 H) 0,92 (s, 9 H) 1,80 (dt, J = 15,0, 4,5 Hz, 1 H) 1,99 (dt, J = 15,0, 2,5 Hz, 1 H) 2,17 (dd, J = 16,6, 10,2 Hz, 1 H) 2,20 - 2,29 (m, 2 H) 2,43 - 2,48 (m, 1 H) 2,54 (d, J = 12,7 Hz, 1 H) 2,87 (dd, J = 9,0, 1,7 Hz, 1 H) 2,99 (dd, J = 16,6, 2,9 Hz, 1 H) 3,27 (td, J = 5,8,

2,4 Hz, 1 H) 3,50 - 3,56 (m, 1 H) 3,66 - 3,74 (m, 2H) 3,75 - 3,78 (m, 1 H) 3,80 (s, 3 H) 3,81 - 3,85 (m, 1 H) 4,26 (d, J = 11,7 Hz, 1 H) 4,50 (d, J = 11,7 Hz, 1 H) 6,26 (d, J = 14,6 Hz, 1 H) 6,42 (dd, J = 14,6, 7,8 Hz, 1 H) 6,87 (d, J = 8,3 Hz, 2 H) 7,21 (d, J = 8,3 Hz, 2 H). ESI-MS (m/z): 927,39 [M + Na]⁺.

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Exemplo 13 (2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((ferc-butildimetilsilil)óxi)-6(hidroximetil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)-9-iodo-7-((4-metoxibenzil)óxi)-6metilnon-8-en-4-ona (Composto C-5)

(+)-CSA

THF-IPA-t-BuOH

A uma solução de Composto C-4: (2S,6S,7S,E)-2((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)óxi)-6-(((tercbutildimetilsilil)óxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)-9-iodo-7-((4metoxibenzil)óxi)-6-metilnon-8-en-4-ona (600 mg, 0,66 mmol) descrita no Exemplo 12 em THF (5,0 ml), IPA (5,0 ml) e t-BuOH (5,0 ml) em 4°C foi adicionado ácido (1S)-(+)-10-camforsulfônico (154 mg, 0,66 mmol). A mistura de reação foi agitada a 4°C durante 20 h. A mistura de reação foi diluída com EtOAc e suprimida com NaHCOsaq sat., depois as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secados por MgSCri, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 35% EtOAc/Heptano forneceu o composto do título (Composto C-5, 500 mg, 95% de rendimento).

¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-d) δ ppm 0,01 (s, 3 H) 0,04 (s, 3 H) 0,07 (s, 3 H) 0,11 (s, 3 H) 0,86 - 0,91 (m, 15 H) 0,93 (s, 9 H) 1,83 (dt, J = 14,9, 4,8 Hz, 1 H) 1,93 - 2,00 (dt, J = 14,9, 4,8 Hz, 1 H) 2,19 - 2,26 (m, 1 H) 2,29 (dd, J = 14,9, 5,6 Hz, 1 H) 2,39 (dd, J = 16,6,

8,3 Hz, 1 H) 2,44 - 2,66 (m, 4 H) 2,91 (dd, J = 9,5, 1,7 Hz, 1 H) 3,36 3,41 (m, 1 H) 3,48 (td, J = 11,3, 2,7 Hz, 1 H) 3,59 (t, J = 7,1 Hz, 1 H) 3,74 - 3,78 (m, 2 H) 3,80 (s, 3 H) 3,85 (m, 1 H) 4,25 (d, J = 11,2 Hz, 1 H) 4,46 (d, J = 11,2 Hz, 1 H) 6,28 (d, J = 14,6 Hz, 1 H) 6,43 (dd, J =

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14,6, 7,8 Hz, 1 Η) 6,87 (d, J = 8,8 Hz, 2 Η) 7,21 (d, J = 8,8 Hz, 2 Η). ESI-MS (m/z): 813,30 [M + Na]⁺

Exemplo 14 ((2R,3R,5S,6S)-3,5-bis((ferc-butildimetilsilil)óxi)-6-((2S,6S,7S,E)-9iodo-7-((4-metoxibenzil)óxi)-6-metil-4-oxonon-8-en-2-il)tetra-hidro-2Hpiran-2-il)metil 4-metilbenzenossulfonato (Composto C-6)

Sob uma atmosfera de nitrogênio, a uma solução de Composto C-5: (2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-3,5-bis((tercbutildimetilsilil)óxi)-6-(hidroximetil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)-9-iodo-7-((4metoxibenzil)óxi)-6-metilnon-8-en-4-ona (500 mg, 0,63 mmol) descrita no Exemplo 13 em DCM (10 ml) a 5°C foram adicionados piridina (2,54 ml, 31,6 mmol), cloreto de p-toluenossulfonila (723 mg, 3,79 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (77 mg, 0,63 mmol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 24 h. Cloreto de ptoluenossulfonila (150 mg, 0,79 mmol) foi adicionado à mistura de reação na temperatura ambiente. Depois, a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 8 h. A mistura de reação foi diluída com DCM e suprimida com NaHCOsaq sat., depois as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com DCM. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secados por Na2SO4, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 25% EtOAc/Heptano forneceu o composto do título (Composto C-6, 560 mg, 94% de rendimento).

¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-c/) δ ppm 0,01 (s, 3 H) 0,04 (s, 3 H) 0,04 (s, 3 H) 0,08 (s, 3 H) 0,81 (d, J = 6,8 Hz, 3 H) 0,83 (s, 9 H) 0,86 (d, J = 6,8 Hz, 3 H) 0,89 (s, 9 H) 1,81 (dt, J = 14,9, 4,5 Hz, 1 H) 1,91

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1,96 (m, 1 Η) 2,15 - 2,32 (m, 3 Η) 2,36 - 2,42 (m, 1 Η) 2,43 (s, 3 Η) 2,57 (d, J = 12,7 Hz, 1 Η) 2,77 (dd, J = 16,6, 3,4 Hz, 1 H) 2,87 (dd, J = 9,0, 1,7 Hz, 1 H) 3,53 - 3,58 (m, 2 H) 3,70 - 3,75 (m, 1 H) 3,80 - 3,85 (m, 1H) 3,81 (s, 3 H) 4,06 (dd, J = 10,0, 5,0 Hz, 1 H) 4,08 - 4,16 (m, 1 H) 4,28 (d, J = 11,2 Hz, 1 H) 4,51 (d, J = 11,2 Hz, 1 H) 6,30 (d, J = 14,6 Hz, 1 H) 6,45 (dd, J = 14,6, 7,8 Hz, 1 H) 6,88 (d, J = 8,8 Hz, 2 H) 7,24 (d, J = 8,8 Hz, 2 H) 7,31 (d, J = 8,3 Hz, 2 H) 7,76 (d, J = 8,3 Hz, 2 H).

Exemplo 15 (2S,6S,7S,E)-2-((2S,3S,5R,6R)-6-(azidometil)-3,5-bis((fercbutildimetilsilil)óxi)tetra-hidro-2H-Diran-2-il)-9-iodo-7-((4metoxibenzil)óxi)-6-metilnon-8-en-4-ona (Composto C-7)

Sob uma atmosfera de nitrogênio, a uma solução de Composto C-6: 4metilbenzenossulfonato de ((2R,3R,5S,6S)-3,5-bis((tercbutildimetilsilil)óxi)-6-((2S,6S,7S,E)-9-iodo-7-((4-metoxibenzil)óxi)-6metil-4-oxonon-8-en-2-il)tetra-hidro-2H-piran-2-il)metila (560 mg, 0,59 mmol) descrito no Exemplo 14 em DMSO (5,6 ml) a 20°C foi adicionado azido de sódio (385 mg, 5,92 mmol). A mistura de reação foi agitada a 85°C. Após 2 h, azida de sódio (100 mg, 1,54 mmol) foi adicionada à mistura de reação, depois a mistura de reação foi agitada a 85°C durante 14 h. A mistura de reação foi diluída com EtOAc e suprimida com H2O, depois as camadas foram separadas. Os extratos orgânicos foram lavados de modo sucessivo com água e salmoura. As camadas orgânicas combinadas foram secadas por Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para fornecer um resíduo bruto. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 15% EtO

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Ac/Heptano forneceu o composto do título (Composto C-7, 298 mg, 62% de rendimento).

¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-c/) δ ppm 0,03 (s, 3 H) 0,06 (s, 3 H) 0,07 (s, 3 H) 0,10 (s, 3 H) 0,84 (d, J = 6,8 Hz, 3 H) 0,85 (d, J = 6,8 Hz, 3 H) 0,91 (s, 9 H) 0,92 (s, 9 H) 1,86 (dt, J = 15,0, 4,7 Hz, 1 H) 1,98 (dt, J = 15,0, 2,9 Hz, 1 H) 2,19 - 2,32 (m, 3 H) 2,41 - 2,49 (m, 1 H) 2,58 (d, J = 12,7 Hz, 1 H) 2,94 (dd, J = 16,6, 2,9 Hz, 1 H) 2,98 (dd, J = 8,8, 2,0 Hz, 1 H) 3,02 (dd, J = 12,7, 2,9 Hz, 1 H) 3,47 (dt, J = 8,8, 2,7 Hz, 1 H) 3,49 - 3,54 (m, 1 H) 3,63 (dd, J = 12,7, 8,8 Hz, 1 H) 3,69 - 3,73 (m, 1 H) 3,81 (s, 3H) 3,83 - 3,88 (m, 1 H) 4,26 (d, J = 11,7 Hz, 1 H) 4,50 (d, J = 11,7 Hz, 1 H) 6,26 (d, J = 14,6 Hz, 1 H) 6,42 (dd, J = 14,6, 7,8 Hz, 1 H) 6,87 (d, J = 8,8 Hz, 2 H) 7,22 (d, J = 8,8 Hz, 2 H).

Exemplo 16 (((2R,3R,5S,6S)-3,5-bis((ferc-butildimetilsilil)óxi)-6-((2S,6S,7S,E)-9iodo-7-((4-metoxibenzil)óxi)-6-metil-4-oxonon-8-en-2-il)tetra-hidro-2Hpiran-2-il)metil)carbamato (Composto C-8)

LI

TBSO

OTBS n₃

THF-água 90°C. 16h ^0MPM PPh₃

A uma solução de Composto C-7: (2S,6S,7S,E)-2((2S,3S,5R,6R)-6-(azidometil)-3,5-bis((terc-butildimetilsilil)óxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)-9-iodo-7-((4-metoxibenzil)óxi)-6-metilnon-8-en-4ona (298 mg, 0,37 mmol) descrita no Exemplo 15 em THF (10 ml) e água (1,0 ml) a 20°C foi adicionada trifenilfosfina (1437 mg, 5,478 mmol). A mistura de reação foi agitada a 70°C durante 1,5 h. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para fornecer uma amina bruta. A uma solução da amina bruta obtida acima em THF (10 ml) a 5°C foram adicionados EtsN (0,51 ml, 3,66 mmol) e dicarbonato de dialila (341 mg, 1,83 mmol). A mistura de reação foi agitada na tem

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51/101 peratura ambiente durante 60 min. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 0% a 25% EtOAc/Heptano forneceu o composto do título (Composto C-8, 300 mg, 94% de rendimento).

¹H RMN (500 MHz, CLOROFORM-c/) δ ppm 0,05 - 0,07 (m, 9 H) 0,11 (s, 3 H) 0,85 (d, J = 6,3 Hz, 3 H) 0,87 (d, J = 6,3 Hz, 3 H) 0,90 (s, 9 H) 0,93 (s, 9 H) 1,80 (dt, J = 15,0, 4,4 Hz, 1 H) 1,96 (dt, J = 15,0, 2,8 Hz, 1 H) 2,16 - 2,29 (m, 2 H) 2,32 - 2,39 (m, 1 H) 2,53 - 2,60 (m, 3 H) 2,86 (d, J = 7,3 Hz, 1 H) 3,04 - 3,11 (m, 1 H) 3,30 - 3,34 (m, 1 H) 3,38 - 3,48 (m, 1 H) 3,58 (t, J = 7,1 Hz, 1 H) 3,70 - 3,76 (m, 1 H) 3,80 (s, 3 H) 3,81 - 3,84 (m, 1 H) 4,25 (d, J = 11,2 Hz, 1 H) 4,46 (d, J = 11,2 Hz, 1 H)

4,53 - 4,63 (m, 2 H) 5,19 (dd, J = 10,7, 1,5 Hz, 1 H) 5,32 (d, J = 17,1 Hz, 1 H) 5,47 (d, J = 6,8 Hz, 1 H) 5,88 - 5,99 (m, 1 H) 6,28 (d, J = 14,6 Hz, 1 H) 6,43 (dd, J = 14,6, 7,8 Hz, 1 H) 6,87 (d, J = 8,8 Hz, 2 H) 7,21 (d, J = 8,8 Hz, 2 H). ESI-MS (m/z): 896,34 [M + Na]⁺

Esquema D; Preparação do Composto D-7

LiCI

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52/101 periodinano Dess-

Exemplo 17

Composto D-4

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53/101

Sob uma atmosfera de nitrogênio (em uma caixa de luvas), a uma solução de Composto D-2: (S)-N-(2-(4-isopropil-4,5dihidrooxazol-2-il)-6-metoxifenil)metanossulfonamida (155 mg, 0,497 mmol) obtida pelo método escrito em Organic Letters (2002), 4 (25), 4431-4434 (CAS No; 546141-34-8) e 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno (107 mg, 0,497 mmol) em MeCN (0,75 ml) foi adicionado cloreto de crômio(ll) (55,5 mg, 0,452 mmol) e depois a mistura resultante foi agitada na caixa de luvas na temperatura ambiente durante 1 h. A solução verde resultante foi adicionada a uma mistura do Composto C-8: (((2R,3R,5S,6S)-3,5-bis((íerc-butildimetilsilil)óxi)-6-((2S,6S,7S,E)-9iodo-7-((4-metoxibenzil)óxi)-6-metil-4-oxonon-8-en-2-il)tetra-hidro-2H

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54/101 piran-2-il)metil)carbamato de alila (99,0 mg, 0,113 mmol) descrito no Exemplo 16, Composto D-1 (80,0 mg, 0,09 mmol) obtido pelo método escrito no Journal of the American Chemical Society (1992), 114 (8), 3162-3164 (CAS No; 157322-23-1), Composto D-3: dicloro(2,9-dimetil1,10-fenantrolina)niquel (0,46 mg, 1,36 μιτιοΙ) obtidi pelo método escrito no Journal of the American Chemical Society (2009), 131(42), 15387 - 15393 (CAS No; 21361-04-6) e cloreto de litio (3,83 mg, 0,09 mmol). A mistura de reação foi agitada na caixa de luvas na temperatura ambiente durante 60 min. A mistura de reação foi depois retirada da caixa de luvas, diluída com éter dietílico-EtOAc (5,0 ml - 5,0 ml), então Florisil® (1600 mg, 15,94 mmol) (CAS No; 1343-88-0) foi adicionado à mistura. Depois a mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 30 min. A mistura foi filtrada (Celite®), lavada com EtOAc/Heptano = 2/1, depois o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 3% a 55% EtOAc/Heptano forneceu o composto do título (Composto D-4, 140 mg, 95% de rendimento).

Exemplo 18

Composto D-5

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55/101

Sob uma atmosfera de nitrogênio, a uma solução de Composto D-4 (140 mg, 0,09 mmol) descrito no Exemplo 17 em DCM (5,0 ml) a 5°C foram adicionados NaHCOs (28,8 mg, 0,34 mmol) e periodinano Dess-Martin (72,7 mg, 0,17 mmol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 60 min. A mistura de reação foi diluída com DCM e suprimida com NaHCOs aq sat. e NasSOsaq sat., e depois as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com DCM. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secados por NasSCri, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em silica gel utilizando 2% a 60% EtOAc/Heptano forneceu o composto do título (Composto D-5, 120 mg, 86%).

¹H RMN (500 MHz, BENZENO-c/6) δ ppm 0,01 - 0,05 (m, 9 H) 0,10 0,12 (m, 6 H) 0,15 (s, 3 H) 0,76 (d, J = 6,1 Hz, 3 H) 0,96 (s, 9 H) 1,02 (s, 9 H) 1,04 (s, 9 H) 0,95 -1,10 (m, 7H) 1,20 (d, J = 7,3 Hz, 3 H) 1,31

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1,37 (m, 3 Η) 1,41 (dd, J = 12,8, 4,9 Hz, 1 H) 1,40 - 1,58 (m, 4 H) 1,59 1,64 (m, 1 H) 1,69 - 1,89 (m, 3H) 1,90 - 1,99 (m, 2 H) 2,02 - 2,25 (m, 8 H) 2,26 - 2,48 (m, 6 H) 2,49 - 2,70 (m, 6 H) 2,71 - 2,84 (m, 2 H) 3,00 3,07 (m, 1 H) 3,12 - 3,30 (m, 4 H) 3,36 (s, 3 H) 3,40 (br.s, 1 H) 3,44 -

3,53 (m, 2 H) 3,65 (dd, J = 6,4, 4,0 Hz, 1 H) 3,69 - 3,84 (m, 4H) 3,86 4,03 (m, 4H) 4,07 - 4,17 (m, 3 H) 4,27 - 4,29 (m, 1H) 4,27 (d, J = 11,0 Hz, 1H) 4,48 - 4,58 (m, 1 H) 4,49 (d, J = 11,0 Hz, 1H) 4,65 - 4,70 (m, 2 H) 4,68 (d, J = 5,5 Hz, 1H) 4,74 - 4,86 (m, 2H) 4,78 (s, 1H) 4,93 (s, 1 H) 5,05 (d, J = 10,4 Hz, 1 H) 5,09 (br. s., 1 H) 5,19 (br. s., 1 H) 5,30 (dd, J = 17,1, 1,2 Hz, 1 H) 5,82 (d, J = 8,0 Hz, 1 H) 5,86 - 5,96 (m, 1 H) 6,46 (d, J = 15,9 Hz, 1 H) 6,84 - 6,92 (m, 3 H) 7,31 (d, J = 8,6 Hz, 2 H).

Exemplo 19

Composto D-6

Cloridrato de imidazol (155 mg, 1,48 mmol) foi dissolvido em DMF (2,9 ml) para fornecer uma solução de cloridrato de imidazol 0,5 M em DMF. 1,0 ml desta solução foi misturado com 1,0 ml de TBAF (1,0 M, THF solução) para fornecer uma solução pré-misturada de TBAF 0,5 M e cloridrato de imidazol 0,25 M em THF-DMF (1:1). Sob uma atmosfera de nitrogênio, a uma solução de Composto D-5 (80,0

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57/101 mg, 0,05 mmol) descrito no Exemplo 18 em DMF (7,0 ml) a 20°C foram adicionados 0,588 ml de solução pré-misturada de TBAF (0,5 M) e cloridrato de imidazol (0,25 M) em THF-DMF (1:1) preparado acima. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 14 h.

1,6 g de CaCOs e 4,0 g de Dowex® 50WX8 (forma de hidrogênio, malha 200 a 400, SIGMA-ALDRICH) foram adicionados à mistura de reação. A mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 2 h. Depois mistura foi diluída com EtOAc, depois filtrada (Celite®), lavada com EtOAc. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer um resíduo bruto. 1000 mg de CaCOs e 2,25 g de Dowex® 50WX8 foram adicionados à solução de EtOAc (6,0 ml) do resíduo bruto. A mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 2,5 h. Depois a mistura foi diluída com EtOAc, filtrada (Celite®), lavada com EtOAc. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer um resíduo bruto (63,0 mg). A uma solução do resíduo bruto (63,0 mg) obtida acima em DCM (6,0 ml), t-BuOH (0,6 ml) e Tampão de Fosfato pH 7 (0,6 ml, 1/15 M) na temperatura ambiente foi adicionado DDQ (111 mg, 0,49 mmol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 45 min. A mistura de reação foi suprimida com NaHCOs aq sat., depois diluída com DCM e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com DCM (3 vezes). Os extratos orgânicos combinados foram secados por Na2SO4, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em NH silica gel utilizando 10% a 100% EtOAc/Heptano, então MeOH/EtOAc a 10% forneceu um composto do título rudemente purificado (Composto D-6, 15,0 mg, 27%).

¹H RMN (500 MHz, METANOL-c/4) δ ppm 0,97 (d, J = 7,0 Hz, 3 H) 0,97 (d, J = 7,0 Hz, 3 H) 1,00 - 1,02 (m, 1 H) 1,05 (d, J = 7,3 Hz, 3 H) 1,09 (d, J = 6,3 Hz, 3 H) 1,31 - 1,45 (m, 6H) 1,46 - 1,63 (m, 5H) 1,64 1,75 (m, 3 H) 1,80 - 1,86 (m, 2 H) 1,87 - 1,93 (m, 2 H) 1,94 - 2,11 (m,

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9H) 2,13 - 2,27 (m, 8H) 2,33 (d, J = 2,4 Hz, 2 H) 2,39 (dd, J = 13,4, 6,1 Hz, 1 H) 2,44 (dd, J = 17,6, 2,0 Hz, 1 H) 2,55 (dd, J = 17,6, 9,3 Hz, 1 H) 2,75 - 2,84 (m, 1 H) 2,97 (dd, J = 9,3, 2,0 Hz, 1 H) 3,21 (dd, J = 6,6,

4,6 Hz, 1 H) 3,32 (m, 1 H) 3,41 - 3,46 (m, 1 H) 3,57 (br. s., 1 H) 3,60 (d, J = 11,7 Hz, 1 H) 3,67 - 3,74 (m, 2 H) 3,78 (br. s., 1 H) 3,86 - 3,90 (m, 2 H) 3,97 (d, J = 2,4 Hz, 1 H) 4,02 - 4,11 (m, 4 H) 4,17 (dd, J = 6,6, 4,6 Hz, 1 H) 4,23 (dd, J = 11,5, 2,2 Hz, 1 H) 4,29 (br.s, 1 H) 4,31 (td, J =

9,3, 3,9 Hz, 1 H) 4,44 (d, J = 10,2 Hz, 1 H) 4,51 (d, J = 5,4 Hz, 2 H) 4,59 (t, J = 4,9 Hz, 1 H) 4,61 (dd, J = 7,3, 4,9 Hz, 1 H) 4,69 (t, J= 4,6

Hz, 1 H) 4,80 (s, 1 H) 4,85 - 4,87 (m, 1 H) 5,01 (s, 1 H) 5,05 (s,1 H)

5,16 (dd, J = 10,7, 1,0 Hz, 1 H) 5,28 (dd, J = 17,1, 2,0 Hz, 1 H)5,92 (m, 1 H). ESI-MS (m/z): 1172,57 [M + Na]⁺.

Exemplo 20

Composto D-7

Pd(PPh₃)4 pirrolidina

DCM

D-7 A—'

Sob uma atmosfera de nitrogênio, a uma solução de Composto D-6 (15,0 mg, 0,013 mmol) descrito no Exemplo 19, pirrolidina (10,8 μΙ, 0,13 mmol) em DCM (2,0 ml) na temperatura ambiente foi adicionado tetraquis(trifenilfosfina)paládio(0) (7,53 mg, 6,52 pmol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 30 min.

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A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. A cromatografia rápida do resíduo em NH silica gel utilizando 50% EtOAc/Heptano, depois 0% a 20% MeOH/EtOAc para fornecer um produto rudemente purificado. O produto rudemente purificado obtido foi purificado por HPLC para fornecer o composto do título (D-7, 7,0 mg, 47%, tempo de retenção = 13,8 min).

Condições de HPLC:

Coluna: YMC Pak Pro C18 (20 mm χ 250 mm) Comprimento de onda de detecção: 200 nm Temperatura da coluna: temperatura ambiente Fase móvel: MeCN-Água (0,05% AcOH)

Taxa de fluxo: 8 ml/min

Eluato:

MeCN/Água 25% (iso, 2 min), depois

MeCN/Água 25% a 60% (Gradiente, 20 min) ¹H RMN (500 MHz, METANOL-c/4) δ ppm 0,99 (d, J = 6,7 Hz, 3 H) 1,00 - 1,03 (m, 1 H) 1,04 (d, J = 7,3 Hz, 3 H) 1,06 (d, J = 7,3 Hz, 3 H) 1,10 (d, J = 6,1 Hz, 3 H) 1,29 - 1,63 (m, 10 H) 1,65 - 1,78 (m, 3 H) 1,79 1,89 (m, 2 H) 1,92 - 2,12 (m, 10 H) 1,93 (s, 3 H) 2,13 - 2,36 (m, 9 H) 2,41 (dd, J = 13,5, 6,1 Hz, 1 H) 2,45 (dd, J = 17,6, 2,2 Hz, 1 H) 2,56 (dd, J = 17,6, 9,8 Hz, 1 H) 2,75 - 2,84 (m, 1 H) 2,98 (dd, J = 9,8, 1,8 Hz, 1 H) 3,12 (dd, J = 12,8, 3,7 Hz, 1 H) 3,22 (dd, J = 6,4, 4,6 Hz, 1 H) 3,26 (dd, J = 13,2, 7,8 Hz, 1 H) 3,39 (d, J = 1,8 Hz, 1 H) 3,61 (d, J =

12,8 Hz, 1 H) 3,63 - 3,68 (m, 2 H) 3,68 - 3,76 (m, 2 H) 3,81 - 3,94 (m, 3 H) 4,00 (d, J = 2,5 Hz, 1 H) 4,03 - 4,15 (m, 4 H) 4,18 (dd, J = 6,4, 4,6 Hz, 1 H) 4,25 (ddd, J = 11,0, 4,3, 1,8 Hz, 1 H) 4,27 - 4,36 (m, 2 H) 4,46 (d, J = 11,0 Hz, 1 H) 4,57 - 4,65 (m, 2 H) 4,70 (t, J = 4,6 Hz, 1 H) 4,81 (d, J = 1,2 Hz, 1 H) 5,02 (br. s, 1 H) 5,06 (d, J = 1,8 Hz, 1 H). ESI-MS (m/z): 1066,96 [M + H]⁺, 1090,19 [M + Na]⁺

Composto (1) (forma livre de sal do Composto D-7): ¹H RMN (600

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MHz, METANOL-d4) δ ppm 0,98 (d, J = 7,2 Hz, 3 H) 1,00 (d, J = 6,8 Hz, 3 H) 1,02 (m, 1 H) 1,05 (d, J = 6,8 Hz, 3 H) 1,09 (d, J = 6,4 Hz, 3 H) 1,28 - 1,45 (m, 5 H) 1,46 - 1,59 (m, 4 H) 1,57 - 1,63 (m, 1 H) 1,65 1,71 (m, 1 H) 1,70 - 1,75 (m, 2 H) 1,79 - 1,86 (m, 2 H) 1,91 (dt, J = 14,9,3,1 Hz, 1 H) 1,94-2,11 (m, 8 H) 2,14-2,34 (m, 9 H) 2,39 (dd, J = 13,2, 6,0 Hz, 1 H) 2,44 (dd, J = 17,4, 1,9 Hz, 1 H) 2,56 (dd, J = 17,6,

9,6 Hz, 1 H) 2,69 (dd, J = 13,2, 4,2 Hz, 1 H) 2,79 (ddq, J = 15,9, 7,6, 2,0 Hz, 1 H) 2,92 (dd, J = 13,2, 8,3 Hz, 1 H) 2,97 (dd, J = 9,6, 1,7 Hz, 1 H) 3,21 (dd, J = 6,4, 4,9 Hz, 1 H) 3,29 (m, 1 H) 3,34 (dd, J = 8,3, 4,15 Hz, 1 H) 3,58 (br. s., 1 H) 3,60 (br.d, J = 11,3 Hz, 1 H) 3,68 - 3,73 (m, 2 H) 3,80 (br. s., 1 H) 3,84 - 3,90 (m, 2 H) 3,98 (d, J = 2,3 Hz, 1 H) 4,03 4,13 (m, 4 H) 4,17 (dd, J = 6,4, 4,9 Hz, 1 H) 4,24 (ddd, J = 11,3, 4,5,

1.5 Hz, 1 H) 4,29 (dd, J = 4,0, 1,9 Hz, 1 H) 4,32 (td, J = 10,2, 4,2 Hz, 1 H) 4,44 (br. d, J = 11,0 Hz, 1 H) 4,59 (t, J = 4,5 Hz, 1 H) 4,62 (dd, J =

7,4, 4,7 Hz, 1 H) 4,69 (t, J = 4,7 Hz, 1 H) 4,80 (br. s., 1 H) 4,87 (s, 1 H) 5,00 (br. s., 1 H) 5,05 (br.d, J = 1,1 Hz, 1 H)

ESI-MS (m/z): 1066,57 [M + H]⁺, 1088,55 [M + Na]⁺

Exemplos de Teste Farmacológico

Informação Geral [0092] Os compostos naturais de halicondrina e seus compostos modificados são conhecidos na literatura (ver, por exemplo, D. Uemura et al. “Norhalichondrin A: An Antitumor Polyether Macrolide from a Marine Sponge” J. Am. Chem. Soc., 107, 4796 (1985); Marc Litaudon et al. “Antitumor Polyether Macrolides: New and Hemisynthetic Halichondrins from the New Zealand Deep-Water Sponge Lissodendoryx sp.” J. Org. Chem., 1997, 62, 1868-1871). No entanto, a maioria deles não está facilmente disponível. Por exemplo, Dr. Uemura et.al. isolaram

12.5 mg de Halicondrina B, 35,0 mg de Noralicondrina A e 17,2 mg de Homoalicondrina A em até 600 kg de Halichondria okadai Kadota (Ver, por exemplo, D. Uemura et al. “Norhalichondrin A: An Antitumor

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Polyether Macrolide from a Marine Sponge” J. Am. Chem. Soc., 107, 4796 (1985)). Entre os compostos naturais da Halicondrina, a Halicondrina B mostra as atividades antitumorais mais fortes contra as células de melanoma B-16 in vitro e é altamente ativa contra a leucemia L1210 in vivo (Ver, por exemplo, D. Uemura et al. “Norhalichondrin A: An Antitumor Polyether Macrolide from a Marine Sponge” J. Am. Chem. Soc., 107, 4796 (1985)). A halicondrina C também é ativa em vários modelos in vivo, mas instável em solução aquosa em comparação com a Halicondrina B. A noralicondrina B é muito mais fraca que a Halicondrina B, não apenas in vitro, mas também in vivo. Ver, por exemplo, D. Uemura et al. “Norhalichondrin A: An Antitumor Polyether Macrolide from a Marine Sponge” J. Am. Chem. Soc., 107, 4796 (1985)). Os seguintes testes farmacológicos utilizam Halicondrina B (Hali-B) como compostos de referência conforme necessário.

Exemplo de Teste Farmacolóqico 1. Ensaio de inibição do crescimento de FaDu [0093] Neste ensaio, a atividade inibidora do crescimento dos compostos de teste em um carcinoma humano de células escamosas da linhagem celular de cabeça e pescoço (SCCHN) FaDu foi medida. Células FaDu foram mantidas em um meio RPMI-1640 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 187-02021) contendo soro bovino fetal a 10% (FBS: Nichirei, 12D168), e penicilina e estreptomicina em uma incubadora de CO2 5% (37°C). Em cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios (Becton, Dickinson and Company, 353219), 75 μΙ de suspensão de células FaDu ajustados para uma concentração de 4x10⁴ células/ml com 0 meio de cultura foram adicionados, e as células foram incubadas durante a noite em uma incubadora de CO2 5% (37°C). No dia seguinte, 25 μΙ de Composto (1) ou Halicondrina B na série de diluição de três vezes colocados em suspensão no meio de cultura foram adicionados à cada reservatório, e 0 resultante foi incu

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62/101 bado durante 3 dias em uma incubadora de CO2 5% (37°C). Depois, a viabilidade celular foi determinada por CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) com EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). O valor dos reservatórios contendo células sem adição dos compostos de teste foi definido como 100% e 0 valor dos reservatórios não contendo nenhuma célula foi definido como 0%. A concentração do composto de teste necessária para a inibição do crescimento celular em 50% (isto é, um valor de IC50) foi calculada, e mostrada na Tabela 1.

Tabela 1

Composto de teste	FaDu (IC50 (nM))
Halicondrina B	0,124
Composto (1)	0,0714
Exemolo de Teste Farmacolóaico 2. Ensaio de inibição do crescimento

de MDA-MB231 [0094] Neste ensaio, a atividade inibidora do crescimento dos compostos de teste em uma linhagem celular humana de câncer da mama MDA-MB231 foi medida. As células MDA-MB231 foram mantidas em meio Dulbecco’s Modified Eagle’s (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 044-29765) contendo soro bovino fetal a 10% (FBS: Nichirei, 12D168), e penicilina e estreptomicina em uma incubadora de CO2 5% (37°C). Em cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios (Becton, Dickinson and Company, 353219), 75 μΙ de suspensão de células MDA-MB231 ajustados para uma concentração de 4 χ 10⁴ células/ml com 0 meio de cultura foram adicionados, e as células foram incubadas durante a noite em uma incubadora de CO2 5% (37°C). No dia seguinte, 25 μΙ de Composto (1) ou Halicondrina B na série de diluição de três vezes colocado em suspensão no meio de cultura foram adicionados à cada reservatório, e 0 resultante foi incubado durante 3 dias

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63/101 em uma incubadora de CO2 5% (37°C). Depois, a viabilidade celular foi determinada por CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) com EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). O valor dos reservatórios contendo células sem adição dos compostos de teste foi definido como 100% e 0 valor dos reservatórios não contendo nenhuma célula foi definido como 0%. A concentração do composto de teste necessária para a inibição do crescimento celular em 50% (isto é, um valor de IC50) foi calculada, e mostrada na Tabela

2.

Tabela 2

Composto de teste	MDA-MB231 (IC50 (nM))
Halicondrina B	1,000
Composto (1)	0,109
Exemolo de Teste Farmacolóaico 3.	Ensaio de inibição do crescimento
de HCC1954

[0095] Neste ensaio, a atividade inibidora do crescimento dos compostos de teste em uma linhagem celular humana de câncer da mama HCC1954 foi medida. As células HCC1954 foram mantidas em um meio RPMI-1640 modificado para conter L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM, 4500 mg/Lde glicose, e 1500 mg/L de bicarbonate de sódio (ATCC 30-2001) contendo soro bovino fetal a 10% (FBS: Nichirei, 12D168), e penicilina e estreptomicina em uma incubadora de CO2 5% (37°C). Em cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios (Becton, Dickinson and Company, 353219), 75 μΙ de suspensão de células HCC1954 ajustados para uma concentração de 4 χ 10⁴ células/ml com 0 meio de cultura foram adicionados, e as células foram incubadas durante a noite em uma incubadora de CO2 5% (37°C). No dia seguinte, 25 μΙ do Composto (1) ou Halicondrina B na série de diluição de três vezes colocado em suspensão no

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64/101 meio de cultura foram adicionados à cada reservatório, e o resultante foi incubado durante 3 dias em uma incubadora de CO2 5% (37°C). Depois, a viabilidade celular foi determinada por CelITiter-GIo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) com EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). O valor dos reservatórios contendo células sem adição dos compostos de teste foi definido como 100% e 0 valor dos reservatórios não contendo nenhuma célula foi definido como 0%. A concentração do composto de teste necessária para a inibição do crescimento celular em 50% (isto é, um valor de IC50) foi calculada, e mostrada na Tabela 3.

Tabela 3

HCC1954
Composto de teste	(IC50 (nM))
Halicondrina B	0,154
Composto (1)	0,0668
Exemolo de Teste Farmacolóaico 4. Efeitos antitumorais em modelo
de xenoenxerto subcutâneo	de FaDu em camundonaos como monote-

rapia [0096] Um carcinoma humano de células escamosas da linhagem celular de cabeça e pescoço (SCCHN) FaDu, que foi cultivado em um meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina e estreptomicina, foi ajustado para uma concentração de 4,8 χ 10⁷ células/ml com Solução Salina Equilibrada de Hank de uma concentração para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 μΙ em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 7 semanas de idade (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan Inc.). Nove dias após a inoculação das células, 0 diâmetro mais curto e 0 diâmetro mais longo de um tumor em cada camundongo foram medidos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Digimatic™ caliper, Mitutoyo

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Corporation), de modo a calcular o volume do tumor de acordo com as seguintes fórmulas de cálculo:

Volume do tumor (mm³) = Diâmetro mais longo (mm) χ Diâmetro mais curto (mm) χ Diâmetro mais curto (mm)/2

Volume relativo do tumor (RTV) = Volume do tumor (dia X) / Volume do tumor (o primeiro dia)

Regressão do Tumor (%) = (1 - RTV mínimo) x100 [0097] Na base dos volumes de tumores obtidos no primeiro dia de administração, os camundongos foram agrupados de tal modo que as médias do volume dos tumores foram substancialmente iguais entre os grupos. Cada composto de teste foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. Imediatamente antes da administração, a solução estoque foi diluída em solução salina com 100 μΜ de hidroxipropil-p-ciclodextrina. Cada amostra de avaliação foi por via intravenosa administrada em uma dose tolerável máxima (MTD). Incidentalmente, a experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em 4 camundongos. A regressão do Tumor (%) de cada composto de teste foi mostrada na Tabela 4.

Tabela 4

Composto de teste Dose (mg/kg) Regressão do Tumor (%)

Halicondrina B 0,05 0

Composto (1) 0,2 43

Exemplo de Teste Farmacolóqico 5· Atividade antitumoral contra OSC19 em modelo de xenoenxerto subcutâneo em camundongos como monoterapia [0098] Um carcinoma humano de células escamosas da linhagem celular de cabeça e pescoço (SCCHN) OSC-19, que foi cultivado em um meio DMEM/Ham’s F-12 (1:1) contendo FBS 10%, e penicilina e estreptomicina, foi ajustado para uma concentração de 1 χ 10⁸ células/ml com PBS para preparar uma suspensão de células, e a

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66/101 suspensão foi misturada com Matrigel™ (BD Bioscience, #366237) em uma relação de 1:1 para preparar uma suspensão de células em uma concentração de 5 χ 10⁷ células/ml. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 μΙ em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 5 semanas de idade (CAnN.CgFoxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Seis dias após a inoculação das células, o diâmetro mais curto e o diâmetro mais longo de um tumor em cada camundongo foram medidos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Digimatic™ caliper, Mitutoyo Corporation), de modo a calcular o volume do tumor de acordo com as seguintes fórmulas de cálculo:

Regressão do Tumor (%) = (1 - RTV mínimo) x100 [0099] Na base dos volumes de tumores obtidos no primeiro dia de administração, os camundongos foram agrupados de tal modo que as médias do volume dos tumores foram substancialmente iguais entre os grupos. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em 6 camundongos. O composto de teste foi dissolvido em solução salina e por via intravenosa administrada em doses de 0,06 mg/kg a 0,18 mg/kg uma vez por semana durante 2 semanas (esquema Q7Dx2). A regressão do Tumor (%) de cada dose de teste é mostrada na Tabela 5.

Tabela 5

Composto de teste	Dose (mg/kg)	Regressão do Tumor (%)
Composto (1)	0,06	59
Composto (1)	0,18	90

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Exemplo de Teste Farmacolóqico 6· Atividade antitumoral contra HCC1806 em modelo de xenoenxerto subcutâneo em camundonqos como monoterapia [0100] Uma linhagem celular humana de câncer da mama HCC1806, que foi cultivada em um meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina e estreptomicina, foi ajustada para uma concentração de 1 χ 10⁸ células/ml com PBS para preparar uma suspensão de células, e a suspensão foi misturada com Matrigel™ (BD Bioscience, #366237) em uma relação de 1:1 para preparar uma suspensão de células em uma concentração de 5 χ 10⁷ célula/ml. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 pl em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 5 semanas de idade (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Doze dias após a inoculação das células, o diâmetro mais curto e o diâmetro mais longo de um tumor em cada camundongo foram medidos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Digimatic™ caliper, Mitutoyo Corporation), de modo a calcular o volume do tumor de acordo com as seguintes fórmulas de cálculo:

Regressão do Tumor (%) = (1 - RTV mínimo) x100 [0101] Na base dos volumes de tumores obtidos no primeiro dia de administração, os camundongos foram agrupados de tal modo que as médias do volume dos tumores foram substancialmente iguais entre os grupos. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em 6 camundongos. O composto de teste foi dissolvido em solução salina e por via intravenosa administrada em 0,18 mg/kg uma vez por

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68/101 semana durante 2 semanas (esquema Q7Dx2). A regressão do Tumor (%) para o Composto (1) é mostrada na Tabela 6.

Tabela 6

Composto de teste Dose (mg/kg) Regressão do Tumor (%)

Composto (1) 0,18 90

Exemplo de Teste Farmacolóqico 7 Efeitos antitumorais em modelo de xenoenxerto subcutâneo de FaDu em combinação com cetuximab em camundonqos [0102] Um carcinoma humano de células escamosas da linhagem celular de cabeça e pescoço (SCCHN) FaDu, que foi cultivado em um meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina e estreptomicina, foi ajustado para uma concentração de 5 χ 10⁷ células/ml com Solução Salina Equilibrada de Hank para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 μΙ em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 7 semanas de idade (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan Inc.). Dez dias após a inoculação das células, o diâmetro mais curto e o diâmetro mais longo de um tumor em cada camundongo foram medidos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Digimatic™ caliper, Mitutoyo Corporation), de modo a calcular o volume do tumor de acordo com as seguintes fórmulas de cálculo:

Regressão do Tumor no dia 35 (%) = (1- RTV no dia 35) x100 [0103] Na base dos volumes de tumores obtidos no primeiro dia de administração, os camundongos foram agrupados de tal modo que as médias do volume dos tumores foram substancialmente iguais entre os

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69/101 grupos. Cada composto de teste foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. Imediatamente antes da administração, a solução estoque foi diluída em solução salina com 100 μΜ de hidroxipropil-p-ciclodextrina. Cada composto de teste foi por via intravenosa administrada em doses de 1/4 MTD a 1/2 MTD em combinação com cetuximab (Erbitux, Merck Serono Co., Ltd.). Incidentalmente, a experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em 4 camundongos. A regressão do Tumor no dia 35 (%) de cada composto de teste é mostrada na Tabela 7.

Tabela 7

Composto de teste	Dose (mg/kg)	Cetuximab (mg/kg)	Regressão do Tumor no dia 35 (%)
-	-	20	-242
Halicondrina B	0,0125	20	-38
	0,025	20	-2
Composto (1)	0,05	20	38
	0,1	20	60

Exemplo de Teste Farmacolóqico 8· Atividade antitumoral em modelo de xenoenxerto subcutâneo de KPL-4 em combinação com trastuzumab em camundongos [0104] Uma linhagem celular humana de câncer da mama positivo para HER-2 KPL-4, que foi cultivada em um meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina e estreptomicina, foi ajustada para uma concentração de 1 x 10⁸ células/ml com Solução Salina Equilibrada de Hank para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 μΙ em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 7 semanas de idade (CAnN.CgFoxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Dezesseis dias após a inoculação das células, o diâmetro mais curto e o diâmetro mais longo de um tumor em cada camundongo foram medi

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70/101 dos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Digimatic™ caliper, Mitutoyo Corporation), de modo a calcular o volume do tumor de acordo com as seguintes fórmulas de cálculo:

Regressão do Tumor (%) = (1 - RTV mínimo) x100 [0105] Na base dos volumes de tumores obtidos no primeiro dia de administração, os camundongos foram agrupados de tal modo que as médias do volume dos tumores foram substancialmente iguais entre os grupos. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em 6 camundongos. Cada composto de teste foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. Imediatamente antes da administração, a solução estoque foi diluída em solução salina. O composto de teste foi por via intravenosa administrada em 0,09 mg/kg ou 0,18 mg/kg em combinação com trastuzumab (Herceptin, Genentech, Inc.). A regressão do Tumor para o Composto (1) é mostrada na Tabela 8.

Tabela 8

Composto de teste	Dose (mg/kg)	Trastuzumab (mg/kg)	Regressão do Tumor (%)
-	-	10	0
Composto (1)	0,09	-	43
	0,09	10	83
	0,18	-	87
	0,18	10	100

Exemplo de Teste Farmacolóqico 9· Efeito sobre o vaso positivo para

CD31 no modelo subcutâneo de FaDu em camundongos

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71/101 [0106] Um carcinoma humano de células escamosas da linhagem celular de cabeça e pescoço (SCCHN) FaDu, que foi cultivado em um meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina e estreptomicina, foi ajustado para uma concentração de 5 x10⁷ células/ml com PBS para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 μΙ em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 7 semanas de idade (CAnN.CgFoxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Dez dias após a inoculação das células, um composto de teste em solução salina com 100 μΜ de hidroxipropil-p-ciclodextrina foi por via intravenosa administrada em doses de 1/2 MTD a MTD. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em 3 camundongos. Cinco dias após administração, amostras de tumor foram coletadas e fixadas com IHC Zinc Fixative (BD Pharmingen) a 4°C durante 24 h. Tecidos incorporados com parafina foram cortados (3 pm), montados em lâminas positivamente carregadas, e secados ao ar livre. Coloração imunohistoquímica de CD31 foi conduzida utilizando o autocorante Ventana modelo Discover XT (Roche Diagnostics) de acordo com o protocolo do fabricante. Os cortes foram submetidos à remoção de parafina, condicionados e os antígenos foram devolvidos com CC1 (Ventana Medical Systems). As lâminas foram bloqueadas com Blocker A e Blocker B (Kit de bloqueio de biotina endógeno, Roche Diagnostics). Anticorpo IgG CD31 anticamundongo de rato (Dianova GmbH) foi aplicado em 2 pg/ml. Os cortes foram incubados com o anticorpo durante 6 h, seguido por 32 minutos de incubação com anticorpo IgG antirrato biotinilado (Jackson ImmunoResearch Laboratories) em 2,2 pg/ml. A detecção foi executada com Streptavidin-HRP D durante 16 min, seguido pela incubação com DAB D e DAB H2O2 D (kit DABMap, Ventana Medical Systems, Inc) durante 8 min. As lâminas foram contracoloridas com Hematoxilina II (Roche Diagnostics) durante 16 min, seguido por

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72/101 incubação com reagente Bluing durante 4 min. Os cortes foram desidratados em etanóis graduados, desengordurados na substituição de xileno e cobertos com DPX (Merck KGaA).

[0107] As lâminas imunocoradas foram examinadas utilizando Vectra 2 Automated Slide Imaging System (Perkin Elmer Inc.). O número de vasos sanguíneos em todo o tumor foi quantificado através da contagem dos objetos positivos para CD31 utilizando o software inform 2 (PerkinElmer Inc.). O número de vasos sanguíneos foi normalizado pela área da região do tumor. Uma taxa crescente do número de vasos sanguíneos do grupo de dosagem do composto de teste foi calculada com a fórmula abaixo, e mostrada na Tabela 9.

[0108] Taxa crescente de número de vasos sanguíneos (%) = ((número de vasos sanguíneos do grupo de dosagem do composto de teste-número de vasos sanguíneos do grupo de controle) / número de vasos sanguíneos do grupo de controle) x100

Tabela 9

Composto de teste	Dose (mg/kg)	Taxa crescente de número de vasos sanguíneos (%)
Halicondrina B	0,025	31
	0,05	39
Composto (1)	0,10	69
	0,20	154

Exemplo de Teste Farmacolóqico 10· Efeito sobre os CAFs positivos para a-SMA no modelo subcutâneo de FaDu [0109] Um carcinoma humano de células escamosas da linhagem celular de cabeça e pescoço (SCCHN) FaDu, que foi cultivado em um meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina e estreptomicina, foi ajustado para uma concentração de 5 χ 10⁷ células/ml com PBS para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 μΙ em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 5 a 6 semanas de idade (CAnN.Cg

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Foxnl nu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Dez dias após a inoculação das células, um composto de teste em solução salina com 100 μΜ de hidroxipropil-p-ciclodextrina foi por via intravenosa administrada em 1/2 MTD e MTD. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em 3 camundongos. Dois dias após administração, amostras de tumor foram coletadas e fixadas com IHC Zinc Fixative (BD Pharmingen) a 4 °C durante 24 h. Os tecidos incorporados com parafina foram cortados (3 pm), montados em lâminas positivamente carregadas, e secados ao ar livre durante 6 h. Coloração imuno-histoquímica de α-SMA foi conduzida utilizando autocorante Ventana modelo Discover XT (Roche Diagnostics). Os cortes foram submetidos à remoção de parafina, condicionados e os antígenos foram devolvidos com tampões registrados, EZPrep e CC1 (Ventana Medical Systems). Anticorpo monoclonal anti-a-SMA de camundongo conjugado com fosfatase alcalina (clone 1A4, Sigma) foi aplicado em 5 pg/ml. Os cortes foram incubados com o anticorpo durante 6 h. A detecção foi executada com o kit RedMap (Ventana Medical Systems, Inc). Os cortes foram desidratados em etanóis graduados, desengordurados na substituição de xileno e cobertos com DPX (Merck KGaA). As lâminas de tumor em série foram submetidas à remoção de parafina e coradas com hematoxilina de Mayer (Muto Pure Chemicals) durante 1 min. Os cortes foram desidratados em etanóis graduados, desengordurados na substituição de xileno e cobertos com DPX (Merck KGaA).

[0110] As lâminas imunocoradas foram examinadas utilizando Vectra 2 Automated Slide Imaging System (Perkin Elmer Inc.). A área da região positiva a α-SMA em todo o tumor foi quantificada através da contagem dos objetos positivos para α-SMA utilizando o software inform 2 (PerkinElmer Inc.). A área da região do tumor foi medida através da avaliação da área de coloração de hematoxilina utilizando o

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74/101 software inform 2 (PerkinElmer Inc.). A área da região positiva a α-SMA foi normalizada pela área da região do tumor. Uma taxa de supressão da área positiva a α-SMA do grupo de dosagem do composto de teste foi calculada com a fórmula abaixo, e mostrada na Tabela 10.

Tabela 10

Composto de teste	Dose (mg/kg)	Taxa de supressão da área positiva a a-SMA (%)
Halicondrina B	0,025	7
	0,05	3
Composto (1)	0,10	21
	0,20	28
[0111] Taxa de supressão da área positiva a a-SMA (%) = - ((área

positiva a α-SMA do grupo de dosagem do composto de teste - área positiva a α-SMA do grupo de controle) / área positiva a α-SMA do grupo de controle) x100

Exemplo de Teste Farmacolóqico 11· Modelo de camundonqo de transplante ortotópico HSC-2 [0112] Células HSC-2-Luc submetidas à transdução por luciferase foram estabelecidas através da transferência de gene mediada por retrovirus. Em primeiro lugar, o fragmento de DNA que codifica a luciferase de vaga-lume foi obtido do plasmídeo intensificador de pGL3 (GenBank#:U47297) e subclonado no vetor retroviral pCX4pur (GenBank#:AB086386). Em seguida, os retrovirus recombinantes isentos de auxiliares foram produzidos através da transfecção do vetor de expressão retroviral acima, juntamente com os plasmídeos pGP e pEAmpho (Takara Bio; Shiga, Japan), em células 293T (ATCC; Manassas, USA). Depois, as células HSC-2 foram infectadas com os retrovirus recombinantes e cultivadas por duas semanas na presença de puromicina (2 pg/ml). As células infectadas foram selecionadas de uma população proliferativa policlonal da cultura.

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75/101 [0113] Sob anestesia, a linhagem celular de SCCHN humana, HSC-2-Luc foi inoculada na língua de camundongos nus fêmeas (1 χ 10⁶ células em 50 μΙ de PBS), com 6 semanas de idade (camundongos CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj ; Charles River, Inc.; Shizuoka, Japan). Sete dias após o transplante, o volume do tumor foi analisado utilizando o sinal de bioluminescência das células HSC-2-Luc. Para a formação de imagem de bioluminescência, 0,1 ml de D-luciferina a 15 mg/ml (Promega, Madison, Wl) foi injetado por via intraperitoneal em camundongos nus sob anestesia com isoflurano inalado de 1% a 2%. O sinal de bioluminescência foi monitorado utilizando a série I VIS SPECTRUM (PerkinElmer, Waltham, MA), que consiste em uma câmera de dispositivo de carga acoplada altamente sensível esfriada. O software Living Image (PerkinElmer, Waltham, MA) foi utilizado para colocar em uma grade a formação de imagem dos dados e integrar o sinal total de bioluminescência em cada região de interesse (ROI). Todas as imagens de bioluminescência foram adquiridas com uma exposição de 1 segundo. Os dados foram analisados utilizando a emissão total de fluxo de fótons (fótons / segundo) nas ROls.

[0114] Com base na emissão total de fluxo de fótons obtida no primeiro dia de administração, os camundongos foram agrupados de modo que as médias da emissão total de fluxo de fótons fossem substancialmente iguais entre os grupos. O composto (1) ou cisplatina foi administrado por via intravenosa com ou sem cetuximab (Erbitux, Merck Serono Co., Ltd.) uma vez por semana durante 3 semanas (esquema Q7Dx3). Duas experiências foram conduzidas utilizando o procedimento idêntico e todos os dados foram coletados das experiências. Cada grupo consistia de 16 ratos.

[0115] Os dados de formação de imagem mostraram que apenas o tratamento do Composto (1) com cetuximab reduziu claramente o sinal de bioluminescência em todos os camundongos após o Dia 14

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76/101 (Figura 6A a 6B). O tempo médio de sobrevivência (MST) foi calculado para cada grupo de tratamento como a média dos dias de morte. O aumento da expectativa de vida (ILS) foi calculado pela seguinte fórmula: ILS (%) = (MST de animais tratados com o composto de teste MST de animais de controle) / MST de animais de controle χ 100. A ILS (%) de cada composto de teste é mostrada na Tabela 11.

Tabela 11

Composto de teste	Dose (mg/kg)	Cetuximab (mg/kg)	ILS (%)
-	-	5	231
Cisplatin	5	-	0
	5	5	150
Composto (1)	0,09	-	238
	0,09	5	>1150

Exemplo de Teste Farmacológico 12. Modelo de xenoenxerto de FaDu s.c. em combinação com radiação [0116] As células FaDu-Luc submetidas à transdução por luciferase foram estabelecidas através da transferência de genes mediada por retrovirus. Em primeiro lugar, o fragmento de DNA que codifica a luciferase de vaga-lume foi obtido do plasmídeo intensificador de pGL3 (GenBank#: U47297) e subclonado no vetor retroviral pCX4pur (GenBank#: AB086386). Então, os retrovirus recombinantes isentos de auxiliares foram produzidos pela transfecção do vetor de expressão retroviral acima, juntamente com os plasmídeos pGP e pE-Ampho (Takara Bio; Shiga, Japan), em células 293T (ATOO; Manassas, USA). Depois disso, as células de FaDu foram infectadas com os retrovirus recombinantes e cultivadas durante duas semanas na presença de puromicina (2 pg/ml). As células infectadas foram selecionadas de uma população proliferativa policlonal da cultura.

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77/101 [0117] Uma linhagem celular de SCCHN humana submetida à transdução por luciferase, FaDu-Luc, que foi cultivada em um meio RPMI-1640 contendo FBS 10% e penicilina e estreptomicina, foi ajustada para uma concentração de 5 χ 10⁷ células/ml com Solução Salina Equilibrada de Hank para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 μΙ em uma parte subcutânea de de uma coxa direita de camundongos nus, 6 semanas de idade (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Treze dias após a inoculação das células, o volume do tumor foi analisado utilizando o sinal de bioluminescência das células FaDu-Luc. Para a formação de imagem por bioluminescência, 0,1 ml de D-luciferina a 15 mg/ml (Promega, Madison, Wl) foi injetado por via intraperitoneal em camundongos nus sob anestesia com isoflurano inalado de 1% a 2%. O sinal de bioluminescência foi monitorado utilizando a série IVIS SPECTRUM (PerkinElmer, Waltham, MA), consistindo em uma câmera de dispositivo de carga acoplada altamente sensível resfriada. O software Living Image (PerkinElmer, Waltham, MA) foi utilizado para colocar em uma grade a formação de imagem dos dados e integrar o sinal total de bioluminescência em cada região de interesse (ROI). Todas as imagens de bioluminescência foram adquiridas com uma exposição de 1 segundo. Os dados foram analisados utilizando a emissão total de fluxo de fótons (fótons / segundo) nas ROls. A emissão total do fluxo de fótons foi calculada de acordo com as seguintes fórmulas de cálculo:

[0118] Nível relativo de bioluminescência = Emissão total do fluxo de fótons (dia X) / Emissão total do fluxo de fótons (o primeiro dia) Regressão do tumor (%) = (1 - nível mínimo de bioluminescência relativa) χ 100 [0119] Na base da emissão total de fluxo de fótons obtida no primeiro dia de administração, os camundongos foram agrupados de tal

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78/101 modo que as médias da emissão total de fluxo de fótons fossem substancialmente iguais entre os grupos. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo de 6 camundongos. O composto (1) foi administrado por meio de injeção na veia da cauda no dia 1 e 8. A irradiação foi executada 18 Gy no dia 4 e no dia 11. A regressão do tumor para o Composto (1) é mostrada na Tabela 12.

Tabela 12

Composto de teste	Dose (mg/kg)	Radiação (Gi)	Regressão do Tumor (%)
-	-	18	16
Composto (1)	0,09	-	0
	0,09	18	97

Exemplo de Teste Farmacolóqico 13· Atividade antitumoral no modelo sinqênico subcutaneous de CT26 em combinação com anticorpo antimPD-1 em camundongos [0120] Uma linhagem celular de carcinoma do cólon não diferenciada de murino CT26, que foi cultivada em um meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina e estreptomicina, foi ajustada para uma concentração de 2 χ 10⁷ células/ml com Solução Salina Equilibrada de Hank para preparar uma suspensão de células. No dia 1, a suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 μΙ_ em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos BALB/c, 6 semanas de idade (BALB/cAnNCrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Dois dias após a inoculação das células, os camundongos foram escolhidos a esmo divididos em quatro grupos e cada grupo consiste em 8 camundongos. O diâmetro mais curto e o diâmetro mais longo de um tumor em cada camundongo foram medidos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Digimatic™ caliper, Mitutoyo Corporation), de modo a calcular o volume do tumor de acordo com a seguinte fórmula de cálculo:

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T/C = (volume médio do tumor do grupo tratado)/(volume médio do tumor do grupo de controle)

Inibição do crescimento de tumor (%) = (1-T/C) χ 100 [0121] O composto de teste foi por via intravenosa administrado em 0,09 mg/kg no dias 3 e 11. O anticorpo anti-mPD-1 (BE0146, Bio X Célula) foi por via intravenosa administrado em 10 mg/kg nos dias 3, 7, 11 e 15. A inibição do crescimento de tumor no dia 15 (%) de cada composto de teste é mostrada na Tabela 13.

Tabela 13

Composto de teste	Dose (mg/kg)	Anticorpo anti-mPD-1 (mg/kg)	Inibição do crescimento de tumor no dia15(%)
-	-	10	32
Composto (1)	0,09	-	30
	0,09	10	62

Exemplo de Teste Farmacolóqico 14· Efeito sobre a polimerizacão de tubulina in vitro (Figura 10A) [0122] O kit de ensaio de polimerização de tubulina foi adquirido da Cytoskeleton, Inc. (Cat.# BK011P). O kit continha 1 frasco de proteína tubulina liofilizada purificada do cérebro de suíno, 3 tubos de GTP liofilizado, 2 frascos de tampão de ensaio liofilizado e 1 frasco de tampão de tubulina e glicerol. O tampão de ensaio foi preparado através da dissolução dos conteúdos em 10 ml de água deionizada e esterilizada. Esta solução continha 80 mmol/L de sal de sesquissódio de piperazina-N,N'-bis [ácido 2-etanossulfônico], 2,0 mmol/L de cloreto de magnésio, 0,5 mmol/L de etileno glicol-ácido bis(éter 2-amino-etílico) Ν,Ν,Ν',Ν'-tetra-acético, pH 6,9 e repórter fluorescente de 10 pmol/L. O tampão foi armazenado a -70°C até o uso. O tampão de tubulina e glicerol consistia em 80 mmol/L de sal sesquissódico de piperazinaN, N'-bis[ácido 2-etanossulfônico], 2,0 mmol/L de cloreto de magnésio,

O, 5 mmol/L de etileno glicol-ácido bis(éter 2-amino-etílico) Ν,Ν,Ν',Ν'tetra-acético e 60% v/v de glicerol, pH 6,9. Foi armazenado a 4°C até o uso. A solução estoque de GTP foi preparada mediante a dissolução

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80/101 dos conteúdos de cada tubo em 100 μΙ_ de água deionizada e esterilizada para alcançar uma concentração de 100 mmol/L de GTP. Alíquotas desse material foram armazenadas a -70°C até o uso. A solução estoque de tubulina (10 mg/ml) foi preparada por dissolver o pó de tubulina adicionando 1,1 ml da mistura de tampão de ensaio e solução estoque de GTP (100:1, v/v). As alíquotas foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -70°C até o uso.

[0123] No ensaio de polimerização de tubulina, a mistura de reação foi preparada através da mistura de 820 μΙ de tampão de ensaio,

17,6 μΙ de solução estoque de GTP e 600 μΙ de tampão de tubulina e glicerol. A mistura de reação (1015 μΙ) foi combinada com 240 μΙ da solução estoque de tubulina. Essa solução foi denominada mistura de reação de tubulina e utilizada para a medição dos reservatórios de teste e controle. Nenhuma mistura de reação de tubulina foi preparada através da mistura de 89,85 μΙ de mistura de reação e 21,25 μΙ de tampão de ensaio para a medição de reservatórios em branco. A solução de Composto (1) (6,25 a 100 pmol/L; concentrações finais 0,625 a 10 pmol/L) ou veículo foi adicionada em 5 μΙ_ aos reservatórios individuais de uma placa de microtitulação de meia área de 96 reservatórios. A mistura de reação de tubulina ou nenhuma mistura de reação de tubulina foi adicionada em 45 μΙ a cada reservatório da placa. A emissão de fluorescência em 460 nm (comprimento de onda de excitação em 360 nm) foi medida a cada 2 minutos durante 90 minutos utilizando a leitora de microplacas SpectraMax® M5e (Molecular Devices). A polimerização da tubulina foi seguida pela intensificação da fluorescência devido à incorporação de um repórter de fluorescência nos microtúbulos quando a polimerização ocorreu. O ensaio foi executado em duplicata. O ensaio demonstrou que o Composto (1) inibiu a polimerização da tubulina de uma maneira dependente da concentra

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81/101 ção. A intensidade da fluorescência em cada momento foi calculada pelas seguintes fórmulas:

Intensidade de fluorescência = medição da fluorescência média de reservatórios de teste ou de controle - medição da fluorescência média de reservatórios em branco; reservatório em branco: com veículo sem tubulina; reservatório de controle: com veículo e tubulina; reservatório de teste: com compostos e tubulina.

Exemplo de Teste Farmacolóqico 15· Ensaio de dinâmica dos microtúbulos com base nas células (Figura 10B) [0124] Um ensaio de dinâmica dos microtúbulos com base nas células (MT) foi conduzido com a linhagem celular de osteossarcoma U2OS-EB3-AG, na qual a proteína de fusão do EB3 (um microtúbulo acrescido da proteína de ligação à extremidade) e do Azami-Green (EB3-AG) foi expressa de forma estável. As células U2OS-EB3-AG foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo FBS 10% e penicilinaestreptomicina, a 37°C em uma atmosfera de CO2 a 5% umidificada. A dinâmica do MT nas células vivas pode ser visualizada como o movimento da estrutura semelhante a cometa do EB3-AG. As células U2OS-EB3-AG plaqueadas em placas de cultura à base de vidro (placa EZVIEW, AGC Techno Glass, Japan) foram tratadas com o Composto (1) na concentração indicada e a dinâmica dos microtúbulos foi monitorada pela imagem de lapso de tempo utilizando microscópio fluorescente com lente objetiva imersa em óleo com ampliação de 60 vezes (BZ-X710, KEYENCE, Japan). As imagens paradas nos momentos indicados foram apresentadas na Figura 10B. Vistas de maior ampliação das áreas em caixas foram mostradas nas entradas. Quando tratadas com o Composto (1) em 0,5 nM (valor de IC50 para atividade antiproliferativa em células U2OS-EB3-AG), as estruturas do tipo cometa se tornaram difíceis de observar ao redor de 60 minutos após a adição do composto. Estes resultados demonstraram claramente que

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82/101 o Composto (1) tinha a capacidade de suprimir a dinâmica do MT. Exemplo de Teste Farmacológico 16· Atividade antiproliferativa in vivo (Figura 11) [0125] Os ensaios antiproliferatives in vivo para o Composto (1) foram conduzidos utilizando um pequeno painel de linhagens celulares de câncer incluindo carcinoma humano de células escamosas do esôfago (OE21, TE-8), adenocarcinoma humano do esôfago (OE33), e sarcoma uterino humano (MES-SA, MES-SA-Dx5-Rx1). Todas as linhagens celulares foram cultivads em meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina-estreptomicina (meio de cultura), em uma incubadora de CO2 5% (37°C). Em cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios (Becton, Dickinson and Company, 353219), 75 μΙ de suspensão de células ajustados para uma concentração de 4 χ 10⁴ células/ml com 0 meio de cultura foram adicionados, e as células foram incubadas durante a noite em uma incubadora de CO2 5% (37°C). No dia seguinte, 25 μΙ de Composto (1) na série de diluição de três vezes colocado em suspensão no meio de cultura foram adicionados a cada reservatório, e 0 resultante foi incubado durante 72 horas em uma incubadora de CO2 5% (37°C). Depois, a viabilidade celular foi determinada por CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) com 2013 Envision™ Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). O valor dos reservatórios contendo células sem adição dos compostos de teste foi definido como 100% e 0 valor dos reservatórios não contendo nenhuma célula foi definido como 0%. A concentração de Composto (1) necessária para a inibição do crescimento celular em 50% (isto é, um valor de IC50) foi calculada, e é mostrada em Figura 11. A suscetibilidade de P-gp foi calculada como a relação do valor de IC50 em células MESSA-Dx5-Rx1, que superexpressam P-gp, para 0 valor de IC50 em células MES-SA.

Exemplo de Teste Farmacológico 17· Efeitos antitumorais nos modelos

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83/101 de xenoenxerto de KPL-4 em camundongos como monoterapia; Efeitos antitumorais nos modelos de xenoenxerto de COLO-704 em camundongos como monoterapia (Figura 12) [0126] Uma linhagem celular humana de câncer da mama positivo para HER-2 KPL-4, que foi cultivada em um DMEM contendo FBS 10%, e penicilina-estreptomicina, foi ajustada para uma concentração de 1 x 10⁸ células/ml com Solução Salina Equilibrada de Hank para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 pL em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 8 semanas de idade (CAnN.CgFoxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan Inc.). Onze dias após a inoculação das células (Dia 1), o diâmetro mais curto e o diâmetro mais longo de um tumor em cada camundongo foram medidos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Digimatic™ caliper, Mitutoyo Corporation), de modo a calcular o volume do tumor de acordo com as seguintes fórmulas de cálculo:

Volume do tumor (mm³) = Diâmetro mais longo (mm) x Diâmetro mais curto (mm) x Diâmetro mais curto (mm)/2

Peso corporal relativo (RBW) = Peso corporal (dia X) / Peso corporal (o primeiro dia) [0127] Na base dos volumes de tumores obtidos no dia 1, os camundongos foram agrupados de tal modo que as médias do volume dos tumores foram substancialmente iguais entre os grupos. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo de seis camundongos. O composto de teste foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. Imediatamente antes da administração, a solução estoque foi diluída com solução salina. O composto de teste em solução salina foi por via intravenosa adminisPetição 870190096531, de 26/09/2019, pág. 129/156

84/101 trada uma vez por semana em 20 pg/kg, 60 pg/kg ou 180 pg/kg durante 2 semanas (no dia 1 e Dia 8). A Regressão do Tumor foi observada em grupos tratados com 60 pg/kg e 180 pg/kg, e a administração em 180 pg/kg completamente erradicou os tumores de xenoenxerto em todos os camundongos no dia 15.

[0128] Uma linhagem celular de câncer de ovário humano COLO704, que foi cultivada em um RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina-estreptomicina, foi ajustada para uma concentração de 1 χ 10⁸ células/ml com Solução Salina Equilibrada de Hank para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 pL em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 5 semanas de idade (CAnN.Cg- Foxnl nu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan Inc.). Nove dias após a inoculação das células (Dia 1), o diâmetro mais curto e o diâmetro mais longo de um tumor em cada camundongo foram medidos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Digimatic™ caliper, Mitutoyo Corporation), de modo a calcular o volume do tumor de acordo com as seguintes fórmulas de cálculo:

Volume do tumor (mm^) = Diâmetro mais longo (mm) χ Diâmetro mais curto (mm) χ Diâmetro mais curto (mm)/2

Peso corporal relativo (RBW) = Peso corporal (dia X) / Peso corporal (o primeiro dia) [0129] Na base dos volumes de tumores obtidos no dia 1, os camundongos foram agrupados de tal modo que as médias do volume dos tumores foram substancialmente iguais entre os grupos. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em seis camundongos. O composto de teste foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. Imediatamente antes da

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85/101 administração, a solução estoque foi diluída com solução salina. O composto de teste em solução salina foi por via intravenosa administrada uma vez por semana em 20 pg/kg, 60 pg/kg ou 180 pg/kg durante 2 semanas (no dia 1 e Dia 8). O tratamento com composto induziu a regressão do tumor em 180 pg/kg e retardo do crescimento de tumor em 60 pg/kg. A administração em 180 pg/kg erradicou completamente os tumores de xenoenxerto em todos os camundongos no dia 22.

Exemplo de Teste Farmacolóqico 18· Efeito sobre o vaso positivo para CD31 no modelo subcutâneo de FaDu em camundongos (Figura 13) [0130] Um carcinoma humano de células escamosas da linhagem celular de cabeça e pescoço (SCCHN) FaDu, que foi cultivado em um meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina-estreptomicina (meio de cultura), foi ajustada para uma concentração de 5 x10⁷ células/ml com meio de cultura para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 pl em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 6 semanas de idade (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Dez dias após a inoculação das células, os camundongos foram agrupados de tal modo que as médias do volume dos tumores foram substancialmente iguais entre os grupos. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em 6 camundongos. Cada composto de teste foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. Imediatamente antes da administração, a solução estoque foi diluída com solução salina. O composto de teste em solução salina foi por via intravenosa administrado em 20 pg/kg, 60 pg/kg ou 180 pg/kg. Cinco dias após a única administração, as amostras de tumor foram coletadas e fixadas com IHC Zinc Fixative (BD Pharmingen) a 4 °C durante 24 horas. Os tecidos incorporados com parafina foram cortados (3 pm), montados em lâminas positivamente carregadas, e secados ao ar livre. Coloração

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86/101 imuno-histoquímica de CD31 foi conduzida utilizando autocorante Ventana modelo Discover XT (Roche Diagnostics) de acordo com o protocolo do fabricante. Os cortes foram submetidos à remoção de parafina, condicionados e os antígenos foram devolvidos com CC1 (Ventana Medical Systems). As lâminas foram bloqueadas com Blocker A e Blocker B (Kit de bloqueio de biotina endógeno, Roche Diagnostics). Anticorpo IgG CD31 anticamundongo de rato (Dianova GmbH) foi aplicado em 2 pg/ml. Os cortes foram incubados com o anticorpo durante 6 horas, seguido de 32 minutos de incubação com anticorpo IgG antirrato biotinilado (Jackson ImmunoResearch Laboratories) em 2,2 pg/ml. A detecção foi executada com Streptavidin-HRP D durante 16 minutos, seguido por incubação com DAB D e DAB H2O2 D (kit DABMap, Ventana Medical Systems, Inc.) durante 8 minutos. As lâminas foram contracoloridas com Hematoxilina II (Roche Diagnostics) durante 16 min, seguido por incubação com reagente Bluing durante 4 minutos. Os cortes foram desidratados em etanóis graduados, desengordurados na substituição de xileno e cobertos com DPX® (Merck KGaA). As lâminas imunocoradas foram examinadas utilizando Vectra® 2 Automated Slide Imaging System (Perkin Elmer Inc.). O número de vasos sanguíneos em todo 0 tumor foi quantificado através da contagem dos objetos positivos para CD31 utilizando software inform 2 (PerkinElmer Inc.), A área da região do tumor foi medida através da avaliação da área de coloração de hematoxilina utilizando software inform 2 (PerkinElmer Inc.) O número de vasos sanguíneos foi normalizado pela área da região do tumor. A única administração de composto de teste em doses de 20, 60 e 180 pg/kg aumentou 0 número de vasos sanguíneos do tumor. As relações de número de vasos sanguíneos nos grupos de dosagem do composto de teste em comparação com 0 grupo não tratado foram calculadas com a fórmula abaixo:

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87/101

Relação de vaso do tumor = número de vasos sanguíneos do grupo de dosagem do composto de teste / número de vasos sanguíneos do grupo não tratado)

Exemplo de Teste Farmacolóqico 19· Efeito sobre os CAFs positivos para α-SMA no modelo subcutâneo de FaDu em camundonqos (Figura 14) [0131] Um carcinoma humano de células escamosas da linhagem celular de cabeça e pescoço (SCCHN) FaDu, que foi cultivado em um meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina-estreptomicina (meio de cultura), foi ajustada para uma concentração de 5 x10⁷ células/ml com meio de cultura para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 μΙ_ em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 6 semanas de idade (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Dez dias após a inoculação das células, os camundongos foram agrupados de tal modo que as médias do volume dos tumores foram substancialmente iguais entre os grupos. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em 5 camundongos. Cada composto de teste foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. Imediatamente antes da administração, a solução estoque foi diluída com solução salina. O composto de teste em solução salina foi por via intravenosa administrado em 20 pg/kg, 60 pg/kg ou 180 pg/kg. Dois dias ou 5 dias após a única administração, as amostras de tumor foram coletadas e fixadas com IHC Zinc Fixative (BD Pharmingen) a 4°C durante 24 horas. Os tecidos incorporados com parafina foram cortados (3 pm), montados em lâminas positivamente carregadas, e secados ao ar livre. Os cortes foram submetidos à remoção de parafina, condicionados e os antígenos foram devolvidos utilizando microondas com 1 mM EDTA em pH 6,0. Os cortes foram bloqueados com 1% de BSA em TBS. Anticorpo

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88/101 monoclonal anti-a-SMA de camundongo conjugado com fosfatase alcalina (clone 1A4, Sigma) foi aplicado em 5 pg/ml. Os cortes foram incubados com o anticorpo durante 2,5 h. A detecção foi executada com o kit de substrato Fast red II (Nichirei Bioscience Inc.). Os cortes foram contracoloridas com Hematoxilina de Mayer (Muto Pure Chemicals) durante 50 seconds. Os cortes foram desidratados em etanóis graduados, desengordurados na substituição de xileno e cobertos com DPX (Merck KGaA). As lâminas imunocoradas foram examinadas utilizando Vectra 2 Automated Slide Imaging System (Perkin Elmer Inc.). A área da região positiva para α-SMA em todo o tumor foi quantificada através da contagem dos objetos positivos para α-SMA utilizando o software inform 2 (PerkinElmer Inc.). A área da região do tumor foi medida através da avaliação da área de coloração de hematoxilina utilizando software inform 2 (PerkinElmer Inc.). A área da região positiva para αSMAfoi normalizada pela área da região do tumor. A única administração de composto de teste significativamente reduziu a área positiva a α-SMA em doses de 60 e 180 pg/kg no dia 3 e em uma dose de 180 pg/kg no dia 6. Uma taxa de supressão da área positiva a α-SMA do grupo de dosagem do composto de teste foi calculada com a fórmula abaixo:

Relação de α-SMA = área de α-SMA do grupo de dosagem do composto de teste / área de α-SMA do grupo não tratado

Exemplo de Teste Farmacolóqico 20· Efeitos sobre Tenascin-C e EDAfibronectina no modelo subcutâneo de FaDu em camundonqos (Figura 15) [0132] Um carcinoma humano de células escamosas da linhagem celular de cabeça e pescoço (SCCHN) FaDu, que foi cultivado em um meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina-estreptomicina (meio de cultura), foi ajustado para uma concentração de 5 x10⁷ células/ml com meio de cultura para preparar uma suspensão de células. A sus

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89/101 pensão de células foi inoculada em um volume de 100 pl em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 6 semanas de idade (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Dez dias após a inoculação das células, os camundongos foram agrupados de tal modo que as médias do volume dos tumores foram substancialmente iguais entre os grupos. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em 5 camundongos. O Composto (1) foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. O Composto (1) (180 pg/kg) e Cetuximab (CTX, Erbitux®, Merck Serono Co. Ltd.) (10 mg/kg) foi diluído com solução salina e injetado por via intravenosa no dia 1. Cinco dias após a única administração, amostras de tumor foram coletadas e fixadas com IHC Zinc Fixative (BD Pharmingen) a 4°C durante 24 h. Tecidos incorporados com parafina foram cortados (3 pm), montados em lâminas positivamente carregadas, e secados ao ar livre. Os cortes foram submetidos à remoção de parafina, condicionados e os antígenos foram devolvidos utilizando micro-ondas com EDTA 1 mM em pH 6,0 por Tenascin-C. Para EDA-fibronectina, o procedimento de retorno de antígenos não foi necessário. Os cortes foram incubados com BLOXALL Blocking Solution (Vector Labs) durante 10 min para bloquear a peroxidase endógena, e com Mouse on Mouse Ig Blocking Reagent (Vector Labs) durante 1 hora, e depois com soro normal de cavalo 2,5% durante 30 minutos. Para a coloração imuno-histoquimica de Tenascin-C, o anticorpo monoclonal anti-Tenascin-C de camundongo (clone 4C8MS, IBL) foi aplicado em 5 pg/ml. Os cortes foram incubados com o anticorpo durante a noite a 4°C. Para a coloração imunohistoquímica de EDA-fibronectina, o anticorpo monoclonal anti-EDAfibronectina de camundongo (clone IST-9, Abeam) foi aplicado em 1,5 pg/ml. Os cortes foram incubados com o anticorpo durante 1 hora na temperatura ambiente. A detecção foi executada com Mouse On Mou

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90/101 se ImmPRESS™ Peroxidase Polimer Kit (Vector Labs). Os cortes foram contracoloridas com Hematoxilina de Mayer (Muto Pure Chemicals) durante 50 seg. Os cortes foram desidratados em etanóis graduados, desengordurados na substituição de xileno e cobertos com DPX (Merck KGaA). As lâminas imunocoradas foram examinadas utilizando Vectra 2 Automated Slide Imaging System (Perkin Elmer Inc.). Os níveis de expressão tanto de Tenascin-C quanto de ED-A fibronectina foram reduzidos no Composto (1) e tumores tratados com CTX comparados com os tumores de controle.

Exemplo de Teste Farmacolóqico 21. Efeitos antitumorais em modelo de xenoenxerto subcutâneo de FaDu em combinação com cetuximab em camundongos (Figura 16) [0133] Um carcinoma humano de células escamosas da linhagem celular de cabeça e pescoço (SCCHN) FaDu, que foi cultivado em um meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina-estreptomicina, foi ajustado para uma concentração de 5 χ 10⁷ células/ml com Solução Salina Equilibrada de Hank para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 μΙ em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos atímicos (CAnN.Cg-Foxnl nu/CrlCrlj, fêmea, 7 semanas de idade, Charles River Japan Inc.). Dez dias após a inoculação das células (Dia 1), o comprimento e a largura de um tumor em cada camundongo foram medidos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Mitutoyo Corporation), de modo a calcular o volume do tumor de acordo com a seguinte fórmula de cálculo:

Volume relativo do tumor (RTV) = Volume do tumor (dia X) / Volume do tumor (o primeiro dia) [0134] Na base de TV, os camundongos foram aleatoriamente

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91/101 agrupados (Dia 1). Cada grupo consistia em seis camundongos. O Composto (1) foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. O Composto (1) (20, 60, ou 180 pg/kg) e Cetuximab (CTX, Erbitux®, Merck Serono Co., Ltd.) (10 mg/kg) foram diluídos com solução salina e por via intravenosa injetados no dia 1. Alterações do RTV de cada grupo foram mostradas na Figura 16. Em doses de 180 pg/kg e 60 pg/kg, as eficácias antitumorais do Composto (1) com CTX foram mais fortes do que aquela da monoterapia de CTX com regressão do tumor. A eficácia antitumoral do Composto (1) em doses de 20 pg/kg em combinação com CTX levaram a ser mais forte do que aquela da monoterapia de CTX.

Exemplo de Teste Farmacolóqico 22· Efeitos antitumorais em modelos de xenoenxerto de sarcoma de tecidos moles o modelos de xenoenxerto de sarcoma de tecidos moles em camundongos como monoterapia (Figura 17)

MES-SA [0135] Uma linhagem celular de sarcoma uterino de ser humano MES-SA, que foi cultivado em um RPMI-1640 contendo FBS 10%, e penicilina-estreptomicina, foi ajustada para uma concentração de 2 χ 10⁸ células/ml com Solução Salina Equilibrada de Hank para preparar uma suspensão de células, e a suspensão foi misturada com Geltrex® (Thermo Fisher Scientific Inc., #A1413202) em uma relação de 1:1 para preparar uma suspensão de células em uma concentração de 1 χ 10⁸ células/ml. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 pl em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 6 semanas de idade (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan Inc.). Seis dias após a inoculação das células (Dia 1), o diâmetro mais curto e o diâmetro mais longo de um tumor em cada camundongo foram medidos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Digimatic™ caliper, Mitutoyo Corporation),

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92/101 de modo a calcular o volume do tumor de acordo com as seguintes fórmulas de cálculo:

Volume relativo do tumor (RTV) = Volume do tumor (dia X) / Volume do tumor (o primeiro dia) [0136] Na base dos volumes de tumores obtidos no dia 1, os camundongos foram agrupados de tal modo que as médias do volume dos tumores foram substancialmente iguais entre os grupos. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em 6 camundongos. O composto de teste foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. Imediatamente antes da administração, a solução estoque foi diluída com solução salina. O composto de teste em solução salina foi por via intravenosa uma vez por semana administrada em 180 pg/kg durante 2 semanas (no dia 1 e Dia 8). A atividade antitumoral foi observada com retardo de crescimento do tumor no grupo tratado.

HT-1080 [0137] Uma linhagem celular de fibrosarcoma humano HT-1080, que foi cultivada em um E-MEM contendo FBS 10%, NEAA e antibióticos foi ajustada para uma concentração de 3 χ 10⁷ células/ml com meio para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 μΙ em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos atímicos (CAnN.CgFoxnlnu/CrlCrlj, fêmea, 6 semanas de idade, Charles River Japan Inc.). Seis dias após a inoculação das células (Dia 1), o comprimento e a largura de um tumor em cada camundongo foram medidos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Mitutoyo Corporation), de modo a calcular o volume do tumor de acordo com a seguinte fórmula de cálculo:

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Volume relativo do tumor (RTV) = Volume do tumor (dia X) / Volume do tumor (o primeiro dia) [0138] Na base de TV, os camundongos foram aleatoriamente agrupados (Dia 1). Cada grupo foi consistia em seis camundongos. O Composto (1) foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. O Composto (1) (180 pg/kg) foi diluído com solução salina e por via intravenosa injetado no dia 1 e Dia 8. As alterações de RTV de cada grupo foram mostradas na Figura 17. A atividade antitumoral foi observada com regressão do tumor no grupo tratado.

CTG-2041 [0139] Fragmentos de tumor de angiossarcoma humano CTG2041 foram implantados s.c. no flanco esquerdo de camundongos fêmeas. O crescimento tumoral foi monitorado duas vezes por semana utilizando compasso de calibre digital, de modo a calcular o volume do tumor de acordo com a seguinte fórmula de cálculo:

Volume relativo do tumor (RTV) = Volume do tumor (dia X) / Volume do tumor (o primeiro dia) [0140] Quando o volume dos tumores alcançou aproximadamente 200 mm³, os animais são combinados por volume do tumor nos grupos de tratamento ou controle e a dosagem iniciou no dia 1. Cada grupo consistiia em cinco camundongos. O Composto (1) foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. O Composto (1) (100 pg/kg) foi diluído em solução salina e por via intravenosa injetado no dia 1 e Dia 8. As alterações de RTV de cada grupo

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94/101 foram mostradas na Figura 17. A atividade antitumoral foi observada com a regressão do tumor no grupo tratado.

Exemplo de Teste Farmacolóqico 23· Efeitos antitumorais nos modelos de xenoenxerto de sarcoma de câncer endometrial (Figura 18) H EC-108 [0141] Uma linhagem celular de câncer endometrial humano HEC108, que foi cultivada em um E-MEM contendo 15% FBS e antibióticos foi ajustada para uma concentração de 7,14 χ 10⁷ células/ml com meio para preparar uma suspensão de células. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 150 μΙ em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos atímicos (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, fêmea, 6 semanas de idade, Charles River Japan Inc.). Treze dias após a inoculação das células (Dia 1), o comprimento e a largura de um tumor em cada camundongo foram medidos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Mitutoyo Corporation), de modo a calcular o volume do tumor de acordo com a seguinte fórmula de cálculo:

Volume relativo do tumor (RTV) = Volume do tumor (dia X) / Volume do tumor (o primeiro dia) [0142] Na base de TV, os camundongos foram aleatoriamente agrupados (Dia 1). Cada grupo consistia em seis camundongos. O Composto (1) foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. O Composto (1) (180 pg/kg) foi diluído em solução salina e por via intravenosa injetado no dia 1 e Dia 8. As alterações de RTV de cada grupo foram mostradas na Figura 18. A atividade antitumoral foi observada com o retardo de crescimento do tumor no grupo tratado.

AN3CA

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95/101 [0143] Uma linhagem celular de câncer endometrial humano AN3CA, que foi cultivada em um E-MEM contendo FBS 10%, e penicilina-estreptomicina, foi ajustada para uma concentração de 1,4 χ 10⁸células/ml com Solução Salina Equilibrada de Hank para preparar uma suspensão de células, e a suspensão foi misturada com Geltrex® (Thermo Fisher Scientific Inc., #A1413202) em uma relação de 1:1 para preparar uma suspensão de células em uma concentração de 7 χ 10⁷ células/ml. A suspensão de células foi inoculada em um volume de 100 μΙ em uma parte subcutânea de um flanco direito de camundongos nus, 6 semanas de idade (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, fêmea, Charles River Laboratories Japan Inc.). Doze dias após a inoculação das células (Dia 1), o diâmetro mais curto e o diâmetro mais longo de um tumor em cada camundongo foram medidos através do uso de um compasso de calibre digital eletrônico (Digimatic™ caliper, Mitutoyo Corporation), de modo a calcular o volume do tumor de acordo com as seguintes fórmulas de cálculo:

Volume relativo do tumor (RTV) = Volume do tumor (dia X) / Volume do tumor (o primeiro dia) [0144] Na base dos volumes de tumores obtidos no dia 1, os camundongos foram agrupados de tal modo que as médias do volume dos tumores foram substancialmente iguais entre os grupos. A experiência foi conduzida em grupos cada um consistindo em cinco camundongos. O composto de teste foi dissolvido em DMSO e uma solução foi armazenada no congelador antes do uso. Imediatamente antes da administração, a solução estoque foi diluída com solução salina. O composto de teste em solução salina foi por via intravenosa uma vez por semana administrada em 180 pg/kg durante 2 semanas (no dia 1 e Dia 8). A atividade antitumoral foi observada com a regressão do tumor

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96/101 no grupo tratado.

Exemplo de Teste Farmacolóqico 24· Ensaio de inibição do crescimento de NCI-N87 e MKN-28 [0145] Neste ensaio, as atividades inibidoras do crescimento dos compostos de teste em linhagens celulares de câncer gástrico humano NCI-N87 e MKN-28 foram medidas, respectivamente. As células NCIN87 e MKN-28 foram mantidas em meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, penicilina e estreptomicina em uma incubadora de CO2 5% (37°C). A cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios (Becton, Dickinson and Company, 353219), 100 μΙ de suspensão de células NCI-N87 ou MKN-28 ajustados para uma concentração de 3 χ 10⁴ células/ml com 0 meio de cultura foram adicionados, e as células foram incubadas durante a noite em uma incubadora de CO2 5% (37°C). No dia seguinte, 100 μΙ de Composto (1) ou Halicondrina B na série de diluição de três vezes colocados em suspensão no meio de cultura foram adicionados à cada reservatório, e 0 resultante foi incubado durante 3 dias em uma incubadora de CO2 5% (37 °C). Depois, a viabilidade celular foi determinada por CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) com EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). O valor dos reservatórios contendo células sem adição dos compostos de teste foi definido como 100% e 0 valor dos reservatórios não contendo nenhuma célula foi definido como 0%. As concentrações do composto de teste necessárias para a inibição do crescimento celular em 50% (isto é, um valor de IC50) foram calculadas e são mostradas na Tabela 14.

Tabela 14

Composto de teste	NCI-N87 (IC₅₀ (nM))	MKN-28 (IC50 (nM))
Halicondrina B	0,007	0,017
Composto (1)	0,002	0,015

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Exemplo de Teste Farmacolóqico 25· Ensaio de inibição do crescimento de HuTu 80 [0146] Neste ensaio, as atividades inibidoras do crescimento dos compostos de teste na linhagem celular de câncer do intestino delgado humano HuTu 80, que foi isolada do tecido duodenal, foram medidas. Células HuTu 80 foram mantidas em meio EMEM contendo FBS 10%, penicilina e estreptomicina em uma incubadora de CO2 5% (37°C). A cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios (Becton, Dickinson and Company, 353219), 100 μΙ de uma suspensão de células HuTu80 ajustada para uma concentração de 3 χ 10⁴ células/ml com 0 meio de cultura foram adicionados, e as células foram incubadas durante a noite em uma incubadora de CO2 5% (37°C). No dia seguinte, 100 μΙ de Composto (1) ou Halicondrina B na série de diluição de três vezes colocado em suspensão no meio de cultura foram adicionados a cada reservatório, e 0 resultante foi incubado durante 3 dias em uma incubadora de CO2 5% (37°C). Depois, a viabilidade celular foi determinada por CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) com EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). O valor dos reservatórios contendo células sem adição dos compostos de teste foi definido como 100% e 0 valor dos reservatórios não contendo nenhuma célula foi definido como 0%. As concentrações dos compostos de teste necessárias para a inibição do crescimento celular em 50% (isto é, um valor de IC50) foram calculadas e são mostradas na Tabela 15.

Tabela 15

Composto de teste	HuTu 80 (IC₅o (nM))
Halicondrina B	0,031
Composto (1)	0,019

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Exemplo de Teste Farmacolóqico 26· Ensaio de inibição do crescimento de SW780 [0147] Neste ensaio, as atividades inibidoras do crescimento dos compostos de teste na linhagem celular de câncer urotelial humano SW780 foram medidas. As células SW780 foram mantidas em meio RPMI-1640 contendo FBS 10%, penicilina e estreptomicina em uma incubadora de CO2 5% (37°C). A cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios (Becton, Dickinson and Company, 353219), 100 μΙ de uma suspensão de células SW780 ajustada para uma concentração de 3 χ 10⁴ células/ml com 0 meio de cultura foram adicionados, e as células foram incubadas durante a noite em uma incubadora de CO2 5% (37°C). No dia seguinte, 100 μΙ de Composto (1) ou Halicondrina B na série de diluição de três vezes colocado em suspensão no meio de cultura foram adicionados a cada reservatório, e 0 resultante foi incubado durante 3 dias em uma incubadora de CO2 5% (37°C). Depois, a viabilidade celular foi determinada por CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) com EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). O valor dos reservatórios contendo células sem adição dos compostos de teste foi definido como 100% e 0 valor dos reservatórios não contendo nenhuma célula foi definido como 0%. As concentrações dos compostos de teste necessárias para a inibição do crescimento celular em 50% (isto é, um valor de IC50) foram calculadas, e são mostradas na Tabela 16.

Tabela 16

Composto de teste	SW780 (IC₅₀ (nM))
Halicondrina B	0,032
Composto (1)	0,017

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Exemplo de Teste Farmacolóqico 27· Ensaio de inibição do crescimento de HS-SY-II [0148] Neste ensaio, as atividades inibidoras do crescimento dos compostos de teste na linhagem celular de sarcoma sinovial humano HS-SY-II foram medidas. As células SH-SY-II foram mantidas em um meio DMEM contendo FBS 10%, penicilina e estreptomicina em uma incubadora de CO2 5% (37°C). A cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios (Becton, Dickinson and Company, 353219), 100 μΙ de uma suspensão de células HS-SY-II ajustada para uma concentração de 3 x 10⁴ células/ml com 0 meio de cultura foram adicionados, e as células foram incubadas durante a noite em uma incubadora de CO2 5% (37°C). No dia seguinte, 100 μΙ de Composto (1) ou Halicondrina B na série de diluição de três vezes colocado em suspensão no meio de cultura foram adicionados à cada reservatório, e 0 resultante foi incubado durante 3 dias em uma incubadora de CO2 5% (37°C). Depois, a viabilidade celular foi determinada por CelITiter-GIo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) com EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). O valor dos reservatórios contendo células sem adição dos compostos de teste foi definido como 100% e 0 valor dos reservatórios não contendo nenhuma célula foi definido como 0%. As concentrações dos compostos de teste necessárias para a inibição do crescimento celular em 50% (isto é, um valor de IC50) foram calculadas, e são mostradas na Tabela 17.

Tabela 17

Composto de teste	HS-SY-II (IC₅₀ (nM))
Halicondrina B	0,010
Composto (1)	0,002

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100/101

EQUIVALENTES E ESCOPO [0149] Nas reivindicações, os artigos como um, uma, o e a podem significar um ou mais do que um, a não ser que indicado em contrário ou de outra maneira evidente do contexto. As reivindicações ou descrições que incluem ou entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais do que um ou todos os membros do grupo estiverem presentes, empregados ou, de outra maneira, forem relevantes para um determinado produto ou processo, a menos que indicado ao contrário ou de outra forma evidente a partir do contexto. A invenção inclui modalidades nas quais exatamente um membro do grupo está presente, empregado ou, de outro modo, é relevante para um determinado produto ou processo. A invenção inclui modalidades nas quais mais do que um, ou todos os membros do grupo estão presentes, empregados ou, de outra maneira, são relevantes para um determinado produto ou processo.

[0150] Além disso, a invenção abrange todas as variações, combinações e permutações nas quais uma ou mais limitações, elementos, cláusulas e termos descritivos de uma ou mais das reivindicações listadas são introduzidas em outra reivindicação. Por exemplo, qualquer reivindicação que depende de outra reivindicação pode ser modificada para incluir uma ou mais limitações encontradas em qualquer outra reivindicação que seja dependente da mesma reivindicação de base. Onde os elementos são apresentados como listas, por exemplo, no formato de grupo Markush, cada subgrupo dos elementos também é divulgado, e quaisquer elementos podem ser removidos do grupo. Deverá ficar entendido que, em geral, onde a invenção, ou aspectos da invenção, é/são referidos como compreendendo elementos e/ou características particulares, certas modalidades da invenção ou aspectos da invenção consistem, ou consistem essencialmente, desses elementos e/ou aspectos. Por motivos de simplicidade, essas modalidades não

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101/101 foram especificamente estabelecidas literalmente nesta invenção. Note-se também que os termos compreendendo e contendo destinamse a serem abertos e permitem a inclusão de elementos ou etapas adicionais. Onde as faixas são fornecidas, os parâmetros são incluídos. Além disso, a menos que seja indicado de outra forma ou de outra maneira evidente a partir do contexto e entendimento de uma pessoa de habilidade prática na técnica, os valores que são expressos como faixas podem assumir qualquer valor ou subfaixa específica dentro das faixas mencionadas nas diferentes modalidades da invenção, até o décimo da unidade do limite inferior da faixa, a não ser que o contexto indique claramente de outra maneira.

[0151] Aqueles versados na técnica irão reconhecer ou serão capazes de determinar, utilizando não mais do que experiências de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas aqui descritas. O escopo das presentes modalidades descritas nesta invenção não se destina a ser limitado à Descrição acima, mas de preferência é como apresentado nas reivindicações anexas. Aqueles de habilidade prática na técnica irão observar que várias alterações e modificações a esta descrição podem ser feitas sem se afastar do espírito ou escopo da presente invenção, conforme definido nas seguintes reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto, caracterizado pelo fato de que possui a seguinte estrutura:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 1, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, em um veículo farmaceuticamente aceitável.
3. Composto ou seu sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para uso na inibição do crescimento de um tumor ou câncer destacado por angiogênese, invasão ou metástase.
4. Composto ou seu sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um tumor ou câncer destacado por angiogênese, invasão ou metástase.
5. Composto para uso de acordo com a reivindicação 3 ou

4, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer uterine, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer gástrico, câncer do intestino delgado, câncer de bexiga ou um sarcoma.
6. Composto para uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é o câncer de cabeça e pescoço.

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7. Composto para uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN).
8. Composto para uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o câncer é carcinoma cístico das adenoides.
9. Composto para uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de mama.
10. Composto para uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de mama positivo para HER2.
11. Composto para uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de mama negativo para HER2.
12. Composto para uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de mama triplo negativo.
13. Composto para uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer colorretal.
14. Composto para uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de esôfago.
15. Composto para uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é adenocarcinoma do esôfago.
16. Composto para uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer uterino.
17. Composto para uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de ovário.
18. Composto para uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é um sarcoma.

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19. Composto para uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é sarcoma uterino, fibrossarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma de tecidos moles ou angiosssarcoma.
20. Composto para uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer gástrico.
21. Composto para uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer do intestino delgado.
22. Composto para uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é adenocarcinoma do intestino delgado.
23. Composto para uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de bexiga.
24. Composto para uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer urotelial.
25. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 24, caracterizado pelo fato de que é para uso em combinação com um anticorpo de proteína de Morte Programada 1 (PD-1).
26. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 24, caracterizado pelo fato de que é para uso em combinação com um anticorpo de proteína de Morte Programada L1 (PD-L1).
27. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 24, caracterizado pelo fato de que é para uso em combinação com um anticorpo anti-EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico).
28. Composto para uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-EGFR é um mAb anti-

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EGFR.
29. Composto para uso de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de cabeça e pescoço.
30. Composto para uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN).
31. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 30, caracterizado pelo fato de que o mAb antiEGFR é cetuximab.
32. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 24, caracterizado pelo fato de que é para uso em combinação com um anticorpo de HER2 (receptor do fator de crescimento epidérmico humano).
33. Composto para uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de HER2 é um mAb de HER2.
34. Composto para uso de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama.
35. Composto para uso de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que o mAb de HER2 é trastuzumab.
36. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 24, caracterizado pelo fato de que é para uso em combinação com a terapia de radiação.
37. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 24, caracterizado pelo fato de que é para uso em combinação com a cirurgia.
38. Método para tratamento de um tumor ou câncer destacado pela angiogênese, invasão ou metástase em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo do

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5/8 composto de acordo com a reivindicação 1, ou urn sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, opcionalmente em um veículo farmaceuticamente aceitável.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer uterino, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer gástrico, câncer do intestino delgado, câncer de bexiga ou um sarcoma.
40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de cabeça e pescoço.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN).
42. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o câncer é carcinoma cístico das adenoides.
43. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de mama.
44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de mama positivo para HER2.
45. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de mama negativo para HER2.
46. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de mama triplo negativo.
47. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer colorretal.
48. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de esôfago.

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49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é adenocarcinoma do esôfago.
50. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer uterino.
51. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de ovário.
52. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é um sarcoma.
53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é sarcoma uterino, fibrossarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma de tecidos moles ou angiossarcoma.
54. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer gástrico.
55. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer do intestino delgado.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é o adenocarcinoma do intestino delgado.
57. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer de bexiga.
58. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é câncer urotelial.
59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 58, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o tratamento do indivíduo com um anticorpo da proteína de Morte Programada 1 (PD-1).
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 58, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o tratamento do indivíduo com um anticorpo da proteína de Morte Programada L1 (PD-L1).

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61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 58, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o tratamento do indivíduo com um anticorpo anti-EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico).
62. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-EGFR é um mAb anti-EGFR.
63. Método de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é o câncer de cabeça e pescoço.
64. Método de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o câncer ou tumor é carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN).
65. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 64, caracterizado pelo fato de que o mAb anti-EGFR é cetuximab.
66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 58, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o tratamento do indivíduo com um anticorpo do HER2 (receptor do fator de crescimento epidérmico humano).
67. Método de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o anticorpo do HER2 é um mAb de HER2.
68. Método de acordo com a reivindicação 66 ou 67, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama.
69. Método de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizado pelo fato de que o mAb de HER2 é trastuzumab.
70. Método para tratamento de câncer de mama negativo para HER2 ou carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN) em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo do composto de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.