CN108143732A

CN108143732A - 雷帕霉素和ω-3脂肪酸在制备治疗肾癌的药物中的用途

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Publication number: CN108143732A
Application number: CN201711374903.6A
Authority: CN
Inventors: 陈永泉; 冯宁翰; 朱升龙; 王小英; 单锴; 韦冷云
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2018-06-12

Abstract

本发明公开了雷帕霉素类药物和ω‑3脂肪酸的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的用途。本发明将雷帕霉素类药物联合ω‑3脂肪酸添加到体外培养的肾癌细胞和移植瘤小鼠中，雷帕霉素类药物联合ω‑3脂肪酸对肾癌细胞的生长抑制、对肾癌细胞的凋亡促进和对移植瘤小鼠的肿瘤生长抑制等效果均得到明显提升；雷帕霉素类药物和ω‑3脂肪酸在用于肾癌的治疗时具有明显的协同作用，在提高肾癌治疗效果的同时，能够降低由雷帕霉素类药物带来的代谢紊乱、血脂升高等毒副作用，具有重要的临床药物应用前景。

Description

雷帕霉素和ω-3脂肪酸在制备治疗肾癌的药物中的用途

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及雷帕霉素和ω-3脂肪酸的组合在制备治疗肾癌的药物中的用途。

背景技术

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是最常见的肾脏恶性疾病，与前列腺癌和膀胱癌并称泌尿系三大恶性肿瘤。肾细胞癌作为主要的肾脏恶性肿瘤，发病率约占癌症综合发病率的2～3％，位居男女恶性肿瘤的第6位和第7位。在过去30年内，肾细胞癌在全世界的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，每年有大约20万例新诊断病例，约10万人死于该病。25％的患者在确诊时已发生远处转移，约30％的术后患者在3年内出现复发或转移。肾细胞癌的预后效果极差，5年生存率不到10％。由于肾细胞癌具有无早期体征、临床表现不同以及耐放射等特征，传统的放疗对晚期肾癌收效甚微；白介素(IL)-2或干扰素(IFN)为主的免疫治疗对转移性肾细胞癌反应率低，药物毒性作用大，限制了免疫治疗的应用；化学治疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一，但是肾细胞癌的多药耐药性常常导致治疗失败。目前，肾细胞癌的治疗作为世界性难题，尚缺少有效的治疗手段。

雷帕霉素(rapamycin)是由吸水链霉菌FC904(Streptomyces hygroscopicμs，FC904) 发酵产生的多功能药物，现称西罗莫司(sirolimμs)。雷帕霉素是大环内酯类化合物，临床上用于器宫移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。雷帕霉素主要作用于细胞周期G1，抑制细胞因子和生长因子的DNA在免疫和非免疫细胞内的合成。雷帕霉素作器宫移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗药物，具有活性高、用量小(2mg/天，人)，以及毒性低等优点，美国已在全球80个中心进行1295例肾移植试验，雷帕霉素对肾移植后排斥反应的治疗效果显著，副作用小。

目前已经发现，雷帕霉素单用或与化疗药物合用具有抗肿瘤活性。体内外研究表明，雷帕霉素可以诱导多种肿瘤停滞在Gl期，减小肿瘤细胞体裂，诱导肿瘤细胞非p53依赖性凋亡，雷帕霉素通过减少VEGF的产生，阻止VEGF与血管内皮细胞的作用，来显著减少肿瘤血管的生成，降低肿瘤血管密度，使肿瘤发生坏死，延长荷瘤小鼠的生存时间。基于临床试验结果，雷帕霉素类似物被2011年NCCN肾癌治疗指南作为1类证据推荐为预后不佳的转移性肾癌(透明细胞为主和非透明细胞为主型)患者的一线治疗。

雷帕霉素虽然有一定程度的抗肾细胞癌活性，但是以雷帕霉素单用其抗肿瘤效果较差，且长期服用后会产生严重的血脂代谢紊乱及药物耐受。另外，在已有的雷帕霉素与其他抗肿瘤药物的联合使用文献中，联合使用的成分只涉及到现有的一些人工合成而非天然的抗肿瘤药物，并且这些抗肿瘤药物毒性较大，具有骨髓抑制作用、白细胞减少、还具有引起呕吐、恶心等肠胃反应的作用。目前，还未有报道表明天然食品组分能够辅助雷帕霉素治疗肾癌。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中辅助雷帕霉素治疗肾癌的药物组合物无法在提高雷帕霉素抗肾癌活性的同时，降低雷帕霉素的毒副作用、改善雷帕霉素引起的代谢紊乱的缺陷，进而提供了雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的用途。

为此，本发明提供了雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的用途。

上述的用途，所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备增强肿瘤细胞的活性氧簇水平的药物中的用途。

上述的用途，所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备肾癌细胞的糖酵解抑制剂中的用途。

上述的用途，所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备肾癌细胞的谷氨酸代谢抑制剂中的用途。

上述的用途，所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备增强肾癌细胞的氧化磷酸化水平的药物中的用途。

上述的用途，所述ω-3脂肪酸选自α-亚麻酸ALA、二十碳五烯酸EPA和二十二碳六烯酸DHA中的至少一种。

上述的用途，所述ω-3脂肪酸包括含有ω-3脂肪酸的食品和/或含有ω-3脂肪酸的营养补充剂。

上述的用途，所述雷帕霉素类药物包括雷帕霉素、雷帕霉素药学上可接受的盐、雷帕霉素衍生物和/或雷帕霉素衍生物药学上可接受的盐。

上述的用途，所述雷帕霉素类药物和所述ω-3脂肪酸的摩尔比为2:1～1:3。

上述的用途，所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物制成的药物组合物为胃肠道给药和胃肠道外给药中的任一临床上可接受的剂型。

优选地，用于口服时，胃肠道给药时的剂型选自片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖浆、颗粒、滴丸、口崩片、缓释片、缓释胶囊、控释片或控释胶囊；胃肠道外给药时的剂型选自水针、冻干粉针、无菌粉针或输液。

本发明提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸。

优选地，上述药物组合物，所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的摩尔比为1:3～2:1。优选地，所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的摩尔比为1:2。

本发明提供了一种上述的药物组合物的制备方法，将所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸按照选定的量进行混合，制成临床上可接受的制剂。

优选地，上述的制备方法，将所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸按照选定的量进行混合，加入常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的制剂。

优选地，所述常规辅料包括所述常规辅料为：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000、PEG4000、虫蜡等。

本发明相对于现有技术具有如下优点：

1、本发明提供的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的用途。ω-3脂肪酸为多不饱和脂肪酸(polyμnsatμrated fatty acids，PΜFAs)，源于鱼类、特别是原产自寒冷海水的深海鱼类，以及海豹油和某些植物中。本发明将ω-3脂肪酸和雷帕霉素类药物的组合物分别处理人体外培养的肾癌细胞、移植有肾癌细胞的移植瘤小鼠，结果发现与单独雷帕霉素类药物和单独ω-3脂肪酸的处理效果相比，雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物应用后对肾癌细胞的生长抑制、对肾癌细胞的凋亡促进和对移植瘤小鼠的肿瘤生长抑制等效果均得到明显提升，说明雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在用于肾癌的治疗时具有明显的协同作用。本发明首次将雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸组合应用于治疗肾癌，通过雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的协同作用，显著增强了对肾细胞癌的治疗效果。

另一方面，雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸组合应用于治疗肾癌，在提高肾癌治疗效果的同时，能够增强对脂肪酸的代谢水平，降低由于雷帕霉素类药物所导致的总胆固醇、甘油三酯和脂蛋白的升高，起到降低血脂的效果。雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸组合使用能够缓解单独以雷帕霉素类药物治疗时容易产生代谢水平紊乱和高血脂症等药物毒副作用，对于肾癌患者的身体健康状况和生存质量有明显提升。

2、本发明提供的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备增强肾癌细胞的活性氧簇水平的药物中的用途。活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)是体内氧化代谢产物，是重要的信号分子，在细胞凋亡过程中担当着重要角色。对ROS的研究发现，ROS可以通过加速肿瘤细胞死亡而达到治疗的目的，目前以增加肿瘤细胞内 ROS水平为目的的药物渐渐应用于临床。

本发明提供的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物应用于治疗肾癌时，能够增强肾癌细胞的活性氧簇水平，进而引发肾癌细胞内的caspase级联反应，促进肾癌细胞凋亡，实现对肾癌的治疗。同时，本发明中的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸在促使肾癌细胞的产生活性氧簇的过程中协同作用，效果优于仅以雷帕霉素类药物或者仅以ω-3 脂肪酸处理肾癌细胞时对活性氧簇水平的增加，进而能够提高对肾癌的治疗效果。

3、本发明提供的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备肾癌细胞的糖酵解抑制剂中的用途。糖酵解是细胞利用营养物质生产能量的途径之一，主要存在于快速增殖的癌细胞中。糖酵解活性增强是癌症的标志之一，肿瘤细胞通过糖酵解实现快速分裂和增殖。抑制肿瘤细胞内高活性的糖酵解过程，能够有效抑制肿瘤细胞的生长。

本发明提供的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物应用于治疗肾癌时，能够显著抑制肾癌细胞糖酵解途径中的相关蛋白，进而抑制糖酵解活性；而仅以雷帕霉素类药物或者仅以ω-3脂肪酸处理肾癌细胞时，糖酵解相关蛋白的表达水平未发生明显变化，说明雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的协同作用能够起到抑制肿瘤细胞中糖酵解的作用，进而实现对肾癌细胞的生长抑制。

4、本发明提供的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备肾癌细胞的谷氨酸代谢抑制剂中的用途。肿瘤细胞内需要代谢谷氨酰胺为肿瘤细胞快速合成蛋白质、脂类和核酸提供重要原料，肿瘤细胞生长依赖于谷氨酰胺。谷氨酰胺缺乏或谷氨酰胺酶代谢水平的抑制均能抑制肿瘤细胞的生长。

本发明提供的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物应用于治疗肾癌时，能够显著抑制肾癌细胞谷氨酰胺代谢过程中的相关蛋白；而仅以雷帕霉素类药物或者仅以ω-3脂肪酸处理肾癌细胞时，谷氨酰胺代谢相关蛋白的表达水平未发生明显变化，说明雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的协同作用能够起到降低肿瘤细胞中谷氨酰胺代谢水平，进而实现对肾癌细胞的生长抑制。

5、本发明提供的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备增强肾癌细胞的氧化磷酸化水平的药物中的用途。肿瘤细胞中的能量代谢主要依赖有氧糖酵解，在肿瘤细胞的糖酵解代谢活跃过程中，线粒体呼吸链缺失，线粒体的氧化磷酸化代谢功能则受到不同程度的损伤，增强肿瘤细胞内的氧化磷酸化代谢水平，有利于抑制肿瘤细胞中的能量代谢，进而抑制肿瘤细胞的生长。

本发明提供的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物应用于治疗肾癌时，能够明显增强氧化磷酸化代谢过程中相关蛋白的表达量，提高肾癌细胞内的氧化磷酸化代谢水平，抑制肾癌细胞生长，实现肾癌治疗效果。

6、本发明中的ω-3脂肪酸选自α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)中的至少一种。上述的ω-3脂肪酸具有对血脂有正向调节作用，有利于降低心血管疾病发生的危险度系数。α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA)在与雷帕霉素类药物配合使用后，与雷帕霉素类药物的协同作用不仅能够增强药物的肾癌治疗效果，还能缓解雷帕霉素类药物的毒副作用，延长肾癌患者的存活时间以及改善存活质量。

7、本发明提供的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的摩尔比为1:3～2:1。雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的摩尔比介于1:3～2:1的范围内，能够发挥两者的协同作用，提高对肾癌细胞增殖的抑制效果、促进肾癌细胞凋亡，抑制移植瘤小鼠的肿瘤生长，并能降低移植瘤小鼠体内的血脂水平，说明上述比例范围内的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸具有明显改善的肾癌治疗效果和明显缓解的药物毒副作用。

8、本发明提供的一种药物组合物，包括治疗有效量的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸。通过雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的协同配合作用，显著提高了上述药物对于肾癌细胞增殖的抑制效果、促进肾癌细胞凋亡，并且能够缓解单独以雷帕霉素类药物治疗时容易产生代谢水平紊乱和高血脂症等药物毒副作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实验例1中ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对肾癌细胞增殖影响的检测结果图；

图2为本发明实验例2中ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对肾癌细胞生长周期影响的检测结果图；

图3为本发明实验例3中ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对肾癌细胞凋亡影响的检测结果图；

图4为本发明实验例4中ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对移植瘤小鼠模型中肿瘤质量、体积影响的检测结果图；

图5为本发明实验例4中ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对移植瘤小鼠模型中肿瘤生长影响的检测结果图；

图6为本发明实验例4中ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对移植瘤小鼠模型中肿瘤生长影响的检测结果图；

图7为本发明实验例5中ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对移植瘤小鼠模型中血脂影响的检测结果图；

图8为本发明实验例6中ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对肾癌细胞的活性氧簇(ROS)水平影响的检测结果图；

图9为本发明实验例7中ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对肾癌细胞内糖酵解活性、谷氨酸代谢水平、ω-3脂肪酸代谢水平和氧化磷酸化水平的影响的检测结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。下述实验例中所涉及的肾癌细胞为肾癌细胞株A498，购于自上海生命科学研究院细胞所；裸鼠为BALB/C，购自购自上海斯莱克。下述实施例中使用的一抗为带有GST 标签的抗体，购自ABCAM；二抗为鼠抗和兔抗，购自金斯瑞生物科技有限公司。

实施例1

本实施例提供了一种药物组合物，配方如下：雷帕霉素和ω-3脂肪酸；所述雷帕霉素和ω-3脂肪酸的摩尔比为1:2。

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素10μM，和ω-3脂肪酸20μM的混合物，即得。其中，ω-3脂肪酸为EPA。

实施例2

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素10μM，和ω-3脂肪酸20μM的混合物，即得。其中，ω-3脂肪酸为DHA。

实施例3

本实施例提供了一种药物组合物，配方如下：雷帕霉素和ω-3脂肪酸；所述雷帕霉素和ω-3脂肪酸的摩尔比为2:1。

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素20μM，和ω-3脂肪酸10μM的混合物，即得。其中，ω-3脂肪酸为EPA。

实施例4

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素20μM，和ω-3脂肪酸10μM的混合物，即得。其中，ω-3脂肪酸为DHA。

实施例5

本实施例提供了一种药物组合物，配方如下：雷帕霉素和ω-3脂肪酸；所述雷帕霉素和ω-3脂肪酸的摩尔比为1:3。

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素10μM，和ω-3脂肪酸30μM的混合物，即得。其中，ω-3脂肪酸为ALA。

实施例6

本实施例提供了一种药物组合物，配方如下：雷帕霉素和ω-3脂肪酸；所述雷帕霉素和ω-3脂肪酸的摩尔比为1:1。

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素10μM，和ω-3脂肪酸10μM的混合物，即得。其中，ω-3脂肪酸为EPA和DHA，EPA为7μM，DHA为3μM。

实施例7

本实施例提供了一种药物组合物，配方如下：雷帕霉素和ω-3脂肪酸；所述雷帕霉素和ω-3脂肪酸的摩尔比为1.5:1。

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素15μM，和ω-3脂肪酸10μM的混合物，即得。其中，ω-3脂肪酸为EPA和ALA，EPA为5μM，ALA为5μM。

实施例8

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素15μM，和ω-3脂肪酸30μM的混合物，即得。其中，ω-3脂肪酸包括EPA、DHA和ALA，EPA为10μM，ALA为5μM， DHA为15μM。

实施例9

本实施例提供了一种药物组合物，配方如下：雷帕霉素和ω-3脂肪酸；所述雷帕霉素和ω-3脂肪酸的摩尔比为1.8:1。

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素18μM，和ω-3脂肪酸10μM的混合物，添加常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的片剂。其中，ω-3脂肪酸包括DHA和ALA，ALA为5μM，DHA为5μM。

实施例10

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素10μM，和ω-3脂肪酸20μM的混合物，添加常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的胶囊剂。其中，ω-3脂肪酸包括DHA和ALA，ALA为15μM，DHA为5μM。

实施例11

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素10μM，和ω-3脂肪酸20μM的混合物，添加常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的颗粒剂。其中，ω-3脂肪酸包括EPA、DHA和ALA，EPA为10μM，ALA为5μM，DHA为5μM。

实施例12

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素10μM，和ω-3脂肪酸20μM的混合物，添加常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的冻干粉。其中，ω-3脂肪酸包括EPA、DHA和ALA，EPA为5μM，ALA为10μM，DHA为5μM。

实施例13

本实施例还提供了一种制备上述药物组合物的方法，包括：按照上述配方取雷帕霉素和ω-3脂肪酸，混合均匀，最终制成含有雷帕霉素10μM，和ω-3脂肪酸20μM的混合物，添加常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的制剂，如胃肠道给药时的剂型选自片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖浆、颗粒、滴丸、口崩片、缓释片、缓释胶囊、控释片或控释胶囊；或胃肠道外给药时的剂型选自水针、冻干粉针、无菌粉针或输液。其中，ω-3脂肪酸包括EPA、DHA和ALA，EPA为5μM，ALA为5μM，DHA为10μM。

实验例1

本实验例检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸的药物组合物对肾癌细胞增殖的影响，具体包括以下步骤：

1、细胞计数实验检测ω-3脂肪酸对肾癌细胞增殖的影响

取对数生长期癌细胞，接种于6孔培养板中(2×10⁵个/孔细胞)，5％CO₂，37℃孵育，待细胞贴壁后分别加入浓度梯度(10μM、20μM、40μM)的EPA和DHA孵育24小时，消化收集活细胞，吹打成单个细胞，吸取10μL细胞液滴加在血球计数器计数，于显微镜下计数，统计ω-3脂肪酸处理后肾癌细胞数目的变化情况(图1A和图1C)。

2、细胞计数实验检测雷帕霉素对肾癌细胞增殖的影响

取对数生长期癌细胞，接种于6孔培养板中(2×10⁵个/孔细胞)，5％CO₂，37℃孵育，待细胞贴壁后分别加入浓度梯度(1μM、10μM、20μM)的雷帕霉素孵育24小时，消化收集活细胞，吹打成单个细胞，吸取10μL细胞液滴加在血球计数器计数，于显微镜下计数，统计雷帕霉素处理后肾癌细胞数目的变化情况(图1B和图1C)。

3、细胞计数实验检测雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对肾癌细胞增殖的影响

取对数生长期癌细胞，接种于6孔培养板中(2×10⁵个/孔细胞)，5％CO²，37℃孵育，待细胞贴壁后分别加入实施例1中的药物组合物(20μM的EPA联合10μM的雷帕霉素)，和实施例2中的药物组合物(20μM的DHA联合10μM的雷帕霉素)。孵育24小时，消化收集活细胞，吹打成单个细胞，吸取10μL细胞液滴加在血球计数器计数，于显微镜下计数，统计雷帕霉素联合ω-3脂肪酸处理后肾癌细胞的变化情况(图1C)。

图1A显示加入不同浓度梯度的ω-3脂肪酸(EPA\DHA)后，肾癌细胞数目的变化情况。由图1A结果可知：随着加入的ω-3脂肪酸的浓度的增加，肾癌细胞数目呈不断下降的趋势，当ω-3脂肪酸浓度达40μM时，肾癌细胞数目为起始数目的60％～70％，说明ω-3脂肪酸能够抑制肾癌细胞的增殖。其中EPA对肾癌细胞增殖的抑制效果优于 DHA。

图1B显示加入不同浓度梯度的雷帕霉素后，肾癌细胞数目的变化情况。由图1B 结果可知：随着加入的雷帕霉素的浓度的增加，肾癌细胞数目呈不断下降趋势，当雷帕霉素浓度达20μM时，肾癌细胞数目为起始数目的50％左右，说明雷帕霉素能够抑制肾癌细胞的增殖。

图1C中比较雷帕霉素、ω-3脂肪酸和雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对肾癌细胞数目的影响。柱形图从左向右依次显示空白、雷帕霉素(20μM)、EPA(40μM)、雷帕霉素(10μM) 联合EPA(20μM)、DHA(40μM)，以及雷帕霉素(10μM)联合DHA(20μM)后，肾癌细胞数目的变化。由图1C结果可知：与雷帕霉素或ω-3脂肪酸(EPA\DHA)单独处理结果相比，将雷帕霉素浓度减半后联合浓度减半的EPA或DHA处理肾癌细胞，肾癌细胞数量明显降低，雷帕霉素联合ω-3脂肪酸后显著提高了对肾癌细胞增殖的抑制效果。以上数据说明雷帕霉素和ω-3脂肪酸能够发挥协同作用，在降低雷帕霉素和ω-3脂肪酸的使用浓度的情况下，提高了对肾癌的治疗效果。

实验例2

本实验例ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸的药物组合物对肾癌细胞生长的影响，具体包括以下步骤：

1、流式细胞法检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对细胞生长周期的影响

取处于对数生长期的肾癌细胞，接种于6孔培养板中(2×10⁵个/孔细胞)，5％CO₂，37℃孵育，然后分别用EPA(40μM)、DHA(40μM)、雷帕霉素(20μM)、实施例3中的药物组合物(雷帕霉素20μM联合EPA10μM)，和实施例4中的药物组合物(雷帕霉素10μM联合DHA20μM)处理培养24h。最后以PI单染流式检测细胞周期，具体步骤如下：

(1)收集细胞：贴壁细胞，用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤细胞两次；

(2)固定细胞：离心去上清，用预冷70％乙醇重悬(-20℃预冷)，4℃过夜固定；

(3)染色：离心去70％乙醇，PBS洗一遍，用含50μg/mL的PI染液重悬混匀(用时添加100μg/mL RNase和0.1％曲拉通-100)，室温避光染色15min；

(4)上机检测：立即用流式细胞仪进行检测；

(5)分析：运用细胞周期拟合软件分析细胞各个时期的分布情况。

图2A显示ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸处理肾癌细胞后，处于细胞周期中S、G2/M和G0/G1三个不同阶段的细胞所占的比例。柱形图从左向右依次显示空白、雷帕霉素(20μM)、EPA(40μM)、实施例3的药物组合物(雷帕霉素 (20μM)联合EPA(10μM))、DHA(40μM)，以及实施例4的药物组合物(雷帕霉素 (20μM)联合DHA(10μM))处理后，处于细胞周期中各阶段的细胞比例。由图2A 可知，仅以雷帕霉素、EPA或DHA处理的肾癌细胞，其细胞周期未受到明显影响，而雷帕霉素联合EPA或DHA后，处于周期静止的G0/G1阶段的细胞比例明显提升，而处理DNA合成期S和有丝分裂期G2/M的细胞比例降低，说明雷帕霉素联合ω-3脂肪酸能够调控肾癌细胞的生长周期，使肿瘤细胞阻滞在G0/G1期，从而有效地抑制肿瘤细胞增殖，诱使肿瘤细胞凋亡。

2、western blot检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对细胞周期相关蛋白p21和p27的影响

A.配制溶液：

(1)10％(w/v)十二烷基硫酸钠SDS溶液：0.1gSDS，1mL的H₂O去离子水配制，室温保存。

(2)分离胶缓冲液：称取18.15g的Tris，用80ml水溶解后，用HCl调节pH到 8.8，加水稀释到100mL终体积，得到1.5mmol/L的Tris-HCl(pH8.8)溶液。

(3)浓缩胶缓冲液：6.05gTris溶于80mL水中，用约HCI调至pH6.8，加水稀释到100ml终体积，得到0.5mmol/L的Tris-HCl(pH6.8)溶液。

(4)SDS-PAGE加样缓冲液：将pH6.8的0.5mol/L的Tris缓冲液8mL，甘油6.4mL，10wt％的SDS 12.8mL，巯基乙醇3.2mL，0.05wt％的溴酚蓝1.6mL，H₂O 32mL混匀备用。

(5)Tris-甘氨酸电泳缓冲液：称取30.3gTris、188g甘氨酸和10g SDS，用蒸馏水溶解至1000毫升，临用前稀释10倍。

(6)转膜缓冲液：称取14.4g甘氨酸、6.04g Tris，向其中加入200mL甲醇，最后加水至总体积为1L。

(7)Tris缓冲盐溶液(TBS)：含有20mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)和500mmol/L的NaCl。

B.将肾癌细胞用PBS清洗3次，加入裂解液，直接煮沸5分钟，冰上冷却后，12000rpm离心2min，取上清，-20℃保存备用。

C.采用BCA法测定蛋白质浓度

将0.5mg/mL标准蛋白梯度加到孔板中，加PBS补足至20μL；加适当体积(3μL) 蛋白质样品到孔板中，加PBS补足至20μL；各孔加入200μL BCA工作液(使用前配制，现配现用)，37℃孵育30min；测定波长562nm吸光度，通过标准曲线和样品体积计算出蛋白质的浓度。

D.SDS-PAGE凝胶电泳

(1)清洗后的两块玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。

(2)灌注10wt％分离胶：分离胶缓冲液中加入TEMED(四甲基乙二胺)后立即摇匀，灌注至两块玻璃板中间的间隙内，随即用乙醇液封，胶充分凝固就可倒去胶上层乙醇并用吸水纸吸干。

(3)灌注5wt％的浓缩胶：浓缩胶缓冲液中加入TEMED(四甲基乙二胺)后立即摇匀，灌注至分离胶的上层，将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，竖直向上轻轻将其拔出。

(4)将灌胶完成后的玻璃板放入电泳槽中，加足够的电泳液后开始准备上样。蛋白质样品测完蛋白含量后，加入5×SDS上样缓冲液，在沸水中煮3min混匀后上样，上样的总蛋白量为35μg。

(5)恒压80V电泳跑胶，当样品进入下层胶后恒压120V电泳直至溴酚蓝达到凝胶底部为止，进行转膜。

E.转膜

(1)切胶：将玻璃板撬掉，除去小玻璃板后，将浓缩胶刮去，根据实验需要按照蛋白的分子量，以Marker为对照进行切胶。

(2)备膜：裁剪PVDF膜和滤纸，将切好的PVDF置于80％甲醇溶液中激活30s。

(3)装膜：将转膜用的夹子打开使黑的一面(负极)保持水平。在上面垫一张海绵垫，加入转膜液浸湿，在垫子上垫上中浸泡好的滤纸，随后按照凝胶—硝酸纤维素膜—滤纸—海绵垫的顺序依次叠放。最后将白色板(正极)盖好装入转膜槽中。

(4)转膜：将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。4℃转膜，恒流400mA。

(5)转完后将膜取下，标记一角。

F.免疫反应

(1)封闭：将膜用TBST中漂洗3次，每次5min。漂洗后将硝酸纤维素膜放入5％脱脂奶粉中，室温下摇床1h。

(2)加一抗((p21、p27、CylinD1、PARP、Bcl-2、Glut1、HK2、PKM2、PFKP、 PD和GPD)：将封闭后的硝酸纤维素膜放入含有TBST的洗缸中摇床上漂洗3次，每次 5min。放入加有一抗的平皿中4℃过夜孵育。

(3)加二抗(鼠抗)：回收一抗，将硝酸纤维素膜在TBST洗缸中室温摇床漂洗3 次，每次5min，然后将漂洗过的硝酸纤维素膜放入加有二抗的平皿中，避光室温孵育 45min。孵育后将硝酸纤维素膜在TBST洗缸中洗3次，每次5min。

G.化学发光

将A和B两种试剂在小离心管里按照发光试剂盒说明书操作将其混合，加到硝酸纤维素膜上，用化学发光成像仪显色。

图2B显示ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸处理肾癌细胞后，细胞周期相关蛋白p21、p27的变化情况。蛋白条带从左向右依次显示空白、雷帕霉素 (Rp)(20μM)、EPA(40μM)、实施例3药物组合物(雷帕霉素(20μM)联合EPA(10μM))、 DHA(40μM)，以及实施例4药物组合物(雷帕霉素(20μM)联合DHA(10μM))处理后，p21、p27、CylinD1和β-action四种蛋白的变化情况，其中CylinD1和β-action 为内参蛋白。P21和P27是细胞周期重要调控因子，是依赖周期素的蛋白激酶抑制因子 (CKI)中的一员。

由图2B可知，仅以雷帕霉素、EPA或DHA处理的肾癌细胞，P21和P27蛋白的表达量未发生明显变化，而雷帕霉素联合EPA或DHA后，P21以及P27的蛋白表达量明显降低，进一步说明雷帕霉素联合ω-3脂肪酸能够调控肾癌细胞的生长周期，使肾癌细胞的生长周期发生停止，通过两者的协同作用，实现了对肿瘤细胞的增殖抑制。

实验例3

本实验例检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸的药物组合物对肾癌细胞的凋亡的影响，具体包括以下步骤：

1、Annexin V-PI双染实验检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸的药物组合物对肾癌细胞的凋亡的影响

A.ω-3脂肪酸对肾癌细胞凋亡的影响

(1)取处于对数生长期肾癌细胞，接种于6孔培养板中(2×10⁵个/孔细胞)，5％CO₂，37℃孵育，向细胞中分别加入40μM的EPA和40μM的DHA处理培养48h。

(2)收集细胞：贴壁细胞，用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤细胞两次，用试剂盒中 1×Binding Buffer重悬，调整细胞为10⁶个/ml。

(3)染色：转移100μL细胞悬液(约105个细胞)到1.5mL EP管中，加入5μL FITC-Annexin V染液，轻轻吹打混匀，室温避光染色15min；之后加入2μL PI染液，室温避光染色2min。

(4)上机检测：每EP管加入400μL 1×Binding Buffer，1h以内进行检测。

(5)分析：根据各象限细胞数目，分析细胞早期凋亡、晚期凋亡的百分比。

B.雷帕霉素对肾癌细胞凋亡的影响

采用上述步骤A中的方法，检测雷帕霉素对肾癌细胞凋亡的影响，其中处理肾癌细胞的雷帕霉素的浓度为20μM。

C.雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对肾癌细胞凋亡的影响

采用上述步骤A中的方法，检测雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对肾癌细胞凋亡的影响，分别以实施例1中的药物组合物(雷帕霉素10μM联合EPA20μM)，以及实施例2中的药物组合物(雷帕霉素10μM联合DHA 20μM)处理肾癌细胞。

图3A显示ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸处理肾癌细胞后，Annexin V-PI双染色检测细胞凋亡的变化情况。图3A中的第一排散点图从左向右依次显示空白、DHA(40μM)和EPA(40μM)处理后，在流式细胞术Annexin V-PI双参数染色结果；第二排散点图从左向右依次显示雷帕霉素(20μM)、实施例1药物组合物(雷帕霉素(10μM)联合EPA(20μM))，以及实施例2药物组合物(雷帕霉素(10μM) 联合DHA(20μM))处理后，在流式细胞术Annexin V-PI双参数染色结果。每个散点图中的左下象限显示活细胞，为Annexin V^-/PI^-，而右上象限显示凋亡细胞或凋亡继发性坏死细胞，为Annexin V⁺/PI⁺。图3B为图3A中检测结果的量化柱形图。

由图3A和图3B可知，单独的雷帕霉素、EPA或DHA处理肾癌细胞，均不能明显引起细胞凋亡，肾癌细胞凋亡率<10％。而在雷帕霉素联合ω-3脂肪酸(DHA/EPA) 后，凋亡细胞数量显著上升，说明雷帕霉素联合ω-3脂肪酸在使用浓度减半的情况下，能够明显促进肾癌细胞的凋亡，雷帕霉素和ω-3脂肪酸产生协同作用，有利于提高对肾癌的治疗效果。

2、western blot检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸的药物组合物对肾癌细胞的凋亡的影响

采用实验例2中所示的western blot方法，检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸的药物组合物对肾癌细胞的凋亡的影响。检测目标蛋白为抑凋亡蛋白PARP和Bcl-2。

图3C显示ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸处理肾癌细胞后，抑凋亡蛋白PARP和Bcl-2的变化情况。蛋白条带从左向右依次显示空白、雷帕霉素 (20μM)、EPA(40μM)、实施例1药物组合物(雷帕霉素(10μM)联合EPA(20μM))、 DHA(40μM)，以及实施例2药物组合物(雷帕霉素(10μM)联合DHA(20μM))处理后，PARP、Bcl-2和β-action三种蛋白的变化情况，其中β-action为内参蛋白。

由图3C可知，仅以雷帕霉素、EPA或DHA处理的肾癌细胞，雷帕霉素处理的细胞中PARP和Bcl-2表达量未发生明显变化，EPA和DHA能够降低PARP和Bcl-2蛋白的表达，当影响程度微弱。在雷帕霉素联合EPA或DHA后，能够观察到PARP和Bcl-2 的表达量显著降低，说明雷帕霉素联合ω-3脂肪酸的药物组合物能够降低抑凋亡蛋白的表达，从而有利于促进肿瘤细胞的凋亡。雷帕霉素和ω-3脂肪酸在使用浓度减半的情况下，通过协同作用，实现对肾癌细胞的凋亡促进，提高对肾癌的治疗效果。

3、利用凋亡抑制剂，检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸的药物组合物对肾癌细胞的凋亡的影响

取处于对数生长期肾癌细胞，接种于6孔培养板中(2×10⁵个/孔细胞)，5％CO₂，37℃孵育，在雷帕霉素(10μM)联合EPA(20μM)处理前，进行凋亡抑制剂(FMK)处理，然后利用实验例1中的细胞计数方法统计空白对照、联合药物处理组、凋亡抑制剂+联合药物组进行细胞计数。

图3D显示雷帕霉素联合EPA联合处理肾癌细胞，在使用凋亡抑制剂和未使用凋亡抑制处理两种情况下，细胞数量的变化结果。其中柱形图从左向右依次显示空白对照组、雷帕霉素(10μM)联合EPA(20μM)处理组，以及雷帕霉素(10μM)联合EPA(20μM) 处理+凋亡抑制剂处理组。

由图3D可知，在EPA和雷帕霉素联合处理前，进行凋亡抑制剂处理，抑制剂组肾癌细胞的细胞数目相比药物联合组明显增加，具有显著性差异。从上述结果，进一步说明ω-3脂肪酸和雷帕霉素联合作用有明显的促进细胞凋亡作用。

实验例4

本实验例检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸的药物组合物对移植瘤小鼠模型中肿瘤生长的抑制作用，具体包括以下步骤：

1.裸鼠移植瘤模型的建立及药物处理

(1)培养肾癌细胞至密度80％(对数生长期)，按照细胞传代实验进行，PBS洗涤，消化，离心去上清，之后用无血清的培养基重悬洗涤细胞两遍；用无血清培养基调整细胞悬液浓度为2×10⁷个/mL；等体积加入已经过夜四度融化的基质胶，振荡混合均匀待用(含基质胶的步骤全部在冰上操作)；

(2)每只裸鼠在背部皮下接种100μL细胞与基质胶混合液，接种后每天定时观察肿瘤的生长情况，确定移植瘤模型是否成功，待肿瘤体积约在200mm³，开始药物处理；

(3)实验选取移植瘤模型成功裸鼠(成瘤率100％)，分为四组，ALA(60μM)组：口服灌胃60μM的ALA；雷帕霉素(20μM)组：口服灌胃20μM的雷帕霉素；ALA(30μM) 联合雷帕霉素(10μM)组：口服灌胃30μM的ALA和10μM的雷帕霉素(实施例5中的药物组合物)；空白对照组：口服灌胃蒸馏水。每天灌胃一次，六周后进行肿瘤测定。分组时每组六只裸鼠，且给药前起始肿瘤体积大小平均值基本一致。

(4)肿瘤体积计算公式：

V＝ab²/2，式中V为体积(mm³)，a为长度(mm)，b为宽度(mm)；

(5)药物处理两周，眼球取血处死，剥离瘤组织，进行称重，取一小部分浸泡于 4％多聚甲醛用于免疫组化；剩余瘤组织装于EP管于-80℃保存。

图4A和图4B显示ALA、雷帕霉素和雷帕霉素联合ALA对移植瘤小鼠的肿瘤的影响，其中图4A显示肿瘤体积的变化情况，图4B显示肿瘤重量的变化情况，图4B中的柱形图从左向右依次显示空白对照组、雷帕霉素处理组、ALA处理组、雷帕霉素联合 ALA处理组。

由图4A可知，单独以雷帕霉素或ALA处理的移植瘤小鼠，小鼠肿瘤体积的增长速度慢于空白对照组，但肿瘤仍呈现增长趋势。而ALA和雷帕霉素联合组在9天喂食之后，肿瘤体积出现了负增长的趋势，随着喂食天数的增加，各组肿瘤体积差距越来越明显。15天对裸鼠进行处死，取瘤组织块进行称重，得到图4B中所显示的不同处理情况下，肿瘤质量的变化情况。由图4B可知，雷帕霉素处理后虽然使肿瘤的重量降低，但降低幅度较小，而以雷帕霉素和ALA的联合处理组，肿瘤质量明显降低，与雷帕霉素或ALA的单独处理组有显著性差异。上述结果说明，雷帕霉素和ω-3脂肪酸的协同作用，能够抑制肿瘤生长，使肿瘤在体积和质量都呈现负增长的变化，雷帕霉素联合ω-3 脂肪酸对于肾实体肿瘤的治疗效果明显，具有重要的临床应用前景。

2、免疫组化(IHC)实验检测肿瘤标记增殖蛋白KI67的水平

(1)固定：将步骤1中的移植瘤小鼠处死后，取新鲜肿瘤组织于4％多聚甲醛浸泡固定过夜，用自来水冲洗组织块3h；

(2)脱水与透明：组织块分别浸于70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇各30min，95％乙醇、100％乙醇Ⅰ、100％乙醇Ⅱ各20min，1:1二甲苯乙醇20min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10min；

(3)组织脱蜡：烘箱温度维持62℃，石蜡Ⅰ1.5h，石蜡Ⅱ1.5h；

(4)组织切片、烤片：切片5μm的厚度，60℃恒温箱烘烤20min；

(5)脱蜡与水化：脱蜡二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15min；水化100％乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min， 95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇各2min；最后PBS浸洗，2min/次，重复3 次；

(6)封闭内源性过氧化氢酶：浸于3％过氧化氢甲醇10min，PBS浸洗，2min/ 次，重复3次；

(7)抗原修复：抗原修复液为pH＝6.0的柠檬酸钠溶液，热水浴95℃修复20min, 自然冷却至室温，PBS浸洗，2min/次，重复3次；

(8)封闭：用吸水纸吸去PBS，5％BSA封闭30min，用吸水纸，从边缘吸去封闭液；

(9)一抗：用吸水纸吸去封闭液，滴加用5％BSA稀释的一抗溶液，于湿盒中4℃孵育过夜；

(10)二抗：室温放置45min复温，PBS浸洗，2min/次，重复3次，吸去多余的 PBS，滴加二抗，室温孵育30min；

(11)显色：PBS浸洗，2min/次，重复3次，DAB暗室显色5min；

(12)苏木精复染：PBS浸洗，2min/次，重复3次，苏木精染色20s；

(13)脱水、透明、封片：PBS浸洗，2min/次，重复3次，70％乙醇、80％乙醇、 90％乙醇、95％乙醇分别脱水2min，100％乙醇Ⅰ、100％乙醇Ⅱ各2min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各2min，最后中性树胶封片；

(14)计数阳性细胞数目及染色强度，分析实验结果。

图5显示ALA、雷帕霉素，以及ALA联合雷帕霉素喂食的移植瘤小鼠，小鼠肿瘤标记增殖蛋白Ki67的表达变化情况。图5由左向右依次显示空白对照组、雷帕霉素组、 ALA组，以及ALA联合雷帕霉素处理组。图6为图5的量化柱形图，柱形图从左向右依次显示空白对照组、雷帕霉素组、ALA组，以及ALA联合雷帕霉素处理组。

由图5和图6可知：以ALA联合雷帕霉素喂食的移植瘤小鼠，其肿瘤增殖蛋白Ki67的阳性细胞数量(染色深的细胞)明显少于空白对照组、雷帕霉素组和ALA组，进一步证明了ALA联合雷帕霉素对肿瘤增殖的抑制效果，两者之间的协同作用明显，有显著的抑制肿瘤增长、治疗肾癌的效果。

实验例5

本实验例检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸的药物组合物对移植瘤小鼠模型的血脂的影响，具体包括以下步骤：

将实验例4中获得的构建的移植瘤小鼠随机分为4组，分别为正常组：口服灌胃蒸馏水作为空白对照；雷帕霉素组：口服灌胃20μM的雷帕霉素；EPA组：口服灌胃40μM 的EPA；雷帕霉素联合EPA组：口服灌胃10μM的雷帕霉素和20μM的EPA的药物组合物。每天灌胃一次，六周后取小鼠眼球取血，分离出血清，测定各组小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TC)、高密度脂蛋白(HDL-c)和低密度脂蛋白(LDL-c)。

图7显示以雷帕霉素、EPA，以及雷帕霉素联合EPA对小鼠给药后，小鼠总胆固醇 TC(图7A)、甘油三酯TC(图7B)、高密度脂蛋白HDL-c(图7C)和低密度脂蛋白 LDL-c(图7D)的变化情况。每幅图从左向右依次的柱形图依次代表空白对照组、雷帕霉素组、EPA组，以及雷帕霉素联合EPA组。由图7A～图7D可知，雷帕霉素联合EPA 处理小鼠，能够降低由于雷帕霉素引起的血脂升高的问题，其中雷帕霉素联合EPA对总胆固醇(TC)、甘油三酯(TC)和高密度脂蛋白(HDL-c)的降低程度与仅以EPA处理的结果相近，而对低密度脂蛋白(LDL-c)的降低程度优于EPA单独处理。目前已有研究报道ω-3脂肪酸能够降低血液中甘油三脂含量，抑制胆固醇、低密度脂蛋白的合成，具有抗心血管疾病作用。而本发明首次发现了在由于雷帕霉素引起的血脂升高和代谢紊乱的情况下，ω-3脂肪酸能明显降低小鼠体内升高的血脂，调节小鼠体内代谢平衡，其调节效果与在未添加雷帕霉素的EPA的处理的效果相近，说明雷帕霉素联合ω-3脂肪酸，两者的协同作用不仅能提高对肾癌的治疗效果，还能减轻雷帕霉素引起的代谢紊乱、血脂升高等毒副作用，在应用于临床的肾癌治疗时，有利于提高患者的身体健康状况和生存质量。

实验例6

本实验例检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸对肾癌细胞的活性氧簇(ROS)水平的影响，具体包括以下步骤：

1、ROS荧光染色

取处于对数生长期肾癌细胞，接种于6孔培养板中(2×10⁵个/孔细胞)，5％CO₂，37℃孵育。使用EPA(40μM)、DHA(40μM)、雷帕霉素(20μM)，以及雷帕霉素药物(10μM) 联合EPA(20μM)或DHA(20μM)处理培养48h。ROS荧光染色流式具体流程步骤如下：

(1)收集细胞：贴壁细胞，用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤细胞两次，用试剂盒中 1×Binding Buffer重悬，调整细胞为10⁶个/mL；

(2)染色：转移100μL细胞悬液(约10⁵个细胞)到1.5mL EP管中，加入ROS 探针，轻轻吹打混匀，室温避光染色15min；

(3)上机检测分析：各组荧光强度。

图8A显示ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸处理肾癌细胞后，细胞内活性氧簇的荧光检测结果。图8B为图8A检测结果的柱形量化图，柱形图从左向右依次显示空白、雷帕霉素(20μM)、EPA(40μM)、雷帕霉素(10μM)联合EPA(20μM)、 DHA(40μM)，以及雷帕霉素(10μM)联合DHA(20μM)的处理结果。

由图8A和图8B可知，仅以雷帕霉素、EPA和DHA处理肾癌细胞，均不能引起细胞内活性氧簇水平的明显变化，而雷帕霉素联合EPA或DHA后，细胞内的活性氧簇明显增加。活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)是体内氧化代谢产物，是重要的信号分子，在细胞凋亡过程中担当着重要角色。对ROS的研究发现，ROS可以通过加速肿瘤细胞死亡而达到治疗的目的，目前以增加肿瘤细胞内ROS水平为目的的药物渐渐应用于临床。因此，雷帕霉素类和ω-3脂肪酸联合处理，两者的协同作用增加了肾癌细胞的活性氧簇水平，进而引发肾癌细胞内的caspase级联反应，促进肾癌细胞凋亡，有利于提高对肾癌的治疗效果。

2、ROS抑制剂试验

取处于对数生长期肾癌细胞，接种于6孔培养板中(2×10⁵个/孔细胞)，5％CO₂，37℃孵育，在ω-3脂肪酸和雷帕霉素联合处理前，进行ROS抑制剂(NAC)处理，分别对空白组、雷帕霉素联合EPA处理组、雷帕霉素联合DHA处理组、雷帕霉素联合EPA+ROS 抑制剂处理组，以及雷帕霉素联合DHA+ROS抑制剂处理组进行细胞计数和ROS荧光染色试验(细胞计数方法同实验例1、ROS荧光染色试验方法同步骤1)

图8C显示雷帕霉素联合ω-3脂肪酸，在使用ROS抑制剂进行前处理和未使用ROS抑制剂进行前处理两种情况下，肾癌细胞内活性氧簇水平的变化情况。图8D为图8C 的量化柱形图，柱形图从左向右依次显示空白对照、雷帕霉素联合EPA处理、雷帕霉素联合DHA处理、雷帕霉素联合EPA+ROS抑制剂处理，以及雷帕霉素联合DHA+ROS 抑制剂处理后的活性氧簇变化情况。图8E显示雷帕霉素联合ω-3脂肪酸，在使用ROS 抑制剂进行前处理和未使用ROS抑制剂进行前处理两种情况下，肾癌细胞数目的变化情况，柱形图从左向右依次显示空白对照、雷帕霉素联合EPA处理、雷帕霉素联合 DHA+ROC抑制剂处理、雷帕霉素联合EPA处理，以及雷帕霉素联合DHA+ROC抑制剂处理后肾癌细胞数目的变化结果。

由图8C～图8E可知，在ω-3脂肪酸和雷帕霉素联合处理前，进行凋亡抑制剂处理，抑制剂组活性氧簇的水平相比药物联合组明显降低，而肾癌细胞的细胞数目相比药物联合组明显增加，具有显著性差异。从上述结果，进一步说明ω-3脂肪酸和雷帕霉素的协同作用，促进肾癌细胞内活性氧簇的产生，而肾癌细胞内的产生的活性氧簇抑制了肾癌细胞增殖、促进肾癌细胞凋亡，实现对肾癌的治疗效果。

实验例7

本实验例通过检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸的药物组合物对肾癌细胞内糖酵解活性、谷氨酸代谢水平、ω-3脂肪酸代谢水平和氧化磷酸化水平的影响，具体包括以下步骤：

1、western blot检测糖酵解途径相关蛋白Glut1、HK2、PKM2、PFKP、PD和GPD 的变化

以实验例2中所示的western blot的方法，检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸处理后，肾癌细胞内糖酵解途径相关蛋白Glut1、HK2、PKM2、PFKP、 PD和GPD的表达变化情况。检测结果如图9A所示，蛋白条带从左向右依次显示空白对照、雷帕霉素(20μM)、EPA(40μM)、雷帕霉素(10μM)联合EPA(20μM)、DHA (40μM)，以及雷帕霉素(10μM)联合DHA(20μM)处理后，Glut1、HK2、PKM2、 PFKP、PD、GPD和β-action的表达变化情况。其中，β-action为内参蛋白。

由图9A可知，与单独进行雷帕霉素、EPA和DHA处理结果相比，雷帕霉素联合EPA或DHA处理的肾癌细胞，其糖酵解途径相关蛋白HK2、PKM2、PFKP、PD和GPD 的表达量明显降低，具有显著性差异，说明雷帕霉素和ω-3脂肪酸的协同作用能够抑制糖酵解途径相关蛋白的表达，从而抑制肾癌细胞的糖酵解活性。糖酵解是细胞利用营养物质生产能量的途径之一，主要存在于快速增殖的癌细胞中。糖酵解活性增强是癌症的标志之一，肿瘤细胞通过糖酵解实现快速分裂和增殖。抑制肿瘤细胞内高活性的糖酵解过程，能够有效抑制肿瘤细胞的生长。

本发明提供的雷帕霉素类和ω-3脂肪酸的协同作用，通过抑制肾癌细胞内的糖酵解活性，抑制肾癌细胞的增殖和生长，有利于提高对肾癌的治疗效果。

2、western blot检测谷氨酸代谢相关蛋白GLS的变化

以实验例2中所示的western blot的方法，检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸处理后，肾癌细胞内谷氨酸代谢途径相关蛋白GLS的表达变化情况。检测结果如图9B所示，蛋白条带从左向右依次显示空白对照、雷帕霉素(20μM)、 EPA(40μM)、雷帕霉素(10μM)联合EPA(20μM)、DHA(40μM)，以及雷帕霉素(10μM) 联合DHA(20μM)处理后，GLS和β-action的表达变化情况。其中，β-action为内参蛋白。

由图9B可知，与单独进行雷帕霉素、EPA和DHA处理结果相比，雷帕霉素联合 EPA或DHA处理的肾癌细胞，其谷氨酸代谢途径相关蛋白GLS的表达量明显降低，具有显著性差异，说明雷帕霉素和ω-3脂肪酸的协同作用能够抑制谷氨酸代谢相关蛋白的表达，从而抑制肾癌细胞内谷氨酸的代谢。肿瘤细胞内需要代谢谷氨酰胺为肿瘤细胞快速合成蛋白质、脂类和核酸提供重要原料，其生长依赖于谷氨酰胺。谷氨酰胺缺乏或谷氨酰胺酶代谢水平的抑制均能抑制肿瘤细胞的生长。

本发明提供的雷帕霉素类和ω-3脂肪酸的协同作用，通过抑制肾癌细胞内的谷氨酸代谢，抑制肾癌细胞的增殖和生长，有利于提高对肾癌的治疗效果。

3、western blot检测ω-3脂肪酸代谢相关蛋白ACC、p-ACC、Srebp1c、p-Srebp1c、PPARα和CPT1的变化

以实验例2中所示的western blot的方法，检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸处理后，肾癌细胞内脂肪酸代谢相关蛋白ACC、p-ACC、Srebp1c、 p-Srebp1c、PPARα和CPT1的表达变化情况。检测结果如图9C所示，蛋白条带从左向右依次显示空白对照、雷帕霉素(20μM)、EPA(40μM)、雷帕霉素(10μM)联合EPA (20μM)、DHA(40μM)，以及雷帕霉素(10μM)联合DHA(20μM)处理后，ACC、 p-ACC、Srebp1c、p-Srebp1c、PPARα、CPT1和β-action的表达变化情况。其中，ACC 为乙酰辅酶A，能够促进脂肪酸的合成，ACC磷酸化后为p-ACC，能够促进脂肪酸的代谢；Srebp1c、PPARα和CPT1在脂肪酸代谢过程中发挥作用，Srebp1c磷酸化后对脂肪酸代谢的促进作用增强；β-action为内参蛋白。

由图9C可知，与单独进行雷帕霉素、EPA和DHA处理结果相比，雷帕霉素联合 EPA或DHA处理的肾癌细胞，促进了脂肪酸代谢相关蛋白ACC和Srebp1c的磷酸化，并增加了PPARα的表达水平，与单独雷帕霉素、EPA或DHA的处理结果相比具有显著差异；说明雷帕霉素联合ω-3脂肪酸能够通过促进脂肪酸代谢相关蛋白的表达，或者促进脂肪酸代谢相关蛋白的磷酸化以提高其蛋白活性，实现对脂肪酸代谢水平的促进作用，缓解由于单独以雷帕霉素处理时可能产生的代谢紊乱，降低雷帕霉素的毒副作用，提高癌症治疗效果。

本发明提供的雷帕霉素类和ω-3脂肪酸的协同作用，通过促进脂肪酸代谢相关蛋白的表达，或者促进脂肪酸代谢相关蛋白的磷酸化以提高其蛋白活性，实现对脂肪酸代谢水平的促进作用，降低雷帕霉素的毒副作用，提高癌症治疗效果。

4、western blot检测氧化磷酸化相关蛋白CV、CIV、CIII、CII和CI的变化

以实验例2中所示的western blot的方法，检测ω-3脂肪酸、雷帕霉素，以及雷帕霉素联合ω-3脂肪酸处理后，肾癌细胞内氧化磷酸化相关蛋白CV、CIV、CIII、CII和 CI的表达变化情况。检测结果如图9D所示，蛋白条带从左向右依次显示空白对照、雷帕霉素(20μM)、EPA(40μM)、雷帕霉素(10μM)联合EPA(20μM)、DHA(40μM)，以及雷帕霉素(10μM)联合DHA(20μM)处理后，CV、CIV、CIII、CII、CI和β-action 的表达变化情况。其中，β-action为内参蛋白。

由图9D可知，以EPA或DHA处理肾癌细胞，能够增加CV、CIV、CIII、CII和 CI的表达量，而EPA或DHA联合雷帕霉素处理后的肾癌细胞，CV和CIV的表达水平有进一步的提升，说明雷帕霉素和ω-3脂肪酸的协同作用，能够促进氧化磷酸化相关蛋白CV和CIV的表达，进而促进癌症细胞的氧化磷酸化的水平。肿瘤细胞中的能量代谢主要依赖糖酵解，而线粒体呼吸链缺失，线粒体的氧化磷酸化代谢功能均受到不同程度的损伤，增强肿瘤细胞内的氧化磷酸化代谢水平，有利于抑制肿瘤细胞中的能量代谢，进而抑制肿瘤细胞的生长。雷帕霉素协同ω-3脂肪酸，通过促进肾癌细胞内的氧化磷酸，提高了对肾癌细胞的抑制效果，有利于提高对肾癌的治疗效果。

对比例1

以实验例1中所示的检测方法，对比不同摩尔比的雷帕霉素和ω-3脂肪酸的药物组合物对肾癌细胞增殖的影响，检测结果如表1所示：

表1

由上表可知，在雷帕霉素和ω-3脂肪酸的摩尔比介于2:1～1:3的范围内时，能够形成对肾癌细胞的有效抑制，而当雷帕霉素和ω-3脂肪酸的摩尔比为1:20、1:30或1:40时，对肾癌细胞增殖的抑制效果显著降低，说明当雷帕霉素和ω-3脂肪酸的摩尔比介于 2:1～1:3时，两者通过发生协同作用，提高了对肾癌的治疗效果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备增强肾癌细胞的活性氧簇水平的药物中的用途。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备肾癌细胞的糖酵解抑制剂中的用途。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备肾癌细胞的谷氨酸代谢抑制剂中的用途。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物在制备增强肾癌细胞的氧化磷酸化水平的药物中的用途。

6.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于，所述雷帕霉素类药物包括雷帕霉素、雷帕霉素药学上可接受的盐、雷帕霉素衍生物和/或雷帕霉素衍生物药学上可接受的盐。

7.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于，所述雷帕霉素类药物和所述ω-3脂肪酸的摩尔比为1:3～2:1。

8.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于，所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸的药物组合物为胃肠道给药和胃肠道外给药中的任一临床上可接受的剂型。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括治疗有效量的雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸。

10.一种药物组合物的制备方法，其特征在于，将所述雷帕霉素类药物和ω-3脂肪酸按照选定的量进行混合，制成临床上可接受的制剂。