TW201429479A - 褐藻醣膠對於治療惡病質及癌症之應用 - Google Patents

Abstract

本發明係關於褐藻醣膠對於治療惡病質及癌症之應用。具體而言，本發明提供一種治療惡病質之醫藥組合物，其包括治療有效量之褐藻糖膠，以及一或多種醫藥上可接受之載劑。在一具體實例中，本發明之醫藥組合物可投予患有可能產生惡病質之疾病之患者，例如，癌症等。本發明亦提供褐藻醣膠對於治療膀胱癌之應用，特別是抑制膀胱癌之腫瘤生長、腫瘤血管新生、或癌細胞移行或侵犯能力。

Description

褐藻醣膠對於治療惡病質及癌症之應用

本發明係關於惡病質及癌症之新穎療法及醫藥組合物。具體而言，本發明係關於在有需要之個體，如癌症病患，使用褐藻醣膠以改善或減緩惡病質之病徵。本發明亦關於褐藻醣膠針對治療膀胱癌之應用，特別是抑制膀胱癌之腫瘤生長、腫瘤血管新生、或癌細胞移行或侵犯能力。

惡病質(cachexia)是一種在疾病情況下所產生的複雜代謝性症候群，主要的臨床病徵為肌肉耗損及體重下降(Evans WJ et al.Clin Nutr.2008；27：793)。目前臨床上診斷惡病質的標準為：患者有持續體重下降之情形，例如，一年內體重減輕原體重的5%，並伴隨下列五項標準之其中三項：肌肉張力降低、疲勞、厭食、低無脂肪重量指數、及生化指數異常，例如，發炎因子上升(如，介素白-6(IL-6)、反應蛋白(CRP))、貧血(血紅素濃度小於12g/dL)、血清白蛋白下降(小於3.2g/dL)(Evans WJ et al.,supra)等。惡病質之肌肉耗損病徵無法單純藉由供給營養而回復，其與因飢餓、老化相關的肌肉質量流失、原發性憂鬱症或內分泌異常而產生之病徵並不相同。惡病質之病患即便增加進食量或提高營養之攝取，也無法預防或停止病患體重的持續下降。

惡病質可發生在許多慢性病或重症患者，例如，癌症(如，膀胱癌、肝癌、乳癌、卵巢癌、胃癌、胰臟癌、大腸癌、骨癌、血癌等)、免疫不全疾病(如，愛滋病等)、感染性疾病(如，結核病、敗血症等)、自體免疫疾病(如，風濕性關節炎等)、代謝性疾病(如，糖尿病等)以及慢性的腸道、肝臟、腎臟、肺臟或心臟疾病(如，肝硬化、腎衰竭、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性心臟衰竭等)、厭食症、創傷或燒傷、營養吸 收不良、貧血等。惡病質可急速降低患者各種生理功能，使生活品質下降，最後身體因過度虛弱而無法承受各種治療，加速患者死亡。

目前針對惡病質之治療方向以改善患者生活品質、增加食慾、降低疲勞感、減少促發炎因子以及增加瘦體質量為主，其常用藥物可分為四大類：(1)促蛋白合成劑，例如，癸酸諾龍(nandrolone decanoate)、胰島素(insulin)、類固醇(corticosteroids)等；(2)食慾促進劑，例如，醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、甲孕酮(medroxyprogesterone)等；(3)細胞激素抑制劑，如沙利竇邁(thalidomide)、褪黑激素(melatonin)等；(4)抗發炎製劑，如，非類固醇抗發炎藥物等。然而，此等藥物雖可改善食慾或增加體重，但肌肉質量並未增加(Donohoe CL et al.,Gastroenterology research and practice.2011；2011：601434)。因此，仍有需要提供另一種惡病質之新穎療法。

褐藻醣膠(fucoidan)是一種硫化的多醣體，可由多種褐藻中獲得，例如，海帶、裙帶菜、馬尾菜等。已知褐藻醣膠有多種生物活性，包括抗發炎(Li C et al.,Food and chemical toxicology 2011；49：2090-5,Park HY et al.,Food and chemical toxicology 2011；49：1745-52,Cumashi A et al.,Glycobiology.2007；17：541-52)、抗氧化(Wang J et al.,International journal of biological macromolecules.2008；42：127-32)及免疫調節(Zapopozhets TS et al.,Antibiotiki i khimioterapiia=Antibiotics and chemoterapy[sic]/Ministerstvo meditsinskoi i mikrobiologicheskoi promyshlennosti SSSR.1995；40：9-13)等，亦有研究顯示其對於肺癌、黑色素癌或大腸癌有抗腫瘤或抑制癌細胞生長之效果(Ale MT et al.,International journal of biological macromolecules.2011；49：331-6,Kim EJ et al.,BMC gastroenterology.2010；10：96,Koyanagi S et al.,Biochemical pharmacology.2003；65：173-9)。然而，目前並無 任何先前技藝文獻揭示褐藻醣膠可用以治療惡病質。

在一方面，本發明提供一種治療惡病質之醫藥組合物，其包括治療有效量之褐藻糖膠，以及一或多種醫藥上可接受之載劑。本發明亦提供褐藻糖膠用於製備供治療惡病質之藥物之應用，以及將褐藻糖膠投予有需要的個體以治療惡病質之方法。

在另一方面，本發明提供一種癌症療法，其包括對有需要的個體投予治療癌症有效量之抗癌藥劑及/或施予放射性療法，併同投予治療惡病質有效量之褐藻糖膠。本發明亦提供一種治療癌症及惡病質之醫藥組合物，其包括第一活性成分，包括一或多種治療癌症有效量之抗癌藥劑；第二活性成分，包括治療惡病質有效量之褐藻糖膠，以及一或多種醫藥上可接受之載劑。

在另一方面，本發明尚提供一種治療膀胱癌之醫藥組合物，其包括治療有效量之褐藻糖膠，以及一或多種醫藥上可接受之載劑。特定而言，本發明之醫藥組合物可有效抑制膀胱癌之腫瘤生長、腫瘤血管新生、或癌細胞移行或侵犯能力。本發明亦提供褐藻糖膠用於製備供治療膀胱癌之藥物之應用，以及將褐藻糖膠投予有需要的個體以治療膀胱癌之方法。

下文中將詳細描述本發明的各種具體實施例。本發明的其他特徵將藉由下列有關各種具體實施例的詳細說明以及申請專利範圍而清楚呈現。

相信在本發明所屬技術領域中具通常知識者在不需進一步說明之情況下可根據此處的描述利用本發明至其最廣範圍。因此，下列描述應被當作例證之目的而非以任何方式作為本發明之範圍的限制。

除非另有說明，否則此處使用之全部技術和科學名詞與本 發明所屬技術領域之技藝人士通常所瞭解的意義相同。

此處所使用的冠詞「一」係指該冠詞的一或一個以上(即，至少一個)的文法受詞。

在本發明中，非可預期地發現褐藻糖膠投予惡病質之小鼠可有效改善或減緩肌肉耗損情形，並證實其可抑制骨骼肌分解因子及肌肉生長抑制素之表現。根據本發明之揭露，惡病質之小鼠經投予褐藻糖膠後，不但改善肌肉耗損情形，亦有效減緩體重減輕、食慾不振及發炎反應，並抑制臟器之細胞壞死情形、減少小腸黏膜損傷及回復消化酵素活性。因此，褐藻糖膠可作為治療惡病質之藥劑。

本發明使用之褐藻醣膠又名岩藻黃質、岩藻多醣、褐藻多醣或褐藻素。褐藻糖膠取自褐藻細胞獨有的黏滑成分。從化學上來說，它是一種以「岩藻糖」為主的多醣體，是由岩藻糖(fucose)及硫酸鹽(sulphate)組成之水溶性雜聚多醣成分，其中岩藻糖以α-(1→2)、α-(1→3)或α-(1→4)互相鍵結成主鍵，而硫酸鹽結合在C-2或C-4的還原端上。具體而言，褐藻醣膠具有單元結構如下：

褐藻醣膠可由商業上獲得，其可由多種褐藻萃取而得，包括但不限於，海帶、裙帶菜、馬尾菜、昆布、墨角藻等常見之食用藻類。褐藻分佈在世界許多海域，在台灣可見於北部、東北角、恆春半島、東部沿岸海域以及澎湖、綠島、蘭嶼等區域，取得容易，可以在此領域已熟知之方法從褐藻萃取出褐藻醣膠，例如，以熱水或有機酸性溶劑濃縮處理褐藻，並視需要併 同發酵或酵素消化步驟，進一步將大分子褐藻醣膠(一般分子重可達500,000 Da)切成有較高吸收率且更具療效的小分子褐藻寡醣(如100,000 Da、50,000 Da、10,000 Da、5,000 Da、1,000 Da或500 Da或更低)。

褐藻醣膠之分子量可由此領域已熟知方法測得，例如，凝膠過濾法(gel filtration)。通常，聚合體之分子量是以平均分子量表示。因此，此處所使用之「分子量」，除非另有說明，是指平均分子量，其可由此領域已知方法測得，例如，以凝膠過濾法呈現之模式(pattern)決定。在本文中，當分子量以一特定數值表示時，該數值包括其上下20%範圍內之分子量。例如，以50,000 Da之分子量為例，其係表示40,000 Da至60,000 Da之分子量。

此處所使用的「個體」乙詞包括人類及非人類動物，例如，伴侶動物(如，狗、貓及類似者)、農場動物(如，牛、羊、豬、馬及類似者)或實驗動物(如，大鼠、小鼠、天竺鼠及類似者)。

此處所使用的「治療」乙詞係指為了治癒、癒合、減輕、舒緩、改變、矯正、改善、改進或影響該疾病、該疾病之症狀、該疾病引起的殘疾或罹患該疾病之傾向的目的，而將包含一或多種活性劑之組合物施用或投與至患有該疾病、該疾病之症狀或有罹患該疾病之傾向的個體。

此處所使用的「治療上有效量」乙詞係指相較於未接受該量之對應個體，一藥物或藥劑可造成治療目的之有效成分之含量。例如，治療惡病質有效量為可防止、改善或減緩肌肉耗損之劑量，或可進一步防止、改善或減緩一或多種其他惡病質病徵(如，體重下降、疲倦、厭食、無力、衰弱、發炎等)之劑量。該等病徵可使用此領域已知方法並基於各種與病程相關之指標進行測定及評估，例如，與發炎相關之細胞激素及蛋白，如，IL-6、TNF-α、IL-1β及CRP，淨體重(lean body mass，LBM)，血紅素，肌力測試，進食量，疲倦測試，衰弱等(可 參見Malnutrition,fatigue,frailty,vulnerability,sarcopenia and cachexia：overlap of clinical features.Curr Opin Clin Nutr Metab Care.2012 May；15(3)：213-9.；Anorexia,cachexia and fatigue.Clin Med.2010 Oct；10(5)：476.；Diagnostic criteria of cachexia and their assessment：decreased muscle strength and fatigue.Curr Opin Clin Nutr Metab Care.2008 Jul；11(4)：417-21.)。又例如，治療癌症有效量可為減少腫瘤大小或癌細胞生長、移行或侵犯能力等之劑量，亦可用此領域已知方式評估治療效果。有效量可視各種因素而變動，例如，投藥途徑、接受該藥劑之個體的體重及物種，以及投藥目的。技藝人士可根據此處的揭示及此技藝已建立的方法依經驗決定每一個別案例的劑量。在一特定實例中，本發明之醫藥組合物之口服劑量為每日10至1,000 mg/kg，較特定為每日50至500 mg/kg，更特定為每日60至400 mg/kg，又更特定為每日70至350 mg/kg，再更特定為每日80至300 mg/kg之有效成分。在另一特定實例中，本發明之醫藥組合物之口服劑量為每日約80 mg/kg，較特定為每日約160 mg/kg，更特定為每日約300 mg/kg之有效成分。以體重約50公斤之成人為例，服用劑量為每日約4-15克，較特定為每日約8 mg/kg之有效成分。在本文中，當劑量以一特定數值表示時，該數值包括其上下20%範圍內之劑量。例如，以500 mg之劑量為例，其係表示400 mg至600 mg之劑量。

本發明之醫藥組合物可用於治療個體之惡病質。具體而言，本發明之醫藥組合物可施用於具有產生惡病質風險或感受惡病質相關病徵之個體，以避免惡病質之發生或改善或延緩惡病質之進展。

在部分具體實施例中，本發明之醫藥組合物可施用於具有可導致惡病質之疾病、狀態或損傷之個體，該等疾病、狀態或損傷包括但不限於，癌症(如，膀胱癌、肝癌、乳癌、卵巢癌、胃癌、胰臟癌、大腸癌、骨癌、血癌等)、免疫不全疾病(如，愛滋病等)、感染性疾病(如，結核病、敗血症等)、自體免疫 疾病(如，風濕性關節炎)、代謝性疾病(如，糖尿病等)、慢性的腸道、肝臟、腎臟、肺臟或心臟疾病(如，肝硬化、腎衰竭、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性心臟衰竭等)、厭食症、創傷或燒傷、營養吸收不良、貧血等。

以癌症而言，當病程進入末期，有80%病患會出現惡病質症狀，是造成病患死亡的主要原因。因此，本發明亦提供一種癌症療法，其包括對有需要的個體在進行化療及/或放射性療法，併同投予治療惡病質有效量之褐藻糖膠，俾能於治療癌症之同時，避免惡病質之發生或改善或延緩惡病質之進展。褐藻糖膠之投予可與化療及/或放射性療法同時(同步)或依序進行。

因此，本發明尚提供一種治療癌症及惡病質之醫藥組合物，其包括第一活性成分，包括一或多種治療癌症有效量之抗癌藥劑；第二活性成分，包括治療惡病質有效量之褐藻糖膠；以及一或多種醫藥上可接受之載劑。此處之活性成分可混合於相同單元或分開置於不同單元，可依此領域之已知方式製備。

此處所描述之「化療」是對病患投予抗癌藥劑以治療癌症。抗癌藥劑包括但不限於，烷化劑(alkylating agents)，例如，愛斯達(fosfamide)、環磷醯胺(cyclophosphamide)及達卡巴嗪(dacarbazine)；抗代謝藥物(antimetabolites)，例如，卡培他濱(capecitabine)、卡莫氟(carmofur)及健澤(gemcitabine)；植物鹼類藥物(plant alkaloid agents)，例如，抗癌妥(irinotecan)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)及抗癌妥(irinotecan)；抗生素類藥物，例如，放線菌素D(actinomycin D)、莫力辛(bleomycin)及絲裂霉素C(mitomycin C)；鉑類藥物，例如，奧沙利鉑(oxaliplatin)、佳鉑帝(carboplatin)、順鉑(cisplatin)及奈達鉑(nedaplatin)；荷爾蒙製劑(hormonal agents)，例如，安美達錠(Anastrozole)、氯地孕酮(chlormadinone)及泰莫西芬(tamoxifen)；分子標靶類藥物(molecular target drugs)，例如，替尼(Imatinib)、艾瑞莎 (gefitinib)、吉妥單抗(gemtuzumab)及妥昔單抗(rituximab)等。抗癌藥劑之投予方式依藥物種類不同而異，可為口服或注射，如肌肉內或靜脈注射。

此處所描述之「放射性療法」是對病患投予放射線以治療癌症。放射性療法之施用方式包括但不限於體外放射治療，例如，術中放射線療法(intraoperative radiotherapy)及預防式頭部放射(prophylactic cranial irradiation，PC)；體內放射治療，例如，組織間質放射性治療(interstitial radiation therapy)、腔內放射性治療(intracavitary radiation therapy)及管道內放射性治療(intraluminal radiation therapy)；全身性放射性治療(systemic radiation therapy)；立體定位放射手術(stereotactic (stereotaxic)radiosurgery)；三度空間順形放射治療(three-dimensional conformal radiotherapy,3D CRT)；及強度調控放射治療技術(Intensity Modulated Radiation Therapy,IMRT)。放射性療法之能量來源包括但不限於X射線、伽馬射線、粒子束(particle beams)、質子束(proton beam)及高能光子射束(high-energy photon radiation)。

另一方面，亦發現褐藻醣膠本身對於膀胱癌有優異的治療效果。因此，本發明尚提供一種用於治療膀胱癌之醫藥組合物，其包括治療有效量之褐藻糖膠，以及一或多種醫藥上可接受之載劑。特定而言，本發明之醫藥組合物可抑制膀胱癌之腫瘤生長、腫瘤血管新生、或癌細胞移行或侵犯能力。

根據本發明，膀胱癌係指各種出自膀胱的惡性腫瘤，包括上皮性腫瘤，包括乳頭狀瘤、移行細胞癌、鱗狀細胞癌及腺癌等，以及非上皮性腫瘤。在臨床上，90%以上的膀胱癌屬於移行性上皮細胞(Transitional cell carcinomas,TCCs)，依據移行性上皮細胞癌侵入肌肉層組織程度可分為：Ta，乳突腫瘤於泌尿道上皮與計畫朝向腔道發展；Tcis，平坦病變組織切片確認為泌尿道上皮；T1，乳突狀腫瘤侵入上皮組織；T2，腫瘤往平滑肌肉層入侵；T3，腫瘤入侵脂肪層；及T4，腫瘤入侵前 列腺、尿道、陰道、腎孟或腹部壁。

目前膀胱癌治療包括外科療法、免疫療法、放射線治療及化學藥物治療，表淺性膀胱癌可經由膀胱鏡切除腫瘤合併術後給予化學藥物治療。順鉑為治療膀胱癌常用的化學藥物，但對腎臟具有毒性(Dos Santos NA et al.,Arch Toxicol.2012 Aug；86(8)：1233-50)，因此多與健澤合併使用(Cohen MH et al.,Oncology.2001；19：1229-31)。然而，接受多重性療法的膀胱癌患者，其局部及遠端擴散後之五年存活率仍僅約五成(George L et al.,Urology.2004；64：488-93)。本發明提供針對膀胱癌之醫藥組合物，尤其可降低其移行或侵犯能力，可提供膀胱癌之有效治療。

根據本發明，治療有效量之有效成分可與醫藥上可接受載劑調配成適當劑型之醫藥組合物，以達輸送及吸收之目的。視投藥模式而定，本發明之醫藥組合物較佳含有約0.1重量%至約100重量%之有效成份，重量百分比係以總組合物計。

此處「醫藥上可接受」係指該載劑可與組合物內所含的有效成分相容，其較佳為能穩定該活性成分並且對被治療的個體無害。該載劑可作為活性成分的稀釋劑、載劑、賦形劑或基質。一些適當賦形劑的實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、褐藻酸鹽、黃蓍樹膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、滅菌水、糖漿和甲基纖維素。組合物可另外包括潤滑劑，例如，滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油；濕潤劑；乳化和懸浮劑；保存劑，例如，羥基苯甲酸甲酯和丙酯；甜味劑；以及調味劑。本發明的組合物藉由此技藝已知的程序可經配製而能在投與至病人後提供活性成分之快速、持續或延遲釋放的效果。

根據本發明該組合物的形式可為錠劑、藥丸、粉末、糖錠、藥包、藥片、酏劑、懸浮液、乳劑、溶劑、糖漿、軟和硬明膠膠囊、栓劑、滅菌注射液和包裝粉末。

本發明的組合物可經由任何生理上可接受途徑，例如，口 服、腸道外(例如，肌肉、靜脈、皮下、腹腔內)、經皮、直腸、吸入等方式予以輸送。對於非經腸道之投藥，最佳係以無菌水溶劑型式使用，其可含有其它物質，例如，足夠之鹽或葡萄糖以使此溶液與血液呈等滲壓。水溶液需要時需被適當緩衝(較佳係至pH值為3至9)。於無菌條件下製備適合之非經腸道組成物係藉由熟習此項技藝者所知之標準藥學技術輕易完成。

現參考以下具體實施例更明確地描述本發明，其目的係用以說明而非作為限制。

1.材料及方法 1.1褐藻醣膠

褐藻醣膠係由台灣褐藻萃取而得，先以熱水處理，再經酵素消化，得到分子量為500 Da以下的褐藻醣膠。在細胞株實驗中使用濃度為25、50、100 μg/ml，動物實驗之劑量為每日80、160、300 mg/kg。

1.2細胞培養

膀胱癌細胞T24購自國家細胞庫，源自人類女性膀胱移形性上皮細胞癌，生長特性為貼附型單層細胞。T24細胞培養於含有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、0.2% NaHCO₃、100 u/ml青黴素(Penicillin)、100 μg/ml鏈黴素(Streptomycin)之RPMI1640完全培養液。在含有5% CO₂及飽和水蒸氣的37℃培養箱中培養，每三天更換一次培養液並定期繼代培養，培養期間定期以倒立式顯微鏡觀察細胞形態之完整性與生長速度。

1.3動物試驗

本研究使用之動物是六週齡的母BALB/c裸鼠，每隻體重約為25克，購自國家動物中心。飼養在有12小時光照週期(AM 7：00-PM 7：00)，並給予適當溫度及濕度控管、充份供應飼料與飲水。

1.4惡病質之動物模式

在第0天以原位注射方式在六週齡的母BALB/c裸鼠膀胱內植入1×10⁶/100μl的T24細胞，每三天記錄攝食量及體重變化，14天後以口服方式開始給予褐藻醣膠，此外，順鉑(Cisplatin；75 mg/m²予以腹腔注射)係以每週給予一次為一週期，施打兩個週期休息一週期；健澤(Gemcitabine；1000 mg/m²予以腹腔注射)係以每週給予兩次為一週期，施打兩個週期休息一週期；以及褐藻醣膠以24小時口服給藥一次(160mg/kg/day)，連續給藥21天。評估動物之體重及食慾變化，在第22天以二氧化碳將裸鼠犧牲，取下心臟、肺臟、胃、肝臟、脾臟、腎臟、膀胱、小腸、下肢肌肉保存於-80℃冰箱，進行後續分析。

1.5小腸酵素活性試驗

以二氧化碳將裸鼠犧牲後取下之小腸擷取片段刮除腸黏膜，取0.2克加入4℃ 0.9% NaCl溶液，其含有蛋白酶抑制劑1μM苯甲基磺醯化氟(phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF)及2.2 mM碘乙酸(iodoacetic acid)，然後以均質機均質化離心後取上清液滴加於玻片(Fuji DRI-CHEM slides)，並於分析儀(Fuji DRI-CHEM 3030 Analyzer(Fuji Photo Film Co.Ltd.,Tokyo,Japan)進行酵素活性測定。

1.6西方墨漬法(Western Blotting)

將含蛋白質之待分析樣本以膠體電泳分離，再將電泳膠(SDS-PAGE gel)轉印至聚二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)。轉印完成後，將聚二氟乙烯膜置於含有5%之脫脂奶粉的TBST緩衝液中，於室溫下搖晃反應1小時，以填補聚二氟乙烯膜膜上非專一性位置的結合位置。接者以TBST緩衝液清洗後，加入一級抗體，於室溫下搖晃反應2小時或視需要置於4℃過夜。經TBST緩衝液清洗後，加入二級抗體，於室溫下搖晃反應1小時，再以TBST緩衝液沖洗聚二氟乙烯膜，最後再加入適量的化學冷光試劑(ECL)，經呈色1-2分鐘後，與底片一起置於壓片夾中壓片。

1.7免疫化學染色分析(IHC)

將組織切片脫蠟後以TBS緩衝液(pH值7.5-7.6)清洗細胞。加入含30% H₂O₂之甲醇置室溫下作用十分鐘以去除內生性過氧化酵素。以TBS緩衝液清洗細胞，去除非特異性的結合，將3%胎牛血清(FBS)加入細胞培養片(coverslips)中使之足以覆蓋表面，置室溫下十分鐘。移除胎牛血清，以TBS緩衝液清洗細胞後，加入初級抗體置於4℃過夜反應。移除初級抗體，以TBS緩衝液清洗細胞後，加入次級抗體於室溫下反應一小時。移除次級抗體，以TBS緩衝液清洗細胞後，加入過氧化氫酵素共軛的鏈黴親和素(peroxidase-conjugated streptavidin)於室溫下反應二十分鐘。移除過氧化氫酵素共軛的鏈黴親和素，以TBS緩衝液清洗細胞後，加入二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)約兩分鐘作呈色反應。再以TBS緩衝液內清洗後，使用血毒素(hemotoxin)染細胞核，以TBS緩衝液沖洗後進行封片，封片後即可使用顯微鏡進行拍照。

1.8細胞激素濃度測定

將事先結合好欲測細胞激素抗體之96孔盤，加入100 μl的標準品及樣品，於37℃放置兩小時後將內容物倒出，加入100 μl的測定試劑於37℃作用1小時。清洗後，將孔盤內水分拍乾，避光加入四甲基聯苯(tetramethylbenzidine，TMB)基質催化過氧化酶使之產生顏色變化。最後加入酸性溶液中止反應，以波長450nm測量吸光值。

1.9腫瘤生長分析

第0天在六週齡母BALB/c裸鼠右背部以皮下注射方式注入2×10⁶/100 μl的T24細胞，14天後以口服方式開始給藥，每24小時給藥一次，連續給藥28天，第29天以二氧化碳將裸鼠犧牲，取下腫瘤。每三天記錄腫瘤大小變化。

1.10統計分析方法

本研究結果之圖式皆以平均值±標準誤差來表示，統計方法 是根據原始實驗數據，並以單因子變異數分析法(one-way ANOVA)比較各組之間是否有差異，若有統計上差異則以學生氏t-檢定法(Student t-test)進行統計分析。若P<0.05則視為有顯著差異。

2.結果 2.1改善體重減輕及食慾低下

本研究使用惡病質動物模式進行分析，其中各組動物處理方式如下：

注射T24細胞之腫瘤小鼠於第14天後以上述方式給藥，每三天記錄攝各組動物之食量及體重變化。

如圖1(A)顯示，控制組(腫瘤小鼠)的體重相較於正常組較低，而當給予健澤及順鉑兩種化療藥物後(第3組)，外觀明顯瘦弱許多，體重至少降低原體重5%以上，同時觀察到小鼠行動力下降、衰弱而無法正常活動；相較之下，化療藥物合併給予褐藻醣膠之組別(第4組及第5組)，體重皆有增加，以第5組改善最為明顯，行動力亦有顯著改善。此外，如圖1(B)顯示，給予健澤及順鉑兩種化療藥物之動物(第3組)，其平均攝食量相較於其他組為最低，但合併給予褐藻醣膠則可增加攝食量(第4組及第5組)。

這些結果顯示褐藻醣膠可明顯改善或減緩惡病質動物之體重減輕及食慾降低等病徵。

2.2減少肌肉耗損

將裸鼠以二氧化碳犧牲後，將下肢肌肉取下觀察。由外觀可見腫瘤合併化療藥物組別之整體肌肉組織明顯較小，而給予褐藻醣膠合併治療後肌肉組織及外觀顯著增加及正常，參見圖2(A)，而肌肉重量之測量結果也顯示出一致的結果，參見圖2(B)。

此外，將各組別骨骼肌肉組織以石蠟包埋切片後進行蘇木紫-伊紅染色(H&E statin)，於顯微鏡下觀察正常組別肌肉細胞型態。結果顯示，正常組之肌肉細胞型態為排列整齊之橢圓形，而腫瘤組之肌肉細胞型態已產生變化，呈狹長及萎縮型態，當給予化療藥物後肌肉萎縮情形更加嚴重，而給予褐藻醣膠後肌肉細胞排列較為緊密，已接近正常肌肉組織的型態，尤以健澤+褐藻醣膠組改善最顯著，參見圖2(C)。

這些結果顯示褐藻醣膠可顯著改善或減緩惡病質動物之肌肉降解耗損。

2.3減少促骨骼肌分解因子之表現

肌肉細胞中泛素連接酶(ubiquitin ligase)Atrogin-1(MAFbx)及MuRF1活化時可促使肌肉的萎縮，這些因子可受到許多轉錄因子的調控，例如，FoxO及NF-κB。本研究將各組別骨骼肌肉組織以石蠟包埋切片後進行免疫螢光染色分析，觀察泛素連接酶及相關轉錄因子之表現。結果顯示當腫瘤合併化療藥物治療時，泛素連接酶及相關轉錄因子皆大量表現，而合併給予褐藻醣膠後可抑制其表現，參見圖3(A)。類似的泛素連接酶及相關轉錄因子之蛋白質表現變化也在西方墨點法結果中得到進一步證實，參見圖3(B)。

2.4抑制肌肉生長抑制素之表現

肌肉生長抑制素(myostatin)於骨骼肌萎縮中也扮演重要角色。因此，本研究取部分肌肉組織進行酵素免疫分析法，結 果顯示在腫瘤小鼠中，肌肉生長抑制素之表現量高於正常組，再給予化療藥物後，其表現情形更加明顯，而合併給予褐藻糖膠，可降低肌肉生長抑制素之表現，參見圖4(A)。在西方墨點法也進一步證實，與促進肌肉生長有關之IGF-1/AKT訊息路徑，在腫瘤組及合併給予化療藥物組之IGF-1及磷酸化AKT之表現都低於正常組，而磷酸化AKT的減少可促使FoxO的活化及肌肉分解，因此肌肉生長抑制素(myostatin)/ActR Ⅱ B/FoxO為抑制肌肉生長的主要訊息路徑，腫瘤組及合併給予化療藥物組會促使肌肉生長抑制素的表現增加，而給予褐藻糖膠後不但可抑制肌肉生長抑制素及其接受器ActR Ⅱ B的表現，同時也抑制轉錄因子FoxO的活性，參見圖4(B)。

2.5保護臟器之作用

將裸鼠以二氧化碳犧牲，取下之膀胱、肺臟及小腸以石蠟包埋切片後進行蘇木紫-伊紅染色(H&E statin)。於顯微鏡下觀察發現腫瘤組之膀胱因腫瘤生長快速，已出現細胞壞死(necrosis)，癌細胞也侵犯至髖部，再給予化療藥物後(第3組：健澤+順鉑)可減緩癌細胞侵犯程度，降至肌肉層，但細胞壞死的情形並無改善，然而合併褐藻醣膠後(第4組：健澤+順鉑+褐藻醣膠，TGCF)可抑制癌細胞生長速度使細胞壞死情況得到改善並影響腫瘤侵犯能力，參見圖5(A)。此外，於腫瘤組之肺臟切片發現因發炎反應引起之肺水腫及浸潤，導致肺泡塌陷，然而予以化療藥物及化療藥物合併褐藻糖膠皆可達到抑制肺部發炎改善肺水腫情形，參見圖5(B)。

這些結果顯示褐藻醣膠在惡病質動物有保護臟器避免破壞及細胞壞死之作用。

2.6保護小腸黏膜組織及回復消化酶活性

由於化療藥物抑癌之機轉為針對癌細胞快速生長特性，作用於細胞週期，因此同樣具有此特性之小腸黏膜細胞也會受到破壞，因此也針對小腸組織的損傷情形進行評估。將裸鼠之小腸組織做病理切片檢查，發現相較於腫瘤，組健澤+順鉑組(第 3組)對小腸黏膜的破壞更為嚴重，然而給予褐藻醣膠之動物則顯著減少此破壞現象，腸道黏膜受到保護，小腸絨毛之型態也維持完整，參見圖6(A)。化療藥物造成腸胃道黏膜細胞損傷，使得消化酶分泌及活性降低，導致消化動物之吸收功能不良。收集裸鼠之小腸萃取液，分析其酵素活性，結果顯示健澤+順鉑組的三種主要消化酶(亮氨酸肽酶、澱粉酶及脂解酶)之活性都低於控制組，並遠低於正常組，而給予褐藻醣膠合併治療後三種酵素活性數值均明顯增加，尤以健澤+褐藻醣膠組增加最多，參見圖6(B)、6(C)及6(D)。

這些結果顯示褐藻醣膠在惡病質動物有保護小腸黏膜組織及回復消化酶活性之作用，此與前述改善或減緩體重減輕及食慾低下之結果一致。

2.7減少發炎因子之表現

在腫瘤微環境中，癌細胞與宿主產生交互作用衍生出許多細胞激素，例如，TNF-α、IL-6、IL-1β，而造成體內產生發炎反應進而驅動惡病質的發生，血液中細胞激素的表現也為臨床診斷惡病質標準之一。本研究以西方墨漬法及酵素免疫分析法分析動物實驗中給予褐藻醣膠是否可抑制發炎因子之表現。

西方墨漬法結果顯示，於腫瘤組及腫瘤合併化療藥物組之動物中，肌肉組織中這些發炎因子表現量均高於正常組，而合併給予褐藻醣膠，則可明顯減少TNF-α、IL-6、IL-1β及急性發炎蛋白CRP之表現，參見圖7(A)。酵素免疫分析法結果也顯示，於腫瘤組及腫瘤合併化療藥物組之動物的血清中，TNF-α、IL-6、IL-1β之含量均高於正常組，而合併給予褐藻醣膠，則顯著減少其表現，參見圖7(B)、7(C)及7(D)。

這些結果顯示褐藻醣膠在惡病質動物具有減少發炎因子生成之作用。

2.8抑制腫瘤生長

本研究亦在異種移植膀胱癌細胞之腫瘤小鼠進行抑制腫瘤生長分析試驗。在小鼠右肩植入T24人類膀胱移形性上皮細 胞癌細胞株兩週後，以口服方式給予不同劑量之褐醣糖膠，分別為每日80 mg/kg、160 mg/kg或300 mg/kg，每三日測量腫瘤大小，為期四週，最後犧牲後將腫瘤取下秤重。結果顯示，給予褐藻醣膠160 mg/kg或300 mg/kg之組別的腫瘤體積及重量明顯小於控制組，參見圖8(A)、8(B)及8(C)。此結果顯示，褐藻醣膠亦具有抑制膀胱癌之腫瘤生長之作用。

2.9抑制HIF-1α及促血管生長因子表現

在缺氧環境下，腫瘤細胞必須做一些基因調適及一系列訊息傳導路徑的應變，以求能繼續存活及生長，其中缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor,HIF-1)即是一重要核心因子。已有研究證實癌細胞在缺氧環境下HIF-1α有過度表現的情形。此外HIF-1α所調控的VEGF也會大量表現，進而刺激血管新生而造成使預後變差(Folkman et al.The Journal of investigative dermatology.1972；59：40-3)。

在異種移植膀胱癌細胞之腫瘤小鼠試驗中，將裸鼠犧牲後取下的腫瘤組織進行組織蛋白質萃取，觀察促血管新生蛋白HIF-1α及VEGF之表現量。結果顯示每日給予褐藻醣膠160mg/kg及300mg/kg對於HIF-1α及VEGF之表現量皆有抑制效果，參見圖9(A)及9(B)。同時，將腫瘤組織以石蠟包埋切片後進行免疫化學染色分析，結果顯示給予褐藻糖膠組別之HIF-1α及VEGF表現均下降，參見圖9(C)及9(D)。此外，CD31普遍存在於內皮細胞，常作為血管新生的指標。本研究之免疫化學染色分`結果顯示，未給藥之控制組大量表現CD31，表示腫瘤有血管新生現象；而給予褐藻醣膠之組別，CD31表現下降，顯示血管新生情形受到抑制，參見圖9(E)。此結果顯示，褐藻醣膠可減少HIF-1α及VEGF之表現，進而達到抑制腫瘤血管新生情形。

2.10抑制膀胱癌細胞移行及侵犯能力

以缺氧做為趨化物，誘導T24膀胱癌細胞之移行及侵犯現象，結果顯示褐藻醣膠可抑制膀胱癌細胞之轉移及侵犯。如圖 10(A)顯示，T24癌細胞於正常氧氣濃度下即有移行之行為(19.27%)，將面積量化後，在缺氧24小時，移行範圍更加顯著(61.29%)，但在給予褐藻醣膠後，移行的範圍隨褐藻醣膠濃度上升而減少，分別為38.23%、31.73%及24.57%。此外，如圖10(B)顯示，相較於正常氧之組別，缺氧24小時後，膀胱癌細胞侵犯能力顯著提高(26.81%)，而在給予褐藻醣膠後，侵犯能力被抑制，分別降低為15.23%、11.98%及6.32%。

3.結論

綜合以上研究結果，我們在惡病質動物模式中已證實，褐藻醣膠可有效改善動物之肌肉耗損情形，其中，動物之促骨骼肌分解因子及肌肉生長抑制素之表現受到抑制，故可減緩肌肉耗損情形；以及褐藻醣膠有效減緩了動物之體重減輕、食慾不振、發炎、衰弱及肌肉無力，並改善臟器之細胞壞死情形、減少小腸黏膜損傷、及回復消化酵素活性。此外，褐藻醣膠亦證實具有治療膀胱癌之效果，也可抑制膀胱癌之腫瘤生長、腫瘤血管新生以及癌細胞移行及侵犯能力。

熟習該項技術者將瞭解上述具體實施例可被改變而仍不偏離其廣義的發明概念。因此，應瞭解本發明非僅侷限於所揭示的特定具體實施例，而應涵蓋所附申請專利範圍所定義的發明之精神及範圍內的變化。

從上述的說明，熟習該項技術者可輕易地確認本發明的主要特徵，以及在不偏離本發明的精神和範圍之下可作出各種的改變和修飾，以適應各種的用途和狀況。因此，其他具體實施例亦屬於申請專利範圍之範圍內。

上述的發明內容以及詳細說明將於配合附圖閱讀時而被更佳地瞭解。為達說明本發明之目的，圖式係顯示較佳的具體實施例。然而，應瞭解本發明並非僅侷限於該所示的較佳具體實施例。 在該圖示中：圖1顯示褐藻醣膠在惡病質動物模式中改善或減緩(A)體重及(B)進食量之下降。

圖2顯示褐藻醣膠在惡病質動物模式中改善或減緩肌肉耗損，其中(A)顯示肌肉組織外觀，(B)顯示肌肉重量之測量結果，以及(C)顯示肌肉細胞型態。

圖3顯示褐藻醣膠在惡病質動物模式中減少促骨骼肌分解因子之表現，其中(A)顯示免疫螢光染色分析結果，以及(B)顯示西方墨點法分析結果。

圖4顯示褐藻醣膠在惡病質動物模式中抑制肌肉生長抑制素之表現，其中(A)顯示酵素免疫分析結果，以及(B)顯示西方墨點法分析結果。

圖5顯示褐藻醣膠在惡病質動物模式中有保護臟器避免細胞壞死之功效，其中(A)及(B)分別為動物之膀胱及肺部之切片染色結果。

圖6顯示褐藻醣膠在惡病質動物模式中保護小腸黏膜組織及回復消化酶活性之功效，其中(A)顯示小腸組織病理切片，以及(B)、(C)及(D)分別顯示亮氨酸肽酶、澱粉酶及脂解酶之活性分析結果。

圖7顯示褐藻醣膠在惡病質動物模式中減少發炎因子之表現，其中(A)顯示TNF-α、IL-6、IL-1β及急性發炎蛋白CRP之西方墨漬法之結果，以及(B)、(C)及(D)顯示TNF-α、IL-6及IL-1β之酵素免疫分析法之結果。

圖8顯示褐藻醣膠在異種移植膀胱癌細胞之腫瘤小鼠模式中抑制腫瘤之生長，其中(A)顯示取下之腫瘤外觀，(B)顯示取下之腫瘤重量，以及(C)處理期間測量之腫瘤體積。

圖9顯示褐藻醣膠在異種移植膀胱癌細胞之腫瘤小鼠模式減少HIF-1α、VEGF及CD31之表現，具有抑制腫瘤血管新生之功效，其中(A)及(B)顯示西方墨漬法之結果及其定量結果，以及(C)、(D)及(E)顯示免疫化學染色分析結 果。

圖10顯示褐藻醣膠在異種移植膀胱癌細胞之腫瘤小鼠模式抑制膀胱癌細胞(A)移行及(B)侵犯能力。

Claims (10)

1. 一種用於在有需要之個體治療惡病質之醫藥組合物，其包括治療有效量之褐藻糖膠，以及一或多種醫藥上可接受之載劑。
2. 根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該治療有效量之褐藻糖膠可在該個體改善或減緩肌肉耗損。
3. 根據申請專利範圍第2項之醫藥組合物，其中該治療有效量之褐藻糖膠可在該個體改善或減緩體重降低、厭食、發炎、衰弱或肌肉無力。
4. 根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該個體係具有選自以下所組成之群之疾病、狀態或損傷：癌症、免疫不全疾病、感染性疾病、自體免疫疾病、代謝性疾病、以及慢性的腸道、肝臟、腎臟、肺臟及心臟疾病、厭食症、創傷、燒傷、營養吸收不良及貧血。
5. 根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該個體係罹患癌症。
6. 根據申請專利範圍第5項之醫藥組合物，其中該個體係接受化療或放射性療法之治療。
7. 一種治療癌症及惡病質之醫藥組合物，其包括第一活性成分，其包括一或多種治療癌症有效量之抗癌藥劑；第二活性成分，其包括治療惡病質有效量之褐藻糖膠；以及一或多種醫藥上可接受之載劑。
8. 一種用於治療膀胱癌之醫藥組合物，其包括治療有效量之褐藻糖膠，以及一或多種醫藥上可接受之載劑。
9. 褐藻糖膠用於製備供治療惡病質之藥劑之應用。
10. 褐藻糖膠用於製備供治療膀胱癌之藥劑之應用。