TWI717139B - 含有亞鐵胺基酸螯合物粒子的組合物用於製備治療或減緩自體免疫相關疾病的醫藥品的用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種組合物用於製備治療或減緩自體免疫相關疾病的醫藥品的用途，其中所述組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓(Dalton)至600,000道爾頓，所述醫藥品含有有效劑量的所述組合物及藥學上可接受的載劑。本發明的組合物具有治療或減緩自體免疫相關疾病，尤其是類風濕性關節炎和異位性皮膚炎的效果。

Description

含有亞鐵胺基酸螯合物粒子的組合物用於製備治療或減緩自體免疫相關疾病的醫藥品的用途

本發明涉及含有亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子的組合物的用途，特別是用於治療或減緩自體免疫相關疾病。

自體免疫相關疾病是當身體的免疫系統功能失衡時，也就是免疫系統將體內的組織或器官視為外來的物質或病原體而攻擊，常使受攻擊的組織、器官慢性發炎甚或失去功能。常見的自體免疫疾病包括：類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡、異位性皮膚炎等。

類風濕性關節炎常因發炎導致細胞浸潤(cellular infiltration)、滑膜增生(synovial hyperplasia)，並進一步造成骨質侵蝕(bone erosion)，而基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族中的MMP-2、MMP-9因可分解明膠、I型、IV型、V型和IX型膠原及黏合素(integrin)等關節軟骨的重要成分，因而被認為與類風濕性關節炎密切相關。

異位性皮膚炎的症狀有發癢、紅腫、皮膚龜裂，且容易反覆發作難以根治。目前已知環境、心理因素及氧化壓力(如：自由基)會引起免疫失調的遺傳預先傾向性(genetic predisposition)者的皮膚的發炎變化並造成異位性皮膚炎的臨床症狀。

由於自體免疫疾病是全身性的問題且確診困難，自體免疫疾病的治療相較於一般疾病更為辛苦且漫長，因此尋找一種有效治療或減緩自體免疫相關疾病的藥物是目前亟需解決的課題。

為達上述目的，本發明提供一種組合物用於製備治療或減緩自體免疫相關疾病的醫藥品的用途，其中所述組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓(Dalton)至600,000道爾頓，所述醫藥品含有有效劑量的所述組合物及藥學上可接受的載劑。

於其中一實施態樣中，較佳地，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均分子量為1,500道爾頓至15,000道爾頓；於另一實施態樣中，較佳地，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均分子量為400,000道爾頓至550,000道爾頓，較佳地，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均分子量為1,500道爾頓至550,000道爾頓，更佳地，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均分子量為525,538道爾頓。

較佳地，所述組合物中的亞鐵胺基酸螯合物的亞鐵與胺基酸的重量比是介於1：1至1：4之間。

較佳地，所述組合物中的亞鐵胺基酸螯合物的亞鐵與胺基酸的重量比是介於1：1.5至1：2.5之間。

較佳地，所述組合物中的亞鐵胺基酸螯合物是由鐵化合物與胺基酸混合並歷經60ºC至90ºC加熱8小時至48小時所製得的亞鐵胺基酸螯合物，其中，鐵化合物較佳為無機鐵化合物，更佳為無機亞鐵化合物。其中鐵化合物與胺基酸的重量比例是介於1：1.2至1：1.5之間。

更佳地，所述鐵化合物是硫酸亞鐵、氯化亞鐵、焦磷酸亞鐵或其組合；所述胺基酸是甘胺酸。

本發明另外提供一種組合物用於製備治療或減緩自體免疫相關疾病的醫藥品的用途，其中所述組合物由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子所組成，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2,600奈米、平均分子量為1,500道爾頓至600,000道爾頓，且所述醫藥品由有效劑量的所述組合物及藥學上可接受的載劑所組成。

本發明另外提供一種用於治療或減緩自體免疫相關疾病的組合物，其中所述組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2,600奈米、平均分子量為1,500道爾頓至600,000道爾頓。

本發明另外提供一種用於治療或減緩自體免疫相關疾病的組合物，其中所述組合物由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子所組成，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2,600奈米、平均分子量為1,500道爾頓至600,000道爾頓。

本發明另外提供一種治療或減緩自體免疫相關疾病的方法，其包含對受體施予有效劑量的組合物以及藥學上可接受的載劑，其中所述組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2,600奈米、平均分子量為1,500道爾頓至600,000道爾頓。

本發明另外提供一種治療或減緩自體免疫相關疾病的方法，其由對受體施予有效劑量的組合物以及藥學上可接受的載劑所組成，其中所述組合物由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子所組成，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓至600,000道爾頓。

本發明所述的「有效劑量」是指達成治療或減緩自體免疫相關疾病的效果的所需劑量；依據本發明的一些實施例，是指透過施予特定範圍量的含有亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子的組合物，能夠降低巨噬細胞產生的一氧化氮自由基、降低嗜鹼性球的去顆粒作用、抑制基質金屬蛋白酶的分泌、抑制單核球細胞的遷移、抑制NF-κB及IKK-β途徑、降低類風濕性關節炎跛行發生率、炎症程度、減緩異位性皮膚炎造成的搔癢、病兆嚴重程度、加速皮膚的修復及增加自由基清除率等。

依據本發明，有效劑量的計算方式是以本說明書的實驗例中本發明的組合物的濃度為基準，根據美國食品藥物管理局公告的實驗初期估算方法，以60公斤的成人為基準，劑量換算以人體每日每公斤體重之建議攝取量(/kg b.w./d)的3.1倍為兔子的1倍劑量換算而得。

較佳地，本發明的組合物的給藥對象可為人類，所述組合物的有效劑量可為2.5 mg/kg 至10 mg/kg。

依據本發明，有效劑量的計算方式是以本說明書的實驗例中本發明的組合物的濃度為基準，根據美國食品藥物管理局公告的實驗初期估算方法，以60公斤的成人為基準，劑量換算以人體每日每公斤體重之建議攝取量(/kg b.w./d)的1.8倍為狗的1倍劑量換算而得。

較佳地，本發明的組合物的給藥對象可為人類，所述組合物的有效劑量可為1 mg/kg至10 mg/kg。較佳地，所述組合物的有效劑量可為3 mg/kg至7 mg/kg，更佳地，所述組合物的有效劑量可為5.5 mg/kg。

本發明所述之「藥學上可接受的載劑」包含，但不限於還原劑(reducing agent)、溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、表面活性劑(surfactant)，及其他類似或適用本發明的載劑。

較佳地，所述還原劑包含，但不限於抗壞血酸(ascorbic acid)、檸檬酸(citric acid)、乙酸(acetic acid)、丙酸(propionic acid)、丁酸(butyric acid)、乳酸(lactic acid)、羥琥珀酸(malic acid)、磺酸(sulfonic acid)、丁二酸(succinic acid)或其組合。

本發明所述的「醫藥品」可以多種形式存在，該等形式包含，但不限於液體、半固體及固體藥劑形式，諸如溶液(solution)、乳劑(emulsion)、懸浮液(suspension)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(capsule)、脂質體、栓劑以及其他類似或適用本發明的劑型。

較佳地，所述醫藥品是經腸道的或非經腸道的劑型。

更佳地，所述經腸道的劑型是口服劑型，其口服劑型是溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、丸劑、口含錠、片劑、口嚼膠或膠囊。

較佳地，所述治療或減緩自體免疫相關疾病是藉由包括抑制免疫細胞的去顆粒作用。

更佳地，前述免疫細胞為肥大細胞。

其中，前述抑制免疫細胞的去顆粒作用可降低組織胺的釋出量。

較佳地，所述自體免疫相關疾病包括，但不限於類風濕性關節炎。

較佳地，所述自體免疫相關疾病包括，但不限於異位性皮膚炎。

本發明的組合物有降低巨噬細胞產生的一氧化氮自由基、降低嗜鹼性球的去顆粒作用、抑制基質金屬蛋白酶的分泌、抑制單核球細胞的遷移、抑制NF-κB及IKK-β途徑及增加自由基清除率等功效，並在動物實驗中顯示，能降低類風濕性關節炎跛行發生率、炎症程度並能減緩異位性皮膚炎造成的搔癢、病兆嚴重程度及加速皮膚的修復等，因此本發明的組合物可有效治療或減緩自體免疫相關疾病，特別是類風濕性關節炎及異位性皮膚炎。

發明將由下列的實施例做為進一步說明，這些實施例並不限制本發明前面所揭示的內容。熟習本發明的技藝者，可以做些許的改良與修飾，但不脫離本發明的範疇。

製備例1　製備含有亞鐵胺基酸粒子的組合物

本發明的含有亞鐵胺基酸螯合物粒子的組合物是由台灣配位體股份有限公司製作(批次號碼：F171001；製造日期：2017年10月5日)，且該組合物為冷凍乾燥的粉末，其是以下述方式製備。首先，將硫酸亞鐵與甘胺酸(純度98%以上)以重量比1：1.3混合並歷經60°C至90°C加熱8小時至48小時，以獲得亞鐵胺基酸螯合物，其中亞鐵胺基酸螯合物的亞鐵與胺基酸螯合比例是介於1：1至1：4之間，接著，亞鐵胺基酸螯合物在200-240°C下進行燒結，以獲得亞鐵胺基酸螯合物粒子。經由雷射粒徑分析儀(Beckman Coulter, N5, Submicron Particle Size Analyzer)在水中進行動態光散射測得亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為1465.90±132.29 奈米。利用Waters Alliance 2695 System進行凝膠穿透層析儀(GPC)測定數目平均分子量(Mn)、重量平均分子量(Mw)、峰值分子量(MP)和多分散性(polydispersity，PDI)，分別為68188道爾頓、525,538道爾頓、286,426道爾頓及7.707205。

製備例2　培養巨噬細胞Raw264.7

將巨噬細胞Raw264.7(財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 BCRC，60001)以含有10%熱失活的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 培養基(Gibco 11965092)培養於37°C、5%二氧化碳的培養箱中，至約八分滿。

製備例3　培養嗜鹼性球細胞RBL-2H3

將嗜鹼性球細胞RBL-2H3(財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 BCRC，60310)以Minimum Essential Medium (MEM) 培養基(Gibco 11095-080)培養於37°C、5%二氧化碳的培養箱中，至約八分滿。

製備例4　培養滑膜肉瘤細胞SW982

將滑膜肉瘤細胞SW982(財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 BCRC，60535)以含有10%FBS 的L15培養基(Gibco，11415-064)培養於37°C、0%二氧化碳的培養箱中，至約八分滿。

製備例5　培養單核球細胞THP-1

將單核球細胞THP-1(財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 BCRC，60430)以含有10%熱失活的胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI1640培養基(Gibco，A10491-01)培養於37°C、5%二氧化碳的培養箱中至約八分滿。

製備例6　類風濕性關節炎實驗動物

紐西蘭大白兔，3月齡，體重約3公斤共6隻。並參考Trivillin et al. (2014). Boron neutron capture synovectomy (BNCS) as a potential therapy for rheumatoid arthritis: boron biodistribution study in a model of antigen-induced arthritis in rabbits. Radiation and environmental biophysics, 53(4), 635-643進行抗原誘導關節炎(antigen-induced arthritis)模式，方法如下所述：

(1) 兔子接受2次皮內注射卵白蛋白乳劑 (Ovoalbumin emulsion，OVA, Sigma Chemicals, USA, 5 mg/mL 在0.9% NaCl中)，OVA先以1:1比例與完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant) (Difco, USA)混合製成乳劑。2次皮內注射間隔為15天。

(2) 兔子於第2次皮內注射後的第10天及第20天，分別於右膝關節內注射1 mL OVA (5 mg/mL，在0.9% NaCl中)。

(3) 兔子於第1次關節內注射OVA後的第50-60天期間，評估抗原誘導關節炎的臨床徵狀(關節腫脹、觸診時的疼痛反應)。

製備例7　異位性皮膚炎實驗動物

納入本研究的動物共有15隻患有異位性皮膚炎的動物，分別為14隻犬、1隻貓，均為1歲齡以上，有一隻犬隻在研究計畫途中退出，因此總共有14隻動物的研究結果資料呈現。

實施例1 本發明的組合物對巨噬細胞Raw 264.7生長的影響

本實施例利用活細胞粒線體的酵素能將MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)試劑還原成formazan結晶，測量其溶解後的吸光值以反映細胞的存活率。MTT試驗方法如下所述： (1)將本發明的組合物先溶於0.1 M檸檬酸配製成濃度 250 mg/mL的溶液 (pH3.5)，再進一步稀釋成25、50、100 μg/mL的濃度。 (2)取製備例2的巨噬細胞Raw264.7，以每孔4×10⁴ 細胞的密度種植到24孔細胞培養盤中，並於37°C、5% CO₂ 培養箱中培養24小時。 (3)以步驟(1)中的不同濃度本發明的組合物處理步驟(2)的巨噬細胞Raw264.7，並以0 μg/mL的本發明的組合物為對照組，每一條件於相同的兩組試驗中各進行三重複。 (4)分別在0、24、48及72小時的時間點加入MTT，並觀察細胞生長情形。亦即，在前述每一時間點將每一格細胞中的培養液置換成500 μL 的0.5 mg/mL 的MTT(Sigma，M2128)溶液，接著，於37°C、5%CO₂ 培養箱中培養4小時後，將MTT溶液移除。 (5) 偵測formazan吸光值。具體而言，用200 μL的100% 乙醇與DMSO(體積比1：1)的溶液溶解formazan結晶後，在振盪器上震盪20分鐘讓formazan結晶完全溶解，吸取50 μL溶液到96孔細胞培養盤中，用酵素免疫分析測讀儀讀取565 nm的吸光值，並以對照組的吸光值為基準作圖。

結果如圖1所示，本發明的組合物對免疫細胞(巨噬細胞)不具毒性，甚至相較於對照組顯示可些微促進免疫細胞生長。

實施例2　本發明的組合物對單核球細胞THP-1生長的影響

本實施例同實施例1的方法，但改以製備例5的單核球細胞THP-1(細胞密度為每孔3×10⁵ 細胞)進行實驗，且本發明的組合物的使用濃度為50、100、250 μL/mL)。利用活細胞粒線體的酵素能將MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)試劑還原成formazan結晶，測量其溶解後的吸光值以反映細胞的存活率。

結果如圖2所示，本發明的組合物對免疫細胞(單核球細胞)不具毒性，甚至相較於對照組顯示可些微促進免疫細胞生長。

實施例3　本發明的組合物對發炎模型中巨噬細胞Raw264.7產生一氧化氮的影響

當巨噬細胞受到外來物刺激時，會增加誘發型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表現，產生大量一氧化氮，此為巨噬細胞參與免疫反應及發炎的重要機制。因此以格蘭氏陰性菌產生的內毒素－脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)刺激巨噬細胞生成一氧化氮，並測試本發明組合物對一氧化氮生成濃度的影響，試驗方法如下： (1) 將本發明的組合物先溶於0.1 M檸檬酸配製成濃度 100 mg/mL的溶液(pH3.5)，再進一步稀釋成25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的濃度。 (2) 取製備例2的巨噬細胞Raw264.7，以每孔1×10⁶ 細胞的密度種植到24孔細胞培養盤中，並於37°C、5%CO₂ 培養箱中培養24小時。 (3) 以步驟(1)中的不同濃度本發明的組合物處理步驟(2) 巨噬細胞Raw264.7兩個小時，並以0 μg/mL為對照組，每一條件於相同的兩組試驗中各進行三重複，接著經本發明的組合物處理的組別再加入1 μg/mL的脂多醣 (Sigma，L4391)，另以僅加入1 μg/mL脂多醣的巨噬細胞Raw264.7為正對照組，繼續培養20小時。 (4)收集細胞培養液，以Biovision K262試劑組並參照其使用手冊進行一氧化氮濃度測定，並以對照組一氧化氮濃度為基準作圖。

結果如圖3所示，本發明的組合物可以在脂多醣誘導之發炎反應中，抑制巨噬細胞生成一氧化氮，抑制發炎反應。

實施例4　經本發明組合物處理的嗜鹼性球細胞RBL-2H3去顆粒作用(degranulation)的β-己糖胺酶(β-hexosaminidase)釋放量

嗜鹼性球細胞和肥大細胞在體內的功用主要是在受到過敏原刺激時進行去顆粒作用釋放β-己糖胺酶、類胰蛋白酶、組織胺(histamine)等過敏介質(mediators)引起免疫反應。由於嗜鹼性球細胞RBL-2H3的性質與肥大細胞(mast cell)相似，因此本實驗使用嗜鹼性球細胞RBL-2H3模擬肥大細胞所釋放出的過敏介質中的β-己糖胺酶以評估去顆粒作用的發生，試驗方法如下所述： (1) 將本發明的組合物先溶於0.1 M檸檬酸配製成濃度 100 mg/mL的溶液(pH3.5)，再進一步稀釋成10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的濃度。 (2)將製備例3的培養的嗜鹼性球細胞RBL-2H3培養皿加入1 mL胰蛋白酶(trypsin)裂解液靜置於37°C、5%二氧化碳的培養箱中，加入2 mL MEM培養基製成細胞懸浮液後放入水平離心機以1000 rpm離心3分鐘後移除上清液以去除胰蛋白酶後，加入新鮮培養液重新懸浮細胞後取20 μL置於細胞計數盤上計數細胞，將細胞以每孔4×10⁴ 的細胞密度種植於96孔盤中。 (3)待細胞完全貼附後，加入anti-dinitrophenyl IgE (Sigma，D8406)，使每一孔的最終濃度達1 μg/mL致敏18小時。 (4)以PBS清洗3次完全去除anti-dinitrophenyl IgE後，加入100 μL MEM培養基並於實驗組分別加入步驟(1)中的不同濃度本發明的組合物及0.1 M檸檬酸(即，0 μg/mL本發明的組合物)作為對照組，處理時間為1小時，每一條件於相同的兩組試驗中各進行三重複。 (5)接著使用tyrode’s buffer (135mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl₂ , 1.8mM CaCl₂ , 20mM Hepes, pH 7.4，使用當天再加入0.04%BSA)清洗2次，接著每孔添加100 μL tyrode’s buffer並加入DNP-BSA (Thermo fisher，A23018)使其最終濃度為0.5 μg/mL，靜置於37°C烘箱刺激30分鐘。 (6)刺激期間配製pNAG(Merck，487052) 3.5 mg/mL 檸檬酸緩衝液(citrate buffer)，分注到新的96孔盤，共兩盤，一盤標註上清液(supernatant)、另一盤標註細胞液(lysate)。 (7)吸取50 μL上清液置入於標有上清液的pNAG 96孔盤內，接著放入37°C烘箱90分鐘。 (8)對含有細胞的96孔盤每孔加入150 μL 0.1% Triton X-100，並用分注器上下吸取5次後放入37℃烘箱10分鐘，接著吸取50 μL置入標有細胞液的pNAG 96孔盤內，接著放入37℃烘箱90分鐘。 (9)中止反應，每孔加入100 μL 400 mM甘胺酸(glycine)溶液，當顏色轉變為黃色時代表有β-己糖胺酶存在，使用酵素免疫測讀儀偵測405 nm下的吸光值。 (10)去顆粒百分比為100x(上清液含量)/ (上清液含量＋細胞液含量)，但上清液只取了1/2、裂解液只取了1/4，且裂解液中亦包含一部份來自上清液的β-己糖胺酶，所以應改為%=100x[2x(上清-培養盤 blank)]/ [1/2(上清-盤養盤 blank)]＋[4x(細胞液-盤養盤 blank)]，並以對照組的去顆粒百分比為基準作圖。

結果如圖4所示，經由本發明的組合物處理的組別β-己糖胺酶釋放百分比相較於對照組低降，且隨著處理本發明的組合物濃度的增加，β-己糖胺酶釋放的量下降，顯示本發明的組合物可以降低嗜鹼性球細胞或肥大細胞的去顆粒作用、抑制免疫細胞的去顆粒作用、降低類風濕性關節炎的發炎反應。

實施例5　本發明的組合物對滑膜肉瘤細胞SW982生長的影響

類風濕性關節炎的關節軟骨和骨的損傷主要是由於滑膜細胞的增生所引起，而滑膜細胞的增生可經由腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的刺激所引起。本實施例以TNF-α刺激滑膜肉瘤細胞並利用活細胞粒線體的酵素能將MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)試劑還原成formazan結晶，測量其溶解後的吸光值以反映細胞的生長、存活率。本實驗的步驟如下所述： (1)將本發明的組合物先溶於0.1 M檸檬酸配製成濃度 250 mg/mL的溶液 (pH3.5)，再進一步稀釋成50、100、250、500 μg/mL的濃度。 (2)取製備例4的滑膜肉瘤細胞SW982，以每孔2×10⁴ 細胞的密度種植到24孔細胞培養盤中，並於37°C、0% CO₂ 培養箱中培養24小時。 (3)將細胞分別以0或10 ng/mL的TNF-α蛋白質(R&D，210-TA)處理，並置於37°C培養箱培養24小時。 (4)以步驟(1)中的不同濃度本發明的組合物處理步驟(3)的滑膜肉瘤細胞SW982，並以0 μg/mL的本發明的組合物為對照組，每一條件於相同的兩組試驗中各進行三重複。 (5)分別在0、24、48及72小時的時間點加入MTT，並觀察細胞生長情形。亦即，在前述每一時間點將每一格細胞中的培養液置換成500 μL 的1 mg/mL 的MTT(Sigma，M2128)溶液，接著，於37°C培養箱中培養3小時後，將MTT溶液移除。 (6)偵測formazan吸光值。具體而言，用200 μL的100% 乙醇與DMSO(體積比1：1)的溶液溶解formazan結晶後，在振盪器上震盪20分鐘讓formazan結晶完全溶解，吸取50 μL溶液到96孔細胞培養盤中，用酵素免疫分析測讀儀讀取565 nm的吸光值，並以對照組的吸光值為基準作圖。

結果如圖5所示，以TNF-α蛋白質處理的滑膜肉瘤細胞SW982相較於對照組細胞異常增生。而隨著處理本發明的組合物濃度的增加，增加了滑膜肉瘤細胞增生的抑制。因此本發明的組合物能有效抑制滑膜肉瘤細胞SW982的增生而降低類風濕性關節炎的發生。

實施例6　基質金屬蛋白酶酵素圖譜(Zymography)

基質金屬蛋白酶會分解關節軟骨的重要成分，因此被認為與類風濕性關節炎密切相關，而基質金屬蛋白酶一般以酶原(zymogen，pro-MMP)的形式表現，分泌、活化後成為MMP。本實驗以酵素圖譜測試滑膜肉瘤細胞SW982的培養液中Pro-MMP-9、MMP-9的量，實驗步驟如下所述： (1)將本發明的組合物先溶於0.1 M檸檬酸配製成濃度 250 mg/mL的溶液，再進一步稀釋成50、100、250、500 μg/mL的濃度。 (2)取製備例4的滑膜肉瘤細胞SW982，以每孔3×10⁵ 細胞的密度種植到6孔細胞培養盤中，並於37°C培養箱中培養24小時。 (3)先用PBS清洗細胞一次，接著以1 mL含有10 ng/mL TNF-α蛋白質(R&D，210-TA)之無血清L15培養液處理每孔細胞，並置於37℃培養箱培養24小時。 (4)以步驟(1)中的不同濃度本發明的組合物及0.1 M檸檬酸(即，0 μg/mL本發明的組合物)處理步驟(2)的滑膜肉瘤細胞SW982 48小時。 (5)收集每孔的培養液，並加入1 mM苯甲基磺醯氟(Phenylmethanesulfonyl Fluoride，PMSF)(Applichem，A0999.0005)，再以400xg離心5分鐘，去除沉澱物後，置於冰上保冰。 (6)取10 μL培養液混合5x loading buffer (不含β-Mercaptoethanol或其他還原劑)後，注入0.1% Gelatin-7.5% SDS-PAGE進行電泳，並以含有Pro-MMP-9、MMP-9兩蛋白質的肺腺癌細胞 A549的培養液為對照組。 (7)跑膠完畢後，取出膠體置入washing buffer (2.5% triton X-100)中，室溫搖盪30分鐘，重複兩次。 (8)膠體用d.d H₂ O清洗一次，接著置入reaction buffer (40mM Tris-HCl, pH 8.0, 10mM CaCl₂ , 0.01% NaN₃ )，在37°C下搖晃12-16小時。 (9) 用d.d H₂ O清洗兩次膠後，以0.25% Coomassie blue R-250 (Panreac，254932)染色20分鐘。 (10)用退色液(50% methanol, 7% acetic acid)退染、封膠。

結果如圖6所示，對照組的Pro-MMP-9明顯少於以本發明的組合物處理的組別，而以本發明的組合物處理的滑膜肉瘤細胞SW982分泌的MMP-9基質金屬蛋白酶明顯比對照組要高，可見得對照組的Pro-MMP-9相較於以本發明的組合物處理的組別大量修飾成為活化的MMP-9。且隨著本發明的組合物處理濃度越高，越可以抑制滑膜肉瘤細胞SW982分泌Pro-MMP-9、MMP-9基質金屬蛋白酶。本發明的組合物可通過抑制基質金屬蛋白酶分泌來抑制關節軟骨的重要成分分解，而達到治療或減緩類風濕性關節炎的效果。

實施例7　本發明的組合物對類風濕性關節炎造成的發炎細胞聚集的影響

發炎反應的發生會使破壞的組織釋出組織胺，而增加血管的通透性，使嗜中性球、單核球聚集、進行分化產生免疫反應。 (一)製備SW982 條件培養基(conditioned medium)： (1)取製備例4的滑膜肉瘤細胞SW982，以每孔3×10⁵ 細胞的密度種植到6孔細胞培養盤中，並於37°C培養箱中培養24小時。 (2)以含有0或10 ng/mL TNF-α蛋白質(R&D，210-TA)之10% FBS L15培養基處理細胞，並在37°C培養箱中培養24小時。 (3)用PBS清洗細胞一次，將培養液換成含10 ng/mL的TNF-α蛋白質及0、50、100、250或500 μg/mL的本發明的組合物的無血清 L15培養基，放置到37°C培養箱中培養24小時，對照組為 0μg/mL 的本發明的組合物且無TNF-α蛋白質處理。 (4)收集培養液，離心400xg五分鐘，去除沉澱物後備用。 (二)細胞遷移試驗(Migration assay) (1)收集製備例5的單核球細胞THP-1，用PBS清洗兩次後，使細胞懸浮在1 mL的0.5%FBS L15 培養液，置入37℃培養箱裡使細胞飢餓兩小時。 (2)取300μl的THP-1細胞液(含有1×10⁵ 細胞)種入上層孔盤 (Corning，3421)裡，接著將所述上層孔盤放入含600 μL的0.5%FBS SW982條件培養基之24孔培養盤中。 (3)將培養盤置入37℃培養箱裡，使細胞爬行2小時。 (4)取出上層孔盤，並將培養液移除，接著將上層孔盤浸入甲醇中，固定8分鐘後，取出上層孔盤、風乾。 (5)用1/10稀釋的Giemsa溶液(Fluka，48900)染上層孔盤表面的細胞一小時，接著用棉花棒將上層孔盤上方擦拭乾淨。 (6)數細胞，並以對照組的細胞數為基準作圖。

結果如圖7所示，單純經TNF-α蛋白質刺激組相較於對照組，遷移的單核球細胞THP-1數量明顯增加，而處理有本發明的組合物的組別則具有抑制單核球細胞THP-1遷移的能力，且隨濃度增加，抑制單核球細胞THP-1遷移的能力越明顯。因此，本發明的組合物能有效抑制類風濕性關節炎引起之發炎細胞聚集、減緩類風濕性關節炎的發炎程度。

實施例8　本發明的組合物對TNF-α蛋白質刺激的滑膜肉瘤細胞SW982的IKK-β及RelA (NF-κB)途徑的影響

轉錄因子RelA(NF-κB)的活化在免疫、發炎的反應中扮演重要的角色。在受到外來刺激如TNF-α時，IKK也會被磷酸化進一步使IKK-β分解，並使NF-κB呈現活化的狀態，受活化的NF-κB會進入細胞核中引發特定基因的表現、產生大量的發炎因子造成後續的發炎反應。因此本實驗透過測定TNF-α蛋白質刺激的滑膜肉瘤細胞SW982後細胞質中的IKK-β及細胞核的中NF-κB的量以測試異常發炎的發生。 (一)蛋白質萃取 (1)將本發明的組合物先溶於0.1M檸檬酸配製成濃度 250 mg/mL的溶液(pH3.5)，再進一步稀釋成50、100、250、500 μg/mL的濃度。 (2)取製備例4的滑膜肉瘤細胞SW982以每孔3×10⁵ 細胞的密度種植到6孔細胞培養盤中，並於37°C培養箱中培養24小時。 (3)將細胞分別處理0或10 ng/mL的TNF-α蛋白質(R&D，210-TA)，並置於37°C培養箱培養24小時。 (4)以步驟(1)中的不同濃度本發明的組合物處理細胞，並以0.1M檸檬酸溶液為對照組，放置到37°C培養箱培養24小時後，收集細胞。 (5)萃取蛋白質：用PBS清洗細胞2次後，將培養盤置於冰上，加入含有蛋白酶抑制劑(protease inhibitor) (Thermo Pierce，87786)的100 μL RIPA lysis buffer (Sigma，R0278)，用刮勺將細胞刮下來並收集到離心管中，再置於冰上20分鐘。接著以12,000 rpm離心10分鐘，分別收集細胞質上清液蛋白質及細胞核蛋白質。利用BCA試劑組(Thermo Pierce，23227)定量蛋白質濃度，分配等量的蛋白質與sample buffer(Sigma，S3401)混勻，沸水煮10分鐘。 (二)西方墨點法： (1)配製9% SDS-PAGE，取30 μg的前述步驟(一)之(5)的蛋白質檢體進行蛋白質電泳，接著轉印一小時。 (2)取出轉印好的硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane，NC membrane)，浸入3% 脫脂乳中進行blocking一小時。 (3)將硝酸纖維素膜置換到一級抗體中，室溫作用4小時。(β-Actin：Novus，NB600-501；RelA(NF-κB) Novus，NBP1-96139)，並以β-Actin及Lamin B1 (Novus，NB100-56403)分別作為細胞質和細胞核的loading control 蛋白質。 (4)使用3% 脫脂乳清洗硝酸纖維素膜三次。 (5)將硝酸纖維素膜置換到二級抗體中，室溫作用2小時。(Goat anti rabbit IgG(H+L) HRP JacksonImmunoResearch，111-035-003、Goat anti mouse IgG(H+L) HRP JacksonImmunoResearch，115-035-003)。 (6)TBS buffer清洗硝酸纖維素膜三次後以定影劑、顯影劑 (Kodak，1901875)顯影。

細胞核蛋白質結果如圖8所示，以本發明的組合物處理的組別中細胞核的RelA(NF-κB)的量均較對照組低，且隨處理本發明的組合物的濃度越高，滑膜肉瘤細胞SW982細胞核中的RelA(NF-κB)量越低，因此本發明的組合物可以抑制細胞異常發炎反應、減緩類風濕性關節炎的發炎程度。

實施例9　類風濕性關節炎動物實驗

類風濕性關節炎為一種全身性慢性炎症疾病，滑液膜細胞增生伴隨炎症細胞浸潤、關節面血管翳(pannus formation)及關節損傷為其特徵。實驗動物以抗原誘導關節炎，其病程相似於類風濕性關節炎，因而如文獻Trivillin et al. (2014). Boron neutron capture synovectomy (BNCS) as a potential therapy for rheumatoid arthritis: boron biodistribution study in a model of antigen-induced arthritis in rabbits. Radiation and environmental biophysics, 53(4), 635-643所述被長期應用於研究人類類風濕性關節炎的致病機制和治療藥物研發。

取製備例6的兔子，分為對照組(不投予本發明的組合物)及實驗組，實驗組投予本發明的組合物60天，投予本發明組合物的時間點為兔子產生明顯臨床徵狀時，亦即觸診時有疼痛反應或跛行時即開始投予。實驗組又分為高劑量組及低劑量組，其中高劑量組為每日以口服方式投予一次24 mg/kg本發明的組合物、低劑量組為每日以口服方式投予一次8 mg/kg本發明的組合物。並於本發明的組合物投藥結束後將實驗組及對照組的兔子予以犧牲，採其兩側膝關節滑膜組織(synovial tissue)並以4 % paraformaldehyde予以固定；再以石蠟包埋後切成3-5 μm之薄切片，並以蘇木紫以及伊紅染色，以顯微鏡及即時顯像系統觀察，進行組織病理學病變檢查並依據SÁNCHEZ-PERNAUTE等(1997)發炎嚴重程度分級系統(Grade 0為正常，Grade 3為最嚴重)來進行評估。

其中，於第二次關節內注射抗原後第14天即陸續有兔子出現跛行徵狀，共計引起70%兔子呈現疼痛跛行臨床徵狀(其中64%兔子於本發明的組合物投予前即呈現臨床徵狀，另外36%兔子則於本發明的組合物給予後才出現跛行症狀)。

此外，在本發明的組合物的投予期間，高劑量組僅有25%兔子從無跛行症狀演變成有跛行症狀，而低劑量組及對照組則分別有50%及66%。

而發炎嚴重程度的評估結果如下表1所示：

	右膝關節
高劑量	0.9±1.0
低劑量	1.6±0.6
對照組	1.8±0.4

由肉眼檢視病變及組織病理學來看，對照組兔子都有肉眼可見的病變且炎症程度亦較嚴重，高劑量組兔子有肉眼可見病變(均伴隨有跛行徵狀)的比例較低且炎症程度較輕微，低劑量組則介於前述兩個組別之間，因此本發明的組合物對兔子有延緩或改善病程、降低跛行發生率及炎症反應程度現象的效果。故本發明的組合物具有治療或減緩類風濕性關節炎的效果。

實施例10　異位性皮膚炎動物實驗

將製備例7的實驗動物分為兩組，實驗組有12隻動物(A01-A12)接受皮膚病藥物治療外，也給予本發明的組合物每天給予一次，劑量為100 mg/10 kg，對照組有2隻動物(B01、B02)，同樣接受皮膚藥物治療，但另外分別給予類固醇(B01)或Oclacitinib (B02)，其中皮膚病治療藥物根據動物情況給予包含抗黴菌藥(itrconazole)、抗生素、抗組織胺、末梢血管擴張藥物(pentoxifylline)、抗氧化物(Vitamin E)等，所有實驗動物在開始使用本發明的組合物後，每2週回診評估一次，評估的工具包含獸醫師檢查紀錄、皮膚細菌及黴菌培養。

(一)皮膚搔癢程度評估

以pruritus visual analog scale (PVAS) 為評估工具(Olivry, T., Marsella, R., Iwasaki, T., Mueller, R., & International Task Force On Canine Atopic Dermatitis. (2007). Validation of CADESI‐03, a severity scale for clinical trials enrolling dogs with atopic dermatitis.Veterinary dermatology ,18 (2), 78-86.)，以0分表示不搔癢(not itchy)，而以10分表示重度搔癢(extremely itchy)。給予本發明的組合物的實驗組，經獸醫師檢查紀錄，結果如圖9所示，其搔癢程度均有緩解功效；對照組中則以接受Oclacitinib藥物者(B02)，其搔癢緩解程度和接受本發明的組合物的動物相近。

(二)皮膚病兆嚴重程度

皮膚病兆嚴重程度評估是經過獸醫師檢查、紀錄，詳細評估方法包括經由獸醫師討論、伍氏燈檢查、皮毛採集顯微鏡下檢查及皮膚壓片檢查等，結果如圖10所示，實驗組多有明顯改善，對照組中則以接受Oclacitinib藥物的犬隻(B02)獲得明顯改善。

(三)細菌及黴菌培養

以採樣刷刷取動物身上皮毛上的皮屑，再以培養基進行細菌及黴菌的培養。

結果如表2、表3顯示，實驗組於試驗後，其細菌和黴菌培養多為陰性，顯示當皮膚屏障修復完整後，較不易讓健康的皮膚受到細菌或黴菌感染，而試驗前後所培養出的細菌主要以克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae )、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )及革蘭氏陽性桿菌，與Kristensen等人在1978年調查正常犬隻皮膚菌叢的研究中金黃色葡萄球菌流行率高的結果相似 (Kristensen, S., Haarløv, N., & Mourier, H. (1978). A study of skin diseases in dogs and cats. IV. Patterns of flea infestation in dogs and cats in Denmark.Nordisk veterinaermedicin ,30 (10), 401)。

表2 皮屑的細菌及黴菌培養結果

檢查項目	細菌	黴菌
前	後	前	後
A01	P	N	N	N
A02	P	P	N	N
A03	P	N	P	N
A04	P	P	N	N
A05	P	N	P	N
A06	NA	NA	NA	NA
A07	P	P	N	P
A08	P	P	P	N
A09	P	P	P	N
A10	P	N	N	P
A11	P	N	N	N
A12	NA	NA	NA	NA
B01	P	P	N	N
B02	P	N	N	N

P：陽性(positive)、N：陰性(negative)、NA：無法獲得(not available)

表3 皮毛採樣的細菌培養結果

細菌	培養出案例數
克雷伯氏肺炎菌 (Klebsiella pneumoniae )	4
金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus )	4
革蘭氏陽性桿菌 (Gram positive bacillus)	4
凝固酶葡萄球菌 (CoagulaseStaphylococcus )	3
腸球菌屬 (Enterococcus spp)	3
大腸桿菌 (Escherichia coli )	3
奇異變形桿菌 (Proteus mirabilis)	2
鮑氏不動桿菌 (Acinetobacter baumannii )	1
不動桿菌屬 (Acinetobacter spp.)	1
乙型鏈球菌 (Streptococcus group B)	1
摩式摩根菌 (Morganella morganii )	1
綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa )	1
雷氏普羅威登斯菌 (Providencia rettgeri )	1
非A、B群β溶血類型鏈球菌 (β-haemolytic Streptococcus group non A, B)	1
仙人掌桿菌 (Bacillus cereus , light)	1

因此，有使用本發明的組合物的動物都會讓皮膚快速修復且維持皮膚健康狀態，本發明的組合物具有治療或減緩異位性皮膚炎的效果。

實施例11　本發明的組合物的清除自由基能力

自由基不僅會造成皮膚老化、對於皮膚較敏感或是皮膚疾病的患者亦可能造成發炎、或破壞皮膚的阻隔作用並伴隨搔癢症狀的發生。DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)是一穩定的自由基，常用於測定物質的供氫、捕捉自由基的能力，本實驗利用DPPH測定本發明的組合物的清除自由基能力，步驟如下：

(1)將本發明的組合物先溶於0.1 M檸檬酸配製成濃度 250 mg/mL的溶液 (pH3.5)，再稀釋成0.25、0.5、1、1.5、2、4 mg/mL的濃度。

(2)取90 μL的50mM Tris-HCl、pH 7.4溶液到96孔盤。

(3)加入10 μL的步驟(1)不同濃度的本發明的組合物，並以0 mg/mL為對照組。

(4)加入200 μL的0.1 mM DPPH(Sigma，D9132)溶液後均勻混合。

(5)避光環境下於室溫靜置30分鐘後，利用酵素免疫分析測讀儀讀取517 nm的吸光值。

結果如圖11所示，添加有本發明的組合物組的DPPH自由基清除能力均比對照組高，且隨本發明的組合物的濃度增加，清除自由基的能力也增加，因此可降低自由基造成皮膚的發炎及相關症狀的可能性。

根據上述實施例，本發明的組合物不僅可降低巨噬細胞產生的一氧化氮自由基、降低嗜鹼性球的去顆粒作用、抑制基質金屬蛋白酶的分泌、抑制單核球細胞的遷移、抑制與發炎有關的NF-κB及IKK-β途徑及增加自由基清除率等，並在動物實驗中顯示，能降低類風濕性關節炎跛行發生率、炎症程度並能減緩異位性皮膚炎造成的搔癢、病兆嚴重程度及加速皮膚的修復等，因此本發明的組合物可有效治療或減緩自體免疫相關疾病，特別是類風濕性關節炎及異位性皮膚炎。

無

圖1 以0、25、50、100 μg/mL本發明的組合物處理巨噬細胞Raw264.7對細胞生長造成影響的相對比例。 圖2 以0、50、100、250 μg/mL本發明的組合物處理單核球細胞THP-1對細胞生長造成影響的相對比例。 圖3 以0、25、50、100 μg/mL本發明的組合物處理經發炎誘導的巨噬細胞Raw264.7後一氧化氮生成濃度的相對比例。 圖4 以0、10、50、100 μg/mL本發明的組合物處理的嗜鹼性球細胞RBL-2H3之去顆粒作用的β-己糖胺酶(β-hexosaminidase)釋放量相對比例。 圖5 以0、50、100、250、500 μg/mL本發明的組合物處理經TNF-α蛋白質刺激的滑膜肉瘤細胞SW982造成的細胞生長影響相對比例。 圖6 以0、50、100、250、500 μg/mL本發明的組合物處理經TNF-α蛋白質刺激的滑膜肉瘤細胞SW982的酵素圖譜。 圖7 以0、50、100、250、500 μg/mL本發明的組合物處理經TNF-α蛋白質刺激的滑膜肉瘤細胞SW982對於單核球細胞THP-1造成的異常細胞遷移數量相對比例。 圖8 以0、50、100、250、500 μg/mL本發明的組合物處理經TNF-α蛋白質刺激的滑膜肉瘤細胞SW982細胞核中的RelA (NF-κB)的量。 圖9 第一次至第六次就診時獸醫師檢查紀錄搔癢程度。 圖10 第一次至第六次就診時獸醫師檢查紀錄病兆嚴重程度。 圖11 0.25、0.5、1、1.5、2、4 mg/mL本發明的組合物的自由基清除百分比。

無

Claims (12)

1. 一種組合物用於製備治療或減緩自體免疫相關疾病的醫藥品的用途，其中所述組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成的亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓(Dalton)至600,000道爾頓，所述醫藥品含有有效劑量的所述組合物及藥學上可接受的載劑。
2. 如請求項1所述的用途，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均分子量為1,500道爾頓至550,000道爾頓。
3. 如請求項1所述的用途，其中所述亞鐵胺基酸螯合物的亞鐵與胺基酸的重量比是介於1：1至1：4之間。
4. 如請求項1所述的用途，其中所述亞鐵胺基酸螯合物的亞鐵與胺基酸的重量比是介於1：1.5至1：2.5之間。
5. 如請求項4所述的用途，其中所述亞鐵胺基酸螯合物是由鐵化合物與胺基酸混合並歷經60ºC至90ºC加熱8小時至48小時所製得的亞鐵胺基酸螯合物，其中無機鐵化合物與胺基酸的重量比例是介於1：1.2至1：1.5之間。
6. 如請求項5所述的用途，其中所述鐵化合物是硫酸亞鐵、氯化亞鐵、焦磷酸亞鐵或其組合。
7. 如請求項1所述的用途，其中所述亞鐵胺基酸螯合物為亞鐵甘胺酸螯合物。
8. 如請求項1所述的用途，其中所述自體免疫相關疾病為類風濕性關節炎。
9. 如請求項1所述的用途，其中所述自體免疫相關疾病為異位性皮膚炎。
10. 如請求項1或8所述的用途，其中所述有效劑量為2.5 mg/kg 至10 mg/kg。
11. 如請求項1所述的用途，所述治療或減緩自體免疫相關疾病抑制免疫細胞的去顆粒作用。
12. 如請求項11所述的用途，所述抑制免疫細胞的去顆粒作用降低組織胺的釋出量。

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