TWI666448B - 一種預測藥物療效的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了一種預測用於治療癌症之藥物的療效的方法，該方法包含：(A)從一罹患癌症之個體得到一多種細胞團簇(multicellular cluster)，該多種細胞團簇包含一癌細胞；(B)將該多種細胞團簇培養於一纖維素海綿體上；(C)投予藥物於該培養之多種細胞團簇；(D)測量該癌細胞於投予藥物前之第一存活率，並測量該癌細胞於投予藥物後之第二存活率，當該第二存活率比該第一存活率低時，此方法即預測該藥物對於該罹患癌症之個體有正向效果。

Description

一種預測藥物療效的方法
本發明係關於一種預測藥物療效的方法。
個體對於藥物反應的差異性會使許多疾病的治療方式複雜化，即使在一同質性高的群體中(譬如同性別或年齡近似等)，有些個體對某一特定藥物有良好反應，而其他個體對於該特定藥物卻會反應不良。
在對病患施予化療之前預測該化療的效果可有助於改善該病患的化療反應、減少毒性與照護費用，因而提供該病患一量身訂做的治療方案。化療敏感性測試(chemosensitivity assays)係指在實驗室中所進行的專門用於分析某一已知化療藥物對於抑制腫瘤生長之功效的任何生體外(in vitro)測試。理想的生體外化療敏感性測試應具有可重複性與可使用少量組織，而其臨床反應預測結果應為快速而準確。各種化療敏感性測試與抗藥性測試(resistance assay)雖已被發展出來，但因成功率低、定義生體外敏感性的標準含糊、過長的檢驗報告時間(turnaround time)以及缺少測試指引療法(assay-guided therapy)與經驗療法(empirical therapy)之試驗比較，因而極少被證明能利用於臨床實務上。
在生物細胞領域中，通常認為三維細胞培養的仿生活性(biomimetic activity)會比單層二維細胞培養的更佳，也因此目前已有數種三 維細胞培養方式被發展出來，例如基底膜基質法(Matrigel)、水合膠法(hydrogel)、懸浮法(suspension)、懸滴培養法(hanging drop culture)、微團塊培養法(micromass culture)以及非黏附性基質法(non-adherent substrate)等。而在細胞培養學領域中，使用生物支架(scaffold)的重要性在於為了使所培養的細胞能生長成為具有意欲的功能與形態；生物支架的功能在於提供適於細胞生長的三維框架，一般稱為三維生物支架(three-dimensional scaffold)；此類三維生物支架為多孔性，作為植入細胞、細胞附著(cell attachment)、並導引細胞於三維空間上生長分化之用，目的為產生仿真與組織或器官之再生。
傳統的二維平面細胞培養方式，細胞間彼此相接觸的面積很小，細胞表面積約有一半接觸細胞培養盤，另一半則接觸培養基；而三維的細胞培養環境則有以下好處：能提供較佳的指示細胞功能的生化訊息、容許細胞於生物支架內移動(migration)、增加細胞密度並增加細胞間的訊號傳輸(signal transmission)、提供細胞附著分子和誘發細胞分化的分子。當海綿體狀的三維生物支架其孔隙之孔徑大於50微米(μm)時，細胞移動增強，所植入的細胞與養分的分布也因互相連結的孔隙結構而更平均。
對於一藥物的效果或是個體對於治療方案的反應，現今仍需要更有效的預測方法。醫生或醫學專家藉由這樣的預測方法可以快速判斷某一藥物或治療方案對於一特定個體是否具有療效，可因此減少該個體的病痛與治療花費，同時，也可降低或消除該個體被投予無效藥物或治療方案的機會，並因此減少不良副作用的可能性。
除非上下文另有明確說明，否則本說明書以及申請專利範圍 中所使用之單數形式「一」及「該」包含複數個提及物。
本說明書以及申請專利範圍中所使用的「藥物」一詞為包含一或多種以上之藥物組合，及使用一或多種以上藥物組合之治療方案(treatment regimen)。
本說明書以及申請專利範圍中所使用的「海綿體」(sponge)一詞為包含任何形狀、大小或組成之三維立體結構，可植入至少一種細胞，作為細胞附著、細胞黏附、並作為促進細胞正常生長、及/或增生及/或分化之用。
於一實施例中，本發明之海綿體為由纖維素(cellulose)所組成；由於該纖維素海綿體(cellulose sponge)是藉由本發明所揭示之方法製備而成並作為醫藥之用，因此較佳地，該纖維素海綿體具有生物相容性。
於一實施例中，本發明之纖維素海綿體可作為細胞培養之用，而該纖維素海綿體具有高度透氣性及養分可滲透性，亦即該纖維素海綿體具有較佳的比表面積(specific surface area)。
於一實施例中，培養於本發明之纖維素海綿體上的細胞種類可為任何天然取得的細胞、或人為進行生物工程處理之細胞或上述兩者再經繁殖所得者，使用上並無特別的限制。
本說明書中所使用的「起始劑」(initiator)一詞，乃指一類易因受熱或受光而分解，進而產生自由基而引發聚合反應之化合物。該起始劑不但可引發自由基引致之聚合反應及不飽和鏈單體聚合之共聚合反應，此外，也可用於不飽和多體的交聯反應(cross-linking)。
本說明書以及申請專利範圍中所使用的「類器官」(organoid) 一詞，為生體外(in vitro)產生之一種器官的微型與簡化形態，三維的結構可顯示真實的微解剖結構。類器官是由來源組織的單一或一些細胞衍生而來，可於三維培養環境中自我組織。
本發明提供了一種預測用於治療癌症之藥物的療效的方法，該方法包含：(A)從一罹患癌症之個體得到一多種細胞團簇(multicellular cluster)，該多種細胞團簇包含一癌細胞；(B)將該多種細胞團簇培養於一纖維素海綿體上；(C)投予藥物於該培養之多種細胞團簇；(D)測量該癌細胞於投予藥物前之第一存活率，並測量該癌細胞於投予藥物後之第二存活率，當該第二存活率比該第一存活率低時，此方法即預測該藥物對於該罹患癌症之個體有正向效果。
依據本發明之預測方法，於一實施例中，該藥物為化療劑。
依據本發明之預測方法，於一實施例中，該化療劑為順鉑(Cisplatin)或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)。
依據本發明之預測方法，於一實施例中，該癌症為大腸直腸癌。
依據本發明之預測方法，於一實施例中，該多種細胞團簇(multicellular cluster)形成一類器官(organoid)。
本發明並提供了一種預測藥物療效的方法，該方法包含：(A)從一患病之個體得到一多種細胞團簇(multicellular cluster)，該多種細胞團簇包含病變之細胞；(B)將該多種細胞團簇培養於一纖維素海綿體上；(C)投予藥物於該培養之多種細胞團簇；(D)測量該病變之細胞於投予藥物前之第一存活率，並測量該病變之細胞於投予藥物後之第二存活率，當該第二存活 率比該第一存活率低時，此方法即預測該藥物對於該患病之個體有正向效果。
依據本發明之預測方法，於一較佳實施例中，該病變之細胞為癌細胞。
依據本發明之預測方法，於一較佳實施例中，該藥物為化療劑。於一更佳實施例中，該化療劑為順鉑(Cisplatin)與5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)。
依據本發明之預測方法，於一較佳實施例中，該患病之個體為大腸直腸癌患者。
依據本發明之預測方法，於一較佳實施例中，所培養之多種細胞團簇形成一類器官(organoid)。
依據本發明之預測方法，於一實施例中，製備該纖維素海綿體之方法包括：(A)提供一羥丙基纖維素(hydroxypropyl cellulose)溶液，該羥丙基纖維素溶液含有一可自我交聯(self-crosslinkable)而形成化學鍵之取代基；(B)將該含有可自我交聯而形成化學鍵之取代基之羥丙基纖維素溶液以伽馬射線(γ-ray)照射以產生交聯反應；其中，製備該含有可自我交聯而形成化學鍵之取代基之羥丙基纖維素溶液之方法包括：(a)將羥丙基纖維素溶解於二甲基甲醯胺(dimethylformamide，DMF)中以形成一羥丙基纖維素溶液；(b)將一包含可自我交聯而形成化學鍵之取代基之化合物溶解於DMF中以形成一溶液，將該溶液緩慢逐滴地加入步驟(a)之羥丙基纖維素溶液；(c)加入一醇類以產生反應；(d)於室溫下反應並自然乾燥，形成該含有可自我交聯而形成化學鍵之取代基之羥丙基纖維素。
依據本發明之預測方法，於另一實施例中，製備該纖維素海綿體之方法包括：(A)提供一羥丙基纖維素(hydroxypropyl cellulose)溶液，該羥丙基纖維素溶液含有一可自我交聯(self-crosslinkable)而形成化學鍵之取代基；(B)加入一起始劑與一催化劑於該含有可自我交聯而形成化學鍵之取代基之羥丙基纖維素溶液中以產生交聯反應；其中，製備該含有可自我交聯而形成化學鍵之取代基之羥丙基纖維素溶液之方法包括：(a)將羥丙基纖維素溶解於二甲基甲醯胺(dimethylformamide，DMF)中以形成一羥丙基纖維素溶液；(b)將一包含可自我交聯而形成化學鍵之取代基之化合物溶解於DMF中以形成一溶液，將該溶液緩慢逐滴地加入步驟(a)之羥丙基纖維素溶液；(c)加入一醇類以產生反應；(d)於室溫下反應並自然乾燥，形成該含有可自我交聯而形成化學鍵之取代基之羥丙基纖維素。
依據該製備纖維素海綿體之方法，於一實施例中，該包含可自我交聯而形成化學鍵之取代基之化合物包括但不限於：異氰酸烯丙酯(allyl isocyanate)、甲基丙烯酸(methacrylic acid)、丙烯酸(acrylic acid)或甲基丙烯酸環氧丙酯(glycidyl methacrylate)。
依據該製備纖維素海綿體之方法，於一實施例中，該醇類的體積為DMF總體基的1.5-50%。於另一實施例中，該醇類的體積為DMF總體基的7.5-40%。而於另一實施例中，該醇類的體積為DMF總體基的10-35%。
依據該製備纖維素海綿體之方法，於一實施例中，該醇類包括但不限於：甲醇、乙醇、丙醇與丁醇。
依據該製備纖維素海綿體之方法，於一實施例中，該起始劑為過硫酸鹽(persulfate)起始劑；而該催化劑為有機胺類(organic amine)催化 劑。於另一實施例中，該過硫酸鹽起始劑包括但不限於：過硫酸鈉、過硫酸銨或過硫酸鉀；而該有機胺類催化劑包括但不限於：N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine,TEMED)、N,N,N’,N’-肆(2-羥基丙基)乙二胺(N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine，TKHED)、N,N,N’,N’-四甲基-3-(10H-酚噻嗪(phenothiazin)-10-yl-1,2-丙二胺(propanediamine)(N,N,N’,N’-tetramethyl-3-(10H-phenothiazin-10-yl)-1,2-propanediamine)、N,N,N’,N’-四甲基朴瑞根(tetramethylpregn)-5-烯-3β,20α-二胺(N,N,N’,N’-tetramethylpregn-5-ene-3β,20α-diamine)、N,N,N’,N’-四甲基-1,4-丁二胺(N,N,N’,N’-tetramethyl-1,4-butanediamine)、4,4’-四甲基二胺基二苯甲烷(4,4’-tetramethyldiaminodiphenylmethane)、N,N,N’,N’-四甲基-1,4-對苯二胺(N,N,N’,N’-tetramethyl-1,4-benzenediamine)或N,N,N’,N’-四甲基-1,4-萘二胺(N,N,N’,N’-tetramethyl-1,4-napthalenediamine)。
圖1係光學顯微鏡放大圖，顯示所植入的人類肝癌細胞(HepG2細胞)於本發明之加了醇類的纖維素海綿體上的形態。
圖2係光學顯微鏡放大圖，顯示所植入的人類肝癌細胞(HepG2細胞)於本發明但未加醇類的纖維素海綿體上的形態。
圖3(A)係類器官培養於基底膜基質上於P1代或P2代的形態。
圖3(B)係類器官培養於纖維素海綿體上於P1代或P2代的形態。
圖4係類器官分別培養於基底膜基質或纖維素海綿體上於第 3天、第7天及第11天的形態。
圖5(A)係類器官於纖維素海綿體的分布情形(distribution)。
圖5(B)係類器官於纖維素海綿體的數目(number)。
圖6係類器官於投藥前與投藥後的存活率。
圖7(A)係病患經化療前的電腦斷層掃瞄圖。
圖7(B)係病患經化療後的電腦斷層掃瞄圖。
以下之實施例非為限定用途，僅用以呈現此發明之多種面向與特性。
製備纖維素海綿體(cellulose sponge)
製備纖維素海綿體可以下述兩步驟進行：
1.合成一含有一取代基之羥丙基纖維素(hydroxypropyl cellulose)：(1)將羥丙基纖維素(分子量10,000)加入甲苯(toluene)中以共沸蒸餾(azeotropic distillation)的方式脫水；(2)將3.0克經脫水之羥丙基纖維素溶解於120毫升之二甲基甲醯胺(dimethylformamide，DMF)中；(3)將3.84毫升之異氰酸烯丙酯(allyl isocyanate)溶解於5毫升之DMF中，再將此溶液緩慢逐滴地加入上述(2)之羥丙基纖維素溶液中；(4)加入37.5毫升之醇類(例如丙醇(propanol))以產生反應，該醇類之體積為DMF溶液總體積之30%(125毫升之DMF×30%=37.5毫升，DMF：醇類之體積比為3.3：1)；(5)加入一滴之二月桂酸二丁基錫(dibutyltin dilaurate)作為催化劑；(6)在室溫下以磁石攪拌48小時；(7)將(6)之溶液以旋轉蒸餾器(rotatory evaporator)蒸餾以減少體積，再將當中的聚合物(polymer)以醚類(ether)分離出來；(8)將該反應產物以真空過 濾(vacuum filtration)的方式收集，並於乙醚(diethyl ether)中沉澱，殘餘的不純物則以索氏萃取(Soxhlet extraction)方式從乙醚中移除，最後形成含有取代基之羥丙基纖維素。
2.伽馬射線(γ-ray)照射：(1)將乾燥形式之含有一取代基之一羥丙基纖維素配製為10重量%的水溶液並置於玻璃管中(直徑10毫米×高度50毫米)；(2)溫度測試步驟：以溫度控制器調控溫度，並使樣品於每個溫度下停留一段時間，溫度增加時可觀察到顏色的變化，水溶液會從透明變為乳白色；當觀察到溶液變為白色乳液狀，但還未形成分層與沉澱時(意指形成了一穩定的膠態系統，該膠態系統有利於接下來的三維多孔性結構的形成)，紀錄對應的溫度，得到的溫度值落在38-45℃的範圍中；該紀錄所得之溫度亦用於接下來以伽馬射線照射產生的交聯反應中；(3)在上述該紀錄所得之溫度下以伽馬射線照射，以及(4)該含有取代基之羥丙基纖維素經伽馬射線照射後產生固化(solidified)，再經過清洗與冷凍乾燥，得到最後完成物。
製備纖維素海綿體的另一個方式可以下述兩步驟進行：
1.合成含有一取代基之一羥丙基纖維素：(1)將羥丙基纖維素(分子量10,000)加入甲苯(toluene)中以共沸蒸餾(azeotropic distillation)的方式脫水；(2)將3.6克經脫水之羥丙基纖維素溶解於200毫升之二甲基甲醯胺(dimethylformamide，DMF)中；(3)將4.18毫升之異氰酸烯丙酯(allyl isocyanate)溶解於5毫升之DMF中，再將此溶液緩慢逐滴地加入上述(2)之羥丙基纖維素溶液中；(4)加入24.6毫升之醇類(例如丙醇(propanol))以產生反應，該醇類之體積為DMF溶液總體積之12%(205毫升之DMF×12%=24.6 毫升，DMF：醇類之體積比為8.3：1)；(5)加入一滴之二月桂酸二丁基錫(dibutyltin dilaurate)作為催化劑；(6)在室溫下以磁石攪拌48小時；(7)將(6)之溶液以旋轉蒸餾器(rotatory evaporator)蒸餾以減少體積，再將當中的聚合物(polymer)以醚類(ether)分離出來；(8)將該反應產物以真空過濾(vacuum filtration)的方式收集，並於乙醚(diethyl ether)中沉澱，殘餘的不純物則以索氏萃取(Soxhlet extraction)方式從乙醚中移除，最後形成含有取代基之羥丙基纖維素。
2.固化步驟：(1)將乾燥形式之含有一取代基之一羥丙基纖維素配製為10重量%的水溶液並置於玻璃管中(直徑10毫米×高度50毫米)；(2)在2-8℃溫度條件下加入1.2克之過硫酸銨(ammonium persulfate，APS)與35微升之N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine,TEMED)於上述(1)溶液中；(3)將(1)之該玻璃管置於低溫(-20℃)下反應24小時；(4)將(3)之該玻璃管移置室溫下繼續反應48小時，再經過清洗與冷凍乾燥，得到最後完成物。
本發明但未加醇類之製備纖維素海綿體之方法如同上述，只除了省略步驟1之(4)之加入醇類的步驟。
纖維素海綿體之應用
細胞培養條件：人類肝癌細胞(HepG2細胞)，使用之培養基為輔有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)之高醣型杜氏改良依格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)，細胞培養箱之條件為37℃與5%二氧化碳。
植入細胞之步驟：將纖維素海綿體置於48孔盤(48-well plate) 中，HepG2細胞液之濃度調整為每毫升5×106個細胞，取60微升之該濃度的HepG2細胞液植入纖維素海綿體中，於細胞培養箱培養4小時後，將該置有纖維素海綿體之細胞培養盤取出，並加入500微升之培養基，之後每隔三天以磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer saline)清洗該纖維素海綿體並替換新鮮之培養基。
圖1與圖2為觀察HepG2細胞於植入纖維素海綿體24小時後之情形：圖1為所植入的細胞於本發明之加了醇類的纖維素海綿體中之形態，圖2為所植入的細胞於本發明但未加醇類的纖維素海綿體中之形態；兩圖皆為植入HepG2細胞後的第二天以光學顯微鏡觀察得到之放大圖。結果發現：本發明之加了醇類的纖維素海綿體(圖1)，其孔隙的形態結構未變，而植入的細胞其所呈現的球形形態亦接近人體肝臟細胞之真實形態；而本發明但未加醇類的纖維素海綿體(圖2)則顯示植入細胞後，纖維素海綿體的孔隙形態結構並未維持，其孔徑明顯縮減，而細胞形態則表現出細胞凋亡的傾向；該結果也顯示孔隙的形態結構會明顯影響細胞的正常形態。
評估臨床上與生體外(in vitro)反應
患者為一名60歲女性，臨床診斷為直腸癌，TNM分期(T，Tumor，指腫瘤本身的情況；N，lymph Nodes，指腫瘤轉移到淋巴結的情況；M，Metastasis，指腫瘤有無遠處轉移)判定為T4N0N0，病理學診斷為腺癌II級。以患者腫瘤組織培養於支架(基底膜基質(Matrigel)或纖維素海綿體(cellulose sponge))以獲得患者來源的類器官(patient-derived organoid,PDO)，培養方式如下：
1.將腫瘤組織裂解為細胞以獲得腫瘤多種細胞團簇(tumor multicellular cluster)的步驟：(1)取一黃豆粒大小之患者腫瘤組織，以磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer saline，PBS)清洗；(2)放入24孔盤中，加入腫瘤裂解液；(3)用無菌的剪刀剪碎組織；(4)補加裂解液，37℃，作用2小時；(5)將裂解液經100微米之尼龍過濾膜(Nylon Filter)過濾；(6)離心每分鐘1500轉(revolutions per minute,rpm)，5分鐘，棄上清液；(7)加入約3毫升之紅血球裂解液，重新懸浮細胞，室溫5分鐘；(8)加入約10毫升之PBS以稀釋含有紅血球裂解液的細胞懸浮液；(9)離心1500rpm，5分鐘，棄上清液；(10)加入約8毫升之PBS清洗細胞，離心1500rpm，5分鐘，棄上清液；(11)加入1毫升之PBS，重新懸浮細胞沉澱；(12)取得腫瘤多種細胞團簇。
2.細胞培養步驟：(1)配置培養液：高級杜氏改良依格爾培養基/F12輔以雙特異性抗體、每公升10毫莫耳之4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES)、一含有穩定形態之L-麩醯胺酸和L-丙胺醯-L麩醯胺酸之補充物(GlutaMAX)與10%之胎牛血清；(2)用鑷子將支架(基底膜基質或纖維素海綿體)放置入48孔盤中；(3)加入20微升之腫瘤單細胞懸浮液；(4)37℃放置4小時；(5)加入300微升之培養液，放入細胞培養箱(37℃與5%二氧化碳)中繼續培養；(6)每三天移除培養液，以PBS潤洗，再加入新的培養液。(7)於第三天、第七天、第十一天，以光學顯微鏡做觀察。
本發明建立了來自病患癌症組織(包含癌細胞及與之相對應的癌旁組織)所形成的類器官，已經從P1代傳到P2代(圖3(A)及圖3(B))，並凍存保留。患者來源的類器官(patient-derived organoid,PDO)之生長過程如圖4所示，以光學顯微鏡觀察細胞生長情況，觀察到纖維素海綿體中腫瘤單細 胞隨著時間，形成的類器官尺寸有增長。因此，可知纖維素海綿體環境有助於細胞生長以及類器官形成。特別需要說明的是，這些類器官是分別在基底膜基質和纖維素海綿體中進行培養獲得的。纖維素海綿體採用的是植物來源的羥丙基纖維素，對類器官的生長具有如下優點：(1)相對於在基底膜基質中進行培養獲得的PDO(PDOMatrigel)，在纖維素海綿體中進行培養獲得的PDO(PDOcellusponge)的大小生長較均勻(圖3(A)：PDOMatrigel；圖3(B)：PDOcellusponge)；(2)相對於PDOMatrigel，PDOcellusponge的數量較多，這主要歸結於基底膜基質和纖維素海綿體的空間結構的不同，基底膜基質呈小丘狀，類器官主要生長在丘陵中心的基底膜基質較多的部位，而纖維素海綿體呈圓柱體，類器官可以在材料中均勻生長，生長空間較大，因此數量較多(圖5)；(3)培養方法經濟和簡便：傳統的PDOMatrigel的培養液除了：一種稱為R-spondin-1之分泌型蛋白質、上皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、一種稱為Noggin之與組織生長有關的蛋白質、及一種稱為Wnt3a之與發育有關的蛋白質以外，另外還需要加入菸鹼醯胺(nicotinamide)、退行發育淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，Alk)的小分子抑制劑和p38蛋白質的抑制劑(Jung,P.et al.Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.Nat.Med.17,1225-1227(2011))。本發明證實纖維素海綿體中的PDOcellusponge的培養無需加入這三種小分子抑制劑，就可以達到PDOcellusponge的長期培養。此外，PDOcellusponge的培養可以避免基底膜基質培養的繁瑣操作。
利用活細胞計量套組-8測定(Cell Counting Kit-8 assay,CCK-8 assay)作為PDO存活率測試
1.用鑷子將纖維素海綿體放置入48孔盤中；2.加入20微升 之腫瘤單細胞懸浮液；3.37℃放置4小時；4.加入300微升之培養液，放入細胞培養箱(37℃與5%二氧化碳)中繼續培養；5.於第一天、第二天、第三天、第四天，分別執行CCK-8細胞存活率試驗；其中以順鉑(Cisplatin，CP)加5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)為投效藥物組合，對照組則為沒有投藥的控制組；6.於實驗時間點移除孔盤中的培養液；7.在每個孔盤中加入200微升之新鮮培養液與20微升之CCK-8溶液；8.於37℃環境下培養1-4小時；9.量測吸收光450nm的讀值。
由圖6可發現類器官在投予藥物順鉑與5-氟尿嘧啶後，存活率明顯下降。因此認為類器官在投予藥物前後是具有指標性。接著依據CCK-8測定的結果給予患者投藥，執行化療。化療之治療方案為奧沙利鉑(oxaliplatin)聯合卡培他濱(capecitabine)方案(XELOX方案)，療程方式為：第一天注射奧沙利鉑，連續兩周口服卡培他濱，停藥一周。三周為一個療程，兩個療程後評定療效。由圖7可發現患者腫瘤位置(箭頭指示位置)的灰白亮區明顯變少，判定為腫瘤組織部分緩解(partial response，PR)，而此結果與類器官體外培養的數據相符合。因此認定纖維素海綿體不僅適合初代腫瘤細胞生長，更可利用此平台做臨床藥測模擬。使醫生可依據患者的模擬結果，給予服藥種類判定，以實現個體化醫療。

Claims (7)

  1. 一種製備纖維素海綿體的方法，該方法包括下列步驟：(A)將一羥丙基纖維素溶於一二甲基甲醯胺形成一羥丙基纖維素溶液；(B)將一含有可自我交聯而形成化學鍵之取代基之化合物溶於該二甲基甲醯胺形成一溶液，再將該溶液緩慢的加入步驟(A)之該羥丙基纖維素溶液而形成一混合物；(C)加入一醇類於步驟(B)之該混合物以產生反應；(D)將反應後之該混合物乾燥而成一含有一取代基之羥丙基纖維素；(E)將乾燥之該含有一取代基之羥丙基纖維素配製成一水溶液；以及(F)將該水溶液固化。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該可自我交聯而形成化學鍵之取代基化合物包含異氰酸烯丙酯、甲基丙烯酸、丙烯酸或甲基丙烯酸環氧丙酯。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該醇類的體積為該二甲基甲醯胺的1.5-50%。
  4. 一種預測癌症藥物療效的方法，其中該方法包含：(A)從一罹患癌症之個體得到一多種細胞團簇，其中該多種細胞團簇包含一癌細胞；(B)將該多種細胞團簇培養於一利用請求項1所述之方法製成之纖維素海綿體上；(C)投予一藥物經培養之該多種細胞團簇；以及(D)測量該癌細胞於投予該藥物前之一第一存活率，並測量該癌細胞於投予該藥物後之一第二存活率，當該第二存活率比該第一存活率低時，此方法即預測該藥物對於該罹患癌症之個體有正向效果。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該藥物為一化療劑。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該化療劑為順鉑或5-氟尿嘧啶。
  7. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該多種細胞團簇形成一類器官。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111534564A (zh) * 2020-04-17 2020-08-14 上海市第十人民医院 一种基于肠道类器官筛选药物的方法
CN112813029B (zh) * 2021-02-01 2023-08-18 中国药科大学 一种髓母细胞瘤细胞的3d培养方法及其在药物筛选中的应用
CN113186165B (zh) * 2021-04-15 2022-06-28 北京大学 一种肾癌相关的类器官组合及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110159272A1 (en) * 2007-12-18 2011-06-30 Agency For Science, Technology And Research Forming porous scaffold from cellulose derivatives
US20140080214A1 (en) * 2012-09-20 2014-03-20 Agency For Science, Technology And Research Cleavable cellulosic sponge development for 3 dimensional cell culture and spheroids retrieval

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3493651A (en) * 1967-03-09 1970-02-03 Century Lab Inc Production of viral vaccines
WO2012071578A2 (en) * 2010-11-24 2012-05-31 Bc Genesis Llc Pharmacology bioassays for drug discovery, toxicity evaluation and in vitro cancer research using a 3d nano-cellulose scaffold and living tissue
TWI547277B (zh) * 2012-08-14 2016-09-01 Yuan Shu Lai Honokiol for the treatment or prevention of bladder cancer growth and metastasis and improve the cachexia new use
TW201429479A (zh) * 2013-01-25 2014-08-01 Yuan-Shu Lai 褐藻醣膠對於治療惡病質及癌症之應用
CN106176702A (zh) * 2016-07-01 2016-12-07 江南大学 一种辅助维甲酸类药物治疗多种肿瘤的药物组合物
CN107814958B (zh) * 2016-09-12 2020-10-27 山西加乐医疗科技有限责任公司 一种纤维素海绵的制备方法以及其混合溶液
CN108102129B (zh) * 2016-11-25 2021-01-01 山西加乐医疗科技有限责任公司 一种纤维素海绵的制备方法
CN106676074B (zh) * 2017-03-17 2020-09-25 南京鼓楼医院 一种体外扩增肝癌干细胞的方法
CN109852574B (zh) * 2017-11-30 2021-11-16 山西加乐医疗科技有限责任公司 一种细胞支架及其制备方法
CN108130313B (zh) * 2017-12-28 2021-04-30 杭州枫霖科技有限公司 一种基于生物3d打印构建三维胶质瘤组织的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110159272A1 (en) * 2007-12-18 2011-06-30 Agency For Science, Technology And Research Forming porous scaffold from cellulose derivatives
US20140080214A1 (en) * 2012-09-20 2014-03-20 Agency For Science, Technology And Research Cleavable cellulosic sponge development for 3 dimensional cell culture and spheroids retrieval

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Invitrocue,"3D Cell Culture Platforms and Services ", 2016/12/8, https://invitrocue.com/wp-content/uploads/2016/12/InvitroCue_Brochure_cell_based_single_pages.pdf *
Pauli C et al, "Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.", Cancer Discov. 2017 May;7(5):462-477, Epub 2017 Mar 22. *

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