TWI755628B - 用以合成甲狀腺激素類似物及其多形體之方法 - Google Patents

Abstract

本說明書說明合成作為甲狀腺激素類似物及其前藥之噠嗪酮化合物之方法。根據本說明書之較佳方法得以大規模地製備具有高純度的噠嗪酮化合物。一些實施例中，根據本說明書之較佳方法亦得以製備比先前使用於製備此化合物之方法具有更佳產率之噠嗪酮化合物。亦揭示噠嗪酮化合物之形體形式。進一步揭示用於治療具有至少一種TRβ突變之病患的甲狀腺激素抗性之方法。

Description

用以合成甲狀腺激素類似物及其多形體之方法 相關專利申請案

本專利申請案主張享有2012年9月17日提出之美國暫時專利申請案案號61/702,137及2013年3月15日提出之美國暫時專利申請案案號61/790,432之優先權及利益，每一者之整體內容均整體併入本文中以供參考。

序列表之併入以供參考

名為“41245-522001WO_ST25.txt”之文字檔案(其於2013年9月16日創立且大小為4KB)在此乃整體併入本文中以供參考。

本發明關於合成作為甲狀腺激素類似物及其前藥之噠嗪酮化合物之方法。

甲狀腺激素對供正常生長及發育及供保持體內代謝平 衡方面具關鍵性(Paul M.Yen,Physiological reviews,Vol.81(3)：pp.1097-1126(2001))。甲狀腺激素之循環濃度被下視丘/腦下垂體/甲狀腺(HPT)軸中的回饋機轉所緊密調節。導致甲狀腺功能低下及甲狀腺功能亢進的甲狀腺功能異常明顯地證實甲狀腺激素對心臟功能、體重、代謝、代謝速率、體溫、膽固醇、骨頭、肌肉及行為發揮深度的效應。

甲狀腺激素之生物學活性係藉由甲狀腺激素受體(TR或THR)所調解(M.A.Lazar,Endocrine Reviews,Vol.14：pp.348-399(1993))。甲狀腺激素受體(TR)隸屬於稱之為核受體的總科。甲狀腺激素受體(TR)與充作配體誘導性轉錄因子的類視色素受體一起形成異源二聚體。甲狀腺激素受體(TR)具有配體結合結構域、DNA結合結構域、及胺基端結構域，且經由與DNA反應元件及與各種核共活化因子及共抑制因子之交互反應而調節基因表現。甲狀腺激素受體係由兩個個別基因α及β所衍生。這些截然不同的基因產物經由差別RNA加工法產生其個別受體之多重形式。主要之甲狀腺受體同功型為α1、α2、β1及β2。甲狀腺激素受體α1、β1及β2係與甲狀腺激素結合。甲狀腺激素受體亞型已發現可不同在其對特定生物學反應的貢獻。最近研究顯示，TRβ1在調節TRH(促甲狀腺激素釋放激素)及於肝內調節甲狀腺激素作用扮演重要角色。TRβ2在TSH(甲狀腺刺激激素)之調節中扮演重要角色(Abel et.al.,J.Clin.Invest.,Vol 104：pp.291-300(1999))。TRβ1在調節心跳速率中扮演重要角色(B.Gloss et.al.Endocrinology,Vol.142：pp.544-550(2001)；C.Johansson et.al.,Am.J.Physiol.,Vol.275：pp.R640-R646(1998))。

已有努力於合成甲狀腺激素類似物，其顯現增加之甲狀腺激素受體β選擇性及/或組織選擇性作用。此甲狀腺激素模擬物可產生期望之體重、脂肪、膽固醇及脂蛋白降低的作用，同時降低對心血管功能或下視丘/腦下垂體/甲狀腺軸正常功能的衝擊(例如參見Joharapurkar et al.,J.Med.Chem.,2012,55(12),pp 5649-5675)。可避免不期望之甲狀腺功能亢進及甲狀腺功能低下的不期望效應同時可保持甲狀腺激素的有利效應之甲狀腺激素類似物的發展將開啟治療具有代謝疾病諸如肥胖症、高血脂症、高膽固醇血症、糖尿病及其他病症及疾病諸如肝臟脂肪變性及NASH、動脈粥狀硬化、心血管疾病、甲狀腺功能低下、甲狀腺癌、甲狀腺疾病、甲狀腺激素抗性及相關病症及疾病之病患的新途徑。

本發明(一部分地)提供合成甲狀腺激素類似物諸如噠嗪酮化合物及其前藥之方法。合成甲狀腺激素類似物及其前藥之理想方法為提供(例如)高純度及高產率之產物化合物。本發明係指向提供一或多種這些期望特徵。

本說明書說明一種合成方法，其可用於製備6-(4-胺 基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮(“Int.7”)，此化合物可用於作為供製備甲狀腺激素類似物噠嗪酮化合物的中間體，方法如下：

(a)將R¹MgX或R¹Li與式(I)化合物接觸：

以形成式(II)化合物：

其中R¹為異丙基或異丙烯基，X為鹵基且R²為H或胺保護基；及(b)當R¹為異丙烯基時，於鹼之存在下；或者當R¹為異丙基時，於氧化劑之存在下將式(II)化合物轉化成式(III)化合物：

步驟(a)中，溶劑可為質子惰性有機溶劑諸如四氫 呋喃、乙醚、甲苯、或二

烷，反應溫度可為0-60℃、20-50℃、30-45℃、或35-45℃，反應時間可10分鐘至10小時、1-8小時、或3-5小時，且格利雅(Grignard)試劑(R¹MgX)之量可為式(I)化合物之3-10當量或3-6當量。

步驟(b)中，鹼係用於將式(II)化合物異構體化。其可為有機鹼或無機鹼。鹼之實例包括(但不限定於)三乙胺、吡啶、氫氧化鉀、氫氧化鈉、及碳酸鹽。異構化反應亦可於其他條件下達成，例如以酸處理或於質子惰性溶劑中加熱。

又，步驟(b)中，氧化劑並未特別限制。例如，可使用溴之乙酸或丙酸液。

胺保護基之實例包括(但不限制於)經取代烷基、醯基(例如苯甲醯基或乙醯基)及甲矽烷基。羥基及胺保護基已於T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,2d.Ed.,John Wiley and Sons(1991)中討論。

一實施例中，步驟(a)係藉將R¹MgX與式(I)化合物接觸進行，其中R¹為異丙烯基且X為Br。此反應中所用之溶劑可為四氫呋喃，且四氫呋喃與式(I)化合物之體積重量比在7至30(或者7至15)之範圍內。此步驟可於路易斯酸(例如鹵化鋰)之存在下進行。

一實施例中，步驟(a)係藉將R¹MgX與式(I)化合物接觸進行，其中R¹為異丙基且X為Cl。此反應中所 用之溶劑可為四氫呋喃，且四氫呋喃與式(I)化合物之體積重量比在7至30(或者7至15)之範圍內。此步驟可於路易斯酸(例如鹵化鋰)之存在下進行。

一實施例中，步驟(b)中之鹼為金屬氫氧化物(例如氫氧化鉀)。

一實施例中，步驟(b)中之氧化劑為溴且步驟(b)係於酸之存在下進行。

一實施例中，式(I)及式(II)中之R²基為乙醯基或苯甲醯基。進一步實施例中，R²為苯甲醯基。

一實施例中，該方法進一步包含提供式(I)化合物，其係藉將3,6-二氯基噠嗪與2,6-二氯-4-胺基酚接觸以形成3,5-二氯-4-((6-氯基噠嗪-3-基)氧基)苯胺，將3,5-二氯-4-((6-氯基噠嗪-3-基)氧基)苯胺水解，且於水解之前或之後將3,5-二氯-4-((6-氯基噠嗪-3-基)氧基)苯胺之胺基進行保護以形成式(I)化合物。3,6-二氯基噠嗪與2,6-二氯-4-胺基酚之接觸係於極性質子惰性溶劑(例如二甲基乙醯胺(DMAC)中、於鹼(例如碳酸銫)之存在下、於60至120℃之反應溫度(例如約65℃)進行。此外，純化步驟可包括在內。亦即，在步驟(a)之前，將式(I)化合物於酸性溶液中、於80至100℃之溫度純化。

一實施例中，當存在時，該方法進一步包含步驟(c)，將式(III)化合物之胺保護基R²移除以形成6-(4-胺基-2,6-二氯基苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮。

一實施例中，藉本案所述方法所製之化合物(例如Int.7)具有大於85%、例如大於86%、大於90%、大於92.5%、大於95%、大於96%、大於97%、大於97.5%、大於98%、大於98.5%、大於99%、大於99.2%、大於99.5%、或大於99.8%。

一實施例中，藉本案所述方法所製之化合物亦即6-(4-胺基-2,6-二氯基苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮具有小於1.5%之6-(4-胺基-2,6-二氯基苯氧基)-5-異丙基噠嗪-3(2H)-酮，例如小於1.0%之6-(4-胺基-2,6-二氯基苯氧基)-5-異丙基噠嗪-3(2H)-酮，或小於0.5%之6-(4-胺基-2,6-二氯基苯氧基)-5-異丙基噠嗪-3(2H)-酮。

另一實施例中，藉上述方法所製之化合物不含6-(4-胺基-2,6-二氯基苯氧基)-5-異丙基噠嗪-3(2H)-酮。

本發明之合成方法可進一步包括下列之步驟以合成作為甲狀腺激素類似物及其前藥之噠嗪酮化合物：

(d)將6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮轉化成式(IV)化合物：

其中R³為H或CH₂R_a，其中R_a為羥基、O-連結胺基酸、 -OP(O)(OH)₂或-OC(O)-R_b，R_b為低級烷基、烷氧基、烷基酸、環烷基、芳基、雜芳基、或-(CH₂)_n-雜芳基且n為0或1；R⁴為H；且R⁵為CH₂COOH、C(O)CO₂H、或其酯或醯胺，或者R⁴及R⁵一起為-N=C(R_c)-C(O)-NH-C(O)-；其中R_c為H或氰基。

一實施例中，式(IV)化合物為2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(“化合物A”)且上述步驟係藉將6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮與(2-氰基乙醯基)胺基甲酸乙酯及金屬亞硝酸鹽接觸，其後以乙酸鉀於二甲基乙醯胺中處理進行。

一實施例中，該方法進一步包含形成2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(“化合物A”)之形體形式(形式I)，其中X光粉末繞射圖案包括於約10.5、18.7、22.9、23.6、及24.7度2θ之峰。

一實施例中，式(IV)化合物為式(V)

其中R³為CH₂R_a，且步驟(d)係藉將6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮與(2-氰基乙醯基)胺基甲酸乙酯接觸，其後以乙酸鉀於二甲基乙醯胺中處理以形成2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(“化合物A”)，再將化合物A以適當方式例如使用美國專利8,076,334中所述之一種技術轉化成式(V)化合物。

一實施例中，藉本案所述方法所製之式(IV)化合物，例如2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(“化合物A”)，具有大於85%、例如大於86%、大於90%、大於92.5%、大於95%、大於96%、大於97%、大於97.5%、大於98%、大於98.5%、大於99%、大於99.2%、大於99.5%、或大於99.8%之純度。例如，雜質(亦即藉本案所述方法所製得之組成物中除了式(IV)化合物以外的任何組份，諸如副產物、原材料、溶劑殘留物、重金屬等等)之含量小於15%、小於14%、 小於10%、小於8%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1.5%、小於1%、小於0.8%、小於0.5%、或小於0.2%。

一實施例中，藉本案所述方法所製之式(IV)化合物為形式I之化合物A，且具有大於85%、例如大於86%、大於90%、大於92.5%、大於95%、大於96%、大於97%、大於97.5%、大於98%、大於98.5%、大於99%、大於99.2%、大於99.5%、或大於99.8%之純度。例如，雜質(亦即藉本案所述方法所製得之組成物中除了化合物A以外的任何組份，諸如副產物、原材料、溶劑殘留物、重金屬等等)之含量小於15%、小於14%、小於10%、小於8%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1.5%、小於1%、小於0.8%、小於0.5%、或小於0.2%。

一實施例中，藉本案所述方法所製之式(IV)化合物為形式I之化合物A，且形式I具有大於85%、例如大於86%、大於90%、大於92.5%、大於95%、大於96%、大於97%、大於97.5%、大於98%、大於98.5%、大於99%、大於99.2%、大於99.5%、或大於99.8%之純度。例如，雜質(亦即藉本案所述方法所製得之組成物中除了形式I以外的任何組份，諸如化合物A之其他形體形式、副產物、原材料、溶劑殘留物、重金屬等等)之含量小於15%、小於14%、小於10%、小於8%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1.5%、小於1%、小於0.8%、小於0.5%、或小於0.2%。

一實施例中，藉本案所述方法所製之包含式(IV)化合物(諸如化合物A)的組成物具有小於1.5%(例如小於1.0%、例如小於0.5%)之相應β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體(例如2-(3,5-二氯-4-((4-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈，此為化合物A之β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體)。

一實施例中，藉本案所述方法所製之包含式(IV)化合物(諸如化合物A)的組成物不含相應之β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體(例如2-(3,5-二氯-4-((4-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈，此為化合物A之β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體)。

一實施例中，藉本案所述方法所製之包含式(IV)化合物(諸如化合物A)的組成物具有小於1.5%(例如小於0.1%)之重金屬例如銀。

一實施例中，藉本案所述方法所製之包含式(IV)化合物(諸如化合物A)的組成物不含重金屬例如銀、金或鉑。

本案所述之合成方法包括可與先前方法諸如美國專利7,452,882中揭示者相比之優點。例如，2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(“化合物A”)之總產率大幅增加(例如>40%，相對於當根據美 國專利7,452,882揭示之方法所製時為約9%)。而且，合成之區域選擇性優越得多。此外，該新穎方法提供更容易之製程，例如更容易之過濾。最後，沒有重金屬要用於本案所述之供化合物A之方法中。相較之下，銀係用於美國專利7,452,882所述之路徑中，其必需要以樹脂進行矯正處理。

另一方面，本發明之特徵為組成物包含大於85%之式(IV)化合物，小於1.5%之相應β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體(亦即

)，及/或小於1.5%之重金屬。

一實施例中，式(IV)化合物(例如化合物A)，具有大於85%、例如大於86%、大於90%、大於92.5%、大於95%、大於96%、大於97%、大於97.5%、大於98%、大於98.5%、大於99%、大於99.2%、大於99.5%、或大於99.8%之純度。例如，雜質(亦即包含式(IV)化合物之組成物中除了式(IV)化合物以外的任何組份，諸如副產物、原材料、溶劑殘留物、重金屬等等)之含量小於15%、小於14%、小於10%、小於8%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1.5%、小於1%、小於0.8%、小於0.5%、或小於0.2%。

一實施例中，式(IV)化合物為形式I之化合物A，且具有大於85%、例如大於86%、大於90%、大於 92.5%、大於95%、大於96%、大於97%、大於97.5%、大於98%、大於98.5%、大於99%、大於99.2%、大於99.5%、或大於99.8%之純度。例如，雜質(亦即包含化合物A之組成物中除了化合物A以外的任何組份，諸如副產物、原材料、溶劑殘留物、重金屬等等)之含量小於15%、小於14%、小於10%、小於8%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1.5%、小於1%、小於0.8%、小於0.5%、或小於0.2%。

一實施例中，式(IV)化合物為形式I之化合物A，且形式I具有大於85%、例如大於86%、大於90%、大於92.5%、大於95%、大於96%、大於97%、大於97.5%、大於98%、大於98.5%、大於99%、大於99.2%、大於99.5%、或大於99.8%之純度。例如，雜質(亦即包含形式I之組成物中除了形式I以外的任何組份，諸如化合物A之其他形體形式、副產物、原材料、溶劑殘留物、重金屬等等)之含量小於15%、小於14%、小於10%、小於8%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1.5%、小於1%、小於0.8%、小於0.5%、或小於0.2%。

一實施例中，式(IV)化合物(諸如化合物A)具有小於1.5%(例如小於1.0%、例如小於0.5%)之相應β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體(例如2-(3,5-二氯-4-((4-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈，此為化合物A之β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體)。

一實施例中，式(IV)化合物(諸如化合物A)不含相應之β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體(例如2-(3,5-二氯-4-((4-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈，此為化合物A之β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體)。

一實施例中，式(IV)化合物(諸如化合物A)具有小於1.5%(例如小於1.0%、例如小於0.5%)之重金屬例如銀、金或鉑。

一實施例中，藉本案所述方法所製之式(IV)化合物(諸如化合物A)不含重金屬例如銀。

另外，本發明之特徵為2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(“化合物A”)之形體形式(形式I)，其中X光粉末繞射(“XRPD”)圖案包括於約10.5、18.7、22.9、23.6、及24.7度2θ之峰。

一實施例中，形式I之特徵為X光粉末繞射圖案進一步包括於約8.2、11.2、15.7、16.4、17.7、30.0、及32.2度2θ之峰。

一實施例中，形式I之特徵為X光粉末繞射圖案包括於約8.2、10.5、18.7、22.9、23.6、及24.7度2θ之峰。

一實施例中，形式I之特徵為X光粉末繞射圖案包括於約8.2、10.5、11.2、15.7、16.4、17.7、18.7、22.9、23.6、及24.7度2θ之峰。

一實施例中，形式I之特徵為X光粉末繞射圖案包括 於約8.2、10.5、11.2、15.7、16.4、17.7、18.7、22.9、23.6、24.7、30.0、及32.2度2θ之峰。

另一實施例中，形式I之特徵為X光粉末繞射圖案實質類似於圖1中所示者。

另一方面，本說明書說明製備形式I之方法。該方法包含將含有化合物A之樣品(例如粗製或純化之化合物A製劑)與有機溶劑諸如醇(例如乙醇)、酮(例如甲基異丁基酮，亦即MIBK)、或包括醇或酮之水性溶液混合。例如，將所得之含有初始化合物A及溶劑之混合物(例如漿液或懸浮液)於第一溫度加熱，然後冷卻至低於第一溫度的第二溫度。較佳地，有機溶劑為乙醇。進行形式轉化之初始化合物A可為溶劑化物，諸如水合物(例如單水合物或二水合物)、或有機溶劑之溶劑化物(例如二甲基乙醯胺、乙醇或甲基異丁基酮)。另外，初始化合物A可為無溶劑化合物(例如無水合物)。

一實施例中，該方法係藉將化合物A與有機溶劑加熱至增溫(例如約60-110℃或約80℃)以形成漿液或懸浮液，其後冷卻(例如至約0-60℃、約40-60℃、約45-55℃、或約室溫)以得化合物A形式I。例如，有機溶劑為乙醇且含有化合物A之漿液可冷卻至大於約40℃之溫度以得形式I。例如，有機溶劑為甲基異丁基酮且含有化合物A之漿液可冷卻至室溫以得形式I。

另一實施例中，將化合物A之乙醇懸浮液加熱至增溫(例如約80℃)，然後冷卻至不低於約40℃之溫度(例 如約45-55℃)，過濾(例如約45-55℃)，以溫(例如約45-55℃)乙醇清洗及於(例如)45-55℃乾燥以得化合物A之形式I，其實質地不含化合物A之任何溶劑化物諸如乙醇溶劑化物。例如，所製化合物A之形式I具有之乙醇溶劑化物含量<5%(例如<2%、<1%、<0.5%、或<0.1%)。

一實施例中，該方法進一步包含(於將混合物冷卻之後)將混合物過濾以得濾塊。過濾步驟可於約0℃至約60℃之溫度間(例如約40-60℃、約45-55℃、或於約室溫)進行以得濾塊。

一實施例中，該方法進一步包含(於將混合物過濾之後)將濾塊潤洗。潤洗步驟可於約0℃至約60℃之溫度間(例如約40-60℃、約45-55℃、或於約室溫)以有機溶劑(例如醇諸如乙醇)進行以得潤洗之濾塊。

一實施例中，該方法進一步包含(於將濾塊潤洗之後)將潤洗之濾塊乾燥。乾燥步驟可於約0℃至約60℃之溫度間(例如約40-60℃、約45-55℃、或於約室溫)進行以得化合物A之形式I。

一實施例中，式I具有大於91%、例如大於92.5%、大於95%、大於96%、大於97%、或大於97.5%之純度。

一實施例中，式I具有大於98%、例如大於98.5%、大於99%、大於99.2%、大於99.5%、或大於99.8%之純度。

另一方面，本說明書提供化合物諸如

及其鹽，其(例如)可用於合成6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮(“Int.7”)。

本說明書亦提供治療有此治療需求之病患的甲狀腺激素(RTH)抗性之方法。該方法包含將醫療有效量之式(IV)化合物投服予具有至少一種TRβ突變之病患：

其中R³為H或CH₂R_a，其中R_a為羥基、O-連結胺基酸、 -OP(O)(OH)₂或-OC(O)-R_b，R_b為低級烷基、烷氧基、烷基酸、環烷基、芳基、雜芳基、或-(CH₂)_n-雜芳基且n為0或1；R⁴為H；且R⁵為CH₂COOH、C(O)CO₂H、或其酯或醯胺，或者R⁴及R⁵一起為-N=C(R_c)-C(O)-NH-C(O)-；其中R_c為H或氰基。

甲狀腺激素抗性(RTH)為一種症候群，其特徵為各種組織對甲狀腺激素之低敏感性且主要係由對THRβ之體染色體顯性突變所致。參見Shi et al.,Biochemistry 2005, 44,4612-4626。

一實施例中，上述方法中所用之化合物為2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(“化合物A”)，例如化合物A之形式I。

一實施例中，待以上述方法治療之病患具有肥胖症、高血脂症、高膽固醇血症、糖尿病、非酒精性脂肪肝炎、脂肪肝、骨病、甲狀腺軸改變、動脈粥狀硬化、心血管病症、心搏過速、多動行為、甲狀腺功能低下、甲狀腺腫大、注意力不足過動症、學習障礙、智能障礙、聽力喪失、骨齡延遲、神經病學及精神病學疾病或甲狀腺癌。

一實施例中，THRβ突變體選自由以下所組成之群組：以蘇胺酸(T)取代SEQ ID NO：1之胺基酸位置234的野生型殘基丙胺酸(A)(A234T)；以麩醯胺酸(Q)取代SEQ ID NO：1之胺基酸位置243的野生型殘基精胺 酸(R)(R243Q)；以組胺酸(H)取代SEQ ID NO：1之胺基酸位置316的野生型殘基精胺酸(R)(R316H)；及以蘇胺酸(T)取代SEQ ID NO：1之胺基酸位置317的野生型殘基丙胺酸(A)(A317T)。另一實施例中，該方法中所用之化合物恢復突變體THRβ之活性。

一實施例中，式(IV)化合物(諸如化合物A)之純度係將粗製化合物由本案所述之適當溶劑中再度漿化而得。另一實施例中，化合物非溶劑化物(例如水合物)。

一實施例中，式(IV)化合物(例如化合物A)具有大於85%、例如大於86%、大於90%、大於92.5%、大於95%、大於96%、大於97%、大於97.5%、大於98%、大於98.5%、大於99%、大於99.2%、大於99.5%、或大於99.8%之純度。

一實施例中，式(IV)化合物為化合物A之形式I且具有大於85%、例如大於86%、大於90%、大於92.5%、大於95%、大於96%、大於97%、大於97.5%、大於98%、大於98.5%、大於99%、大於99.2%、大於99.5%、或大於99.8%之純度。

一實施例中，式(IV)化合物為化合物A之形式I且形式I具有大於85%、例如大於86%、大於90%、大於92.5%、大於95%、大於96%、大於97%、大於97.5%、大於98%、大於98.5%、大於99%、大於99.2%、大於99.5%、或大於99.8%之純度。

一實施例中，式(IV)化合物(例如化合物A)具有小於1.5%(例如小於1.0%、例如小於0.5%)之相應β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體(例如2-(3,5-二氯-4-((4-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈，此為化合物A之β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體)。

一實施例中，式(IV)化合物(例如化合物A)不含相應β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體(例如2-(3,5-二氯-4-((4-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈，此為化合物A之β-異丙基噠嗪-3(2H)-酮區域異構體)。

一實施例中，式(IV)化合物(例如化合物A)具有小於1.5%(例如小於1.0%、例如小於0.5%)之重金屬例如銀、金、或鉑。

一實施例中，該病患為哺乳動物。另一實施例中，該病患為人類。

本說明書進一步提供測定病患對式(IV)化合物或其藥學上可接受之鹽的反應性之方法，該方法包含：(a)提供病患樣品；及(b)檢測於甲狀腺激素受體("TR")中之突變，其中突變之存在表示病患對化合物或其藥學上可接受之鹽有反應。

一實施例中，式(IV)化合物為2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯 基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(“化合物A”)。

一實施例中，TR為TRβ。

一實施例中，藉本發明方法治療之病患具有肥胖症、高血脂症、高膽固醇血症、糖尿病、非酒精性脂肪肝炎、脂肪肝、骨病、甲狀腺軸改變、動脈粥狀硬化、心血管病症、心搏過速、多動行為、甲狀腺功能低下、甲狀腺腫大、注意力不足過動症、學習障礙、智能障礙、聽力喪失、骨齡延遲、神經病學及精神病學疾病或甲狀腺癌。

一實施例中，用於測定對式(IV)化合物之反應性之方法可連同供治療甲狀腺激素抗性之方法一起使用。亦即，在治療之前，令病患接受測試以測定對化合物之反應性。

本發明之其他特徵及優點可由詳細說明、實例及申請專利範圍中明顯得知。

發明之詳細說明

本專利說明書及附加之申請專利範圍中，除非文章中另有明白指定，否則單數形式"a"、"an"、及"the"包括複數指示對象。故，例如，提到"反應物"則不僅包括單一反應物，亦包括二或多種不同反應物之組合或混合物，提到"取代基"則包括單一取代基以及二或多種取代基等等。

本案中所用之詞組"例如"、"諸如"或"包括"乃意指置入實例以進一步地闡述更一般的題材。這些實例僅提供以 幫助了解本說明書，而非意指以任何型式限制。此外，本案中所用之術語"可"、"隨意"、"隨意地"、或"可隨意地"意指接續說明之情況可能發生或可能不發生，故該說明包括其中該情況發生之狀況或其未發生之狀況。例如，詞組"隨意地存在"意指對象可能存在或可能不存在，故，該說明包括其中該對象存在之狀況及其中該對象不存在之狀況。

在說明本發明及申請本發明專利範圍中，下列之術語將根據以下所示之定義使用。

本案中所用之縮寫"TR"或"THR"意指甲狀腺激素受體。源自各種不同物種(例如人類、大鼠、雞等等)之TR核酸及多肽已於先前說明。例如參見R.L.Wagner et al.(2001),Molecular Endocrinology 15(3)：398-410；J.Sap et al.(1986),Nature 324：635-640；C.Weinberger et al.(1986),Nature 324：641-646；及C.C.Tompson et al.(1986),Science 237：1610-1614；每一者均整體併入本文中以供參考。人類TRß之胺基酸序列係(例如)由Genbank Accession No.P10828.2提供，其係併入本文中以供參考。

於人類TRß之SEQ ID NO：1中第234、243、316、及317位置的殘基下面劃線。編碼上述胺基酸序列之該部分人類TRß核苷酸序列為SEQ ID NO：2。人類TRß之核苷酸序列係(例如)由Genbank Accession No.NM_000461.4提供，其係併入本文中以供參考。

如同本案中所用之詞組"具有下式"或"具有下列結構"並不欲限制，而是以與常用之術語"包含"相同之方式使用。術語"獨立地選自"意指所述之元件(例如R基等等)可相同或不同。

本案中所用之術語"烷基"意指通常(雖然未必)含有1至約24個碳原子之支鏈或非支鏈飽和烴基，諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、辛基、癸基等等，以及環烷基諸如環戊基、環己基等等。通常(雖然未必)本案中之烷基可含有1至約18個碳原子，且此基團可含有1至約12個碳原子。術語"低級烷基"意指具1至6個碳原子，例如1、2、3、4、5、或6個碳原子之烷基。"經取代烷基"意指經一或多個取代基取 代之烷基，且術語"含雜原子之烷基"及"雜烷基"意指烷基取代基，其中至少一個碳原子經雜原子(如同於下文中進一步詳述者)替代。

本案中所用之術語"烯基"意指含有至少一個雙鍵之具2至約24個碳原子的直鏈、支鏈或環狀烴基，諸如乙烯基、正丙烯基、異丙烯基、正丁烯基、異丁烯基、辛烯基、癸烯基、十四碳烯基、十六碳烯基、二十碳烯基、二十四碳烯基等等。通常(再度地雖然未必)，本案中之烯基可含有2至約18個碳原子，且例如可含有2至12個碳原子。術語"低級烯基"意指具2至6個碳原子之烯基。術語"經取代烯基"意指經一或多個取代基取代之烯基，且術語"含雜原子之烯基"及"雜烯基"意指烯基，其中至少一個碳原子經雜原子例如N、P、O、或S替代。

本案中所用之術語"炔基"意指含有至少一個三鍵之具2至約24個碳原子的直鏈或支鏈烴基，諸如乙炔基、正丙炔基等等。通常(再度地雖然未必)，本案中之炔基可含有2至約18個碳原子，且此基團可進一步含有2至12個碳原子。術語"低級炔基"意指具2至6個碳原子之炔基。術語"經取代炔基"意指經一或多個取代基取代之炔基，且術語"含雜原子之炔基"及"雜炔基"意指炔基，其中至少一個碳原子經雜原子替代。

本案中所用之術語"烷氧基"意指經由單一、終端醚鍵結合之烷基；亦即，"烷氧基"可以-O-烷基表示，其中烷基為如上所定義者。"低級烷氧基"意指含有1至6個碳原 子之烷氧基，且包括(例如)甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、第三丁氧基等等。本案中被視為"C₁-C₆烷氧基"或"低級烷氧基"之取代基可(例如)含有1至3個碳原子，且進一步實例方面，此取代基可含有1或2個碳原子(亦即甲氧基及乙氧基)。

術語"烷基酸"意指於烷基上之酸取代基，諸如-(CH₂)_oCOOH，其中o為1至6間之整數。烷基可為直鏈或支鏈。

除非另有特定，否則本案中所用之術語"芳基"意指芳族取代基，其通常(雖然未必)含有5至30個碳原子且含有單一芳族環或多重芳族環(其係稠合一起、直接連結或間接連結(諸如不同芳族環結合至共同的基團諸如亞甲基或亞乙基部分))。芳基可(例如)含有5至20個碳原子且進一步實例方面，芳基可含有5至12個碳原子。例如，芳基可含有一個芳族環或兩個稠合或連結芳族環，例如苯基、萘基、聯苯基、二苯醚、二苯胺、二苯甲酮等等。"經取代芳基"意指經一或多個取代基取代之芳基部分，且術語"含雜原子之芳基"及"雜芳基"意指芳基取代基，其中至少一個碳原子經雜原子替代(如同將於下文中進一步詳細說明者)。如果未另有指定，則術語"芳基"包括環，其為未經取代、經取代，及/或具有含雜原子之芳族取代基。

術語"芳烷基"意指具芳基取代基之烷基，且術語"烷芳基"意指具烷基取代基之芳基，其中"烷基"及"芳基"為如 上所定義者。通常，本案中之芳烷基及烷芳基含有6至30個碳原子。芳烷基及烷芳基可(例如)含有6至20個碳原子，在進一步實例方面，此基團可含有6至12個碳原子。

術語"胺基"在本案中意指-NZ¹Z²基，其中Z¹及Z²為氫或非氫取代基，而非氫取代基包括(例如)烷基、芳基、烯基、芳烷基、及其經取代及/或含雜原子之變體。

術語"鹵基"及"鹵素"用於傳統意義係意指氯基、溴基、氟基或碘基取代基。

於"含雜原子之烷基"(亦稱為"雜烷基")或"含雜原子之芳基"(亦稱為"雜芳基")中之術語"含雜原子"意指分子、連結或取代基，其中一或多個碳原子經不是碳的原子例如氮、氧、硫、磷或矽，通常經氮、氧或硫替代。同樣地，術語"雜烷基"意指含有雜原子之烷基取代基，術語"雜環"或"雜環狀"意指含有雜原子之環部分，術語"雜芳基"或"雜芳族"分別意指含雜原子之"芳基"及"芳族"取代基等等。雜烷基之實例包括烷氧基芳基、經烷基硫烷基取代之烷基、N-烷基化之胺基烷基等等。雜芳基取代基之實例包括吡咯基、吡咯啶基、吡啶基、喹啉基、吲哚基、呋喃基、嘧啶基、咪唑基、1,2,4-三唑基、四唑基等等，且含雜原子之脂環基的實例為吡咯啶基、嗎啉基、哌嗪基、哌啶基、四氫呋喃基等等。

“烴基”意指含有1至約30個碳原子、包括1至約24個碳原子、進一步包括1至約18個碳原子、且進一步包 括約1至12個碳原子之單價烴基團，包括直鏈、支鏈、環狀、飽和及不飽和物類，諸如烷基、烯基、芳基等等。"經取代烴基"意指經一或多個取代基取代之烴基，且術語"含雜原子之烴基"意指烴基，其中至少一個碳原子經雜原子替代。

術語"O-連結胺基酸"意指任何胺基酸(天然存在或合成)經由胺基酸之羧基中的氧，較佳經由胺基酸之羧基端的羧基連結至分子。

本案中所用之術語"保護基"意指特定之官能部分(例如O、S或N)暫時地被保護以使反應可選擇性地於多官能化合物之另一個反應位進行。較佳實施例中，保護基選擇性地高產率反應以得對預計之反應具安定性的經保護基質；該保護基必需藉由不會侵犯其他官能基的輕易可得、較佳為無毒性之試劑予以選擇性地高產率移除；保護基形成可輕易分離之衍生物(較佳地不產生新的立體中心)；且保護基具有最小量之其他官能度以避免其他反應位。如同本案中所詳述，氧、硫、氮及碳保護基可予使用。例如，某些實施例中，某些例示之氧保護基可予使用。這些氧保護基包括(但不限定於)甲基醚、經取代甲基醚(例如MOM(甲氧基甲基醚)、MTM(甲硫基甲基醚)、BOM(苄氧基甲基醚)、及PMBM(對-甲氧基苄氧基甲基醚))、經取代乙基醚、經取代苄基醚、甲矽烷基醚(例如TMS(三甲基甲矽烷基醚)、TES(三乙基甲矽烷基醚)、TIPS(三異丙基甲矽烷基醚)、TBDMS(第三 丁基二甲基甲矽烷基醚)、三苄基甲矽烷基醚及TBDPS(第三丁基二苯基甲矽烷基醚)、酯類(例如甲酸酯、乙酸酯、苯甲酸酯(Bz)、三氟乙酸酯、及二氯乙酸酯)、碳酸酯、環狀縮醛及縮酮。某些其他例示實施例中，係使用氮保護基。氮保護基以及保護及去保護法於技藝中已知。氮保護基包括(但不限定於)胺基甲酸酯(包括胺基甲酸甲酯、乙酯及經取代乙酯(例如Troc))、醯胺類、環狀亞醯胺衍生物、N-烷基及N-芳基胺、亞胺衍生物、及烯胺衍生物。又其他實施例中，某些例示之硫保護基可予使用。硫保護基包括(但不限定於)上述之氧保護基以及脂族羧酸(例如丙烯酸)、馬來醯亞胺、乙烯基磺醯基、及隨意經取代之馬來酸。某些其他例示保護基於本案中詳述。然而，應了解，本發明不欲限制在這些保護基；反而，各種其他同等之保護基可使用上述準則輕易鑑定且用於本發明中。另外，各種保護基乃述於“Protective Groups in Organic Synthesis”Third Ed.Greene,T.W.and Wuts,P.G.,Eds.,John Wiley & Sons,New York：1999中，其整體內容乃併入本文中以供參考。

在上述一些定義中提到之"經取代烴基"、"經取代烷基"、"經取代芳基"等等當中的"經取代"乃意指於該烴基、烷基、芳基、或其他部分中，至少有一個結合至碳(或其化)原子的氫原子經一或多個非氫取代基所替代。此取代基之實例包括(非限定)官能基及烴基部分C₁-C₂₄烷基(包括C₁-C₁₈烷基、進一步包括C₁-C₁₂烷基、且進一步 包括C₁-C₆烷基)、C₂-C₂₄烯基(包括C₂-C₁₈烯基、進一步包括C₂-C₁₂烯基、且進一步包括C₂-C₆烯基)、C₂-C₂₄炔基(包括C₂-C₁₈炔基、進一步包括C₂-C₁₂炔基、且進一步包括C₂-C₆炔基)、C₅-C₃₀芳基(包括C₅-C₂₀芳基、且進一步包括C₅-C₁₂芳基)、及C₆-C₃₀芳烷基(包括C₆-C₂₀芳烷基、且進一步包括C₆-C₁₂芳烷基)。

在上述一些定義中提到之"官能基"乃意指包含一或多個非烴官能度之非氫基團。官能基之實例包括(但不限定於)：鹵基、羥基、氫硫基、C₁-C₂₄烷氧基、C₂-C₂₄烯氧基、C₂-C₂₄炔氧基、C₅-C₂₀芳氧基、醯基(包括C₂-C₂₄烷羰基(-CO-烷基)及C₆-C₂₀芳羰基(-CO-芳基))、醯氧基(-O-醯基)、C₂-C₂₄烷氧羰基(-(CO)-O-烷基)、C₆-C₂₀芳氧羰基(-(CO)-O-芳基)、鹵羰基(-CO)-X，其中X為鹵基)、C₂-C₂₄烷基碳酸基(-O-(CO)-O-烷基)、C₆-C₂₀芳基碳酸基(-O-(CO)-O-芳基)、羧基(-COOH)、羧負離子基(-COO^-)、胺基甲醯基(-(CO)-NH₂)、單取代C₁-C₂₄烷基胺基甲醯基(-(CO)-NH(C₁-C₂₄烷基))、二取代烷基胺基甲醯基(-(CO)-N(C₁-C₂₄烷基)₂)、單取代芳基胺基甲醯基(-(CO)-NH-芳基)、硫代胺基甲醯基(-(CS)-NH₂)、胺基甲醯胺基(-NH-(CO)-NH₂)、氰基(-C≡N)、異氰基(-N⁺≡C^-)、氰醯基(-O-C≡N)、異氰醯基(-O-N⁺≡C^-)、異硫代氰醯基(-S-C≡N)、疊氮基(-N=N⁺=N^-)、甲醯基(-(CO)-H)、硫代甲醯基(-(CS)-H)、胺基(-NH₂)、單-及二-(C₁-C₂₄烷基)-取代之胺基、單-及二-(C₅-C₂₀芳基)-取代之胺基、C₂-C₂₄烷基醯胺基(-NH- (CO)-烷基)、C₅-C₂₀芳基醯胺基(-NH-(CO)-芳基)、亞胺基(-CR=NH，其中R=氫、C₁-C₂₄烷基、C₅-C₂₀芳基、C₆-C₂₀烷芳基、C₆-C₂₀芳烷基等等)、烷基亞胺基(-CR=N(烷基)，其中R=氫、烷基、芳基、烷芳基等等)、芳基亞胺基(-CR=N(芳基)，其中R=氫、烷基、芳基、烷芳基等等)、硝基(-NO₂)、亞硝基(-NO)，磺基(-SO₂-OH)、磺酸基(-SO₂-O^-)、C₁-C₂₄烷基硫基(-S-烷基；亦稱為"烷硫基")、芳基硫基(-S-芳基；亦稱為芳硫基")，C₁-C₂₄烷基亞磺醯基(-(SO)-烷基)、C₅-C₂₀芳基亞磺醯基(-(SO)-芳基)、C₁-C₂₄烷基磺醯基(-SO₂-烷基)、C₅-C₂₀芳基磺醯基(-SO₂-芳基)、亞磷羧基(-P(O)(OH)₂)、膦酸基(-P(O)(O^-)₂)、亞膦酸基(-P(O)(O^-))、二氧磷基(-PO₂)、及膦基(-PH₂)、單及二-(C₁-C₂₄烷基)取代之膦基、單-及二-(C₅-C₂₀芳基)取代之膦基；及烴基部分C₁-C₂₄烷基(包括C₁-C₁₈烷基、進一步包括C₁-C₁₂烷基、且進一步包括C₁-C₆烷基)、C₂-C₂₄烯基(包括C₂-C₁₈烯基、進一步包括C₂-C₁₂烯基、且進一步包括C₂-C₆烯基)、C₂-C₂₄炔基(包括C₂-C₁₈炔基、進一步包括C₂-C₁₂炔基、且進一步包括C₂-C₆炔基)、C₅-C₃₀芳基(包括C₅-C₂₀芳基、進一步包括C₅-C₁₂芳基)、及C₆-C₃₀芳烷基(包括C₆-C₂₀芳烷基且進一步包括C₆-C₁₂芳烷基)。此外，上述官能基可(如果特定之基團允許)進一步經一或多個其他官能基或經一或多個烴基諸如特別列舉者取代。類似地，上述烴基部分可進一步經一或多個官能基或其他烴基部分諸如特別列舉者取代。

術語"將方法套疊"意指將多重步驟之方法摺疊成更小數目之步驟或單元操作。單元操作包括轉變、但亦涵蓋處理及離析步驟。離心、過濾、蒸餾、傾析、沈澱/結晶、及包裝為單元操作之實例。文獻中有許多有關套疊及其他方法改善之實例(例如參見J.Org.Chem.,2007,72,9757-9760)。

應了解，上述一些定義可重疊，因而一些化學部分可落在超過一個之定義範圍內。

當術語"經取代"出現在可能之經取代基列表之前時，該術語意欲應用在彼基團之每一成員上。例如，詞組"經取代烷基及芳基"要被解釋為"經取代烷基及經取代芳基"。

本說明書提供合成化合物(例如可用於作為供合成作為甲狀腺激素類似物之噠嗪酮化合物的中間體者)之方法。作為甲狀腺激素類似物之噠嗪酮化合物以及其前藥已揭示於美國專利7,452,882、7,807,674、及8,076,334中。

尤其，本發明之特徵為製備6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮(“Int.7”)或其鹽之方法，該方法包含：(a)將R¹MgX或R¹Li與式(I)化合物接觸：

以形成式(II)化合物：

其中R¹為異丙基或異丙烯基，X為鹵基且R²為H或胺保護基；及(b)當R¹為異丙烯基時，於鹼之存在下；或者當R¹為異丙基時，於氧化劑之存在下將式(II)化合物轉化成式(III)化合物：

本說明書亦說明合成作為甲狀腺激素類似物之噠嗪酮化合物以及其前藥之方法。此些化合物包括於7,452,882、7,807,674、及8,076,334中揭示者。尤其，本說明書說明製備式(IV)化合物或其藥學上可接受之鹽之方法：

其中R³為H或CH₂R_a，其中R_a為羥基、O-連結胺基酸、-OP(O)(OH)₂或-OC(O)-R_b，R_b為低級烷基、烷氧基、烷基酸、環烷基、芳基、雜芳基、或-(CH₂)_n-雜芳基且n為0或1；R⁴為H；且R⁵為CH₂COOH、C(O)CO₂H、或其酯或醯胺，或者R⁴及R⁵一起為-N=C(R_c)-C(O)-NH-C(O)-；其中R_c為H或氰基。該方法包含：(a)將R¹MgX或R¹Li與式(I)化合物接觸：

以形成式(II)化合物：

其中R¹為異丙基或異丙烯基，X為鹵基且R²為H或胺保護基；及(b)當R¹為異丙烯基時，於鹼之存在下；或者當R¹為異丙基時，於溴及酸之存在下將式(II)化合物轉化成式(III)化合物：

(c)當存在時，移除式(III)化合物之胺保護基R²以形成6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮，且隨意地(d)將6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮於適當條件下轉化成式(IV)化合物。

本發明亦根據下列反應圖及實例所示地提供合成本發明各種揭示化合物之詳細方法。

整個說明中，當組成物被述及具有、包括、或包含特定組份時，則預期組成物亦本質上由所述之組份所組成或由所述之組份所組成。類似地，當方法被述及具有、包括、或包含特定方法步驟時，該方法亦本質上由所述之方法步驟所組成或由所述之方法步驟所組成。此外，應了解，只要本發明保持可運行，則步驟之順序或進行某些動作的順序並不重要。又，二或多個步驟或動作可同時進行。

本發明之合成方法可容許廣泛之各種官能基，因此可使用各種經取代原材料。該方法通常在整個方法之結束或接近結束時提供期望之終化合物，然而在某些情況下，可能合乎需要的是進一步將化合物轉化成其藥學上可接受之鹽、酯或前藥。

實施例中，6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮(“Int.7”)係根據下列反應圖1或2製備。

反應圖1：以異丙基格利雅(Grignard)試劑(iPrMgX)進行之6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮(“Int.7”)之合成。

反應圖2：以異丙烯基格利雅(Grignard)試劑進行之6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮(“Int.7”)之合成。

階段1：3,5-二氯-4-((6-氯基噠嗪-3-基)氧基)苯胺(化合物2)及N-(3,5-二氯-4-((6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)苯甲醯胺或N-(3,5-二氯-4-((6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)乙醯胺(化合物4)之合成

化合物2係藉將3,6-二氯基噠嗪與2,6-二氯-4-胺基酚於小量之適當鹼諸如金屬碳酸鹽(例如碳酸銫或鉀)或金屬醇化物(例如第三丁醇鉀)之存在下、於適當有機溶劑(例如二甲亞碸(DMSO)或二甲基乙醯胺(DMAC))中、於適當反應溫度(例如60-120℃)接觸直至反應完全為止，通常約3至30小時，例如約3至15小時而製得。

化合物4係藉將化合物2以適當胺保護試劑(諸如苯 甲酸酐或苯甲醯氯)保護，其後將經保護之中間體以乙酸鈉於適當有機溶劑(諸如乙酸)之存在下、於適當反應溫度(例如100至120℃)處理直至反應完全為止，通常約2至20小時，例如約5至15小時而製得。將粗製產物以適當溶劑(例如水及乙酸之混合液)、於適當溫度(例如88-100℃)純化。經乙酸鹽保護之化合物4可藉令化合物2接受水解條件而製得。

階段2：N-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)苯甲醯胺或N-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)乙醯胺(化合物6)及6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮(Int.7)之合成

化合物6係藉將化合物4與異丙基格利雅(Grignard)試劑於適當有機溶劑(諸如四氫呋喃或二

烷)中接觸，其後進行氧化步驟製得。氧化步驟可於氧化試劑諸如溴之存在下、於適當有機溶劑諸如乙酸中、於適當反應溫度(例如60至90℃)進行直至反應完全為止，通常約2至10小時，例如約2至5小時而製得。

應了解，需要進行去保護反應以完成化合物6轉變成Int.7。尤其，N-保護基(亦即乙醯基或苯甲醯基)必需移除以得Int.7中存在之游離胺基。故，一實施例中，Int.7係藉將化合物6(其中R²為Bz)以鹼諸如金屬氫氧化物(例如氫氧化鉀(KOH)或氫氧化鈉(NaOH))或金屬碳 酸鹽(例如碳酸鈉)進行去保護而得。另一實施例中，Int.7係藉將化合物6(其中R²為Ac)以酸諸如三氟乙酸進行去保護而得。

另外，化合物7係藉將化合物4與異丙烯基格利雅(Grignard)試劑於適當有機溶劑(諸如四氫呋喃或2-甲基四氫呋喃)中接觸，其後於鹼諸如金屬氫氧化物(例如氫氧化鉀(KOH))之處理下異構化(例如由5A至6)及去保護而製得。異構化/去保護步驟係於適當反應溫度(例如60-90℃)進行直至反應完全為止，通常約10至60小時，例如於90℃約16小時。

格利雅(Grignard)反應可於路易斯酸諸如氯化鋰(LiCl)或溴化鋰(LiBr)之存在下、於適當反應溫度(例如室溫至40℃)進行直至反應完全為止，通常約2至10小時，例如約2至5小時。

一實施例中，相對於技藝中已知之其化方法，化合物5或5A之合成可改善Int.7之產率。例如，5或5A之合成可得到大於45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或大於90%之產率。

實施例中，格利雅(Grignard)反應可改善區域選擇性，得到顯著較少之化合物6的β-異丙基區域異構體，亦即

，故得到更純之Int.7。

一實施例中，由6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異 丙基噠嗪-3(2H)-酮(“Int.7”)轉化成化合物A之反應係根據下列反應圖3進行。

階段3：6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮(“Int.8”)之合成

Int.8係藉將6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮與(2-氰乙醯基)胺基甲酸乙酯及金屬亞硝酸鹽諸如亞硝酸鈉、於酸(諸如氫氯酸)之存在下、於適當溶劑(例如乙酸與水之混合液)中、於適當反應溫度(例如低於10℃)接觸直至反應完全而製得。

階段4：2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(化合物A)之合成

化合物A係藉將Int.8與鹼諸如乙酸鈉或乙酸鉀、於適當溶劑(例如二甲基乙醯胺(DMAC))中、於適當反 應溫度(例如約120℃)接觸直至反應完全而製得。

實施例中，由6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮(“Int.7”)轉化成式(IV)化合物而非MGL-3916(諸如其前藥)之反應係於(例如)美國專利7,452,882、7,807,674、及8,076,334中所述之條件下進行，彼等係整體併入本文中以供參考。

相對於先前於(例如)美國專利7,452,882中所揭示之合成路徑中的聯芳基醚形成所得到之不佳區域選擇性相比之下，本案所述之合成方法進行之以異丙烯基或異丙基之格利雅(Grignard)安裝將導致優良之區域選擇性。此外，藉由將聯芳基醚之形成反應套疊至苯甲醯胺之保護反應中，本案所揭示之方法可避免聯芳基醚產物分離出來，此在當此產物以公斤之量合成時，因為每批次的過濾時間大於1星期而實際上幾乎不可能。

本發明提供具高純度及/或具體形體形式(例如形式I)之化合物，本案所述之組成物，以及用於治療或預防肥胖症、高血脂症、高膽固醇血症、糖尿病、非酒精性脂肪肝炎、脂肪肝、骨病、甲狀腺軸改變、動脈粥狀硬化、心血管病症、心搏過速、多動行為、甲狀腺功能低下、甲狀腺腫大、注意力不足過動症、學習障礙、智能障礙、聽力喪失、骨齡延遲、神經病學及精神病學疾病或甲狀腺癌之方法。

應了解，本案所揭示之方法適於大規模以及小規模地製備期望化合物。本案所述方法之較佳實施例中，甲狀腺 激素類似物可大規模地製備，例如以工業製造規模而非實驗/實驗室規模製備。例如，根據本說明書方法之批次型式製造方法得以製備至少1克、或至少5克、或至少10克、或至少100克、或至少1公斤、或至少100公斤之甲狀腺激素類似物批次。此外，該方法得以製備具有藉HPLC測得為至少98%、或至少98.5%純度之甲狀腺激素類似物。

藥學組成物

本發明亦提供藥學組成物，其包含式IV化合物且組合至少一種藥學上可接受之賦形劑或載體。

"藥學組成物"為含有適於投服予病患之形式的本發明化合物之調合物。一實施例中，藥學組成物為散裝或單位劑型。單位劑型為任何各式各樣的形式，包括(例如)膠囊、IV袋、片劑、於氣溶膠吸入器上之單泵、或管瓶。組成物單位劑量中之活性成分(例如所揭示化合物或其鹽、水合物、溶劑化物或異構體之調合物)的量為有效量且根據所涉及之特定治療而變化。熟諳此藝者將了解，偶爾必需根據病患的年齡及病況而進行常規變化。劑量亦依投服路徑而定。預期可有各種路徑，包括經口、肺部、直腸部、非經腸部、經皮、皮下、靜脈內、肌內、腹膜內、吸入、頰部、舌下、胸膜內、鞘內、鼻內等等。本發明化合物用於局部或經皮投服之劑型包括粉末、噴霧、軟膏、糊、乳油、洗劑、凝膠、溶液、貼片及吸入劑。一實施例 中，活性化合物係於無菌條件下與藥學上可接受之載體，及與任何所需之防腐劑、緩衝劑或推進劑混合。

本案所用之詞語"藥學上可接受"意指彼些化合物、材料、組成物、載體、及/或劑型，其(在深思熟慮之醫療決定範圍內)適於與人類及動物組織接觸而不會有過量之毒性、刺激、過敏反應、或其他問題或併發症，具有合理之效益風險比。

"藥學上可接受之賦形劑或載體"意指賦形劑或載體，其可用於製備通常具安全性、無毒性且既非生物學亦非其他方面不期望之藥學組成物，且包括獸醫學用途以及人類藥學用途可接受之賦形劑。本專利說明書及申請專利範圍中所用之"藥學上可接受之賦形劑"包括一種及大於一種之此賦形劑。

本發明之藥學組成物係調配以與其所欲之投服路徑相容。投服路徑之實例包括非經腸部(例如靜脈內、皮內、皮下)、經口(例如吸入)、經皮(局部)、及透黏膜投服。用於非經腸部、皮內、或皮下投服之溶液或懸浮液可包括下列組份：無菌稀釋劑諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑諸如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，及用於調整張力之製劑諸如氯化鈉或葡萄糖。pH可以酸或鹼諸如氫氯酸或氫氧化鈉調整。非經腸部製劑可封在玻璃或塑膠製之安瓶、可丟棄 式注射管或多劑量管瓶內。

本案所用之術語"醫療有效量"意指用於治療、改善、或預防經鑑定的疾病或病況、或顯現可查覺之醫療或抑制效應的藥學劑之量。該效應可藉由技藝中已知之任何分析法檢測。病患之精確有效量將依病患之體重、尺寸、及健康狀況；以及所選擇之用於投服之療法或療法組合而定。供既定狀況用之醫療有效量可藉臨床醫師技術及診斷範圍內之常規實驗決定。較佳方面，待治療之該疾病或病況為代謝病症。

本發明方法之操作中，有效量之任一本發明化合物或本發明任何化合物或其藥學上可接受之鹽或酯的組合係經由技藝中已知之任何常用且可接受之方法單一地或組合地投服。故化合物或組成物可經口(例如頰腔)、舌下、非經腸部(例如肌內、靜脈內、或皮下)、直腸部(例如藉坐藥或清洗液)、經皮(例如皮膚電穿孔法)或藉吸入法(例如藉氣溶膠)，及以固態、液態或氣態劑型，包括片劑及懸浮液形式投服。投服可以單一單位劑型伴隨連續療法進行或以單一劑量療法隨意地進行。醫療組成物亦可為油乳膠或分散液連同親脂性鹽諸如帕莫酸之形式，或為生物可降解性持續釋放型組成物之形式以供皮下或肌內投服。

用於製備組成物之藥學載體可為固體、液體或氣體；故組成物可採用片劑、丸劑、膠囊、坐藥、粉末、腸溶包衣或其他經保護調合物(例如結合於離子交換樹脂上或包 裝於脂肪-蛋白質小囊內)、持續釋放型調合物、溶液、懸浮液、酏劑、氣溶膠等等形式。載體可選自各種油類包括石油、動物、植物或合成來源者，例如花生油、大豆油、礦物油、芝蔴油等等。水、鹽水、水性葡萄糖、及二醇類為理想之液態載體，尤其(當與血液成等張時)供注射溶液用。例如，供靜脈內投服之調合物包括活性成分之無菌水性溶液，其係藉令固體活性成分溶於水中以得水性溶液，再使溶液成為無菌而製得。適當之藥學賦形劑包括澱粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、滑石、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽土、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。組合物可接受慣用之藥學添加劑諸如防腐劑、安定劑、濕化劑或乳化劑、用於調節滲透壓之鹽、緩衝液等等。適當藥學載體及其調合物乃述於E.W.Martin之Remington's Pharmaceutical Sciences中。此些組成物(於任何情況下)將含有有效量之活性化合物連同適當載體，故得以製得適當劑型以供適當投服予接受者。

藥學製劑亦可含有防腐劑、溶解劑、安定劑、濕化劑、乳化劑、甜化劑、著色劑、調味劑、變化滲透壓之鹽、緩衝劑、包衣劑及抗氧化劑。彼等亦可含有其他具醫療價值的物質，包括除了式I以外之其他活性成分。

本發明化合物可用於作為供治療具有至少一種TRβ突變之病患的甲狀腺激素(RTH)抗性的醫藥。該病患可具有疾病諸如肥胖症、高血脂症、高膽固醇血症、糖尿 病、非酒精性脂肪肝炎、脂肪肝、骨病、甲狀腺軸改變、動脈粥狀硬化、心血管病症、心搏過速、多動行為、甲狀腺功能低下、甲狀腺腫大、注意力不足過動症、學習障礙、智能障礙、聽力喪失、骨齡延遲、神經病學及精神病學疾病或甲狀腺癌。

根據本發明化合物之醫療有效量或劑量可在廣乏範圍內變化且可以技藝中已知之方式決定。例如，藥物可根據體重給藥。此劑量將依每一個特定案例包括待投服之特定化合物、投服路徑、待治療之病況、以及待治療之病患而調整到個別的需求。另一實施例中，藥物可以固定劑量投服，例如並未根據體重調整。通常，在經口或非經腸部投服予成人之情況下，每日劑量由約0.5毫克至約1000毫克應該是適當的，然而當有指示時，則可能超過上限。劑量較佳地為每日5毫克至約400毫克。較佳之劑量為每日約20毫克至約100毫克。每日劑量可以單一劑量或以分次劑量方式投服，或者在供非經腸部投服方面，其可以連續輸注之方式給予。

藥學劑之有效量為臨床醫師或其他合格觀察員所注意到之可提供客觀可辨認之改善者。本案所用之術語"劑量有效方式"乃意指活性化合物於病患或細胞中能產生期望生物學效應的量。

藥學組成物可連同投藥指南一起包括於容器、包裝、或分配器中。

本發明化合物可進一步形成鹽。所有之這些形式亦預 期在本發明所申請專利之範圍內。

本案中所用之"藥學上可接受之鹽"意指本發明化合物之衍生物，其中母化合物藉由製成其酸或鹼鹽而改良。藥學上可接受之鹽的實例包括(但不限定於)鹼性殘留物諸如胺之無機或有機酸鹽，酸性殘留物諸如羧酸之鹼或有機鹽等等。藥學上可接受之鹽包括由(例如)無毒性無機或有機酸中所形成之母化合物的慣用無毒性鹽或四級銨鹽。例如，此慣用之無毒性鹽包括(但不限定於)由選自2-乙醯氧基苯甲酸、2-羥基乙磺酸、乙酸、抗壞血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氫鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、乙二胺四乙酸、乙二磺酸、1,2-乙磺酸、富馬酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、谷胺酸、乙醇酸、對乙醯胺基苯胂酸(glycollyarsanilic)、己基間苯二酚、海巴明酸(hydrabamic)、氫溴酸、氫氯酸、氫碘酸、羥基馬來酸、羥基萘甲酸、羥乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂基磺酸、馬來酸、蘋果酸、扁桃酸、甲磺酸、萘磺酸、硝酸、草酸、帕莫酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、聚半乳糖酸酸、丙酸、水楊酸、硬脂酸、亞乙酸(subacetic)、琥珀酸、胺基磺酸、磺胺酸、硫酸、鞣酸、酒石酸、甲苯磺酸，及常見之胺酸例如甘胺酸、丙胺酸、苯基丙胺酸、精胺酸等等之無機及有機酸所衍生者。

藥學上可接受之鹽的其他實例包括已酸、環戊烷丙酸、丙酮酸、丙二酸、3-(4-羥基苯甲醯基)苯甲酸、肉桂酸、4-氯基苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺 酸、4-甲基二環-[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、第三丁基乙酸、黏糠酸等等。本發明亦涵蓋當母化合物中存在之酸性質子被金屬離子，例如鹼金屬離子、鹼土金屬離子、或鋁離子所替代；或者與有機鹼諸如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、胺丁三醇、N-甲基葡糖胺、二乙胺、二乙胺基乙醇、乙二胺、咪唑、賴胺酸、精胺酸、嗎啉、2-羥乙基嗎啉、二苄基乙二胺、三甲胺、哌啶、吡咯啶、苄胺、四甲基氫氧化銨等等配位所形成之鹽。

應了解，所有提及之藥學上可接受之鹽均包括彼鹽之如同本案中所定義之溶劑加成形式(溶劑化物)或結晶形式(多形體)。

本發明化合物亦可製成酯類，例如藥學上可接受之酯。例如，化合物中之羧酸官能基可轉化成其相應之酯，例如甲酯、乙酯或其他酯。又，化合物中之醇基可轉化成其相應之酯，例如乙酸酯、丙酸酯或其他酯。

本發明化合物亦可製成前藥，例如藥學上可接受之前藥。術語"前-藥"及"前藥"在本案中交替使用且意指可於活體內釋放活性母藥之任何化合物。既然已知前藥可增強藥劑之許多期望品質(例如溶解度、生物可利用率、製造等等)，故本發明化合物可以前藥形式遞送。因此，本發明欲涵蓋目前申請專利範圍之化合物的前藥、彼之遞送方法及含彼之組成物。"前藥"欲包括任何共價鍵結之載體，當此前藥投服予病患時，可於活體釋放本發明之活性母藥。 本發明之前藥係藉將化合物中存在之官能基修飾，因而以常規操作方式或於活體內將此修飾裂解成母化合物而製成。前藥包括本發明化合物，其中羥基、胺基、氫硫基、羧基或羰基係鍵結至任何基團上，其可於活體內裂解以分別形成游離羥基、游離胺基、游離氫硫基、游離羧基或游離羰基。

前藥之實例包括(但不限定於)本發明化合物中羥基官能基之酯(例如乙酸酯、二烷胺基乙酸酯、甲酸酯、磷酸酯、硫酸酯及苯甲酸酯衍生物)及胺基甲酸酯(例如N,N-二甲胺基羰基)，羧基官能基之酯(例如乙酯、嗎啉基乙醇酯)，胺基官能基之N-醯基衍生物(N-乙醯基)、N-曼尼西(Mannich)鹼、N-席夫(Schiff)鹼及烯胺酮，酮及醛官能基之肟、縮醛、縮酮及烯醇酯等等，參見Bundegaard,H.,Design of Prodrugs,p1-92,Elesevier,New York-Oxford(1985)。

本化合物、或其藥學上可接受之鹽、酯或前藥係經口、鼻部、經皮、肺部、吸入、頰部、舌下、腹膜內、皮下、肌內、靜脈內、直腸部、胸膜內、鞘內及非經腸部投服。一實施例中，化合物係經口投服。熟諳此藝者將了解某些投服路徑之優點。

使用本化合物進行之給藥方案係根據各種因素包括病患型式、物類、年齡、重量、性別及身體病況；待治療病況之嚴重度；投服路徑；病患之腎及肝功能；及所用之特定化合物或其鹽來選擇。一般熟練的醫師及獸醫師可輕易 地決定及處方預防、對抗或遏止病況進展所需的有效藥物量。

所揭示之本發明化合物的調配及投服技術可見於Remington：the Science and Practice of Pharmacy,19^th edition,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1995)中。實施例中，本案所述之化合物及其藥學上可接受之鹽係與藥學上可接受之載體或稀釋劑組合地用於藥學製劑中。適當之藥學上可接受之載體包括惰性固態填料或稀釋劑及無菌水性或有機溶液。化合物將以足以提供本案所述範圍內之期望劑量之量存在於此藥學組成物中。

本發明之特徵為治療或減輕病患之甲狀腺激素抗性症狀之方法，其係藉將醫療有效量之式(IV)化合物(諸如化合物A，例如其形式I)投服予表現突變體TRβ(包含於配位體結合結構域中之突變)之病患。

本說明書亦提供測定具甲狀腺激素(RTH)抗性之病患對本案所揭示式(IV)化合物之反應性之方法，其係藉提供取自病患之樣品；再檢測至少一種TRβ突變(例如基因突變或於TRβ多肽(例如定義於SEQ ID NO：1中之多肽)之配位體結合結構域中的突變)；而該突變之存在表示病患對式(IV)化合物(諸如化合物A，例如其形式I)有反應。該方法可進一步包括治療具有突變的病患，其係藉投服醫療有效量之式(IV)化合物(諸如化合物A，例如其形式I)。

一實施例中，展現或將會展現對式(IV)化合物諸如 化合物A之反應性的病患具有肥胖症、高血脂症、高膽固醇血症、糖尿病、非酒精性脂肪肝炎、脂肪肝、骨病、甲狀腺軸改變、動脈粥狀硬化、心血管病症、心搏過速、多動行為、甲狀腺功能低下、甲狀腺腫大、注意力不足過動症、學習障礙、智能障礙、聽力喪失、骨齡延遲、神經病學及精神病學疾病或甲狀腺癌。

此外，本說明書亦提供方法，其包括測定病患樣品中TRβ基因突變之存在；再以TRβ基因突變之存在為基準來選擇療法，該療法包括醫療有效量之式(IV)化合物(諸如化合物A，例如其形式I)之投服。

本說明書亦提供方法，其包括將病患樣品中之核酸以引子進行擴增，該引子與突變體TRβ核酸序列(包含如同SEQ ID NO：2中所定義之核酸序列中的TRβ基因突變)成互補；測定所擴增核酸之存在，再以所擴增核酸之存在為基準來選擇療法，該療法包括醫療有效量之式(IV)化合物之投服，或藉以所擴增核酸之存在為基準投服醫療有效量之式(IV)化合物以治療病患。

本案所述之突變體TRβ為突變體TRβ多肽或編碼突變體TRβ多肽之核酸序列。

一實施例中，突變體TRβ包含於SEQ ID NO：1之胺基酸位置234、243、316、及317的一或多個突變。更佳地，突變選自由以下所組成之群組：以蘇胺酸(T)取代SEQ ID NO：1之胺基酸位置234的野生型殘基丙胺酸(A)(A234T)；以麩醯胺酸(Q)取代SEQ ID NO：1 之胺基酸位置243的野生型殘基精胺酸(R)(R243Q)；以組胺酸(H)取代SEQ ID NO：1之胺基酸位置316的野生型殘基精胺酸(R)(R316H)；及以蘇胺酸(T)取代SEQ ID NO：1之胺基酸位置317的野生型殘基丙胺酸(A)(A317T)。

一實施例中，突變體TRβ包含編碼突變體TRβ多肽且具有於SEQ ID NO：1之胺基酸位置234、243、316、及317的一或多個突變之核酸序列。編碼突變體TRβ多肽或肽片段(該肽片段具有突變體TRβ多肽特徵)之核酸序列可使用任何適當方法檢測。例如，編碼突變體TRβ多肽之核酸序列可根據技藝中詳知之方法，使用全基因組重定序或目標區域重定序(後者亦稱為目標化重定序)，使用經適當選擇之DNA來源及聚合酶鏈鎖反應(PCR)引子檢測。例如參見Bentley(2006)Curr Opin Genet Dev.16：545-52，及Li et al.(2009)Genome Res 19：1124-32。方法典型且通常必需有基因組DNA純化、PCR擴增以將所論及之區域擴增、循環定序、定序反應清理、毛細管電泳、及數據分析之步驟。涵蓋所論及區域的高品質PCR引子係使用經由電腦模擬之引子設計工具設計。循環定序為一簡單之方法，其中熱循環儀中連續回合之變性、退火、及延伸可導致延伸產物之直線擴增。產物典型係以可鑑別終端核苷酸鹼基為G、A、T或C之螢光標籤來終止。未併入之可完成毛細管電泳注射法的染料終止劑及鹽則藉清洗法移除。毛細管電泳期間，循環定序反應產物經 由填滿聚合物之毛細管遷移。帶負電荷之DNA片段則於當其移動通過毛細胞朝向正電極時藉由尺寸大小分離。電泳後，數據收集軟體產生原始數據的樣品檔案。使用下游軟體應用，可進一步進行數據分析以將所收集之顏色數據影像轉譯成相應之核苷酸鹼基。另外或者此外，方法包括以微陣列為基底之目標區域基因組DNA補獲及/或定序。供選擇適當PCR引子及進行定序之套組、試劑、及方法為市售，例如得自Applied Biosystems、Agilent、及NimbleGen(Roche Diagnostics GmbH)。供本發明之用途方面，PCR引子可加以選擇以使(例如)至少一部分之編碼突變體TRβ多肽且具有於SEQ ID NO：1之胺基酸位置234、243、316、及317的一或多個突變之核酸序列擴增。

另外或此外，編碼突變體TRβ多肽之核酸序列可根據技藝中詳知之方法使用南方墨點法檢測。

某些實施例中，本發明方法包含進行分析以檢測病患樣品中突變體TRβ之步驟。本案中所用之"病患樣品"意指得自或衍生自病患之含有細胞或細胞組份之任何適當樣品。一實施例中，樣品為血液樣品。一實施例中，樣品為得自(例如)甲狀腺之活組織樣品。

本說明書提供配位體-突變體TRβ複合物，其包含：突變體TRβ多肽及式(IV)化合物。例如，形成複合物之突變體TRβ多肽包含於SEQ ID NO：1之胺基酸位置234、243、316、及317的一或多個突變。例如，形成複 合物之化合物為化合物A。

此外，本說明書提供引子-核酸複合物，其包含：突變體TRβ核酸序列，及與該突變體TRβ核酸序列成互補之PCR引子，其中該突變體核酸序列包括如同於SEQ ID NO：2所定義之核酸序列中的EZH2基因突變。

本案所述之所有專利、專利申請案、及公開均整體併入本文中以供參考。然而，當含有表達定義之專利、專利申請案、或公開併入以供參考時，彼些表達定義應了解係應用在彼等被發現之所併專利、專利申請案或公開上，而非應用至本專利申請案尤其本專利申請案之申請專利範圍之正文上。

應該理解的是，雖然本發明已連同其較佳具體實施例一起說明，但先前說明以及下列實例係欲闡述而非限制本發明之範圍。應了解，熟知技藝者可在不脫離本發明範圍之情況下進行各種變化及同等物之取代，而且其他方面、優點及改良將由與本發明有關之熟知技藝者顯而易見。

除非另有指定，否則所有百分比及比率均以重量計。本發明之其他特徵及優點可由不同之實例中顯而易見。所提供之實例係闡述用以操作本發明之不同組份及方法。實例並不限制所申請專利之本發明。以本說明書為基準，熟知技藝者可鑑別及使用其他可用於操作本發明之組份及方法。

第1圖為2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(“化合物A”)形式I之X光粉末繞射圖(XRPD)。

第2圖為化合物A形式I之差示掃描熱量法圖表(DSC)圖表。

第3A圖及第3B圖為展現T3及化合物A分別於THRβ中之MacPymol建模圖像。

第4圖為展現疊置之T3及化合物A於THRβ中之MacPymol建模圖像。

第5A圖為展現T3與野生型THRβ間之極性交互作用的MacPymol建模圖像，其中T3極專一性地與Arg320交互作用。

第5B圖為展現化合物A與野生型THRβ間之極性交互作用的MacPymol建模圖像，其中化合物A與Arg320及Arg316交互作用。

第6圖為MacPymol建模圖像，其展示突變導致配位體結合結構域(“LBD”)之極性區域中的許多變化。

第7A圖為展現T3與THRβ突變體：Ala234Thr、Arg243Gln、Arg316His、Ala317Thr間之交互作用的MacPymol建模圖像。

第7B圖為展現化合物A與THRβ突變體：Ala234Thr、Arg243Gln、Arg316His、Ala317Thr間之交互作用的MacPymol建模圖像，其顯示與T3相比之下，化 合物A中帶負電荷的雜環可較佳地適應突變。

第8A圖及第8B圖為T3及化合物A分別於Arg316His突變體中之MacPymol建模圖像。T3-Arg320交互作用因為Arg320之旋轉遠離突變體中之配位體而似乎變得較弱，而化合物A則與Arg320保持順利的交互作用且充分定位於CN基以與突變之His316形成pi-陽離子交互作用。

第9A圖及第9B圖為化合物A分別於野生型THRβ及突變體Arg316His中之MacPymol建模圖像。

實例

除非另有特定，否則用於實例中所述化合物的分析儀器及參數如下：

XRPD數據係於X光粉末繞射儀(CubiX-Pro XRD)上，以3至45度2-theta(2θ)，0.12度/分鐘之掃描速率及0.020度之步進大小進行Cu Kα輻射(45kV,40mA)而收集。

將樣品置於Si零點回復超微樣品架上。分析係使用10毫米輻射寬度進行且下列參數係設定於軟體/硬體內：

X-光管：Cu KV，45kV，40mA

檢測器：X’Celerator

ASS初級狹縫：固定1°

發散狹縫(Prog)：自動化-5毫米輻射長度

索拉(Soller)狹縫：0.02弧度

散射狹縫(PASS)：自動化-5毫米觀察長度

掃描範圍：3.0-45.0°

掃描模式：連續

步進大小：0.02°

每一步進的時間：10秒

有效長度：2.54°

分析後，使用X’Pert HighScore Plus軟體及下列參數將數據由可調整式轉化成固定狹縫：

固定之發散狹縫大小：1.00°，1.59毫米

相交點：44.3°Omcga(ω)

除非另有指定，否則下述實例中，化合物4為苯甲醯基保護之化合物。

實例1：N-(3,5-二氯-4-((6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)苯甲醯胺(化合物4，其中R²為苯甲醯基)

在備有頂置式攪拌器、熱電偶、迴流冷凝器、及氮入口/出口之1升三頸式圓底燒瓶內裝入3,6-二氯噠嗪(100克，0.672莫耳，1重量份)、4-胺基-2,6-二氯酚(122克，0.686莫耳，1.02當量)、及二甲基乙醯胺(DMAC，500毫升，5體積份)。將碳酸銫(251克，0.771莫耳，1.15當量)裝入所得溶液中，再將懸浮液加熱至110℃。於彼溫3小時後，將批次溫度降至70℃，再 於彼溫下攪拌16小時。¹H NMR分析(二甲亞碸)顯示幾乎所有二氯噠嗪均已耗盡且反應被視為完全。將此批次冷卻至室溫，再經由乙酸乙酯(2升，20體積份)之協助轉移至3升圓底燒瓶中。將矽膠(100克，1重量份)加入，再將懸浮液攪拌30分鐘，再過濾。將反應器及濾塊以乙酸乙酯(500毫升，5體積份)潤洗直至濾液洗提為無色為止。將所得濾液以10%水性氯化鈉(2升，20體積份)處理，將雙相混合物攪拌30分鐘，再將下方水性層丟棄。將上方有機層於減壓下濃縮至乾。將乙酸乙酯(100毫升，1體積份)加至殘留物中，再於減壓下濃縮至乾以得油狀粗製之化合物2(251克，128%產率)。HPLC分析顯示純度為93.4%。¹H NMR分析(二甲亞碸)顯示與所派定之結構一致且顯示有約25%二甲基乙醯胺(DMAC)及2%乙酸乙酯存在。

用於合成化合物2之其他條件乃述於下列表1-3中。

將上述粗製2置於乙酸(1.48升，7.5體積份)中，再將苯甲酸酐(168克，0.741莫耳，1.1當量)加入。將所得混合物加熱至100℃，於彼溫35分鐘後，2的量為0.8%。將乙酸鈉(110克，2當量)加入，再將溫度增至110℃。於彼溫14.5小時後，反應混合物之HPLC分析顯示無中間體餘留，且反應被視為完全。將此批次冷卻至75℃，再將水(1.5升，7.7體積份)於1小時期間加入，同時保持批次溫度介於72-75℃間。將此批次冷卻至21℃，再通過Sharkskin濾紙中過濾。將反應器及濾塊連續以水(1.5升，5體積份)清洗。將所收集之固狀物於50 ℃真空烘箱中乾燥16小時後，粗製4之產量為195克(77%)。HPLC(方法B，220nm)顯示純度為91.6%。

HPLC方法B：

柱：Waters Sunfire C18，3.5μM，4.6×150毫米

流速：1.0毫升/分鐘

流動相A：0.05%三氟乙酸之水液

流動相B：0.05%三氟乙酸之水液

稀釋劑：50：50乙腈/水

¹H NMR分析(二甲亞碸)與所派定之結構一致且顯示乙酸含量為1%。苯甲醯氯亦可取代苯甲酸酐地用於保護，當使用苯甲醯氯時，則使用鹼諸如碳酸鈀或碳鉀且反應係於室溫進行。

合成化合物4之其他條件乃述於下列表4及5中。

化合物4之純化：在備有頂置式攪拌器、熱電偶、迴流冷凝器、及氮入口/出口之5升三頸式圓底燒瓶內裝入粗製4(100克，1重量份)及乙酸(2升，20體積份)。將漿液攪動，再加熱至95℃，有溶解現象發生。將水(2升，20體積份)於2.75小時期間加入，同時保持批次溫度約95℃，有沈澱現象發生。將所得漿液於95℃加熱另30分鐘，其後將加熱移除。待此批次達到室溫 後，為求便利起見將其於彼溫攪拌過夜，再通過Sharkskin濾紙中過濾。將反應器及濾塊連續以水(1升，10體積份)潤洗。將所收集之白色固狀物於40℃真空烘箱中乾燥成91克(91%)之恆重。

該乾燥固狀物之HPLC分析顯示純度為98.0%。¹H NMR分析(二甲亞碸)與所派定之結構一致且顯示乙酸含量為0.3%。下列表6列出供純化化合物4之其他條件。

實例2：6-(4-胺基-2,6-二氯苯氧基)-4-異丙基噠嗪-3(2H)-酮(“Int.7”)之製備

在備有頂置式攪拌器、熱電偶、氮入口/出口、及迴流冷凝器之4升三頸式圓底燒瓶內裝入4(95克，0.253莫耳，1重量份)、四氫呋喃(665毫升，7體積份)、 及氯化鋰(32.3克，0.759莫耳，3當量)。將所得懸浮液加熱至35℃，再將異丙烯基溴化鎂溶液(0.5M之四氫呋喃液，1.72升，0.859莫耳，3.4當量)於80分鐘期間加入，同時保持批次溫度介於35-45℃間。將所得漿液於40℃加熱3小時後，HPLC分析顯示轉化率為87%。將另外之異丙烯基溴化鎂溶液(0.5M之四氫呋喃液，51毫升，0.026莫耳，0.1當量)加入，再將漿液於40-43℃攪動另90分鐘。HPLC分析顯示轉化率為92.9%，且反應被視為完全。將加熱移除，再將反應混合物冷卻至14℃，將3N水性氫氯酸(380毫升，4體積份)於15分鐘期間徐緩地加入，同時保持批次溫度底於26℃，此時期後，所有固狀物均溶解。將下方之水性層移出，再以四氫呋喃(350毫升，3.7體積份)萃取。將下方之水性層移除後，將結合之有機層於減壓下濃縮成約5體積份之與4有關者。將所得溶液內裝入10%(w/w)水性氫氧化鉀(532毫升，5.6體積份)，再將混合物加熱至85℃，同時使用短路徑蒸餾儀器將四氫呋喃蒸餾出。將此批次保持於85℃ 11小時，再將加熱移除。為求便利起見，將此批次冷卻至室溫過夜。所得漿液之HPLC分析(下示方法A)顯示99%之轉化率轉化成Int.7，且反應被視為完全。

HPLC方法A：

柱：Waters Sunfire C18，3.5μM，4.6×150毫米

流速：1.0毫升/分鐘

流動相A：0.05%三氟乙酸之水液

流動相B：0.05%三氟乙酸之水液

稀釋劑：50：50乙腈/水

將批次溫度調整至48℃，再將3N水性氫氯酸(152毫升，1.6體積份)於35分鐘期間加入以調整pH至7.5-8.0，同時保持批次溫度介於46-48℃之間。將加熱移除，再將漿液冷卻至30℃。¹H NMR分析(二甲亞碸)顯示Int.7/四氫呋喃莫耳比為1.0：0.22(附件14)。將此批次於30℃通過Sharkskin濾紙中過濾，將反應器及濾塊連續以水(475毫升，5體積份)清洗。將米黃色固狀物Int.7於40℃真空烘箱中乾燥至81.6克(102%產率)之恆重。卡爾費雪(Karl Fischer)分析顯示水含量為0.8%。¹H NMR分析(二甲亞碸)與所派定之結構一致且顯示四氫呋喃含量為0.4%。HPLC分析顯示純度為92.6%。下列表7-10提供用於製造Int.7之反應參數摘要。

實例3：(2-氰基-2-(2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)亞肼基)乙醯基)胺基甲酸(Z)-乙酯(Int.8)之製備

在備有頂置式攪拌器、熱電偶、氮入口/出口之2升三頸式圓底燒瓶內裝入Int.7(75.0克，0.239莫耳，1重量份)、乙酸(600毫升，8體積份)、水(150毫升，2體積份)、及濃氫氯酸(71.3毫升，0.95體積份)。將所得薄漿液冷卻至6℃，再將亞硝酸鈉(16.8克，0.243莫耳，1.02當量)之水(37.5毫升，0.5體積份)溶液於10分鐘期間加入，同時保持批次溫度低於10℃。於5-10℃間攪動另10分鐘後，HPLC分析顯示Int.7完全轉化成重氮鹽中間體。將乙酸鈉(54.5克，0.664莫耳，2.78當 量)之水(225毫升，3體積份)於6分鐘期間加入，同時保持批次溫度低於10℃。將N-氰乙醯基胺基甲酸乙酯(37.9克，0.243莫耳，1.02當量)立即加入，將冷卻移除，此批次於35分鐘期間自然加溫至8℃。HPLC分析顯示重氮鹽中間體完全耗盡且反應被視為完全。此批次自然加溫至21℃，再通過Sharkskin濾紙中過濾。將反應器及濾塊連續以水(375毫升，5體積份)清洗。將所收集之橙色固狀物於35℃真空烘箱中乾燥64小時以得粗製Int.8(104.8克，91%)。

在備有頂置式攪拌器、熱電偶、及氮入口/出口之1升三頸式圓底燒瓶內裝入粗製Int.8(104.4克，1重量份)及乙酸(522毫升，5體積份)。將所得漿液加熱至50℃且保持於彼溫1.5小時。此批次於2小時期間自然冷卻至25℃，再通過Sharkskin濾紙中過濾。將反應器及濾塊連續以水(522毫升，5體積份)清洗，再將濾塊於真空下調理1.75小時。將此淡橙色固狀物於40℃真空烘箱中乾燥至恆重，即得89.9克(由Int.7中得78%產率)期望產物。¹H NMR分析(二甲亞碸)顯示與所派定之結構一致。

實例4：2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(化合物A)之製備

在備有頂置式攪拌器、熱電偶、氮入口/出口、及迴 流冷凝器之2升三頸式圓底燒瓶內裝入Int.8(89.3克，0.185莫耳，1重量份)、二甲基乙醯胺(446毫升，5體積份)及乙酸鉀(20.0克，0.204莫耳，1.1當量)。將混合物加熱至120℃且保持於彼溫2小時。HPLC分析顯示完全轉化成化合物A。將批次溫度於1小時期間調整至18℃，再將乙酸(22.3毫升，0.25體積份)加入。將批次溫度調整至8℃，再將水(714毫升，8體積份)於1小時期間加入；有橙色漿液形成。將此批次通過Sharkskin濾紙中過濾，再令濾塊於氮下(為求便利起見無真空)調理過夜。將預混之1：1丙酮/水(445毫升，5體積份)溶液裝入燒瓶內，再以潤洗方式隨著真空之施入加至濾塊中。將濾塊於真空下調理2小時後，將其轉移至備有頂置式攪拌器、熱電偶及氮入口/出口之乾淨1升三頸式圓底燒瓶內。將乙醇(357毫升，4體積份)及丙酮(357毫升，4體積份)裝入，再將所得漿液加熱至60℃，有溶解現象發生。將水(890毫升，10體積份)於90分鐘期間加入，同時保持批次溫度介於55-60℃間。令所得漿液冷卻至25℃，再通過Sharkskin濾紙中過濾。將反應器及濾塊連續以1：1乙醇/水(446毫升，5體積份)清洗。將濾塊於氮下(為求便利起見無真空)調理過夜。將濾塊中之裂縫撫平，再施予真空。將濾塊以水(179毫升，2體積份)清洗，再於45℃真空烘箱中乾燥至70.5克之恆重(87%，粗製化合物A)。HPLC分析顯示純度為94.8%。

在備有頂置式攪拌器、熱電偶、氮入口/出口、及迴 流冷凝器之500毫升三頸式圓底燒瓶內裝入粗製化合物A(70.0克)及甲基異丁基酮(MIBK，350毫升，5體積份)。將橙色漿液加熱至50℃且保持於彼溫2小時。此批次乃自然冷卻至23℃，再通過Sharkskin濾紙中過濾。將反應器及濾塊連續以甲基異丁基酮(MIBK，35毫升，0.5體積份)清洗兩次。將所收集之固狀於45℃真空烘箱中乾燥至58.5克(84%)之恆重。將此固狀物裝入備有頂置式攪拌器、熱電偶、氮入口/出口、及迴流冷凝器之500毫升三頸式圓底燒瓶內。將乙醇(290毫升，5體積份)加入，再將漿液加熱至迴流。於迴流3.5小時後，XRPD顯示該固狀物與形式I一致，再將加熱移除。達到25℃後，將此批次通過濾紙中過濾，再將反應器及濾塊連續以乙醇(174毫升，3體積份)清洗。將此棕褐色固狀化合物A於40℃真空烘箱中乾燥至50.4克(87%，得自Int.8之產率為64%)之恆重。HPLC分析顯示純度為99.1%。¹H NMR分析(二甲亞碸)顯示與所派定之結構一致。

實例5：按比例擴大2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(化合物A)之製備

較大規模批次之化合物A係根據下列反應圖合成。下列反應圖中之條件類似於上示實例1-4中所述者。

4之合成：於50升夾套式玻璃容器(以氮吹洗)內裝入3,6-二氯噠嗪(2.00公斤)、4-胺基-2,6-二氯基酚(2.44公斤)及N,N-二甲基乙醯胺(10.0升)。將此批次以真空(26英吋汞柱)/氮(1 PSIG)吹洗3次。將碳酸銫(5.03公斤)加入，再將批次溫度於3.5小時期間由22.3℃調整至65.0℃。將此批次保持於65.0℃ 20小時。於此時點之¹H NMR分析顯示相對於2而言有3.34%之3,6-二氯噠嗪。將批次溫度調整至21.5℃，再將乙酸乙酯 (4.00升)加至此批次中。將此批次攪動10分鐘，然後通過備有聚丙烯濾布之18" Nutsche濾器中過濾。過濾費時15分鐘。將乙酸乙酯(5.34升)裝入該容器中，再以潤洗方式轉移至濾器中。然後將此批次手動地再懸浮於濾器中，其後再施予真空。此過程乃再重覆進行2次，再將濾塊調理10分鐘。將濾液裝至含有事先製備之15%氯化鈉之水液(16.0升)的100升容器中。將此批次攪動5分鐘，然後令其分離35分鐘。介面並不可見，故將經計算之23升下方水性相移出。將16.0升15%氯化鈉之水液加至此批次中。將此批次攪動6分鐘，然後令其分離7分鐘。介面於約19升時可見，再將下方水性相移出。將17.0升15%氯化鈉之水液加至此批次中。將批次攪動7分鐘，然後令其分離11分鐘。將下方水性相移出。將該容器設置好以供真空蒸餾，再將此批次邊保持批次溫度約21℃邊於2小時20分鐘期間由17.0升濃縮至8.0升。將苯甲酸酐(3.19公斤)及乙酸(18.0升)裝入該容器中。將該容器設置好以供真空蒸餾，再將此批次邊保持批次溫度介於20至55℃間邊於2天期間(保持於20℃過夜)由28.0升濃縮至12.0升。於此時點之¹H NMR分析顯示乙酸與乙酸乙酯之莫耳比為1.0：0.015。將乙酸(4.0升)裝入此批次中，再將此批次蒸餾至12升。¹H NMR分析顯示乙酸與乙酸乙酯之莫耳比為1.0：0.0036。將乙酸(20.0升)裝入此批次中，再將此批次溫度調整至70.0℃。將此批次採樣以供HPLC分析，且2為0.16%。將乙酸鈉 (2.20公斤)加至此批次中，再將批次溫度由72.4℃調整至110.0℃。18.5小時後，HPLC分析顯示無Int.B被檢出。將批次溫度由111.3調整至74.7℃，再將去離子水(30.0升)於2小時期間加至此批次中。將批次溫度調整至20.5℃，然後使用備有聚丙烯濾布之24" Haselloy Nutsche濾器過濾。將先前製備之1：1乙酸之去離子水溶液(10.0升)裝入該容器中，再攪動5分鐘。將此清洗液轉移至濾器，然後將此批次手動地再懸浮於濾器中，其後再施予真空。將去離子水(10.0升)裝至該容器中，然後轉移至濾器。將此批次手動地再懸浮於濾器中，其後再施予真空。將去離子水(10.0升)直接裝入濾器中，然後將此批次手動地再懸浮於濾器中，其後再施予真空。令濾塊調理18小時以得14.4公斤之4。HPLC顯示純度為93.7%。將此濕濾塊進一步地進行純化。於100升夾套式玻璃容器(以氮吹洗)內裝入粗製4(濕塊14.42公斤)、乙酸(48.8升)，再令攪動器起動。將去離子水(1.74升)裝入。將批次(漿液)溫度於4.25小時期間由18.1調整至100.1℃。將此批次保持於100.1至106.1℃ 1小時，然後調整至73.1℃。保持批次溫度介於73.1至70.3℃之間邊將去離子水(28.0升)於1小時期間加至此批次中。將批次溫度進一步由70.3℃調整至25.0℃過夜。將此批次使用備有聚丙烯濾布之24" Haselloy Nutsche濾器過濾。過濾費時13分鐘。製備去離子水(9.00升)與乙酸(11.0升)之溶液，再加至100升該容 器中。將混合物攪動5分鐘，然後轉移至濾塊中。將去離子水(20.0升)裝入該容器中，攪動6分鐘，然後轉移至濾塊中。將去離子水(20.0升)裝入該容器中，攪動9分鐘，然後轉移至濾塊中。令此批次調理3天，然後轉移至乾燥托盤中以供真空烘箱乾燥。於50℃及28英吋汞柱3天後，此批次可得74%產率(3.7公斤)有白色固狀之4。¹H NMR光譜顯示與所派定之結構一致，HPLC分析顯示純度為98.87%且KF分析顯示有0.14%水。

Int.7之合成：於100升夾套式玻璃容器(以氮吹洗)內裝入四氫呋喃(44.4升)。令攪動器起動(125RPM)，再將4(3.67公斤)其後氯化鋰(1.26公斤)裝入。該批次溫度經觀察為26.7℃且為琥珀色溶液。邊保持批次溫度介於24.3與33.6℃之間邊將異丙烯基溴化鎂1.64莫耳之2-甲基四氫呋喃溶液(21.29公斤)於2 ½小時期間加入。將此批次於24.5℃攪動17小時，於此時點之HPLC分析顯示為9%之4。於第2個100升夾套式玻璃容器(以氮吹洗)內裝入3N氯化氫(18.3升)。邊保持批次溫度介於20與46℃之間邊將批次於25分鐘期間轉移至含有3N氫氯酸之該容器中。觀察到雙相溶液。將反應中止之該批次倒轉移回第1個100升容器內以使小量留下之殘留物的反應中止。四氫呋喃係(2.00升)係用作為潤洗液。批次溫度經觀察為40.9℃，再以318RPM攪動45分鐘。將批次溫度調整至21.8℃，再令各層分離。分離費時10分鐘。將下方之水性相(約26.0升)移 出。製備氯化鈉(1.56公斤)之去離子水(14.0升)溶液，再加至此批次中。將其以318RPM攪動10分鐘，再令攪動器停止。分離費時3分鐘。將下方之水性相移出(約16.0升)。將此批次使用約24英吋汞柱及50至55℃之夾套溫度由58.0升真空蒸餾至18.4升。於72升圓底燒瓶內製備氫氧化鉀(2.30公斤)之去離子水(20.7升)溶液。將容器設置好以供使用2蒸餾頭進行常壓蒸餾，再將該批次轉移至72升容器中。四氫呋喃(0.75升)係用作為潤洗液。批次體積約41.0升，將溫度調整至64.1℃，且蒸餾作用係以氮氣吹掃之協助而開始。令加熱持續以將批次溫度帶至85.4℃，而當於此時點蒸餾時，將72升容器設置好以供迴流(批次體積於蒸餾終了之時為約28.0升)。將此批次保持於85℃ 13小時，於此時點之HPLC顯示有0.3%化合物6A。令加熱停止，再將此批次轉移至100升夾套式玻璃容器中。觀察到有固狀物。將批次溫度由70.6℃調整至56.7℃。邊保持批次溫度介於56.7至46.7℃之間邊將先前製備之碳酸氫鈉(2.82公斤)之去離子水(35.0升)溶液於80分鐘期間加入。添加結束之時的批次pH為9.8。將此批次保持於46.7至49.0℃ 40分鐘，然後冷卻至25.0℃。使用18"不鏽鋼Nutsche濾器將此批次過濾。將去離子水(18.4升)裝入該容器中，再轉移至濾器。將濾塊手動地再懸浮於濾器中，然後將液體移除。此過程乃再重覆一次，且濾塊為3"厚。將濾塊於濾器上調理3天，轉移至乾燥托盤上，再於真空烘箱中、於 45℃乾燥，即得2.93公斤Int.7(95%產率)，且HPLC純度為87.6%。

Int.8之合成：於100升夾套式玻璃容器(以氮吹洗且鉛垂至鹼洗滌器中)內裝入酸性酸(13.0升)。將Int.7(2.85公斤)裝入該容器中，再令攪動器起動。將N-氰乙醯基胺基甲酸乙酯(1.56公斤)及去離子水(5.70升)裝入該容器中。將批次溫度由17.0℃調整至5.5℃，由此可觀察到薄漿液。於此時點邊保持批次溫度介於4.8℃至8.8℃之間邊將37%氯化氫(2.70升)於10分鐘期間加入。邊保持批次溫度介於5.8℃至8.7℃之間邊將先前已製備之亞硝酸鈉(638克)之去離子水(1.42升)溶液於26分鐘期間加入。在添加期間可於容器頂部空間觀察到棕色氣體。HPLC顯示無Int.7被檢出。於此時點邊保持批次溫度介於5.5℃至9.5℃之間邊將先前已製備之乙酸鈉(2.07公斤)之去離子水(8.50升)溶液於47分鐘期間加入。添加後，於恰高於此批次高度之上的容器壁可觀察到薄層之橙色殘留物。將批次溫度由9.4℃調整至24.5℃且保持於25℃(±5℃)12小時。將此批次使用備有密編聚丙烯濾布之24" Hastelloy Nutsche濾器過濾。過濾費時30分鐘。將該容器以14.3升1：1酸性酸/去離子水潤洗。將反應器上之橙色殘留物隨著此潤洗液洗掉。再將潤洗液轉移至濾器中，並於此處將批次手動地再懸浮。再度施予真空以移除清洗液。將第二份1：1酸性酸/去離子水清洗液如上地進行，再將此批次於濾器上調理26小時。 濕濾塊之HPLC分析顯示純度為90.4%。將此批次於真空烘箱中、於45℃及28英吋汞柱下乾燥至3.97公斤(91%產率)之恆重。

化合物A N,N-二甲基乙醯胺溶劑化物之製備

於100升夾套式玻璃容器(以氮吹洗)內裝入Int.8(3.90公斤)及乙酸鉀(875克)。將N,N-二甲基乙醯胺(DMAC，18.3升)裝入該容器中，再令攪動器起動。將批次溫度於2小時期間調整至115℃。於115℃ 2小時後，將此批次採樣且HPLC分析顯示有0.27% Int.8餘留。將批之溫度調整至25.0℃過夜。將乙酸(975毫升)加至此批次中，再將此批次攪動另3小時。將此批次轉移至用藤罩保護的大玻璃瓶內，再將容器以800毫升N,N-二甲基乙醯胺潤洗乾淨。將此批次使用真空經由10微米管線濾器轉移回100毫升容器中，且使用N,N-二甲基乙醯胺(DMAC，1.15升)潤洗。過濾在初期快速，但最後變得緩慢，堵塞了濾器。將批次溫度調整至11.1℃，再邊保持批次溫度介於5-15℃之間邊將去離子水(35.1升)於2小時20分鐘期間加入。將此批次保持1小時，再使用備有密編聚丙烯濾布之18" Nutsche濾器過濾。過濾費時15小時。將1：1乙醇/去離子水清洗液(19.5升)裝入該容器中，冷卻至10℃，再轉移至濾塊。令濾塊於氮及真空下調理8小時，再轉移至乾燥托盤上。將此批次於真空烘箱中、於45℃及28英吋汞柱下乾燥，以得89%產率(3.77 公斤)橙色/棕褐色固狀之化合物A N,N-二甲基乙醯胺溶劑化物。¹H NMR光譜與所派定之結構一致，且卡爾費雪(Karl Fischer)分析顯示有0.49%水。XRPD顯示預期之形式，亦即化合物A N,N-二甲基乙醯胺溶劑化物。熱重量分析(TGA)顯示有16%重量喪失。HPLC分析顯示純度為93.67%。

粗製化合物A之製備

於100升夾套式玻璃容器(以氮吹洗)內裝入化合物A N,N-二甲基乙醯胺溶劑化物(3.75公斤)及乙醇(15.0升)。令攪動器起動，再將丙酮(15.0升)加入。將批次溫度於1小時期間由10.6℃調整至60.0℃。於此時點之此批次為溶液形式。邊保持溫度於60±5℃邊將去離子水於1.5小時期間加至此批次中。將批次保持於60±5℃ 1小時，再冷卻至23.5℃。將備有密編(0.67CFM)聚丙烯布之18" Nutsche濾器設置好，再將批次過濾。過濾費時15小時。將1：1乙醇/去離子水清洗液(19.5升)裝入容器中，再轉移至濾塊。令濾塊於氮及真空下調理8小時，再轉移至乾燥托盤上。將此批次於真空烘箱中、於45℃及28英吋汞柱下乾燥五天，即得94%產率(2.90公斤)粉末棕褐色固狀之化合物A。¹H NMR光譜與所派定之結構一致，且卡爾費雪(Karl Fischer)分析顯示有6.6%水。XRPD顯示預期之二水合物形式。熱重量分析(TGA)顯示有6.7%重量喪失。HPLC分析顯示純度為96.4% (AUC)。

粗製化合物A之純化

於50升夾套式玻璃容器(以氮吹洗)內裝入粗製化合物A(2.90公斤)及甲基異丁基酮(14.5升)。令攪動器起動，再將批次溫度於1.5小時期間由20.2℃調整至50.4℃。將批次保持於50℃(±5℃)1小時，再冷卻至20-25℃。將此批次保持於20-25℃ 2.5小時。將備有密編(0.67CFM)聚丙烯布之18" Nutsche濾器設置好，再將批次過濾。過濾費時20分鐘。將甲基異丁基酮(MIBK，1.45升)裝入容器中，再轉移至濾塊。將濾塊手動地再懸浮，再將液體以真空抽離。將甲基異丁基酮(2.90升)裝至濾塊中，再將濾塊手動地再懸浮。將液體以真空抽離，再將濾塊以真空及氮調理15小時。將濾塊乾燥成棕褐色、硬18"×1 ½"圓盤狀物。手動地將其碎裂，再經由咖啡研磨機研磨，即得76%產率(2.72公斤)棕褐色、粉末固狀之MGL-3196 MIBK溶劑化物。無需烘箱乾燥。¹H NMR光譜與所派定之結構一致，且卡爾費雪(Karl Fischer)分析顯示<0.1%水。XRPD顯示預期形式之甲基異丁基酮溶劑化物。熱重量分析(TGA)顯示有17.3%重量喪失。HPLC分析顯示純度為98.5%。

實例6：化合物A轉化成形式I

將純化之化合物A(4802克，1：1甲基異丁基酮溶 劑化物形式，依上示實例5中所述地由Int.8中獲得)連同24升乙醇一起加至100升夾套式反應器中。將所得漿液於1小時25分鐘期間加熱至80±5℃(迴流)，將混合物於彼溫攪拌4小時25分鐘。於2小時55分時之過濾固狀物分析顯示形式之轉化已完全，且XRPD光譜與形式I符合。將混合物於45分鐘期間冷卻至20±5℃，再於彼溫攪拌15分鐘。將漿液過濾，再將濾塊以預過濾之乙醇(2×4.8升)清洗兩次。將濕塊(4.28公斤)於真空下、於40±5℃乾燥118小時，即得3390克化合物A形式I。

X光粉末繞射研究係對不同批號之藉上述方法製得之化合物A形體形式I進行。微粉化後之XRPD證實為形式1。

形式I之數據係提供於下表11中，而形式I之繞射圖提供於圖1。

形式I藉DSC發現熔化起始點約為321℃，接著於熔化後分解(圖2)。

實例7：化合物A形式I之製備：化合物A溶劑化物轉化成形式I

於50升夾套式玻璃容器(以氮吹洗)內裝入得自上述實例5之化合物A甲基異丁基酮溶劑化物(2.72公斤)及乙醇(13.6升)。將攪動器起動，再將批次溫度於1.3小時期間由16.8℃調整至79.4℃。將批次保持於79.5℃ 2小時，再採樣以供XRPD分析。XRPD顯示為形式I，再將此批次於1小時10分鐘期間冷卻至24.9℃。將備 有密編(0.67CFM)聚丙烯布之18" Nutsche濾器設置好，再將批次過濾。過濾費時4分鐘。乙醇(2.8升)裝入容器中，再轉移至濾塊。將濾塊手動地再懸浮，再將液體以真空抽離。將乙醇(2.80升)裝至濾塊中，再將濾塊手動地再懸浮。將液體以真空抽離，再將濾塊以氮及真空下調理1小時。將濾塊轉移至乾燥平底鍋上，再於45℃及28英吋汞柱乾燥一天，即得89%產率(1.96公斤)淡黃色固狀之化合物A。HPLC分析顯示純度為99.6%。XRPD分析與形式I一致。將300克此材料於2"氣流粉碎機上微粉化可得284克(95%產率)微粉化之化合物A。XRPD分析證實微粉化化合物A仍為形式I。

化合物A N,N-二甲基乙醯胺溶劑化物可如同實例7所述地經由二水合物及甲基異丁基酮(MIBK)溶劑化物而轉化成形式I。另外，N,N-二甲基乙醯胺(DMAC)溶劑化物可藉將其以8體積份之乙醇加熱至80℃ 2小時，其後冷卻至室溫再過濾而直接轉化成形式I(產率為75%，產率係由中間體8中計算出)。另一反應中，化合物A樣品(其為N,N-二甲基乙醯胺(DMAC)溶劑化物與二水合物之混合物)係藉將其以8體積份之甲基異丁基酮(MIBK)加熱至80℃，其後冷卻至室溫而轉化成69%產率之形式I。

化合物A與甲狀腺激素受體間之交互作用的模型建構

結晶結構得自RCSB蛋白質資料庫(ID號：1N46、 1NQ0、1NQ1、1NQ2及1NUO)。將蛋白質共結晶使用用於Mac OS X之MacPymol(Copyright 2006 DeLano Scientific LLC；現為Schrodinger公司之產品)來排列。MacPymol亦用於配位體-蛋白質交互作用的所有分析且因而提供圖3-9。這些圖整體地顯示化合物A可較佳地適應THRβ突變體之結構變化。例如，突變體Arg316His中，Arg316突變成His且Arg320略微位移地離間配位體。結果，Arg320與T3間之特定交互作用於Arg316His突變體中較不最理想化。比較之下，化合物A中之大的可負極化雜環形成有利的交互作用，其不被Arg316His突變所干擾。換言之，化合物A(具有較大、較可極化之雜環)維持與Arg320及突變His316之有利交互作用。例如參見圖8及9。結果在其他突變方面亦類似。

下表列出某些TRβ突變體之生化性質。其他突變體及其性質可見於(例如)M.Adams et al.,J Clin Invest.1994；94(2)：506-515,B.R.Huber et al.,Mol Endocrinol,2003,17(4)：643-652；及B.R.Huber et al.,Mol Endocrinol,2003,17(1)：107-116，每一者之內容均整體併入本文中以供參考。

同等物

只要不脫離精髓或主要特徵，本發明可包含其他具體形式。因此前述之實施例在各方面均視為闡述而非對本案所述之本發明有所限制。故本發明範圍係藉由附加之申請專例範圍而非前述說明來指引，且所有在申請專利範圍之定義及等義範圍內之所有變化均欲包含在本案中。

<110> 美商瑪德瑞高製藥公司(Madrigal Pharmaceuticals,Inc.) 瑞士商赫夫曼羅氏股份有限公司(F.Hoffmann-La Roche Ltd)

<120> 用以合成甲狀腺激素類似物及其多形體之方法

<140>

<141> 2013-09-17

<150> US 61/702,137

<151> 2012-09-17

<150> US 61/790,432

<151> 2013-03-15

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 259

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 780

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

Claims (10)

1. 一種2-(3,5-二氯-4-((5-異丙基-6-側氧基-1,6-二氫噠嗪-3-基)氧基)苯基)-3,5-二側氧基-2,3,4,5-四氫-1,2,4-三嗪-6-腈(“化合物A”)之形體形式，其中，該形體形式為二水合物。
2. 一種藥學組成物，其包含如申請專利範圍第1項之形體形式及藥學上可接受之載體。
3. 一種如申請專利範圍第1項之形體形式用於製備治療病患的非酒精性脂肪肝炎之藥物的用途。
4. 一種如申請專利範圍第1項之形體形式用於製備治療病患的脂肪肝疾病之藥物的用途。
5. 一種如申請專利範圍第1項之形體形式用於製備治療病患的高膽固醇血症之藥物的用途。
6. 一種如申請專利範圍第1項之形體形式用於製備治療具有至少一TRβ突變之病患的甲狀腺激素抗性(resistance to thyroid hormone)(RTH)症候群之藥物的用途。
7. 根據申請專利範圍第6項之用途，其中，該病患具有脂肪肝疾病、甲狀腺軸改變、心搏過速、多動行為(hyperkinetic behavior)、甲狀腺功能低下、甲狀腺腫大、注意力不足過動症、學習障礙、聽力喪失、骨齡延遲、或甲狀腺癌。
8. 根據申請專利範圍第6項之用途，其中，該TRβ突變選自由以下所組成之群組：以蘇胺酸(T)取代野生型SEQ ID NO：1之胺基酸位置234的殘基丙胺酸(A) (A234T)；以麩醯胺酸(Q)取代野生型SEQ ID NO：1之胺基酸位置243的殘基精胺酸(R)(R243Q)；以組胺酸(H)取代野生型SEQ ID NO：1之胺基酸位置316的殘基精胺酸(R)(R316H)；及以蘇胺酸(T)取代野生型SEQ ID NO：1之胺基酸位置317的殘基丙胺酸(A)(A317T)。
9. 根據申請專利範圍第1項之形體形式，其中，該二水合物以卡爾費雪(Karl Fischer)分析測定為具有6.6%水(H₂O)。
10. 根據申請專利範圍第1項之形體形式，其係藉由包含以下之方法所製備：(a)將丙酮加至化合物A溶劑化物以製備混合物；(b)將該混合物加熱至第一溫度；(c)保持該混合物於第一溫度，將去離子水加至該混合物；(d)將該混合物冷卻至第二溫度；(e)過濾該混合物以製造濾塊(filter cake)；以及(f)乾燥該濾塊。

Images