TWI587856B - Compositions containing ferrous amino acid chelates are used in the manufacture of reduced cancer production The use of lactic acid medicine - Google Patents

Description

含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物用於製造降低癌症產生 之乳酸之醫藥品的用途

本發明係涉及一種含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物的用途，尤指其用於製造降低乳酸之醫藥品的用途。

醣類做為運動中主要使用的能量來源，而醣類產生能量的方式分為有氧及無氧。醣類在無氧狀況下分解，除了會產生能量外亦產生乳酸，而乳酸的產生過程是由丙酮酸經乳酸脫氫酶轉換而來。在運動強度較低時，醣類主要使用有氧方式產生能量，無氧參與較少。因此乳酸產生的速度不高，人體可以輕易代謝掉乳酸而不會累積在身體及血液中。當運動強度較強時，醣類採取無氧分解產生能量的比率提高，乳酸產生的速度也因此加快。一旦人體清除乳酸的速度會趕不上乳酸產生的速度時，乳酸就會開始在身體中堆積。

因過量運動所引起的疲勞稱作運動疲勞(exercise fatigue)。當氧與養分持續消耗以及乳酸持續累積時，肌肉會因收縮機能下降而變得僵硬，且肌肉纖維可能會因劇烈收縮而產生撕裂，從而造成肌肉酸痛、肌肉無力等不適症狀。現有技術中常作為用於治療運動疲勞的藥物通常伴隨不同程度的副作用，例如，肌肉鬆弛劑可能導致腹瀉、口乾、嗜睡等副作用；非類固醇消炎藥則可能導致消化道黏膜損傷、肝功能異常、頭暈、頭痛、嗜睡等副作用。而中華民國專利公開案第201406381號揭示一種抗運動疲勞之醫藥組合物，該醫藥組合物係為芸香素(rutin)可有效降低血液中乳酸量，用於治療運動疲勞所引起的相關症狀。然而芸香素可能會產生的副作用為過敏、喉頭或胸口緊悶、呼吸障礙等。

有鑑於此，如何發展出一種可用於抗運動疲勞、具有較低副作用的藥物且能有效降低乳酸堆積量，以有效預防及治療運動疲勞所引起的相關症狀，現有技術實有待改善的必要。

有鑑於現有技術之藥物產生副作用之缺點，本發明之目的在於提供一種含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物用於製造降低乳酸之醫藥品的用途，其中含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物具有調控乳酸之功效。

為達到上述之發明目的，本發明所採用的技術手段為提供一種含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物用於製造降低乳酸之醫藥品的用途，其中醫藥品含有有效劑量之亞鐵胺基酸螯合物之組合物以及其藥學上可接受的載劑。

依據本發明，「含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物」係由無機鐵與胺基酸混合所製得之含有亞鐵胺基酸螯合物(ferrous amino acid chelate)之組合物。

較佳的，所述之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物中的亞鐵胺基酸螯合物之亞鐵與胺基酸的螯合比例係介於1：1至1：4之間。

較佳的，所述之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物中的亞鐵胺基酸螯合物之亞鐵與胺基酸的螯合比例係介於1：1.5至1：2.5之間。

較佳的，所述之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物之有效劑量係介於0.1mg/kg/day至5mg/kg/day。

較佳的，所述之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物之有效劑量係介於0.5mg/kg/day至3mg/kg/day。

較佳的，所述之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物之有效劑量係介於0.65mg/kg/day至2.93mg/kg/day。其中，根據2005年美國食品藥物管理局所公告之實驗初期估算方法(Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers)，而以60公斤之成人為基準，使用高等實驗動物進行實驗時，劑量之換算原則上以人體每日每公斤體重之建議攝取量的12.3倍為小鼠(mouse)之1倍劑量。因此就施予小鼠約為8mg/g/day至36mg/g/day而言，換算於人體劑量約為0.65mg/kg/day至2.93mg/kg/day。

較佳的，所述之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物之有效劑量於小鼠係介於8mg/g/day至36mg/g/day。

更佳的，所述之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物係由無機鐵與胺基酸混合並歷經60℃至90℃加熱8小時至48小時所製得之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物，其中無機鐵與胺基酸之重量比例係介於1：1.2至1：1.5之間。

更佳的，所述之無機鐵係硫酸亞鐵、氯化亞鐵、焦磷酸亞鐵或其組合；該胺基酸係甘胺酸。

更佳的，所述之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物係含有重量百分比為95%至100%的亞鐵甘胺酸螯合物；又更佳的，重量百分比為98%至99.9%的亞鐵甘胺酸螯合物。

更佳的，所述之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物中包括還原劑，該還原劑包括，但不限於抗壞血酸(ascorbic acid)、檸檬酸(citric acid)、乙酸(acetic acid)、丙酸(propionic acid)、丁酸(butyric acid)、乳酸(lactic acid)、羥琥珀酸(malic acid)、磺酸(sulfonic acid)、丁二酸(succinic acid)或其組合。

本發明所述之「有效劑量」係指在劑量上及對於所需要之時間段而言對達成所要降低乳酸結果有效之量；依據本發明，係指透過施予特定範圍量之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物，能夠使得肺癌、乳癌或腦癌細胞之乳酸堆積量減少，或是減少氧化壓力；依據本發明，另指能增加活動力、減少乳酸堆積之功效。

本發明所述之「醫藥學上可接受之載劑」包含，但不限於溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、表面活性劑(surfactant)，及其他類似或適用本發明之載劑。

本發明所述之「醫藥品」可以多種形式存在，該等形式包含，但不限於液體、半固體及固體藥劑形式，諸如溶液(solution)、乳劑(emulsion)、懸浮液(suspension)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(slurry)、脂質體、栓劑以及其他類似或適用本發明之劑型。

較佳的，所述之醫藥品係經腸道的或非經腸道的劑型。

更佳的，所述之該經腸道的劑型係口服劑型，其口服劑型係溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、丸劑、口含錠、片劑、口嚼膠或膠囊。

本發明的優點在於：

1.經本發明證實施予含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物可有效降低癌細胞的乳酸堆積、減少葡萄糖攝取量。

2.健康受體施予含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物可有效增加活動力、減少乳酸堆積、並增加乳酸脫氫酶之功效。

圖1為於非小細胞肺癌細胞A549施予含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物(以下簡稱X)後乳酸堆積量的柱狀圖。

圖2為於非小細胞肺癌細胞H460施予組合物X後乳酸堆積量的柱狀圖。

圖3為於乳腺癌細胞MDA-MB-231施予組合物X後乳酸堆積量的柱狀圖。

圖4為於腦神經膠質瘤細胞U87-MG施予組合物X後乳酸堆積量的柱狀圖。

圖5為於正常狀態或低氧狀態的A549非小細胞肺癌細胞施予組合物X後，以β-肌動蛋白(β-actin)做為基準，針對缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白質表現量進行分析之柱狀圖。每組為三重複，*表示相較於控制組p<0.05，#表示相較於單純施予氯化鈷(CoCl₂)p<0.05。

圖6為於腦神經膠質瘤細胞U87-MG施予組合物X後，相較於控制組之葡萄糖攝取百分比柱狀圖。*表示相較於控制組p<0.05。

圖7為美國癌症研究所(Institute of cancer research,ICR)小鼠餵食組合物X後進行強迫游泳測試時間的分布圖。

圖8為ICR小鼠餵食組合物X後血清中乳酸濃度(毫克/分升，mg/dL)柱狀圖。

圖9為ICR小鼠餵食組合物X後血清中乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)濃度(單位/公升，IU/L)之柱狀圖。

以下配合圖式及本發明之較佳實施例，進一步闡述本發明為達成目的所採取的技術手段。

製備例1 製備含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物

本實施例係用以製備含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物，其係以下述方式製備。首先，將硫酸亞鐵與甘胺酸(純度98%以上)以重量比1：1.3混合並歷經60℃至90℃加熱8小時至48小時，以獲得該含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物，其中亞鐵胺基酸螯合物之亞鐵與胺基酸螯合比例係介於1：1至1：4之間；再將所獲得之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物調製成濃度為每毫升含有5 微克(即5μg/ml)、10μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL以及1000μg/mL，並以X代稱該組合物。

製備例2 肺癌細胞培養

將非小細胞肺癌細胞株A549及H460以含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、1%青黴素[100單位/毫升(U/mL)]-鏈黴素[100微克/毫升(μg/mL)](penicillin-streptomycin)以及1%麩醯胺酸(glutamine)[200毫莫耳每升(mM)]之杜氏改良英格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's medium,DMEM)培養於37℃、5%二氧化碳之培養箱中，待細胞貼附7至8分滿時，再進行繼代培養。

製備例3 乳癌細胞培養

將乳腺癌細胞株MDA-MB-231以含有10%胎牛血清、1%青黴素(100U/mL)-鏈黴素(100μg/mL)以及1%麩醯胺酸(200mM)之DMEM培養於37℃、5%二氧化碳之培養箱中，待細胞貼附7至8分滿時，再進行繼代培養。

製備例4 腦癌細胞培養

將腦神經膠質瘤細胞株U87-MG以含有10%胎牛血清、1%非必需胺基酸(non-essential amino acid,NEAA)以及1%青黴素(100U/mL)-鏈黴素(100μg/mL)之拉賽爾培養基(Roswell Park Memorial Institute,RPMI)培養於37℃、5%二氧化碳之培養箱中，約3天至4天繼代培養一次。

實施例1 癌細胞經組合物X處理後乳酸分泌表現量

將製備例2至4培養之癌細胞(肺癌、乳癌及腦癌)以每孔3×10⁴顆細胞種入細胞孔盤，隨後以製備例1所製得組合物X之濃度為30μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL，或未添加組合物X做為控制組分別處理三種癌細胞。經24小時後，收取細胞上清液並以L-乳酸分析套組(L-lactate assay kit，購自於abcam^®型號ab65331)測量癌細胞分泌至細胞培養液中之乳酸堆積量。

請參閱圖1所示，當施予組合物X濃度為30μg/mL於非小細胞肺癌細胞株A549的組別中，其乳酸堆積量相較於控制組降低了約20%；隨著組合物X濃度增加，當施予組合物X濃度為500μg/mL的組別中，其乳酸堆積量降低了近50%。請參閱圖2所示，當施予組合物X濃度為100μg/mL於非小細胞肺癌細胞株H460的組別中，其乳酸堆積量相較於控制組降低了約20%；隨著組合物X濃度增加到250μg/mL至1000μg/mL，其乳酸堆積量皆降低至約30%。請參閱圖3所示，當施予組合物X濃度為5μg/mL於乳腺癌細胞MDA-MB-231的組別中，其乳酸堆積量相較於控制組降低了約10%；隨著組合物X濃度增加到10μg/mL至100μg/mL，其乳酸堆積量降低約為40%至50%。請參閱圖4所示，當施予組合物X濃度為500μg/mL至1000μg/mL於腦神經膠質瘤細胞U87-MG的組別中，其乳酸堆積量相較於控制組降低了大於20%。

實施例2 肺癌細胞在正常或低氧下經組合物X處理後HIF-1α的表現量

將製備例2培養之非小細胞肺癌細胞A549以每孔3×10⁴顆細胞種入細胞孔盤，在正常供氧情下以製備例1所製得組合物X之濃度為100μg/mL或250μg/mL，或未添加組合物X做為控制組分別處理非小細胞肺癌細胞A549，經24小時後進行西方墨點法，分析HIF-1α的蛋白質表現量。另外，以CoCl₂誘發低氧情況下，非小細胞肺癌細胞A549先以200μM CoCl₂作用3小時，再以組合物X之濃度為100μg/mL或250μg/mL作用24小時後，進行西方墨點法，以β-actin為基準進行定量分析HIF-1α的蛋白質表現量。

請參閱圖5所示，在正常供氧情形下施予組合物X之濃度為100μg/mL或250μg/mL於非小細胞肺癌細胞A549的組別中，HIF-1α的蛋白質表現 量相較於控制組皆顯著下降，且降幅大於20%；在低氧情形下，未施予組合物X組別之HIF-1α的蛋白質表現量相較於控制組顯著上升，然而施予組合物X之濃度為100μg/mL之組別其HIF-1α的蛋白質表現量相較於未施予組合物X組別有下降趨勢，而當施予組合物X之濃度為250μg/mL的組別其HIF-1α的蛋白質表現量相較於未施予組合物X組別有顯著降低，甚至可達到與正常情形下施予組合物X之濃度為100μg/mL或250μg/mL相近之HIF-1α的蛋白質表現量。因此，對於非小細胞肺癌細胞A549來說，本發明所述之組合物不論是在正常情況或低氧情況下都能減少HIF-1α的產生。

實施例3 組合物X抑制腦神經膠質瘤細胞葡萄糖攝取

將製備例4培養之腦神經膠質瘤細胞U87-MG以每孔3×10⁴顆細胞種入細胞孔盤，加入製備例1所製備的組合物X分別為0μg/mL(控制組)、100μg/mL(先以200μM CoCl₂作用3小時模擬低氧)、30μg/mL、100μg/mL作用24小時，利用克雷布斯林格緩衝液(Krebs-Ringer buffer,KRB)進行飢餓流程(starvation)30分鐘後，加入含有標記放射線元素³H的葡萄糖作用3小時，接著以PBS清洗3次，利用分解液(lysis buffer)收下細胞並放入閃爍液中，最後放入計數儀器(b-counter)中測量。

請參閱圖6所示，在低氧情形下施予組合物X濃度為100μg/mL於腦神經膠質瘤細胞的組別中，其葡萄糖攝取量相較於控制組並無顯著差異；在正常供氧的情形下，施予組合物X之濃度為30μg/mL於腦神經膠質瘤細胞的組別中，其葡萄糖攝取量相較於控制組有下降的趨勢；當施予組合物X之濃度為100μg/mL時，葡萄糖攝取相較於控制組有顯著下降超過20%。

實施例4 組合物X對實驗動物活動力的影響

針對美國癌症研究所(institute of cancer research,ICR)小鼠(每隻約重25克)分別以製備例1所製備的組合物X每日每隻分別餵食0μg(控制組)、 200μg以及900μg，每組各至少7隻小鼠進行實驗。持續餵食兩周後，進行強迫游泳實驗(forced swimming test)。

請參閱圖7所示，每天餵食200μg或900μg組合物X的小鼠相較於控制組而言，其平均游泳時間都有增加的趨勢，且與餵食量有正相關增加的趨勢。

實施例5 組合物X對實驗動物血清中乳酸堆積的影響

針對ICR小鼠分別以製備例1所製備的組合物X每日每隻分別餵食0μg(控制組)、200μg以及900μg，每組各至少7隻小鼠進行實驗。持續餵食兩周後，進行強迫游泳實驗後抽血檢驗血清中乳酸與乳酸脫氫酶含量。

請參閱圖8所示，每天餵食200μg組合物X的小鼠相較於控制組而言，其血清中乳酸含量有減少的趨勢；每天餵食900μg組合物X的小鼠相較於控制組而言，其血清中乳酸含量則有顯著降低。請參閱圖9所示，每天餵食200μg組合物X的小鼠相較於控制組而言，其血清中乳酸脫氫酶含量有增加的趨勢；每天餵食900μg組合物X的小鼠相較於控制組而言，其血清中乳酸脫氫酶含量則有顯著增加。

根據本發明可作之不同修正及變化對於熟悉該項技術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被不當地限制於該等特定具體事實上。事實上，在實施本發明之已述模式方面，對於熟習該項技術者而言顯而易知之不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之內。

Claims (10)

1. 一種含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物用於製造降低癌症產生之乳酸之醫藥品的用途，其中醫藥品含有有效劑量之亞鐵胺基酸螯合物之組合物以及其藥學上可接受的載劑；該亞鐵胺基酸螯合物係亞鐵甘胺酸螯合物。
2. 如請求項1所述之用途，其中含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物中的亞鐵胺基酸螯合物之亞鐵與胺基酸的螯合比例係介於1：1至1：4之間。
3. 如請求項1所述之用途，其中含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物中的亞鐵胺基酸螯合物之亞鐵與胺基酸的螯合比例係介於1：1.5至1：2.5之間。
4. 如請求項1所述之用途，其中含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物之有效劑量係介於0.1mg/kg/day至5mg/kg/day。
5. 如請求項1所述之用途，其中含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物之有效劑量係介於0.5mg/kg/day至3mg/kg/day。
6. 如請求項1至5中任一項所述之用途，其中含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物係由無機鐵與胺基酸混合並歷經60℃至90℃加熱8小時至48小時所製得之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物，其中無機鐵與胺基酸之重量比例係介於1：1.2至1：1.5之間。
7. 如請求項6所述之用途，其中無機鐵係硫酸亞鐵、氯化亞鐵、焦磷酸亞鐵或其組合。
8. 如請求項6所述之用途，其中含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物中包括還原劑，該還原劑係抗壞血酸(ascorbic acid)、檸檬酸(citric acid)、乙酸(acetic acid)、丙酸(propionic acid)、丁酸(butyric acid)、乳酸(lactic acid)、羥琥珀酸(malic acid)、磺酸(sulfonic acid)、丁二酸(succinic acid)或其組合。
9. 如請求項1所述之用途，其中醫藥品係經腸道的或非經腸道的劑型。
10. 如請求項9所述之用途，其中該經腸道的劑型係口服劑型，其口服劑型係溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、丸劑、口含錠、片劑、口嚼膠或膠囊。