CN106176702A - 一种辅助维甲酸类药物治疗多种肿瘤的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅助维甲酸类药物治疗多种肿瘤的药物组合物,属于生物医学技术领域。本发明将n‑3PUFA以不同浓度单独和联合维甲酸类药物添加到正在培养的肿瘤细胞中,在不同时间点检测细胞生长情况,细胞增殖、细胞死亡情况,Erk1/2蛋白活性变化、Akt蛋白活性变化、p38蛋白活性变化,来评估物质对肿瘤细胞的凋亡和/或增殖的影响,以确定所述n‑3PUFA辅助维甲酸类药物治多种肿瘤的作用。
Description
技术领域
本发明涉及了一种辅助维甲酸类药物治疗多种肿瘤的药物组合物,属于生物医学技术领域。
背景技术
癌症是严重威胁人类生命的常见病和多发病。目前,全世界每年新发生的癌症患者大约1000万,死于癌症的人数近600万,在我国每年新发病患者大约180万,死亡130万,而且发病率逐年上升。癌症死亡占我国各类疾病死因的第2位,在城市已占据首位。癌症的治疗一直是一个世界性的难题,多年来世界各国都在寻找和探索各种有效手段来预防或治疗癌症。药物治疗是癌症治疗的三大疗法之一。传统化学药物治疗恶性肿瘤主要以直接或间接杀伤肿瘤细胞为目的,对正常细胞也有一定程度的杀伤力、毒副作用明显,加之肿瘤细胞耐药性的存在,大大限制了该类细胞毒药物的疗效和应用。
维甲酸及其类似物(retinoids)是一类维生素A衍生物,包括维甲酸、维胺酸、维胺酯和天然维生素A等,约有4000多种。维甲酸类化合物广泛应用于治疗多种疾病,如角化性皮肤病、光老化皮肤病、乳腺癌、皮肤癌、宫颈癌、白血病等。通过研究,发现该类化合物中的全反式维甲酸和9-顺式维甲酸通过参与调节细胞的增殖和分化,具有抗角化、抗增生、促进表皮细胞正常分化的作用,并能通过抑制鸟氨酸脱氢酶的活性干扰肿瘤的发生,可直接抑制皮脂合成和皮脂腺细胞的增殖,以减少皮脂分泌。1988年,首先使用全反式维甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)诱导分化治疗人急性早幼粒细胞白血病,获得显著疗效,五年临床总结显示完全缓解率为86%。目前,全反式维甲酸已被批准用于急性早幼粒细胞白血病、口腔白斑等恶性肿瘤的治疗,已成为治疗白血病的首选药物之一。常见的维甲酸类化合物结构式:
但是,随着维甲酸应用日益广泛,ATRA引起的不良反应时有发生,主要不良反应有:1皮肤、粘膜损害;2消化系统的不良反应如恶心、呕吐、上腹饱胀等消化道反应;3神经系统的不良反应,头痛、视神经乳头水肿、脑脊液压力升高;4骨骼、关节、肌肉疼痛;5白细胞计数增多,国外报道,ATRA治疗APL过程中白细胞增多症发生率高达30%左右;6维甲酸综合征(RA-RS),RA-RS是ATRA治疗APL的主要危险,主要表现为发热及呼吸困难,其它症状和体征包括体重增加、肢体远端水肿、胸水或心包积液以及发作性低血压,胸片见肺间质浸润。此外,ATRA还可引起腕管综合征、严重的心脏损害、高血脂和高血胺血症等不良反应,大大限制了药物的应用。同时快速发展的耐药与高复发率仍是影响长期疗效的两大障碍,随着临床进一步应用,发现其可形成耐药性并使复发患者难以再次获得缓解。
来源于动物或植物的食用油包含大量的各种脂肪酸,包括不同碳链长度和不同饱和度的脂肪酸。他们为人类或/和动物提供了大量的能量和/或营养来源。其中源于鱼类、特别是原产自寒冷海水的野生种群的油中发现大量n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA),它属于中长链脂肪酸中的不饱和脂肪酸。研究表明n-3多不饱和脂肪酸一般对人类健康有益,目前发现它具有较好的抗心血管疾病和抗脂肪肝作用,并已开发出降血脂药物。
虽然维甲酸及其衍生物在预防在白血病、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的发生、抑制肿瘤的生长取得了较好的治疗效果,但其对肿瘤的杀伤作用效果欠佳,以及高浓度时有较大的毒副作用。
发明内容
本发明主要为了增强维甲酸类药物的抗肿瘤作用,扩大其抗肿瘤的范围(抗瘤谱),以及/或降低其剂量从而减少用药时间及/或减少对患者潜在的副作用;而提供一种具有抗肿瘤活性食品辅助治疗药物组合物配方,本发明还提供该组合物在多种肿瘤治疗中的应用。本发明的抗肿瘤组合药物选取维甲酸或其衍生物和n-3多不饱和脂肪酸为主要成分。通过抗肿瘤活性成份之间的协同作用,达到更好的治疗效果。
本发明的第一个目的是提供一种药物组合物,所述药物组合物以A和B为主要活性组分;其中A为维甲酸类药物,B为n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)。
在本发明的一种实施方式中,所述维甲酸类药物包括维甲酸、维胺酸、异维胺酯和天然维生素A、全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、3-顺式维甲酸、阿维甲酯、阿维甲酸、芳香维甲酸、芳香维甲酸乙酯、甲磺基芳香维甲酸、乙酰维甲酸以及其衍生物。
在本发明的一种实施方式中,所述n-3PUFA为多不饱和脂肪酸,包括α-亚麻酸(α-Linolenicacid,ALA)和/或二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid,EPA,含5个不饱和键)和/或二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid,DHA,含6个不饱和键)。
在本发明的一种实施方式中,所述n-3多不饱和脂肪酸包括含有n-3PUFA的食品和/或含有n-3PUFA的营养补充剂。
在本发明的一种实施方式中,所述含有n-3PUFA的食品主要包括鱼油。
在本发明的一种实施方式中,所述药物组合物中A和B的摩尔比为2:1~1:20。
在本发明的一种实施方式中,所述药物组合物中A和B的摩尔比为1:10。
在本发明的一种实施方式中,所述药物组合中,A、B单独或/和结合成固态和/或溶剂化物,即A和B的形态可以相同,也可以不同,A和B的形态可以是固体或者溶剂化物。
在本发明的一种实施方式中,所述药物组合物是用于抑制和/或预防和/或治疗多种肿瘤的组合物。
在本发明的一种实施方式中,所述多种肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、白血病、胃癌、肝癌、卵巢癌、直肠癌和/或结肠癌。
在本发明的一种实施方式中,所述药物组合物是用于治疗或/和抑制或/和预防人乳腺癌细胞的药物组合物;所述人乳腺癌细胞包括人乳腺癌MCF-7细胞、T47D、SUM185、BT474、BT-483、600MPE、ZR-75、MDA-MB-468/453/231。
在本发明的一种实施方式中,所述药物组合物是用于增强和/或提高肿瘤细胞中p38蛋白质活性,降低和/或抑制Erk1/2蛋白质活性和/或Akt蛋白质活性的药物组合物。
本发明还提供了一种评估物质对治疗乳腺癌、前列腺癌、白血病、胃癌、肝癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌癌症的辅助效果的方法,将n-3PUFA以不同浓度单独和联合维甲酸药物添加到正在培养的人癌细胞中,在不同时间点检测Erk1/2信号通路变化情况、Akt信号通路变化情况、p38信号通路变化情况中的至少一种,来评估物质对癌细胞的凋亡和/或增殖的影响,以确定所述物质是否能辅助治疗癌症。
当检测结果为人癌细胞中Erk1/2和/或Akt活性显著降低,和/或p38活性显著增加,则所述物质有益于癌治疗;若结果为人癌细胞中Erk1/2和/或Akt活性显著增加和/或p38活性显著降低,则所述物质对癌治疗无益或有害。
所述有益于癌症治疗,是指联合服用n-3多不饱和脂肪酸和维甲酸药物时,能降低药物使用剂量或增强药物作用效果。
所述n-3多不饱和脂肪酸包括α-亚麻酸(α-Linolenicacid,ALA)和/或二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid,EPA,含5个不饱和键)和/或二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid,DHA,含6个不饱和键)。
所述维甲酸类药物包括全反式维甲酸,9-顺式维甲酸,13-顺式维甲酸,以及其衍生物。
所涉及的人癌细胞包括人乳腺癌、人前列腺癌、人白血病、人胃癌、人肝癌、人卵巢癌、人结肠癌、人直肠癌癌细胞。所述细胞生长可以通过CCK8方法检测,细胞凋亡可以通过TUNEL、细胞核荧光染色DAPI方法确定。细胞数目变化可以通过显微镜血球计数板方法进行直接计数,细胞形态可染色显微观察。
所述Erk1/2信号通路、Akt信号通路、p38信号通路变化情况是指Erk1/2、Akt和p38蛋白活性变化情况。所述Erk1/2、Akt和p38蛋白质活性是指Erk1/2、Akt和p38蛋白质磷酸激酶活性,通过免疫杂交或Western方法来检测。
在本发明的一种实施方式中,将单独n-3多不饱和脂肪酸(主要包括ALA、EPA和DHA)浓度(80μM),单独维甲酸药物(主要包括全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸)浓度(8μM),以及维甲酸药物(4μM)联合n-3多不饱和脂肪酸(40μM),分别加入正在培养的人癌细胞中,在一定的时间点(如6h、12、24h、48h、72h等)通过检测细胞数目、形态、DNA片段和核破裂和浓缩等来评估食品和/或营养补充剂对癌细胞的凋亡和/或增殖作用,从而评估所述补充剂是否能辅助该维甲酸药物发挥协同作用。
在本发明的一种实施方式中,将单独n-3多不饱和脂肪酸(主要包括ALA、EPA和DHA)浓度(80μM),单独维甲酸药物(主要包括全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸)浓度(8μM),以及维甲酸药物(4μM)联合n-3多不饱和脂肪酸(40μM),分别加入正在培养的人癌细胞中,在一定的时间点(如6h、12、24h、48h、72h等)通过蛋白质印迹法检测ERK1/2活性变化等来评估食品和/或营养补充剂对癌细胞的凋亡和/或增值作用,以评估所述补充剂对Erk1/2信号的作用效果。
在本发明的一种实施方式中,将单独n-3多不饱和脂肪酸(主要包括ALA、EPA和DHA)浓度(80μM),单独维甲酸药物(主要包括全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸)浓度(8μM),以及维甲酸药物(4μM)联合n-3多不饱和脂肪酸(40μM),分别加入正在培养的人癌细胞中,在一定的时间点(如6h、12、24h、48h、72h等)通过蛋白质印迹法检测AKT活性变化等来评估食品和/或营养补充剂对癌细胞的凋亡和/或增值作用,以评估所述补充剂对AKT信号的作用效果。
在本发明的一种实施方式中,将单独n-3多不饱和脂肪酸(主要包括ALA、EPA和DHA)浓度(80μM),单独维甲酸药物(主要包括全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸)浓度(8μM),以及维甲酸药物(4μM)联合n-3多不饱和脂肪酸(40μM),分别加入正在培养的人癌细胞中,在一定的时间点(如6h、12、24h、48h、72h等)通过蛋白质印迹法检测p38活性变化等来评估食品和/或营养补充剂对癌细胞的凋亡和/或增值作用,以评估所述补充剂对p38信号的作用效果。
本发明还提供一种药物辅助剂,所述辅助剂是n-3多不饱和脂肪酸或者含有n-3多不饱和脂肪酸的物质。
在本发明的一种实施方式中,所述药物辅助剂是维甲酸类药物的辅助剂。
在本发明的一种实施方式中,所述含有n-3多不饱和脂肪酸的物质是含有n-3PUFA的食品和/或是含有n-3PUFA的营养补充剂。
在本发明的一种实施方式中,所述药物辅助剂是用于抑制和/或预防和/或治疗肿瘤的药物的辅助剂。
在本发明的一种实施方式中,所述肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、白血病、胃癌、肝癌、卵巢癌、直肠癌和/或结肠癌。
在本发明的一种实施方式中,所述药物辅助剂是用于增强和/或提高肿瘤细胞中p38蛋白质活性的药物的辅助剂。
在本发明的一种实施方式中,所述药物辅助剂是用于降低和/或抑制Erk1/2蛋白质活性的药物的辅助剂。
在本发明的一种实施方式中,所述药物辅助剂是用于降低和/或抑制Akt蛋白质活性的药物的辅助剂。
本发明的有益效果:
(1)为减少维甲酸类药物的毒副作用及增强治疗效果,本发明通过n-3PUFA辅助维甲酸类共同治疗人乳腺癌、人前列腺癌、人白血病、人胃癌、人肝癌、人卵巢癌、人结肠癌、人直肠癌等癌症,这种组合配方能获得令人满意的治疗效果。本发明联合治疗肿瘤的效果,对治疗或预防具有指导作用。
(2)本发明的体外细胞实验以乳腺癌细胞为例,可以证明本药物和n-3多不饱和脂肪酸组合物有好的协同效果:将n-3PUFA以不同浓度单独和联合维甲酸药物添加到正在培养的人癌细胞中,在不同时间点检测细胞生长情况,筛选出明显抑制细胞增殖、促进细胞死亡的单独n-3PUFA和维甲酸药物的浓度;再将二者该浓度各减半作为协同作用浓度,可以明显得出协同时比单独添加n-3PUFA和维甲酸药物有更好的抑制细胞增殖、促进细胞死亡的作用。证明了本发明将和n-3多不饱和脂肪酸与维甲酸类药物间发挥了协同作用。
附图说明
图1不同浓度脂肪酸对细胞生长的影响;
图2不同浓度脂肪酸对细胞增殖的影响;
图3不同浓度维甲酸对细胞生长的影响;
图4不同浓度维甲酸对细胞增殖的影响;
图5脂肪酸与维甲酸对细胞生长的影响;
图6脂肪酸与维甲酸对细胞增殖的影响;
图7脂肪酸与维甲酸对细胞凋亡的影响;
图8脂肪酸与维甲酸对细胞凋亡蛋白水平的检验;
图9脂肪酸与维甲酸处理细胞后ERK、Akt、p38的活性变化。
具体实施方式
实施例1:n-3多不饱和脂肪酸对癌细胞的生长作用效果
EPA和DHA对癌细胞生长、增殖的抑制,已被很多研究证实,然而对于ALA对癌细胞的作用,并无明确定论,本发明从生长和增殖两方面,通过两种实验方法验证。
1.取对数生长期癌细胞,接种于6孔培养板中(2×105个/孔细胞),5%CO2,37℃孵育,待细胞贴壁后分别加入浓度梯度(10μM、20μM、40μM、80μM)的EPA、DHA和ALA,孵育24小时候显微镜下观察,并拍摄照片。
2.细胞增殖实验:CCK-8实验,具体方法如下:
(1)收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,用96孔板每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。
(2)5%CO2,37℃孵育,细胞贴壁后加入浓度梯度的药物,每孔1ul,设5个复孔。
(3)孵育24小时后,每孔加入10微升CCK-8溶液。设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。
(4)在细胞培养箱内继续孵育1小时。在450nm测定吸光度,并使用650nm作为参考波长进行双波长测定。
图1是不同浓度的脂肪酸作用细胞后,细胞微观形态的变化比较。图2是对应不同浓度的脂肪酸作用后,细胞增殖情况的变化。由图1的结果可以看出,EPA、DHA和ALA对细胞均有不同程度的损伤,细胞数目大量减少,在脂肪酸浓度达到40μM时,细胞数量有一定较少,而当脂肪酸浓度增至80μM时,细胞数量只有起始量的约1/2。在三种脂肪酸中,EPA作用效果最明显。图2反应了不同浓度脂肪酸处理后,细胞的增殖水平的变化。由结果可看出,三种脂肪酸对细胞的增殖均产生的强烈的抑制作用,其中EPA效果最为明显,此结果与上述结果相符。
实施例2:维甲酸对癌细胞的生长作用效果
维甲酸作为临床试验研究癌药物,对于癌细胞的凋亡作用,已被明确证实,本发明从细胞生长和增殖两方面,通过两种实验方法验证。
1.取对数生长期MCF-7细胞,接种于6孔培养板中(2×105个/孔细胞),5%CO2,37℃孵育,待细胞贴壁后加入浓度梯度(0μM、2μM、4μM、8μM)的维甲酸,孵育24小时候显微镜下观察,并拍摄照片。
2.细胞增殖实验方法:与上述一致。
图3是不同浓度的维甲酸作用细胞后,细胞微观形态的变化比较。由图3的结果可以看出,维甲酸对癌细胞有一定增殖抑制,当药物浓度达到8μM时,增殖抑制较为明显,细胞数目减少。图4反应了不同浓度维甲酸处理后,细胞增殖水平的变化。由结果可看出,维甲酸对细胞的增殖均产生的强烈的抑制作用,其中浓度达到8μM有显著性,此结果与上述结果相符。
实施例3:脂肪酸联合维甲酸对癌的生长作用效果
如实施例1和2,脂肪酸和维甲酸单独对癌细胞抑制增殖作用都已经明确被证实,维甲酸的毒副作用以及耐药性在临床上已经成为影响其发挥抗肿瘤作用的重要因素。因此,本发明提出一个新的观点,将二者联合是否能发挥协同的作用,从而降低脂肪酸与维甲酸的有效治疗浓度。本发明从细胞生长和增殖两方面,通过两种实验方法验证。
1.取对数生长期MCF-7细胞,接种于6孔培养板中(2×105个/孔细胞),5%CO2,37℃孵育,待细胞贴壁后加入单独脂肪酸(EPA、DHA、ALA)浓度(80μM),单独维甲酸药物浓度(8μM),以及维甲酸药物(4μM)联合脂肪酸(40μM),孵育24小时候显微镜下观察,并拍摄照片。
2.细胞增殖实验方法:与上述一致。
图5是脂肪酸和维甲酸单独以及联合作用细胞后,细胞微观形态的变化比较。由图3的结果可以看出,脂肪酸(80μM)和维甲酸(8μM)单独对癌细胞数目有一定减少,减半浓度脂肪酸(40μM)和维甲酸联合细胞数目减少更多(4μM)。图6反应了脂肪酸和维甲酸单独以及联合作用细胞后,细胞的增殖水平的变化。由结果可看出,减半浓度脂肪酸和维甲酸联合对细胞的增殖抑制作用明显强于单独脂肪酸和维甲酸的作用,此结果与上述结果相符。
实施例4:脂肪酸联合维甲酸对癌的凋亡作用效果
脂肪酸和维甲酸分别或联合作用于细胞时,细胞生长增殖被抑制,两者联合对细胞凋亡的效果也进一步被验证。本发明通过凋亡相关的三种实验方法验证。
1.DPAI染色法
a)溶液配制如下:
(1)0.01mol/L(pH7.0):取0.1mol/LNaH2PO4·H2O 34ml、0.1mol/LNa2HPO466ml、NaCl 0.9g,溶于900m1双蒸水;
(2)DAPI储存液:将0.5mgDAPI溶于5.0ml中,分装,低温长期保存;
(3)DAPI工作液:用稀释DAPI储存液,终浓度为0.1ug/ml。
b)具体染色方法如下:
(1)取对数生长期癌细胞接种,5%CO2,37℃孵育,待细胞贴壁后加入浓度梯度药物单独脂肪酸(EPA、DHA、ALA)浓度(80μM),单独维甲酸药物浓度(8μM),以及维甲酸药物(4μM)联合脂肪酸(40μM),孵育24小时后吸去培养基,PBS洗一次。
(2)用4%的多聚甲醛室温固定15分钟,PBS漂洗3次,每次两分钟;
(3)DAPI染色液室温孵育30分钟,并用锡箔纸包裹,PBS漂洗3次,每次两分钟;
(4)荧光显微镜下观察,用UV波段激发照相。
图7反应了脂肪酸和维甲酸单独以及联合作用细胞后,细胞的凋亡DAPI染色情况。由结果可看出,减半浓度脂肪酸和维甲酸联合作用后,细胞核DAPI染色荧光强度明显高于单独脂肪酸和维甲酸,得出联合作用对细胞的凋亡促进作用优于单独脂肪酸和维甲酸的作用。
2.Western Blot检测PARP蛋白水平
a)脂肪酸溶液配制:
(1)10%(w/v)十二烷基硫酸钠SDS溶液:0.1gSDS,1mlH2O去离子水配制,室温保存。
(2)分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris用80ml水溶解,用HCL调节pH到8.8,加水稀释到100ml终体积。
(3)浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于80ml水中,用约HCL调至pH6.8,加水稀释到100ml终体积。
(4)SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.80.5mol/LTris缓冲液8ml,甘油6.4ml,10%SDS12.8ml,巯基乙醇3.2ml,0.05%溴酚蓝1.6ml,H2O 32ml混匀备用。
(5)Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris,188g甘氨酸,10gSDS,用蒸馏水溶解至1000ml,临用前稀释10倍。
(6)转膜缓冲液:称取14.4g甘氨酸、6.04gTris,并加入200ml甲醇,加水至总量1L。
(7)Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5),500mmol/LNaCl。
b)具体步骤如下:
将癌细胞用PBS清洗3次,加入裂解液,直接煮沸5分钟,冰上冷却后,12000rpm离心2min,取上清,-20保存备用。
(一)SDS-PAGE凝胶电泳
(1)清洗后的玻璃板对齐后放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶。
(2)配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶,随即用乙醇液封,胶充分凝固就可倒去胶上层乙醇并用吸水纸吸干。
(3)配5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后,竖直向上轻轻将其拔出。
(5)将其放入电泳槽中,加足够的电泳液后开始准备上样。蛋白质样品测完蛋白含量后,加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×,在沸水中煮3min混匀后上样,总蛋白量35μg。
(6)恒压80V电泳跑胶,当样品进入下层胶后恒压120V电泳直至溴酚蓝达到凝胶底部为止,进行转膜。
(二)转膜:
(1)切胶:将玻璃板撬掉,除去小玻璃板后,将浓缩胶刮去,根据实验需要按照蛋白的分子量,以Marker为对照进行切胶。
(2)备膜:裁剪PVDF膜和滤纸,将切好的PVDF置于80%甲醇溶液中激活30s。
(3)装膜:将转膜用的夹子打开使黑的一面(负极)保持水平。在上面垫一张海绵垫,加入转膜液浸湿,在垫子上垫上中浸泡好的滤纸,随后按照凝胶—硝酸纤维素膜—滤纸—海绵垫的顺序依次叠放。最后将白色板(正极)盖好装入转膜槽中。
(4)转膜:将夹子放入转移槽槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。4℃转膜,恒流400mA。
(5)转完后将膜取下,标记一角。
(三)免疫反应
(1)封闭:将膜用TBST中漂洗3次,每次5min。漂洗后将硝酸纤维素膜放入5%脱脂奶粉中,室温下摇床1h。
(2)加一抗:将封闭后的硝酸纤维素膜放入含有TBST的洗缸中摇床上漂洗3次,每次5min。放入加有一抗的平皿中4℃过夜孵育。
(3)加二抗:回收一抗,将硝酸纤维素膜在TBST洗缸中室温摇床漂洗3次,每次5min,然后将漂洗过的硝酸纤维素膜放入加有二抗的平皿中,避光室温孵育45min。孵育后将硝酸纤维素膜在TBST洗缸中洗3次,每次5min。
(四)化学发光
(1)将A和B两种试剂在小离心管里按照发光试剂盒说明书操作将其混合,加到硝酸纤维素膜上,用化学发光成像仪显色。
和维甲酸单独以及联合作用细胞后,提取总蛋白进行Western Blot检测PARP蛋白水平。图8反映了在不同时间段(12h、24h、48h),脂肪酸和维甲酸联合作用时剪切形式的PARP有明显的上升,24h只有EPA与维甲酸联合有剪切形式的PARP蛋白的出现;而到48h时,三种脂肪酸联合维甲酸都出现了明显的剪切形式PARP,这代表随着时间的推迟,验证脂肪酸和维甲酸联合作用有明显的细胞凋亡发生。
实施例5:脂肪酸联合维甲酸对AKT、ERK1/2、p38信号的作用
Akt又称PKB或Rac,在细胞存活和凋亡中起重要作用。胰岛素等生长和存活因子都可以激活Akt信号途径,Akt的Ser473可以被PDK1磷酸化。
ERKs调节着细胞的增殖、分化和存活,是多种生长因子(EGF、NGF、PDGF等)的下游蛋白,ERK和其信号途径在肿瘤侵袭和转移过程中起中介和放大信号的作用,一方面接受大量来自生长因子、丝裂原、环境刺激等的信号,另一方面通过ERK信号级联反应作用于核转录因子如AP-1、NF-кB等,调控基因表达。在许多人类的癌症(如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、白血病、口腔癌、黑色素瘤等)中都可发现ERK的过度激活。
p38信号通路是MAPK通路的一重要分支,它在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。4种已知的p38异构体包括p38α、p38β、p38γ和p38δ.多年来已发现p38MAPK通路可以由应激包括高渗、热休克、放射线和其他应激反应活化。因此,p38MAPK通路参与了多种刺激引起的信号级联反应,表明它在引起多种细胞反应中起重要作用,并且,p38在细胞凋亡中也显示调节效应。
本发明采用western blotting的方法对AKT、ERK1/2、p38信号通路进行验证。
图9是脂肪酸和维甲酸联合作用细胞后的AKT、ERK1/2、p38信号磷酸化水平的变化。由图9可看出,脂肪酸处理后,AKT、ERK1/2、p38活性上调。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种药物组合物,所述药物组合物以A和B为主要活性组分;其中A为维甲酸类药物,B为n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)。
2.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述维甲酸类药物包括维甲酸、维胺酸、异维胺酯和天然维生素A、全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、3-顺式维甲酸、阿维甲酯、阿维甲酸、芳香维甲酸、芳香维甲酸乙酯、甲磺基芳香维甲酸、乙酰维甲酸以及上述物质的衍生物。
3.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述n-3PUFA为多不饱和脂肪酸,包括α-亚麻酸和/或二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸。
4.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述n-3多不饱和脂肪酸包括含有n-3PUFA的食品和/或含有n-3PUFA的营养补充剂和/或饮食补充剂。
5.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物中A和B的摩尔比为2:1~1:20。
6.一种用于抑制和/或预防和/或治疗肿瘤的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物以A和B为主要活性组分;其中A为维甲酸类药物,B为n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)。
7.根据权利要求6所述的药物组合物,其特征在于,所述肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、白血病、胃癌、肝癌、卵巢癌、直肠癌和/或结肠癌。
8.一种药物辅助剂,其特征在于,所述辅助剂是n-3多不饱和脂肪酸或者含有n-3多不饱和脂肪酸的物质。
9.根据权利要求8所述的药物辅助剂,其特征在于,所述药物辅助剂是用于抑制和/或预防和/或治疗肿瘤的药物的辅助剂。
10.根据权利要求9所述的药物辅助剂,其特征在于,所述肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、白血病、胃癌、肝癌、卵巢癌、直肠癌和/或结肠癌。
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CN108977494A (zh) * | 2017-06-03 | 2018-12-11 | 加乐生医股份有限公司 | 一种预测药物疗效的方法 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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