TWI710370B - 含有亞鐵胺基酸螯合物粒子的組合物用於製備治療或減緩阿茲海默症或帕金森氏症的醫藥品的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種組合物用於製備治療或減緩神經受損相關疾病的醫藥品的用途，其中所述組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓(Dalton)至600,000道爾頓，所述醫藥品含有有效劑量的所述組合物及藥學上可接受的載劑。本發明的組合物具有治療或減緩神經受損相關疾病，尤其是阿茲海默症及帕金森氏症的效果。

Description

含有亞鐵胺基酸螯合物粒子的組合物用於製備治療或減 緩阿茲海默症或帕金森氏症的醫藥品的用途
本發明涉及含有亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子的組合物的用途，特別是用於治療或減緩神經受損相關疾病。
神經受損包括周邊神經受損及中樞神經受損。周邊神經系統受損傷時，受周邊神經支配的運動、感覺功能會根據損傷的嚴重程度不同，而有不同程度的障礙，臨床上常見的障礙包括肌肉癱瘓無力、痠痛刺麻或感覺的減退、消失。而常見的中樞神經系統損傷造成的疾病或傷害有：腦中風、腦外傷、阿茲海默症(Alzheimer’s disease，AD)、脊髓損傷及帕金森氏症(Parkinson’s disease，PD)。
其中，阿茲海默症為一種慢性神經退化疾病，其患者腦部的自由基(Reactive oxygen species，ROS)異常增加且有組織發炎現象，腦內病理特徵呈現神經纖維糾結(neurofibrillary tangles，NFTs)且大腦皮質及海馬迴有大量β-類澱粉蛋白(β-amyloid，Aβ)沉澱而形成斑塊(senile plaques)，斑塊會使得腦神經細胞營養不足，造成神經細胞的突觸功能喪失。而帕金森氏症是大腦中基底核內的神經細胞受損所引起的。大腦基底核的黑質細胞會產生運動所需的神經傳導物質-多巴胺，當黑質細胞死亡時，多巴胺無法被製造，使得運動的神經訊息無法被傳遞。此外，黑質細胞會受MPP+(N-Methyl-4-phenylpyridinium Iodide，1-甲基-4-苯基吡啶鎓)破壞。多巴胺亦調控另一神經傳導物質-乙醯膽 鹼，當多巴胺的量不足時，將使乙醯膽鹼的量增加，然而過多的乙醯膽鹼將引起常見於帕金森氏患者的震顫及肌肉僵直。
上述疾病為國內常見的腦神經疾病，不僅影響患者個人的健康及生活，亦對患者的家庭生活品質造成嚴重影響。因此尋找一種有效治療或減緩神經受損相關疾病的藥物是目前亟需解決的課題。
為達上述目的，本發明提供一種組合物用於製備治療或減緩神經受損相關疾病的醫藥品的用途，其中所述組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓(Dalton)至600,000道爾頓，所述醫藥品含有有效劑量的所述組合物及藥學上可接受的載劑。
於其中一實施態樣中，較佳地，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均分子量為1,500道爾頓至15,000道爾頓；於另一實施態樣中，較佳地，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均分子量為400,000道爾頓至550,000道爾頓，較佳地，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均分子量為1,500道爾頓至550,000道爾頓，更佳地，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均分子量為525,538道爾頓。
較佳地，所述組合物中的亞鐵胺基酸螯合物的亞鐵與胺基酸的重量比是介於1：1至1：4之間。
較佳地，所述組合物中的亞鐵胺基酸螯合物的亞鐵與胺基酸的重量比是介於1：1.5至1：2.5之間。
較佳地，所述組合物中的亞鐵胺基酸螯合物是由鐵化合物與胺基酸混合並歷經60℃至90℃加熱8小時至48小時所製得的亞鐵胺基酸螯合物， 其中，鐵化合物較佳為無機鐵化合物，更佳為無機亞鐵化合物。其中鐵化合物與胺基酸的重量比例是介於1：1.2至1：1.5之間。
更佳地，所述鐵化合物是硫酸亞鐵、氯化亞鐵、焦磷酸亞鐵或其組合；所述胺基酸是甘胺酸。
本發明另外提供一種組合物用於製備治療或減緩神經受損相關疾病的醫藥品的用途，其中所述組合物由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子所組成，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓至600,000道爾頓，且所述醫藥品由有效劑量的所述組合物及藥學上可接受的載劑所組成。
本發明另外提供一種用於治療或減緩神經受損相關疾病的組合物，其中所述組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓至600,000道爾頓。
本發明另外提供一種用於治療或減緩神經受損相關疾病的組合物，其中所述組合物中由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子所組成，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓至600,000道爾頓。
本發明另外提供一種治療或減緩神經受損相關疾病的方法包含對受體施予有效劑量的一組合物以及藥學上可接受的載劑，其中所述組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓至600,000道爾頓。
本發明另外提供一種治療或減緩神經受損相關疾病的方法，是由對一受體施予一有效劑量的一組合物以及藥學上可接受的載劑所組成，其中 所述組合物由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子所組成，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓至600,000道爾頓。
本發明所述的「有效劑量」是指達成治療或減緩神經受損相關疾病的效果的所需劑量；依據本發明的一些實施例，是指透過施予特定範圍量的含有亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子的組合物，能夠降低β-類澱粉蛋白(β-amyloid，Aβ)對人類神經母細胞瘤細胞的傷害及/或降低MPP+(N-Methyl-4-phenylpyridinium Iodide，1-甲基-4-苯基吡啶鎓)對人類神經母細胞瘤細胞的傷害，或進一步有修復的效果，在本發明的一些實施例是指透過施予特定範圍量的含有亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子的組合物，能夠回復因β-類澱粉蛋白(β-amyloid，Aβ)造成的運動活性下降、記憶保留損害、空間學習能力障礙及乙醯膽鹼酯酶活性的增加。所述回復是指本發明的組合物可使因β-類澱粉蛋白(β-amyloid，Aβ)造成的運動活性下降回升、改善因β-類澱粉蛋白(β-amyloid，Aβ)造成的記憶保留損害、空間學習能力障礙及降低因β-類澱粉蛋白(β-amyloid，Aβ)造成的乙醯膽鹼酯酶活性增加。
依據本發明，有效劑量的計算方式是以本說明書的實驗例中本發明的組合物的濃度8mg/kg至36mg/kg為基準，根據美國食品藥物管理局公告的實驗初期估算方法，以60公斤的成人為基準，劑量換算以人體每日每公斤體重之建議攝取量(/kg b.w./d)的6.2倍為大鼠的1倍劑量換算而得。
較佳地，本發明的組合物的給其中給藥對象可為人類，所述組合物的有效劑量可為1.3mg/kg至5.8mg/kg。
本發明所述之「藥學上可接受的載劑」包含，但不限於還原劑(reducing agent)、溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定 劑(stabilizing agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、表面活性劑(surfactant)，及其他類似或適用本發明的載劑。
較佳地，所述還原劑包含，但不限於抗壞血酸(ascorbic acid)、檸檬酸(citric acid)、乙酸(acetic acid)、丙酸(propionic acid)、丁酸(butyric acid)、乳酸(lactic acid)、羥琥珀酸(malic acid)、磺酸(sulfonic acid)、丁二酸(succinic acid)或其組合。
本發明所述「醫藥品」可以多種形式存在，該等形式包含，但不限於液體、半固體及固體藥劑形式，諸如溶液(solution)、乳劑(emulsion)、懸浮液(suspension)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(capsule)、脂質體、栓劑以及其他類似或適用本發明的劑型。
較佳地，所述醫藥品是經腸道的或非經腸道的劑型。
更佳地，所述經腸道的劑型是口服劑型，其口服劑型是溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、丸劑、口含錠、片劑、口嚼膠或膠囊。
較佳地，所述神經受損相關疾病包括，但不限於阿茲海默症。
較佳地，所述神經受損相關疾病包括，但不限於帕金森氏症。
本發明的組合物能有降低β-類澱粉蛋白和MPP+造成的神經細胞受損情形，並產生修復的效果，亦能清除β-類澱粉蛋白產生的自由基、保護神經細胞免於受自由基的攻擊，並在動物實驗中顯示，能回復因β-類澱粉蛋白(β-amyloid，Aβ)造成的運動活性下降、記憶保留損害、空間學習能力障礙及乙醯膽鹼酯酶活性的增加，因此本發明的組合物可有效治療或減緩神經受損相關疾病，特別是阿茲海默症及帕金森氏症。
圖1 為β-類澱粉蛋白在0、24、48小時對SH-SY5Y細胞的細胞生長造成的影響。
圖2 為本發明的組合物與β-類澱粉蛋白共同處理SH-SY5Y細胞的細胞數相對比例。
圖3 為本發明的組合物與β-類澱粉蛋白共同處理SH-SY5Y細胞的一氧化氮的濃度相對比例。
圖4 為MPP+在0、24、48小時對SH-SY5Y細胞的細胞生長造成影響的相對比例。
圖5 為本發明的組合物與MPP+共同處理SH-SY5Y細胞後的細胞生長相對比例。以平均值±標準差表示。
圖6 為動物實驗日程。
圖7A 為本發明的組合物改善注入β-類澱粉蛋白的大鼠的運動活性：15分鐘內移動距離。以5或6個獨立實驗的平均值±標準差表示。**為與假手術組相比p<0.01；#為與注入β-類澱粉蛋白的大鼠相比p<0.05(Student’s t-test)。
圖7B 為本發明的組合物改善注入β-類澱粉蛋白的大鼠的運動活性：移動平均速度。以5或6個獨立實驗的平均值±標準差表示。**為與假手術組相比p<0.01；#及##分別為與注入β-類澱粉蛋白的大鼠相比p<0.05及p<0.01(Student’s t-test)。
圖8 為本發明的組合物改善注入β-類澱粉蛋白的大鼠在記憶保留測試中抑制性迴避的明室滯留時間。以5或6個獨立實驗的平均值±標準差表示。***為與假手術組相比p<0.001；##及###分別為與注入β-類澱粉蛋白的大鼠相比p<0.01及p<0.001(Student’s t-test)。
圖9A 為本發明的組合物改善β-類澱粉蛋白造成的記憶受損：利用莫里斯水迷宮測定抵達平台的平均時間。以5或6個獨立實驗的平均值±標準差表示。**及***為與假手術組相比p<0.01、p<0.001；#、##及###為與注入β-類澱粉蛋白的大鼠相比p<0.05、p<0.01、p<0.001(Student’s t-test)。
圖9B 為本發明的組合物改善β-類澱粉蛋白造成的記憶受損：利用莫里斯水迷宮測定第一次抵達平台時間。以5或6個獨立實驗的平均值±標準差表示。*為與假手術組相比p<0.05；#及###為與注入β-類澱粉蛋白的大鼠相比p<0.05及p<0.001(Student’s t-test)。
圖10 為本發明的組合物改善注入β-類澱粉蛋白的大鼠大腦皮質乙醯膽鹼酯酶的活性。以5或6個獨立實驗的平均值±標準差表示。*為與假手術組相比p<0.05；#為與注入β-類澱粉蛋白的大鼠相比p<0.05(Student’s t-test)。
發明將由下列的實施例做為進一步說明，這些實施例並不限制本發明前面所揭示的內容。熟習本發明的技藝者，可以做些許的改良與修飾，但不脫離本發明的範疇。
製備例1 製備含有亞鐵胺基酸粒子的組合物
本發明的含有亞鐵胺基酸螯合物粒子的組合物是由台灣配位體股份有限公司製作(批次號碼：F171001；製造日期：2017年10月5日)，且該組合物為冷凍乾燥的粉末，其是以下述方式製備。首先，將硫酸亞鐵與甘胺酸(純度98%以上)以重量比1：1.3混合並歷經60℃至90℃加熱8小時至48小時，以獲得亞鐵胺基酸螯合物，其中亞鐵胺基酸螯合物的亞鐵與胺基酸螯合比例是介於1：1至1：4之間，接著，亞鐵胺基酸螯合物在200-240℃下進行燒結，以獲得亞鐵胺基酸螯合物粒子。經由雷射粒徑分析儀(Beckman Coulter,N5,Submicron Particle Size Analyzer)在水中進行動態光散射測得亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為1465.90±132.29奈米。利用Waters Alliance 2695 System進行凝膠穿透層析儀(GPC)測定數目平均分子量(Mn)、重量平均分子量(Mw)、峰值平均分子量(MP)和多分散性(polydispersity，PDI)，分別為68188道爾頓(Dalton)、525538道爾頓(Dalton)、286426道爾頓(Dalton)及7.707205。
製備例2 實驗動物照護及處理
將六週大的Sprague-Dawley雄性大鼠(樂斯科生物科技，台北)以每籠一組三隻飼養，且大鼠能自由獲取食物及飲水。實驗動物的使用是自中國醫藥大學實驗動物照護及使用委員會取得倫理證明。經過2週的熟悉期，大鼠被隨機的分為五組，每組中有6隻大鼠：(1)對照組(假手術sham操作組)；(2)β-類澱粉蛋白單獨處理組；(3)處理β-類澱粉蛋白及低濃度本發明的組合物(8mg/kg)；(4)處理β-類澱粉蛋白及中濃度本發明的組合物(24mg/kg)；(5)處理β-類澱粉蛋白及高濃度本發明的組合物(36mg/kg)。本發明的組合物的各濃度由台灣配位體股份有限公司(Taiwan Bioligand Co.,Ltd.)提供，本發明的組合物是溶於無菌的蒸餾水中，以餵食管每天一次管餵21天施予大鼠。在本發明的組合物預處理三週後，β-類澱粉蛋白(Tocris，Amyloid β-Peptide(1-42))被注入腦室。
實施例1 β-類澱粉蛋白對神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y的影響
將人類神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y(ATCC® CRL2266TM)以每孔1×105細胞的細胞密度種到有10%FBS DMEM/F12培養基(Gibco 11330032)的24孔細胞培養盤裡，並於37℃、5%CO2培養箱中培養24小時。將溶於PBS 500μM的β-類澱粉蛋白(β-amyloid 1-42 peptide，Taiclone tcsc0032566)，分別添加不同量至培養基中，使SH-SY5Y細胞分別受到0、1、2.5、5μM的β-類澱粉蛋白處理，以0μM的β-類澱粉蛋白處理組為對照組，且每一處理條件為三重複。再於 0小時或37℃、5%CO2培養箱中培養24小時、48小時的時間點，收集細胞用台盼藍(Trypan blue)對細胞進行染色，透過顯微鏡觀察細胞生長情形並計算未經染色的活細胞數目，以對照組為基準，結果如圖1所示，隨β-類澱粉蛋白的處理濃度增加、時間增加，細胞生長的相對比例隨之下降，亦即細胞明顯受損傷。在24及48小時的細胞生長情形中，2.5μM及5μM的β-類澱粉處理組對SH-SY5Y細胞造成損傷相似，且均較1μM處理組造成更嚴重的細胞損傷，因此以2.5μM的β-類澱粉蛋白濃度作為後續SH-SY5Y細胞損傷實驗進行的條件。
實施例2 以本發明的組合物及β-類澱粉蛋白共同處理人類神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y的細胞生長情形
將人類神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y(ATCC® CRL2266TM)以每孔1×105細胞的細胞密度種到有10%FBS DMEM/F12培養基(Gibco 11330032)的24孔細胞培養盤裡，並於37℃、5%CO2培養箱中培養24小時後，將溶於0.1M檸檬酸(pH3.5)的製備例1中的本發明的組合物添加不同量至培養盤中使細胞受0、2.5、5及10μg/mL的本發明的組合物處理1小時，接著將培養基置換為同時含有2.5μM的β-類澱粉蛋白(β-amyloid 1-42 peptide，Taiclone tcsc0032566)及前述不同濃度的本發明的組合物培養基，每一濃度處理三重複，以未受本發明組合物及β-類澱粉蛋白處理的組別為對照組。再於37℃、5%CO2培養箱中培養24小時後，收集細胞用台盼藍(Trypan blue)對細胞進行染色，透過顯微鏡觀察細胞生長情形並計算未經染色的活細胞數目，並以對照組為基準作圖，結果如圖2所示，可看出經由本發明的組合物處理的組別其細胞數相對比例較受β-類澱粉蛋白損傷組要高，且與未損傷的對照組相當，顯示處理本發明的組合物有修復受損傷神經細胞的效果。因此本發明的組合物可用於保護神經細胞。
實施例3 以本發明的組合物及β-類澱粉蛋白共同處理人類神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y的一氧化氮濃度
一氧化氮自由基造成的神經細胞損害與神經病變疾病如阿茲海默症密切相關，本實施例利用測量培養基中的一氧化氮濃度的濃度，測試細胞受一氧化氮自由基攻擊的程度。
將人類神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y(ATCC® CRL2266TM)以每孔1×105細胞的細胞密度種到有10%FBS DMEM/F12培養基(Gibco 11330032)的24孔細胞培養盤裡，並於37℃、5%CO2培養箱中培養24小時後，將溶於0.1M檸檬酸(pH3.5)的製備例1中的本發明的組合物添加不同量至培養盤中使細胞受0、2.5、5及10μg/mL的本發明的組合物處理1小時，接著將培養基置換為同時含有2.5μM的β-類澱粉蛋白(β-amyloid 1-42 peptide，Taiclone tcsc0032566)及前述不同濃度的本發明的組合物培養基，以未受本發明組合物及β-類澱粉蛋白處理的組別為對照組，每一濃度處理三重複。再於37℃、5%CO2培養箱中培養20小時後，收集細胞培養液，以Biovision K262試劑組並參照其使用手冊進行一氧化氮濃度測定，檢測各組的自由基濃度。並以對照組一氧化氮濃度為基準作圖，結果如圖3所示，經由本發明的組合物處理的組別的一氧化氮濃度相對比例均明顯較受β-類澱粉蛋白損傷組要明顯下降，且低於對照組。因此本發明的組合物可用於清除自由基、保護神經細胞免於受自由基的攻擊。
實施例4 SH-SY5Y細胞處理MPP+對細胞存活率的影響
本實施例利用活細胞粒線體的酵素能將MTT試劑(Thiazoly Blue Tetrazolium Bromide)還原成formazan結晶，測量其溶解後的吸光值以反映細胞的存活率。
將人類神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y(ATCC® CRL2266TM)以每孔1×105細胞的細胞密度種到有10%FBS DMEM/F12培養基(Gibco 11330032)的24孔細胞培養盤裡，並於37℃、5%CO2培養箱中培養24小時後，將溶於無菌二次水的100mM MPP+(Sigma D048)添加不同量至培養盤中，使細胞受0、1、 1.25、1.5及2mM的MPP+處理，以0mM的MPP+處理組為對照組，每一濃度處理三重複，再分別於0小時或37℃、5%CO2培養箱中培養24小時、48小時的時間點處理MTT、觀察細胞生長情形，具體而言是將培養盤的培養液置換為500μL的1mg/mL MTT溶液，於37℃、5%CO2培養箱中培養4小時。再來，收集formazan結晶到1.5mL離心管中，並經14,000rpm離心五分鐘後，去除上清液保存於-80℃冰箱中。用100μL的100%乙醇與DMSO(體積比1：1)的溶液溶解formazan結晶後，在振盪器上震盪20分鐘，吸取50μL完全溶解的formazan結晶到96孔細胞培養盤中，用酵素免疫分析測讀儀讀取565nm的吸光值，並以對照組的吸光值為基準作圖，結果如圖4所示，MPP+處理會對SH-SY5Y細胞造成損傷，且隨著MPP+處理的濃度及時間增加，SH-SY5Y細胞的細胞存活率越低。
實施例5 SH-SY5Y細胞處理本發明的組合物及MPP+對細胞存活率的影響
本實施例利用活細胞粒線體的酵素能將MTT(Thiazoly Blue Tetrazolium Bromide)試劑還原成formazan結晶，測量其溶解後的吸光值以反映細胞的存活率。
將人類神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y(ATCC® CRL2266TM)以每孔1×105細胞的細胞密度種到有10%FBS DMEM/F12培養基(Gibco 11330032)的24孔細胞培養盤裡，並於37℃、5%CO2培養箱中培養24小時後，將溶於0.1M檸檬酸(pH3.5)的本發明的組合物添加不同量至培養盤中使細胞受0、5、10及25μg/mL的製備例1中的本發明的組合物處理1小時，接著將培養基置換為由溶於無菌二次水的100mM MPP+(Sigma D048)配置而成的含有1.5M MPP+(Sigma D048)的培養基後，繼續於37℃、5%CO2培養箱中培養24小時後，處理MTT、觀察細胞生長情形，其中每一處理兩重複，以未受本發明組合物及β-類澱粉蛋白處理的組別為對照組。具體而言是將培養盤的培養液置換為500μL的1 mg/mL MTT溶液，於37℃、5%CO2培養箱中培養4小時。再來，收集formazan結晶到1.5mL離心管中，並經14,000rpm離心五分鐘、去除上清液後保存於-80°C冰箱中。用100μL的100%乙醇與DMSO(體積比1：1)的溶液溶解formazan結晶後，在振盪器上震盪20分鐘，吸取50μL完全溶解的formazan結晶到96孔細胞培養盤中，用酵素免疫分析測讀儀讀取565nm的吸光值，並以對照組為基準，得出吸光值相對比例的作圖如圖5所示，處理本發明的組合物的組別不論濃度為何均與僅處理MPP+而未處裡本發明組合物的組別相比，可看出細胞的存活率均有上升的情形，亦即表示本發明的組合物能降低MPP+造成的神經細胞損害，亦有修復的效果。
實施例6 神經手術及實驗日程
依據Wu,C.R.,Lin,H.C.,& Su,M.H.(2014).Reversal by aqueous extracts of Cistanche tubulosa from behavioral deficits in Alzheimer’s disease-like rat model：relevance for amyloid deposition and central neurotransmitter function.BMC complementary and alternative medicine,14(1),202將神經手術方法調整為：在本發明的組合物預處理21天後，將製備例2的所有大鼠以舒泰(Zoletil)麻醉，並固定於立體定位儀(David Kopf)。其中，將一輸液套管植入大鼠的左腦室(自囪門AP-1.5mm,ML+0.8mm,V-3.6mm)、藉由將輸液套管連接迷你滲透壓幫浦(Alzet 2002；Alza,Palo Alto,CA,USA，mini-osmotic pump)維持注入β-類澱粉蛋白(280pmol/天)持續29天，在植入輸液套管及與迷你滲透壓幫浦的連接後，開始注入β-類澱粉蛋白，且此天訂為第0天(day 0)，對照組(假手術組)則是未注入β-類澱粉蛋白。本發明的組合物在行為試驗之前的一小時仍施予大鼠，所述的行為試驗包含運動測試(locomotor test)(在β-類澱粉蛋白注入後的第21天)、抑制性迴避測試(inhibitory avoidance)(在β-類澱粉蛋白注入的第22-23天)、及莫里斯水迷宮(morris water maze)(在β-類澱粉蛋白注入後的第24-28 天)。在第29天，將所有大鼠在最後一次施予本發明的組合物後一小時犧牲以測量大腦皮質中乙醯膽鹼酯酶(acetylcholinesterase,AChE)的活性。其中，手術、本發明的組合物的處理、行為測試的日程如圖6所示。
實施例7 運動活性
大鼠的運動活性測試是依據Wu,C.R.,Tsai,C.W.,Chang,S.W.,Lin,C.Y.,& Huang,L.C.(2015).Carnosic acid protects against 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity in in vivo and in vitro model of Parkinson’s disease：involvement of antioxidative enzymes induction.Chemico-Biological Interactions,225,40-46所述進行，且由開放空間儀(Coulbourn Instruments L.L.C.,PA,USA)測定。將每一大鼠獨立地置於開放空間設備中15分鐘，且使大鼠能於其中自由地移動，移動的距離及速度由Truscan軟體(Coulbourn Instruments L.L.C.,PA,USA，TruScan software v 2.07)記錄。
運動活性結果如圖7A及7B所示，注入β-類澱粉蛋白的大鼠與假手術組相比的移動距離和平均速度均顯著下降，經低濃度、中濃度及高濃度本發明的組合物預處理的大鼠均大幅回復因β-類澱粉蛋白造成的移動距離及速度的下降。
實施例8 抑制性迴避測試
大鼠的抑制性迴避測試流程是依據Wu,C.R.,Lin,H.C.,& Su,M.H.(2014).Reversal by aqueous extracts of Cistanche tubulosa from behavioral deficits in Alzheimer’s disease-like rat model：relevance for amyloid deposition and central neurotransmitter function.BMC complementary and alternative medicine,14(1),202.所述。簡而言之，操作室在實驗期間是維持在一黑暗環境，在訓練日時，將每一大鼠獨立地置於設備的明室5秒鐘後，閘門即開啟，測量大鼠在明室滯留時間(step-through latency)，並在大鼠進入暗室時給予無法避免的電刺激 (0.8mA維持2秒鐘)。電擊後，大鼠被移出暗室，被歸回飼養籠。若大鼠在90秒後仍不進入暗室，則強迫其進入暗室，並給予電刺激。在24小時後，利用類似的流程來記錄在明室滯留時間，以評估記憶的保留。若在明室滯留的時間超過300秒，則視為學習記憶力正常。
記憶保留的評估結果如圖8所示，注入β-類澱粉蛋白的大鼠於明室的滯留時間與假手術組相比顯著下降(p<0.001)，而經預處理低濃度、中濃度、高濃度的本發明的組合物與僅有β-類澱粉蛋白處理的大鼠相比，分別增加了因β-類澱粉蛋白造成下降的明室的滯留時間的254%、201%及198%。
實施例9 莫里斯水迷宮
所有的大鼠經過莫里斯水迷宮測試以測定空間學習能力，其方法如Wu,C.R.,Lin,H.C.,& Su,M.H.(2014).Reversal by aqueous extracts of Cistanche tubulosa from behavioral deficits in Alzheimer’s disease-like rat model：relevance for amyloid deposition and central neurotransmitter function.BMC complementary and alternative medicine,14(1),202所述。簡而言之，於黑色圓型的不銹鋼水池(直徑165公分，高60公分)中，將水充滿至35公分，並控制水溫於23±1℃。將水池分為均等的4個象限，每個象限包含釋放點(release point)。將每隻大鼠在連續四天訓練一天兩次尋找位於東北象限中央、隱藏於水面下1公分的塑膠玻璃平台(直徑10公分)。在每一訓練中，依序將大鼠置於水池的其中一象限的釋放點，且每一大鼠能游最多120秒以尋找平台，若大鼠在該終止時間內未找到平台，則由操作員將大鼠引導到平台。不論是失敗或成功，大鼠都可以在平台上休息15秒。此外，在空間性探測試驗(probe test)中，將塑膠玻璃平台移出，以檢測最後一次訓練的參考記憶。將每隻大鼠自移除平台象限的相對象限釋放，且讓大鼠游泳60秒，測定第一次跨越至原放置平台的象限的時間， 以攝影機及設有EthoVision XT(Noldus Information Technology,Leesburg,VA,USA)軟體的自動影像追蹤系統記錄數據。
在四個訓練天中的八個訓練的空間學習能力結果請同時參考圖9A及9B所示，注入β-類澱粉蛋白的大鼠在尋找平台上花費更多的時間。特別是，在第一天和第三天的訓練中，有注入β-類澱粉蛋白的大鼠相較於假手術組(sham group)在尋找平台的平均時間顯著增加(p<0.01和p<0.001)。相反的，與僅處理β-類澱粉蛋白組相比，本發明的組合物在所有濃度下，均降低了尋找平台的平均時間(p<0.05、p<0.01和p<0.001)(圖9A)。這顯示本發明的組合物改善了注入β-類澱粉蛋白造成的空間學習能力障礙。在最後一次訓練後，進行空間性探測試驗的測定以評估參考記憶，如圖9B所示，注入β-類澱粉蛋白的大鼠相較於假手術組，在第一次抵達原平台所在象限時顯著花費了較多的時間(p<0.05)。而本發明的組合物的低濃度組、中濃度組、高濃度組相較於僅處理β-類澱粉蛋白組的第一次抵達原平台所在象限的時間分別顯著減少了79%、49%及67%(p<0.05及p<0.01)。綜上所述，本發明的組合物改善了β-類澱粉蛋白造成的記憶損害。
實施例10 乙醯膽鹼酯酶活性測量
乙醯膽鹼為腦部重要的神經傳遞物質，乙醯膽鹼酯酶活性過高，將使乙醯膽鹼被分解、濃度降低進而嚴重影響記憶及認知功能，被認為與阿茲海默症密切相關。
在冰磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)中均質化前述實驗的大鼠大腦皮質，將均質物在4℃以12000rpm離心15分鐘後收集上清液，儲存於-80℃以測定乙醯膽鹼酯酶活性。乙醯膽鹼酯酶活性的測定是根據Ellman et al.,1961所述的方法進行。簡而言之，將20μL每一皮質的上清液加入含有90μL 50mM冰PBS緩衝液的96孔盤中，接著將20μL的10mM的5,5'-二硫 代(2-硝基苯甲酸)[5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)]及20μL的75mM碘化硫代乙醯膽鹼(acetylthiocholine iodide)基質，三分鐘後產生黃色的5-thio-2-nitrobenzoic acid產物並讀取在412nm下的吸光值。將假手術組(sham group)的乙醯膽鹼酯酶活性訂為100%
結果如圖10所示，相較於假手術組，β-類澱粉蛋白明顯使大腦皮質的乙醯膽鹼酯酶活性上升了約41.1%(p<0.05)。而與僅處理β-類澱粉蛋白組相比，預處理低濃度及中濃度的本發明的組合物組別降低因β-類澱粉蛋白造成的酵素活性增加分別約26%及32%(p<0.05)。
綜上所述，本發明含有亞鐵胺基酸粒子的組合物(本發明的組合物)可治療或減緩神經受損相關疾病。具體而言，本發明的組合物可修復受β-類澱粉蛋白造成的神經細胞損傷，而β-類澱粉蛋白與阿茲海默症緊密相關；且本發明的組合物可修復MPP+造成的神經細胞損傷，MPP+在文獻中已知可造成帕金森氏症，因此本發明的組合物可用於治療阿茲海默症及帕金森氏症。此外，透過動物實驗證實本發明的組合物可以改善β-類澱粉蛋白造成的乙醯膽鹼酯酶活性增加、記憶損害及行為學表現，再度證實本發明的組合物可用於保護阿茲海默症造成的神經退化。
根據本發明可作的不同修正及變化對於熟悉該項技術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被不當地限制於該等特定具體事實上。事實上，在實施本發明的已述模式方面，對於熟習該項技術者而言顯而易知的不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之內。

Claims (8)

  1. 一種組合物用於製備治療或減緩阿茲海默症或帕金森氏症的醫藥品的用途，其中所述組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓(Dalton)至600,000道爾頓，所述醫藥品含有有效劑量的所述組合物及藥學上可接受的載劑。
  2. 如請求項1所述的用途，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均分子量為1,500道爾頓至550,000道爾頓。
  3. 如請求項1所述的用途，其中所述亞鐵胺基酸螯合物的亞鐵與胺基酸的重量比是介於1：1至1：4之間。
  4. 如請求項1所述的用途，其中所述亞鐵胺基酸螯合物的亞鐵與胺基酸的重量比是介於1：1.5至1：2.5之間。
  5. 如請求項4所述的用途，其中所述亞鐵胺基酸螯合物是由鐵化合物與胺基酸混合並歷經60℃至90℃加熱8小時至48小時所製得的亞鐵胺基酸螯合物，其中鐵化合物與胺基酸的重量比例是介於1：1.2至1：1.5之間。
  6. 如請求項5所述的用途，其中所述鐵化合物是硫酸亞鐵、氯化亞鐵、焦磷酸亞鐵或其組合。
  7. 如請求項1所述的用途，其中所述的亞鐵胺基酸螯合物為亞鐵甘胺酸螯合物。
  8. 如請求項1所述的用途，其中所述有效劑量為1.3mg/kg至5.8mg/kg。
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