TWI764960B

TWI764960B - 至少一種甘草屬植物製劑之用途、包括該製劑之解毒劑、及該解毒劑之用途

Info

Publication number: TWI764960B
Application number: TW106142723A
Authority: TW
Inventors: 伊莉莎白梅爾; 芭芭拉諾瓦克; 克莉絲蒂娜舒瓦安迪克斯; 尤蘇拉荷夫斯特舒雅斯; 吉爾德舒哈茲梅爾
Original assignee: 奧地利商艾爾柏有限公司
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2022-05-21
Also published as: RU2019123411A3; RU2747191C2; BR112019013425A2; EP3342416A1; US20200268819A1; RU2019123411A; AU2017389373A1; ZA201904434B; PH12019501512A1; MY196889A; US20210338758A1; CN108245550B; AR110664A1; WO2018121881A1; AU2017389373B2; US11096980B2; TW201827065A; CN108245550A; CA3048280A1; BR112019013425B1

Abstract

本發明係有關使用選自包括整個乾燥甘草屬植物之細粉、乾燥甘草屬植物葉子之細粉、乾燥甘草屬植物根部之細粉、甘草屬植物之水性乾燥萃取物、甘草屬植物之水性/乙醇乾燥萃取物、甘草屬植物之水性萃取物之組群之至少一種甘草屬植物製劑，視需要連同至少一種賦形劑，以降低農業產品中之至少一種多肽真菌毒素的毒性作用之用途。

Description

至少一種甘草屬植物製劑之用途、包括該製劑之解毒劑、及該解毒劑之用途

本發明係有關使用至少一種甘草屬植物萃取物，與供口服施用之解毒劑，於減少至少一種多肽真菌毒素之毒性作用上之用途，及該解毒劑之用途。

自古以來，甘草屬或甘草植物製劑即被作為藥物使用，於傳統中藥中亦被提及為50種基本藥草之一。甘草屬(Glycyrrhiza)係希臘之術語，已敘述此植物根部之主要性質，亦即其味甜，而且，即是根；“glycos”意指甜，“rhize”意指根。於所有種類之甘草屬中，除了傳統中藥原先使用的烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis)以外，光果甘草(Glycyrrhiza glabra)可能係構成最重要之代表性甘草最相關的一種。此外，長久以來，甘草根中所含物質以其抗發炎及黏液溶解作用而知名，甘草根有效決定組成中之主要組成分，最重要的為甘草酸(glycyrrhizic acid)，特別是18-β-甘草酸。甘草酸含量隨著甘草根之處理方式及其來源而不同。因此，取決於其處理方式，可從同一根獲得不同含量的甘草酸。關於甘草根之其他重要組成分，已鑑定出約9%含氮物質、高達3.5%脂肪、少量單寧、高達30%以上澱粉、精油、L-天冬醯胺酸、高達10%苦滷、及約4%樹脂、蘋果酸與草酸。

此外，Liu et al.(Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,2014,39(19),3841,et seq.)針對甘草根之重要成分，甘草酸，研究其對巨噬細胞中有關脂多醣(LPS)誘發的細胞介素表現之影響，發現其具有抗發炎活性。

真菌毒素係由黴菌形成之有毒次級代謝產物；取決於類型及於飼料中之濃度，對於農場動物之體能表現及健康具有負面影響，因其可能引起真菌毒素中毒症。這些負面影響包括體能表現喪失、嘔吐、腹瀉、生育力下降、免疫系統減弱、逐漸形成癌症、與神經系統受損。真菌毒素從而構成健康風險，因此經濟風險至少相當大。

該風險甚至由於黴菌能同時形成不同的真菌毒素與次級代謝物而被增強。因此，多數情形下，高度精確的現代分析方法已於原料中，亦於飼料試樣中，檢測出數種真菌毒素與次級代謝物。Streit et al.,Toxins,2013,5,504,et seq.於超過90%之測試原料與飼料試樣中發現真菌毒素與次級代謝物；每一試樣檢測出7至69種代謝物。由於未詳細研究協同作用的存在，同時發生之非常低濃度之真菌毒素可能已對農場動物具不利影響。

不同種類的黴菌，例如麴菌屬(Aspergillus)、新月形黴菌屬(Fusarium)與青黴菌屬(Penicillium)等，產生對農業有害之真菌毒素(Frisvad et al,Adv.Exp.Med.Biol.,2006,571,3,,et seq.)。於動物營養領域中最廣為人知及最廣泛檢測之黴菌毒素包括黃麴毒素類例如黃麴毒素B1、新月毒素類例如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米稀酮、赭麴毒素A與伏馬鐮孢毒素類例如伏馬鐮孢毒素B1。

迄今，超過500種不同的真菌毒素及其次級代謝物為已知，白殭菌素(beauvericin)(CAS-No：26048-05-5)、恩鐮孢菌素類(enniatins)(CAS-No：11113-62-5)例如恩鐮孢菌素A(CAS-No：2503-13-1)、A1(CAS-No：4530-21-6)、B(CAS-No：917-13-5)、B1(CAS-No：19914-20-6)、B2、B3與制蚜菌素(apicidin)(CAS-No：183506-66-3)為重要代表。於Streit et al.(Toxins,2012,4,788,et seq.)之報告中，89%之試樣發現白殭菌素，96%發現不同恩鐮孢菌素類，66%發現制蚜菌素；分別可於37%、68%與76%經測試之食物試樣(n=4251)、飼料試樣(n=3640)及141個各種未加工穀類試樣(n=2647)中檢測出恩鐮孢菌素類，而分別於20%、21%及54%經測試之食物試樣(n=732)、飼料試樣(n=861)及198個各種未加工穀類試樣(n=554)中檢測出白殭菌素。所有試樣係於2000至2013年期間在歐洲收集(EFSA Journal,2014,12,3802)。

恩鐮孢菌素類(ENNs)、白殭菌素(BEA)與制蚜菌素(API)由於彼等之合成類型而可歸為一類；彼等係經由胜肽生合成形成且共享一多肽結構。恩鐮孢菌素類與白殭菌素顯示對稱結構，並包含具有交替的酯鍵與醯胺鍵之三個肽鍵。制蚜菌素之結構不對稱，包含為醯胺鍵之四個肽鍵。下文中，恩鐮孢菌素類、白殭菌素與制蚜菌素大多稱為“多肽真菌毒素”，為真菌毒素之子群。於例如人類和動物病患中由多肽真菌毒素引起的失調與疾病於本文中稱為“多肽真菌毒素中毒症”。對照之下，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與黃麴毒素B1係經由完全不同的途徑，即經由異丁基生合成而製備，具有聚異戊二烯結構。

由恩鐮孢菌素類、白殭菌素與制蚜菌素引起之多肽真菌毒素中毒症：活體外分析已知恩鐮孢菌素類對哺乳動物細胞株展現細胞毒性作用。於大鼠空腸、肝臟與脂肪組織中可檢測出高恩鐮孢菌素含量，由此可推斷最高吸收作用發生於空腸或小腸。McKee et al.(J.Nat.Prod,1997,60,431,et seq.)之研究證明高劑量之恩鐮孢菌素類使測試小鼠致死，甚至低劑量也導致體重下降。

白殭菌素至少於家禽中與心臟重量增加相關連。於活體外分析中，低濃度白殭菌素已引起毒性作用。

Park et al.(Appl.Environ.Microbiol.,1999,86,126,et seq.)證實，制蚜菌素為環狀組蛋白去乙醯酶抑制劑，於大鼠中具毒性作用，明顯可見體重減輕、腹部、小腸與膀胱出血，隨後死亡。此外，於哺乳動物細胞株中可檢測出抗增殖與細胞毒性作用。

於農場動物，特別是豬與家禽中，多肽真菌毒素中毒症之一般症狀包括食慾不振及腹瀉，對效能參數例如活體重、飼料轉換率、或蛋重具負面影響。

避開有害毒素，即真菌毒素與多肽真菌毒素二者之第一步為施行適當之農業實作及農業產品良好之貯存狀況。然而，飼料試樣分析已顯示這些措施並不充足。因此，已使用飼料添加物以保護動物免受真菌毒素對其健康與體能表現之不利影響；該等添加物包含不同組成分。

高效率之飼料添加物已應用於飼料被黃麴毒素類、玉米稀酮類、新月毒素類、赭麴毒素A與伏馬鐮孢毒素類真菌毒素污染之情況。然而，作用於多肽真菌毒素：白殭菌素、恩鐮孢菌素類及/或制蚜菌素之飼料添加物迄今尚為未知。

因此，盡可能減少食物與飼料中之多肽真菌毒素含量為實質上之需求，經由使用吸收或降解或使此類多肽真菌毒素無害之飼料添加物及/或物質或物質組群，盡可能抑制其中所含之任何多肽真菌毒素。

為了解決此目的，乃根據本發明使用選自包括整個甘草屬植物或甘草屬植物根部之細粉、水性萃取物、水性/乙醇萃取物、水性乾燥萃取物與水性/乙醇乾燥萃取物之組群之至少一種甘草屬植物製劑，視需要連同至少一種賦形劑，以於農業產品中減少至少一種多肽真菌毒素之毒性作用。令人驚奇地發現，於使用選自包括整個甘草屬植物或甘草屬植物根部之細粉、水性萃取物、水性/ 乙醇萃取物、水性乾燥萃取物與水性/乙醇乾燥萃取物之組群之甘草屬植物製劑時，可能抑制農業產品中多肽真菌毒素之毒性作用至對消費該物質之受試者，特別是人類或動物，不再存在危害或，特別是，實質上減少之程度。

若使用包括光果甘草與烏拉爾甘草之組群之甘草屬植物，則可達到選自恩鐮孢菌素類、制蚜菌素或白殭菌素組群之至少一種多肽真菌毒素毒性作用幾乎完全，特別是實質上之減少。

於使用甘草屬植物之水性乾燥萃取物，特別是得自含有介於4%(w/w)與10%(w/w)間，尤其是7%(w/w)甘草酸之光果甘草植物根部時，儘管已知甘草酸本身不顯示任何活性，惟令人驚奇地甚至能進一步達成降低特定多肽真菌毒素，即白殭菌素、恩鐮孢菌素類以及制蚜菌素之作用，因此甘草酸之使用量即被視為係活性組成分之等效計量。經由使用根據本發明之至少一種甘草屬植物製劑，已可能，特別是，完全消除選自恩鐮孢菌素類，尤其是恩鐮孢菌素A、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B與恩鐮孢菌素B1、白殭菌素與制蚜菌素組群之至少一種特定多肽真菌毒素之毒性作用，或將其降低至預期對動物或甚至人類生物無有害作用之程度。

若與本發明之進一步開發一致地，每噸農業產品，特別是飼料或食物產品，使用至少1g，較佳為1g至100g，用於肉雞特佳方式為7g至50g，用於蛋雞特佳方式為5g至30g，及用於小豬，尤其是育種仔豬，特佳方式為5g至30g之水性乾燥萃取物，特別是得自具有介於4%(w/w)與10%(w/w)間，尤其是7%(w/w)甘草酸之光果甘草植物根部，或等效量之根據本發明之一種其他甘草屬植物製劑，則甘草屬植物製劑之確切劑量，並由此保證大量徹底降低多肽真菌毒素，即恩鐮孢菌素類、制蚜菌素與白殭菌素之毒性作用是可能的。

等效性係指甘草屬植物製劑所含植物性物料或物質之濃度。悉知特性又容易定量之物質為於甘草屬植物根部中找到之甘草酸。甘草屬植物製劑中之甘草酸部分可為植物性製劑或活性物質總體濃度之指標。

由甘草屬植物製劑之等效量，理解該等量係等於甘草酸之總量。因此，舉例而言，含4%(w/w)甘草酸之100g乾燥萃取物，與含8%(w/w)甘草酸之50g乾燥萃取物等效。舉例而言，若每噸飼料使用含10%(w/w)甘草酸之50g水性乾燥萃取物，則施用100g另一甘草屬植物製劑，特別是含5%(w/w)甘草酸之另一水性乾燥萃取物，將與其等效。

根據本發明之甘草屬植物製劑或甘草屬解毒劑或解毒劑之有效性，特別是對於罹患多肽真菌毒素中毒症農場動物之效能參數上之正向作用，隨著所用甘草屬植物製劑或甘草屬解毒劑或解毒劑的量之增加而增強。食物或飼料產品中之多肽真菌毒素濃度為34ppb恩鐮孢菌素A、40ppb恩鐮孢菌素A1、510ppb恩鐮孢菌素B、392ppb恩鐮孢菌素B1、4ppb恩鐮孢菌素B2、0.34ppb恩鐮孢菌素B3、717ppb白殭菌素與122ppb制蚜菌素時，對效能參數有明顯之正向作用，尤其是重量與產蛋率之增加，因此甘草屬植物製劑或甘草屬解毒劑或解毒劑對多肽真菌毒素中毒症之良好有效性是可認可的。甘草屬植物製劑或甘草屬解毒劑或解毒劑之最適使用量經常與多肽真菌毒素之濃度相關。食物或飼料中之多肽真菌毒素越多，所需甘草屬植物製劑或甘草屬解毒劑或解毒劑之量就越大。

若使用該等甘草屬植物製劑，則可使被至少一種多肽真菌毒素污染且為選自由含有或選自包括穀類、玉米、稻米、大豆與其他豆科植物、菜籽、禾草、藥草之組群之至少一種產品組成之食物或飼料之農業產品得到特別良好的結果。

其中，與本發明之進一步開發一致地，使用甘草屬植物製劑，例如使進一步包含之賦形劑係選自包括惰性載劑；維生素；礦物質；植物性物質；解毒黴菌毒素之酵素與其他成分，例如黴菌毒素分解酵素，特別是黃麴毒素氧化酶、麥角胺水解酶、麥角胺醯胺酶、玉米稀酮酯酶、玉米稀酮內酯酶、玉米稀酮水解酶、赭麴毒素醯胺酶、伏馬鐮孢毒素胺基轉移酶、伏馬鐮孢毒素羧基轉移酶、胺基多醇胺基轉移酶、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇環氧化物水解酶、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇去氫酶、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇氧化酶、新月毒素去氫酶、新月毒素氧化酶；與黴菌毒素轉化微生物例如DSM 11798；及黴菌毒素結合物質，例如微生物細胞壁或無機材料例如膨土之組群；除了恩鐮孢菌素類、白殭菌素與制蚜菌素等多肽真菌毒素外，亦可能使部分甚至大量發生之另外多肽真菌毒素降解或使其無害。

除了使用甘草屬植物製劑降低食物或飼料中多肽真菌毒素之毒性作用之外，對於抵消此類多肽真菌毒素在可能攝取後之不良作用之產品也有需求。

為了解決此目的，本發明進一步之目的係用於降低至少一種多肽真菌毒素毒性作用之口服施用解毒劑，其包含至少一種甘草屬植物製劑及視需要連同至少一種賦形劑。至少一種甘草屬植物製劑及視需要連同至少一種另外賦形劑作為解毒劑之口服施用，能夠中和或抑制或預防同時攝取之多肽真菌毒素之不良作用。

為得到該解毒劑之特別有效作用，與本發明之進一步開發一致地，該至少一種多肽真菌毒素可選自恩鐮孢菌素類，特別是恩鐮孢菌素A、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B與恩鐮孢菌素B1、恩鐮孢菌素B2或恩鐮孢菌素B3；白殭菌素與制蚜菌素之組群。此特別具重要意義，因為恩鐮孢菌素類，例如，已被證明與蛋白質互相作用及，例如，於大鼠肝臟微粒體中抑制膽固醇醯基轉移酶。此外，已發現高達76%之選自穀類、玉米或稻米之所有未加工穀粒中含有恩鐮孢菌素類，而具有大部分由多肽真菌毒素施加之不良作用。亦檢測白殭菌素類於小鼠與家禽中之毒性作用，發現白殭菌素能累積於家禽之蛋中。攝入遭污染之飼料通常導致家禽蛋重下降，尤其是蛋雞產蛋率之下降，及農場動物飼料轉換率之增加。於高達54%之未經處理穀粒中，亦檢測出白殭菌素。

如果，與本發明之進一步開發一致地，該甘草屬植物製劑係選自整個甘草屬植物或甘草屬植物根之細粉、水性萃取物、水性/乙醇萃取物、水性乾燥萃取物與水性/乙醇乾燥萃取物之組群，視需要連同至少一種賦形劑，則該解毒劑可提供特別有利之作用。於此情形下，可將其與可能受污染之食物或飼料產品一起攝入，以立即預防對生物之任何有害作用。

若該甘草屬植物係選自包括光果甘草與烏拉爾甘草之組群，則解毒劑將展現格外有利，特別是一致之良好活性。

其中，與本發明之進一步開發一致地，使用含4%(w/w)至10%(w/w)，特別是7%(w/w)之甘草酸之水性乾燥萃取物，可使食物或飼料產品所含多肽真菌毒素於消化分解後完全無害，其中亦可預防從文獻中已知之甘草酸之不良作用，即如高血壓或水腫等症狀。

根據本發明之進一步開發，較佳為進行以使每噸農業產品，特別是飼料或食物產品，使用至少1g，較佳為1g至100g，特佳方式為7g至50g，用於蛋雞特佳方式為5g至40g，及用於小豬，尤其是育種仔豬，特佳方式為5g至30g，或等效量之具7%(w/w)甘草酸濃度之水性乾燥萃取物。經由此類應用，已使食物或飼料產品中之恩鐮孢菌素、白殭菌素與制蚜菌素等多肽真菌毒素幾乎完全無害，從而安全地預防或甚至防範例如人類與動物之中毒症狀等不良作用之發生。

其中，與本發明之進一步開發一致地，進一步設計該解毒劑，俾使含有50%(w/w)以上，較佳為90%(w/w)以上，尤其是100%(w/w)以上之至少一種甘草屬植物製劑，使得使用甘草屬植物製劑組成分之協同作用成為可能。如此作法，令人驚奇地發現，甘草屬植物製劑最悉知之成分，即甘草酸本身，並未展現對抗多肽真菌毒素之任何活性。因此，根據本發明之甘草屬植物製劑對抗多肽真菌毒素之正向作用係基於尚未詳細了解之甘草根其他組成分，或在活性方面未詳細了解之甘草根組成分，惟仍提供期望之作用，特別是預防多肽真菌毒素之不利影響。

其中進一步開發該解毒劑，俾使該至少一賦形劑係選自包括惰性載劑；維生素；礦物質；植物性物質；解毒黴菌毒素之酵素與進一步成分，例如黴菌毒素分解酵素，特別是黃麴毒素氧化酶、麥角胺水解酶、麥角胺醯胺酶、玉米稀酮酯酶、玉米稀酮內酯酶、玉米稀酮水解酶、赭麴毒素醯胺酶、伏馬鐮孢毒素胺基轉移酶、伏馬鐮孢毒素羧基轉移酶、胺基多醇胺基轉移酶、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇環氧化物水解酶、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇去氫酶、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇氧化酶、新月毒素去氫酶、新月毒素氧化酶；與黴菌毒素轉化微生物例如DSM 11798；及黴菌毒素結合物質，例如微生物細胞壁或無機材料例如膨土之組群；將正向作用擴大至進一步潛在有害之物質，例如得自伏馬鐮孢毒素、黃麴毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、新月毒素或赭麴毒素組群之黴菌毒素已成為可能。

於此方面，較佳為繼續進行，俾使該解毒劑用於製備預防或治療多肽真菌毒素中毒症之製劑。特別是，此類製劑可用於預防及治療由選自恩鐮孢菌素類，特別是恩鐮孢菌素A、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B1、恩鐮孢菌素B2或恩鐮孢菌素B3與白殭菌素及制蚜菌素組群之多肽真菌毒素引起之多肽真菌毒素中毒症。如此作法，特別可預防或治療多肽真菌毒素之有害作用，而不會同時牽涉由甘草酸引起之例如高血壓等任何不利作用。

本發明進一步目的在於利用口服施用有效量之甘草屬解毒劑於受試者，以提供急性治療罹患多肽真菌毒素中毒症之受試者及/或預防性治療受試者以防止多肽真菌毒素中毒之方法。經由使用甘草屬解毒劑此類方法以治療或預防特別是由恩鐮孢菌素類例如恩鐮孢菌素A、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B1、恩鐮孢菌素B2或恩鐮孢菌素B3、白殭菌素與制蚜菌素引起之多肽真菌毒素中毒症已成為可能，此等毒素係廣泛分佈然而迄今仍未充分研究。

受試者擬被理解為人類與動物，惟特別是農場動物，較佳為豬與家禽，例如肉雞或蛋雞、火雞、牛或小牛。

首先，多肽真菌毒素中毒症均可能由於被污染的飼料或食物產品，即被多肽真菌毒素污染者而引起，低至約500ppb之多肽真菌毒素量已顯示毒性作用。多肽真菌毒素中毒症，特別是於家畜中，在本文中界定為係由多肽真菌毒素觸發並導致至少一種效能參數相對於正對照組劣化至少4%，較佳為10%之疾病。

對於肉雞，多肽真菌毒素中毒症之明顯外部症狀，特別是效能參數之劣化，發生於至少得自約5000ppb，特別是4986.34ppb之多肽真菌毒素總濃度。

對於蛋雞，多肽真菌毒素中毒症之明顯外部症狀，特別是效能參數之劣化，發生於至少得自約2000ppb，特別是1985ppb之多肽真菌毒素總濃度。

於豬中，特別是育種仔豬，多肽真菌毒素中毒症之明顯外部症狀，特別是效能參數之劣化，發生於至少得自約7000ppb，特別是7183.6ppb之多肽真菌毒素總濃度。

可使用任何上述解毒劑或甘草屬植物製劑作為用於治療及/或預防多肽真菌毒素中毒症之甘草屬解毒劑，以得自光果甘草根之水性乾燥萃取物較佳。

甘草屬解毒劑之有效量為被污染飼料或食物中所含多肽真菌毒素量之函數，亦可能取決於相關之受試者。每公斤飼料或食物中得自具7%(w/w)甘草酸濃度甘草根之100%水性乾燥萃取物形式之甘草屬解毒劑之有效量約為：- 對肉雞而言，至少1mg，1mg至100mg，較佳為7mg至50mg； - 對蛋雞而言，至少1mg，1mg至100mg，較佳為5mg至40mg；- 對豬，特別是育種仔豬而言，至少1mg，1mg至100mg，較佳為5mg至40mg。

熟習之技術人員將明瞭，得自具7%(w/w)甘草酸濃度之甘草根之100%水性乾燥萃取物，可用本文所述之任何其他甘草屬解毒劑替換，只要後者係以等效量使用。

此有效量足以使多肽真菌毒素之毒性活性幾乎完全無效，從而幾乎消除多肽真菌毒素對受試者健康及其體能表現參數之不良作用。

下文中，將經由例示具體實例更詳細地說明本發明。

實施例1：甘草屬植物製劑之製備

下述測試與實施例中，係使用含有7%(w/w)甘草酸與0.003%(w/w)甘草次酸(glycyrrhetinic acid)為終產物之噴霧乾燥萃取物作為甘草屬植物製劑。如熟習技術人士所知，甘草酸與甘草次酸之含量可隨著起始物料與程序操作而變化。具甘草酸與甘草次酸偏差濃度之此類甘草屬植物製劑亦為本發明所涵蓋，其施用量必須適應於植物性成分含量，以期確保根據甘草酸含量分別使用之等效量。

為了生產此萃取物，進行如下操作：將3至4年生光果甘草根收穫後，先使其碎裂然後用水研磨成細漿，煮沸該漿並濃縮數小時，特別是3小時。過濾萃取物並使其沉降後，減壓下利用水蒸氣提取進一步萃取。如此，形成天然濃縮汁液，接著於不停攪拌下進一步煮沸，甚至進一步濃縮而得到水性甘草屬萃取物。

於進一步之處理與乾燥步驟中，將該水性甘草屬萃取物噴霧乾燥。此高速蒸發技術係根據小液滴在回火之惰性乾燥氣體中之乾燥。此過程中，液體調配物被霧化成細微液滴並均勻地分佈於噴霧塔之乾燥空氣中；此導致液體整體表面積增加，使產品能於短時間內乾燥。終產物為顆粒大小相當均一之乾燥、自由流動性粉末，即甘草屬乾燥萃取物。然後，產品經定性評估，即可被受試者口服攝取而再溶解，或用於進行額外測試(Karasaaslaan und Dalgici,J.Food Sci.Technol.,2014,51(11),3014 et seq.；Bauer et al.,Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie,2012,ISBN 978-3-8047-2552-2)。

實施例2：甘草屬乾燥萃取物對抗多肽真菌毒素之活體外保護作用

為了測試在控制條件下多肽真菌毒素對上皮組織之相關性，乃進行活體外研究。其中，採用根據細胞培養及見述於文獻中之悉知特性之測試系統。關於飼料添加物，以得自討論中各器官之上皮細胞較佳，例如於本案之情況以得自豬腸之IPEC-J2細胞。所用得自豬腸之上皮細胞提供非轉型細胞之優點，仍具有正常腸細胞之所有重要特性與廣泛生理相似性，例如形成對腸屏障尤其必要之具活力之緊密連接蛋白，以及例如P-醣蛋白、細胞色素P450 3A4、維生素B 12轉運蛋白等特有酵素與轉運系統之表現。

此類活體外測試系統構成用於預測活體內結果之重要且被認可之方法，甚至可以放棄生體可利用率研究。Caco-2細胞，一種在許多方面非常類似IPEC-J2細胞之人類細胞株，已於1980年代末發表，用於研究醫藥物質之轉運。後來，發現從細胞單層得到的滲透性數據與口服吸收速率間之良好關聯；而為此模式找到進入製藥工業途徑之原由。再者，美國許可機構，FDA，對此發佈一項指令，為所謂生物藥劑學分類系統(BCS)提供背景，經由驗證之細胞培養系統確定腸滲透性。根據此類活體外數據，於特定情況下放棄生體可利用率研究是可能的。

為了甘草屬乾燥萃取物之活體外檢驗，乃將其再萃取一次，因而產生二次甘草屬萃取物。二次甘草屬萃取物之製備如下：將1g甘草屬乾燥萃取物與9ml 70%乙醇各自稱重，混合，於室溫下以700rpm震動1小時。然後，將溶液離心，使用0.2μm過濾器無菌過濾液體上清液，進一步以IPEC-J2培養液稀釋。以下述濃度活體外測試二次甘草屬萃取物：於測試調配物中每毫升培養液含250μg、500μg與1,000μg甘草屬乾燥萃取物，下文中亦稱為250、500與1,000μg/ml二次甘草屬萃取物。

乙醇萃取物比純水性萃取物能溶解更多組成分，因此更接近活體內之情況，其中由於口腔胃腸道中之酸性或鹼性條件及各種酵素，亦比由純水性萃取有更多之組成分溶解，此事實為以70%乙醇製備二次萃取物供活體外分析之關鍵原因。

於文獻中，甘草酸被認為是甘草根之植物性主要成分之一。所製備二次甘草屬萃取物中甘草酸與甘草次酸之濃度係使用LC-MS/MS(Agilent 1290 Infinity與Sciex 5500 QTrap)測定。欲達此目的，乃使用Kinetex Biphenyl管柱(100x3mm)將此等萃取物各自分離。甘草次酸之多重反應監測(MRM)為471/105與471/119Da，甘草酸為823/453與823/647Da。由於甘草酸與甘草次酸之良好溶解性，可預期於水性乾燥萃取物中所含總量亦溶解於二次萃取物中。所製備之甘草屬乾燥萃取物含有7%(w/w)甘草酸與0.03%(w/w)甘草次酸。

劑型在活體內之有效性經常是該物質生體可利用率之函數，因此亦為生物動力學過程之函數，惟此通常不適用於活體外實驗。基於此因，活體外實驗時經常使用較高濃度俾使能觀察到如活體內之相同作用(Gülden and Seibert,ALTEX 22,Special Issue 2,2005)。於本活體外分析中，係使用每毫升培養液中250μg、500μg與1,000μg甘草屬乾燥萃取物之濃度，相當於每噸飼料或食物約250g至1kg甘草屬乾燥萃取物之活體內濃度；比活體內測試中使用之5g/t至30g/t多33至50倍(參見實施例3至5)。

以適應形式使用Geens與Niewold所述之TEER技術(Cytotechnology,2011,63,415 et seq.)。於此活體外模式中，將豬腸上皮細胞(IPEC-J2,DSMZ No.：ACC 701,Passage 1-15)培養於可滲透聚酯膜(表面積1.12cm²，孔徑0.4μm，膜直徑12mm)上之嵌入體(insert)中，並於39℃與5% CO₂之培養箱中分化8天。每個嵌入體，施加含1x10^{^5}個細胞之0.5ml培養液至各自之膜上。於上述分化期間，每隔一天吸出用過之培養液並以新鮮培養液替換。將嵌入體固定於12槽細胞培養盤中，細胞係從下方(底側面隔室)供應1.5ml培養液及從上方(頂端隔室)供應0.5ml培養液。此等隔室反映腸部分(頂端“A”)與血液部分(底側面“B”)。培養液為以1% IST、2.5mM Glutamax、16mM Hepes、6ng/ml EGF、5%胎牛血清與100IU/ml青黴素及100μg/ml鏈黴素加強之DMEM/Ham’s F12(1：1)培養液。

經分化之細胞形成細胞屏障，經由緊密連接蛋白牢固地互相連接。此外，此等細胞以如於豬腸中一樣之極性化方式定向，且可用為代表性模式。由於該腸屏障構成消化道對抗病原體與毒素之第一道防線，所以對健康很重要的是要保持完好無損。利用伏特歐姆計測量細胞屏障之完整性：兩個隔室間之電阻稱為TEER(跨上皮電阻)值，以kOhm x cm²表示。每次測量之前，必須將伏特歐姆計設置於“電源(power)”與“R”。然後將較長電極引入底側面隔室，並將較短電極引入頂端隔室中。此過程中，不可觸碰到細胞層。

以培養液將濃度100mg/ml之二次甘草屬萃取物稀釋至所需濃度(250μg/ml、500βg/ml或1,000μg/ml)。吸出頂端隔室中使用過之培養液並補充250ml毒素與250μl甘草萃取物(二者皆於培養液中濃縮兩次)，然後繼續於39℃與5% CO₂下培育72小時。24h、48h與72h後，進行TEER測量。所有測量至少進行三重複，從中取平均值用於進一步計算。

從第8天至第11天，未處理細胞(細胞對照)之TEER值固定不變，於第8天添加濃度250μg/ml、500μg/ml或1,000μg/ml之二次甘草屬萃取物(甘草屬對照)之後，TEER值也同樣固定不變。

然而，於第8天添加不同濃度(0.2-10μM) 之白殭菌素、恩鐮孢菌素類與制蚜菌素等多肽真菌毒素(負對照)，由於毒素損壞腸屏障，TEER值下降。

濃度0.438μM之制蚜菌素、5μM之恩鐮孢菌素A、B、B1、白殭菌素、及10μM之恩鐮孢菌素A1等多肽真菌毒素，各自與濃度250μg/ml、500μg/ml或1,000μg/ml之二次甘草屬萃取物一起同時添加，相較於各自之負對照時，顯示TEER值顯著更小或無減小。因此二次甘草屬萃取物之添加可抵消多肽真菌毒素之負面影響(參見表2)。二次甘草屬萃取物相對於多肽真菌毒素之保護作用係根據下式進行計算：保護作用(%)=[TEER平均值(毒素+萃取物)/TEER平均值(毒素)x 100]-100

例如，就1,000μg/ml二次甘草屬萃取物培育之恩鐮孢菌素A[5μM]而言，24小時之後：恩鐮孢菌素A之TEER平均值：3.928kOhm x cm²

恩鐮孢菌素A+二次甘草屬萃取物之TEER平均值：6.451kOhm x cm²

保護作用：[(6.451kOhm x cm²/3.928kOhm x cm²)x 100]-100=64.2%

於第11天之最後TEER測量後，進行細胞毒性檢測(中性紅測試)以排除所測試毒素與甘草萃取物濃度之細胞毒性作用。該等測試僅於細胞存活率99%以上之非細胞毒性濃度範圍內進行。

可看到二次甘草屬萃取物對抗恩鐮孢菌素A([1,000μg/ml]於24h與48h、[500μg/ml]於72h)及A1([1,000μg/ml]於48h與72h)之最強保護作用。就所有毒素，均可觀察到二次甘草屬萃取物之濃度依賴性增進。亦觀察到對抗恩鐮孢菌素B與B1之良好作用，尤其，最高濃度(1,000μg/ml)之甘草屬萃取物對TEER值具有正向衝擊。於500μg/ml與1,000μg/ml二次甘草屬萃取物，觀察到對抗白殭菌素與制蚜菌素之正向作用。

甘草酸之效力

為了研究甘草酸對抗恩鐮孢菌素A、A1、B、B1與白殭菌素及制蚜菌素之可能影響，乃於如上所述之TEER測試中，以濃度70μg/ml之甘草酸(相當於1,000μg/ml二次甘草屬萃取物)代替二次甘草屬萃取物進行測試。然而，未能顯示相對於負對照之正向作用。此出人意外地明確指示，甘草屬植物製劑之正向作用並非依賴甘草屬植物最悉知之植物性藥劑甘草酸。

結合分析

為了更了解甘草屬植物製劑之正向或保護作用之機制，乃進行水性甘草屬乾燥萃取物與多肽真菌毒素之結合分析。

欲達此目的，乃將1,000ml緩衝液(1.36g三水合乙酸鈉與0.79g乙酸鈣，pH=8.0)與100g飼料基質[由50%(w/w)小麥、10%(w/w)小麥麩皮、20%(w/w)黃豆、10%(w/w)大麥、10%(w/w)礦物質組成之仔豬飼料]一起預培育(於4℃，24小時)，俾使最小化疏水性毒素對玻璃之吸附作用。其後，離心去除固體，將澄清液轉移至各個50ml玻璃槽中。針對此50ml，各自添加具有7%(w/w)甘草酸之水性甘草屬乾燥萃取物，俾使結合分析調配物中萃取物之濃度各自相當於3mg/l與3g/l。其後，添加毒素，恩鐮孢菌素A、A1、B、B1與白殭菌素及制蚜菌素，俾使結合分析中之濃度各自相當於100ppb。接著，於37℃不停攪拌下，培育該等結合分析調配物24小時。於開始及24小時後採取試樣，如上所述，利用LC-MS/MS分析恩鐮孢菌素A、A1、B、B1與白殭菌素及制蚜菌素。於所測試之任何萃取物濃度(3g/l或3mg/l)下，未測量出毒素濃度之下降。因此，排除甘草屬植物製劑之正向、保護作用係經由該等成分之毒素吸附或吸收或由甘草屬植物製劑之溶解物質所引起。

實施例3：肉雞之飼養試驗

為了評估甘草屬植物製劑於家禽中對抗多肽真菌毒素之作用，乃使用甘草屬解毒劑作為飼料添加物進行肉雞飼養試驗。該甘草屬解毒劑包含得自甘草植物根之具甘草酸濃度7%(w/w)之100%水性甘草屬乾燥萃取物。如實施例1中所述，製備水性甘草屬乾燥萃取物。

欲達此目的，乃將800隻起始重量40g之羅氏(Ross)肉雞分配成四個試驗組，各組10間，每間20隻雞；任意給予飼料。

正對照組接受常規雞飼料[階段1，第0至14天：玉米58%、黃豆HP 31.25%、BR預拌料5%、通用飼料(universal)6.25%、美佳脂(megafat)1.25%、黃豆油 2.50%、胺基酸0.50%、磷酸一鈣0.25%；階段2，第15至35天：玉米6%、黃豆HP 29.35%、BR預拌料5%、通用飼料6.0%、美佳脂2.50%、黃豆油2.00%、胺基酸0.15%]。

負對照組接受與正對照組相同配方之雞飼料，然而具多肽真菌毒素污染。多肽真菌毒素之總污染為4986.34ppb，最終之雞飼料包含白殭菌素1197ppb與恩鐮孢菌素類2763.34ppb(ENN A 34ppb、ENN A1 175ppb、ENN B 1700ppb、ENN B1 803ppb、ENN B2 51ppb、ENN B3 0.34)及制蚜菌素1026ppb。黃麴毒素與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇之天然污染各<1ppb，因此可以忽略。

兩個試驗組接受和負對照組相同之具多肽真菌毒素污染之飼料，此外，甘草屬解毒劑之摻和比例係每噸飼料7g(試驗組1)與50g(試驗組2)。試驗期35天，動物於第0天與第35天稱重。

活體重與飼料轉換率等效能參數示於表4與表5。相較於正對照組，負對照組動物罹患多肽真菌毒素中毒症，導致液體糞便與活體重顯著下降(劣化11.4%)及飼料轉換率劣化(劣化4.9%)。於兩個試驗組中，給予甘草屬解毒劑導使該等多肽真菌毒素之毒性作用下降，因此多肽真菌毒素中毒症更不明顯或不再出現，因而相對於負對照組，於兩種摻和比例下，肉雞之活體重與飼料轉換率皆顯著增進。

因此，根據本發明之甘草屬解毒劑或甘草屬植物製劑可於農業產品中用於降低至少一種多肽真菌毒素之毒性作用，及用於增強遭多肽真菌毒素污染飼料之農場動物，特別是肉雞之活體重與飼料轉換率等效能參數，亦可用於治療與預防多肽真菌毒素中毒症。

實施例4：蛋雞之飼養試驗

為了評估甘草屬植物製劑於家禽中對抗多肽真菌毒素之作用，乃使用甘草屬解毒劑作為飼料添加物進行蛋雞飼養試驗。該甘草屬解毒劑包含得自甘草植物根之具甘草酸濃度7%(w/w)之100%水性甘草屬乾燥萃取物。如實施例1中所述，製備水性甘草屬乾燥萃取物。

欲達此目的，乃將160隻羅曼褐(Lohmann Brown)蛋雞分配成四個試驗組，各組10間，每間4隻母雞；任意給予飼料。於22週齡開始試驗。

正對照組接受常規蛋雞飼料(小麥32.1%、玉米30.00%、黃豆HP 25.00%、碳酸鈣8.60%、蛋雞預拌料2.00%、菜籽油1.90%、Biotronic SE forte 0.40%)(Biotronic為Erber Aktiengesellschaft之商標)。

負對照組接受與正對照組相同配方之蛋雞飼料，然而具多肽真菌毒素污染。多肽真菌毒素之總污染為1985ppb，最終之蛋雞飼料包含白殭菌素835ppb與恩鐮孢菌素類1028ppb(ENN A 35ppb、ENN A1 76ppb、ENN B 510ppb、ENN B1 392ppb、ENN B2 15ppb)及制蚜菌素122ppb。黃麴毒素與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇之天然污染各<1ppb，因此可以忽略。

兩個試驗組接受和負對照組相同之具多肽真菌毒素污染之飼料，此外，甘草屬解毒劑之摻和比例係每噸飼料5g(試驗組1)與40g(試驗組2)。試驗期14天。

於試驗期間測定之產蛋率(每天產蛋之母雞百分比)、平均蛋重與飼料轉換率等效能參數如表6所示。負對照組動物罹患多肽真菌毒素中毒症，導致液體糞便及特別是效能參數之顯著劣化(產蛋率：劣化6.1%；蛋重：劣化3.6%；飼料轉換率：劣化7.1%)。於兩個試驗組中，給予甘草屬解毒劑導使該等多肽真菌毒素之毒性作用下降，因此多肽真菌毒素中毒症更不明顯或不再出現，因而相對於負對照組，於兩種摻和比例下，效能參數皆顯著增進。

因此，根據本發明之甘草屬解毒劑或甘草屬植物製劑可於農業產品中用於降低至少一種多肽真菌毒素之毒性作用，及用於增強遭多肽真菌毒素污染飼料之農場動物，特別是蛋雞之產蛋率、平均蛋重與飼料轉換率等效能參數，亦可用於治療與預防多肽真菌毒素中毒症。

實施例5：育種仔豬之飼養試驗

為了評估甘草屬植物製劑於小豬中對抗多肽真菌毒素之作用，乃使用甘草屬解毒劑作為飼料添加物進行育種仔豬飼養試驗。該甘草屬解毒劑包含得自甘草植物根之具甘草酸濃度7%(w/w)之100%水性甘草屬乾燥萃取物。如實施例1中所述，製備水性甘草屬乾燥萃取物。

欲達此目的，乃將120隻育種仔豬分配成四個試驗組，各組10欄，每欄3隻仔豬；任意給予飼料。使用7.7kg重，4週齡之仔豬開始試驗。

正對照組接受常規育種仔豬(階段1，第1至14天：玉米32.00%、大麥34.90%、蛋白質預拌料23%、葵花油1.00%、葡萄糖4.00%、乳糖3.00%、仔豬預拌料2.1%；階段2，第15至56天：玉米41.00%、大麥35.00%、黃豆HP 20.00%、葵花油0.50%、仔豬預拌料3.5%)。

負對照組接受與正對照組相同配方之育種仔豬飼料，然而具多肽真菌毒素污染。多肽真菌毒素之總污染為7183.6ppb，最終之育種仔豬飼料包含白殭菌素717ppb與恩鐮孢菌素類4733.6ppb(ENN A 86ppb、ENN A1 40ppb、ENN B 1492ppb、ENN B1 3111ppb、ENN B2 4ppb、ENN B3 0.6ppb)及制蚜菌素1732ppb。黃麴毒素與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇之天然污染各<1ppb，因此可以忽略。

兩個試驗組接受和負對照組相同之具多肽真菌毒素污染之飼料，此外，甘草屬解毒劑之摻和比例係每噸飼料5g(試驗組1)與30g(試驗組2)。試驗期56天。

於試驗期結束時，測定活體重與飼料轉換率等效能參數，並示於表7。負對照組動物罹患多肽真菌毒素中毒症，導致食慾不振、腹瀉及特別是效能參數之顯著劣化(活體重：劣化17.1%；飼料轉換率：劣化6.4%)。於兩個試驗組中，給予甘草屬解毒劑導使該等多肽真菌毒素之毒性作用下降，因此多肽真菌毒素中毒症更不明顯或不再出現，因而相對於負對照組，於兩種摻和比例下，效能參數皆顯著增進。

因此，根據本發明之甘草屬解毒劑或甘草屬植物製劑可於農業產品中用於降低至少一種多肽真菌毒素之毒性作用，及用於增強遭多肽真菌毒素污染飼料之農場動物，特別是豬之活體重與飼料轉換率等效能參數，亦可用於治療與預防多肽真菌毒素中毒症。

Claims

一種甘草屬植物製劑之用途，該製劑係含有7%(w/w)甘草酸與0.003%(w/w)甘草次酸(glycyrrhetinic acid)，其中，該製劑係選自包括整個甘草屬植物或甘草屬植物根部之細粉、水性萃取物、水性/乙醇萃取物、水性乾燥萃取物與水性/乙醇乾燥萃取物之組群之至少一者，並視需要連同至少一種賦形劑，且係用於農業產品中以減少至少一種選自恩鐮孢菌素類(enniatins)、白殭菌素(beauvericin)與制蚜菌素(apicidin)之多肽真菌毒素之毒性作用。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該甘草屬植物係選自包括光果甘草(Glycyrrhiza glabra)與烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis)之組群。
如申請專利範圍第2項所述之用途，其中，每噸農業產品係使用至少1g，1g至100g之該水性乾燥萃取物，或等效量之申請專利範圍第1或2項之其他甘草屬植物製劑之一種。
如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中，該恩鐮孢菌素類是恩鐮孢菌素A、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B1、恩鐮孢菌素B2或恩鐮孢菌素B3。
如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中，該農業產品係選自由含有或選自包括穀類、玉米、稻米、大豆與其他豆科植物、菜籽、禾草、藥草之組群之至少一種產品組成之食物或飼料。
如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中，該賦形劑係選自包括惰性載劑；維生素；礦物質；植物性物質；選自黃麴毒素氧化酶、麥角胺水解酶、麥角胺醯胺酶、玉米稀酮酯酶、玉米稀酮內酯酶、玉米稀酮水解酶、赭麴毒素醯胺酶、伏馬鐮孢毒素胺基轉移酶、伏馬鐮孢毒素羧基轉移酶、胺基多醇胺基轉移酶、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇環氧化物水解酶、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇去氫酶、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇氧化酶、新月毒素去氫酶及新月毒素氧化酶之解毒黴菌毒素之酵素與進一步成分；與黴菌毒素轉化微生物；及黴菌毒素結合物質之組群。
一種供口服施用之解毒劑，其係用於降低至少一種選自恩鐮孢菌素類、白殭菌素與制蚜菌素之多肽真菌毒素之毒性作用，該解毒劑包含至少一種甘草屬植物製劑，視需要連同至少一種賦形劑，其中，該甘草屬植物製劑係含有7%(w/w)甘草酸與0.003%(w/w)甘草次酸(glycyrrhetinic acid)，其中，該製劑係選自包括整個甘草屬植物或甘草屬植物根部之水性乾燥萃取物與水性/乙醇乾燥萃取物之組群，且該水性乾燥萃取物係藉由下列處理步驟獲得：包含碎裂該整個甘草屬植物或甘草屬植物根部，然後用水研磨成細漿，煮沸該細漿以獲得萃取物，並將該水性甘草屬萃取物噴霧乾燥；以及其中，該水性/乙醇乾燥萃取物係藉由包含以乙醇萃取該水性乾燥萃取物的處理步驟獲得。
如申請專利範圍第7項所述之解毒劑，其中，該恩鐮孢菌素類是恩鐮孢菌素A、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B1、恩鐮孢菌素B2或恩鐮孢菌素B3。
如申請專利範圍第7項所述之解毒劑，其中，該甘草屬植物係選自包括光果甘草與烏拉爾甘草之組群。
如申請專利範圍第7項所述之解毒劑，其中，每公斤食物或飼料係使用1mg至100mg之該水性乾燥萃取物，或等效量之申請專利範圍第7或9項之至少一種其他甘草屬植物製劑。
如申請專利範圍第7或8項所述之解毒劑，其中，含有50%(w/w)以上之該至少一種甘草屬植物製劑。
如申請專利範圍第7或8項所述之解毒劑，其中，該至少一賦形劑係選自包括惰性載劑；維生素；礦物質；植物性物質；選自黃麴毒素氧化酶、麥角胺水解酶、麥角胺醯胺酶、玉米稀酮酯酶、玉米稀酮內酯酶、玉米稀酮水解酶、赭麴毒素醯胺酶、伏馬鐮孢毒素胺基轉移酶、伏馬鐮孢毒素羧基轉移酶、胺基多醇胺基轉移酶、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇環氧化物水解酶、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇去氫酶、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇氧化酶、新月毒素去氫酶及新月毒素氧化酶之解毒黴菌毒素之酵素與進一步成分；與黴菌毒素轉化微生物；及黴菌毒素結合物質之組群。
一種申請專利範圍第7至12項中任一項之解毒劑之用途，係用於製造預防及/或治療由選自恩鐮孢菌素類、白殭菌素與制蚜菌素之群組之至少一種多肽真菌毒素引起之多肽真菌毒素中毒症之製劑。
如申請專利範圍第13項所述之用途，其中，該恩鐮孢菌素類是恩鐮孢菌素A、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B1、恩鐮孢菌素B2或恩鐮孢菌素B3。
如申請專利範圍第13項所述之用途，其中，每公斤食物或飼料係使用1mg至100mg之申請專利範圍第7項所述之解毒劑、或等效量之申請專利範圍第7至9項中至少一項所述之解毒劑作為該解毒劑之有效量。