CN115837018B - 3-羟基巴戟醌在制备抗乳腺癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了3‑羟基巴戟醌在制备抗乳腺癌药物中的应用。本发明通过3‑羟基巴戟醌作用于裸鼠乳腺瘤4T‑1模型，发现3‑羟基巴戟醌能明显抑制乳腺癌4T‑1细胞的生长和乳腺瘤的增殖，且对小鼠的体重影响不大，这说明3‑羟基巴戟醌可以开发成治疗乳腺癌的药物且毒副作用小，具有良好的药物前景。天然来源的3‑羟基巴戟醌为抗肿瘤药物的研究提供了药物资源，为临床乳腺癌的治疗提供了一种新思路。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及3-羟基巴戟醌在制备抗乳腺癌药物中的应用。
背景技术
乳腺癌已成为继肺癌之后的第二大癌症死因，是我国女性常见的恶性肿瘤之一，目前乳腺癌的临床主要治疗手段有手术切除、放化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗及光动力学疗法等。近年来，随着中医药在乳腺癌方面研究的深入，中药在提高患者生活质量、减轻放化疗的不良反应、预防复发及转移等方面逐渐显现优势与特色，已然成为乳腺癌有效的辅助疗法之一。顺铂是治疗各种癌症最有效和最广泛使用的抗癌药物之一。然而，以顺铂为基础的治疗方案常常引起严重的毒副作用。因此，目前寻找一种新的、有效的、副作用小的抗乳腺癌药物是非常迫切的。
发明内容
本发明的目的是提供3-羟基巴戟醌在制备抗乳腺癌药物中的应用。
本发明的目的是这样实现的，3-羟基巴戟醌的应用为在制备抗乳腺癌药物中的应用，3-羟基巴戟醌的结构式如下：
。
本发明的有益效果为：
本发明通过将天然来源的3-羟基巴戟醌作用于裸鼠乳腺瘤4T-1模型，发现3-羟基巴戟醌能明显抑制乳腺癌4T-1细胞的生长和乳腺瘤的增殖，且对小鼠的体重影响不大，毒副作用小，这说明3-羟基巴戟醌可以开发成治疗乳腺癌的药物，具有良好的药物前景，为抗肿瘤药物的研究提供了药物资源，为临床乳腺癌的治疗提供了一种新思路。
附图说明
图1为实施例1不同组小鼠体重变化折线图；（注：图中3-H为3-羟基巴戟醌缩写，CON指空白组， MOD指模型组，3-H高指3-羟基巴戟醌给药组II，3-H低指3-羟基巴戟醌给药组I。）
图2为实施例1不同组小鼠移植瘤体积的变化折线图；
图3为实施例1不同组小鼠移植瘤大小变化图；
图4为实施例1不同组小鼠平均移植瘤重量图（注：与对照组相比，“*”p< 0.05，“**”表示p< 0.01，“***”表示p< 0.001）；
图5为实施例1不同组免疫组织化学标记的CD31分析图像,比例尺=50微米；
图6为实施例1不同组免疫组织化学标记的E-cadherin分析图像,比例尺=50微米；
图7为实施例1不同组免疫组织化学标记的ki67分析图像,比例尺=50微米；
图8为实施例1不同组对乳腺癌小鼠模型VEGF和MMP-9的表达影响图。图A为Western blot（蛋白质印记分析法）分析3-羟基巴戟醌对4T-1细胞中凋亡相关蛋白VEGF和MMP-9水平的影响；图B左右图分别为VEGF和MMP-9的密度定量（注：与对照组相比，“*”p<0.05，“**”表示p< 0.01，“***”表示p< 0.001）。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明提供了3-羟基巴戟醌在制备抗乳腺癌药物中的应用，3-羟基巴戟醌的结构式如下：
。
3-羟基巴戟醌在动物体内试验中的给药剂量为10-40 mg/kg。
本发明还提供了一种抗乳腺癌药物，所述药物以3-羟基巴戟醌为主要活性成分或活性成分之一。
所述抗乳腺癌药物还含有一种或至少两种药学上可以接受的载体。
所述载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
所述抗乳腺癌药物的给药途径为口服给药、注射给药、植入给药、腔 内给药、舌下给药、透皮给药或内外敷。
所述抗乳腺癌药物的剂型为液体注射剂、粉针注射剂、注射用乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、膏剂、霜剂、贴剂、擦剂、粉剂、喷雾剂、植入剂、滴剂、栓剂、软膏剂或糖果剂。
实施例13-羟基巴戟醌对体内肿瘤的增殖的抑制作用
1、建立裸鼠移植瘤模型，检测3-羟基巴戟醌对体内肿瘤的抑制作用。
将0.2 mL鼠源乳腺癌细胞4T-1(1×106细胞/mL)接种至裸鼠腹股沟处皮下，待肿瘤小鼠的肿瘤直径约为3-5 mm表明接种成功，将动物随机分为空白组、模型组、阳性药组(顺铂注射液2.0mg/kg)、3-羟基巴戟醌给药组I（10 mg/kg)）和3-羟基巴戟醌给药组II（40mg/kg)）。阳性药组和3-羟基巴戟醌给药组I和给药组II采用腹腔注射给药，3-羟基巴戟醌给药时间为21d，阳性药每隔三天给药。）每天检测肿瘤生长情况，并记录裸鼠的体重、瘤块体积，对实验数据进行统计分析。通过游标卡尺测量肿瘤的最长直径（a）及垂直方向最大橫径（b），并按照公式以下公式计算肿瘤体积：
V（mm3）=1/2 a×b2 。
处死前小鼠禁食24h，自由饮水8 h。处死小鼠后，迅速切除肿瘤称重，然后将肿瘤组织用0.9%氯化钠冰水冲洗干净吸取水分，精密称定，计算抑瘤率（抑瘤率=(模型对照组平均质量-实验组平均质量)／模型对照组平均质量×100％），结果如表1所示。最后放入4%多聚甲醛中固定进行组织学检查。
表 不同抑瘤率
实验结果：如图1所示，给药21天后，顺铂给药后裸鼠体重急剧下降，但3-羟基巴戟醌与正常组比较无明显变化，裸鼠的饮水及进食量无明显增减，粪便、尿液正常；精神状态良好，皮肤呈粉红色，动物状态良好。
给药组肿瘤体积显著小于模型对照组，表明药物具有良好的抗肿瘤作用。与模型组相比，用3-羟基巴戟醌治疗的乳腺癌移植的生长速度较慢。与用3-羟基巴戟醌或顺铂处理的小鼠相比，模型组小鼠的肿瘤体积明显增加（图2）。组间的最终肿瘤重量有明显的差异。3-羟基巴戟醌组小鼠的平均肿瘤重量明显低于模型组，但是，比阳性药组高（图3和图4）。
以上结果说明3-羟基巴戟醌能起到延缓肿瘤生长的作用，且副作用小。
2、采用免疫组织化学方法标记CD31、E-cadherin和Ki-67，检测肿瘤增殖状态的变化。
取福尔马林固定的瘤块组织，脱水后，进行包埋、切片，并将切片脱蜡水化。将脱蜡水化后的切片避光置于3％内源性过氧化物的阻断液中15min，而后用PBS洗涤2次，每次5min。95℃抗原修复，封闭，加入一抗，4℃过夜，将切片取出，恢复室温 30min，再用PBS洗3次，每次5min。加入HRP标记聚合物，室温孵育30min后，用PBS洗3次，每次 5min。DAB显色2min，然后用苏木素复染5min，自来水除去多余染液。将切片依次置于80％乙 醇(2min)、95％乙醇(2min)、100％乙醇(5min)。之后将组织切片放入二甲苯中(10min)，用 中性树胶封片，拍照，保存。
实验结果：免疫组化结果显示(图5-7)，肿瘤组织中，给药组瘤块CD31和ki67的表达量显著低于对照组。Ki67是反应细胞增殖的核抗原，是反映细胞过度增殖的表达，其在正常组织中表达很低，在良性增生组织和癌组织中表达异常升高。CD31作为血管内皮标记物，CD31标记肿瘤组织内血管内皮细胞，通过标记血管内皮来反应肿瘤血管密度。肿瘤血管生长具有一定的组织侵蚀性，肿瘤细胞可沿新形成的血管的组织裂隙向外侵袭。这些数据可能意味着3-羟基巴戟醌可以抑制肿瘤的发展并促进肿瘤组织中细胞的凋亡。E-cadherin表达与肿瘤大小、分级(分化程度)、分期密切相关。E-cadherin表达减弱使得上皮细胞间的连接作用减弱，使细胞间出现松散，易于扩散和转移。表现为肿瘤直径越大，E-cadherin阳性表达越低。本实验中其表达量显著上升，表明3-羟基巴戟醌抑制了乳腺癌的发展和转移。
3、采用蛋白印迹分析检测3-羟基巴戟醌对乳腺癌小鼠模型VEGF和MMP-9的表达影响。
将肿瘤组织用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。在4℃和12000×g离心10分钟后取上清用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。调整蛋白浓度后将蛋白提取液加入到上样缓冲液中，在99℃下变性10分钟。在10%的SDS-PAGE凝胶上进行电泳，并将其转移到PVDF膜上。用稀释的一抗(1:1000)将膜在4°C孵育过夜，然后用TBST洗3次，每次5分钟。稀释的二抗(1:8000)与膜在室温下孵化1 h，然后用TBST洗3次，每次5分钟。使用化学发光凝胶成像系统检测目标蛋白，并使用ImageJ软件对印迹进行可视化。
结果：VEGF作为肿瘤血管生成重要的促进因子之一，在肿瘤生长中十分重要。MMP-9可通过释放VEGF以参与血管生成。由图8可知，与对照组相比，3-羟基巴戟醌导致VEGF和MMP-9的表达明显下调，表明3-羟基巴戟醌对这两个重要蛋白均有调节作用，这一发现可以为更好理解3-羟基巴戟醌抗癌作用的潜在机制提供启示，并为寻找乳腺癌的选择性治疗程序提供协助。
Claims (5)
1.一种以3-羟基巴戟醌作为唯一活性成分在制备抗乳腺癌药物中的应用，其结构式如下：
。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗乳腺癌药物还含有一种或至少两种药学上可以接受的载体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗乳腺癌药物的给药途径为口服给药、注射给药、植入给药、腔内给药、舌下给药、透皮给药或内外敷。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗乳腺癌药物的剂型为液体注射剂、粉针注射剂、注射用乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、膏剂、霜剂、贴剂、擦剂、粉剂、喷雾剂、植入剂、滴剂、栓剂、软膏剂或糖果剂。
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