TWI623321B - Method for preventing and treating cervical erosion - Google Patents

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Abstract

本發明涉及纖維蛋白溶酶原在治療子宮頸糜爛中的用途，與現有其它治療子宮頸糜爛的藥物相比，本發明的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶能促進損傷黏膜的炎症修復。因此纖維蛋白溶酶原可能成為全新治療子宮頸糜爛的策略。

Description

一種用於預防和治療子宮頸糜爛的方法
本發明涉及一種新的使用纖維蛋白溶酶原或纖溶酶預防和/或治療子宮頸糜爛的方法。與現有治療子宮頸糜爛的藥物相比，該方法能有效促進損傷黏膜的修復。
慢性子宮頸炎是已婚婦女的常見病、多發病，在我國婦女發病中占首位，約占婦科疾患的50%。子宮頸糜爛又是慢性子宮頸炎中最常見的一種病理改變，其發生子宮頸癌者要高於無子宮頸糜爛婦女的7.3倍。有報導，單純鱗狀細胞癌中，約有80%是在頸管或糜爛區即柱狀上皮區發生，而其中絕大多數是在「糜爛」區發生[1]。造成子子宮頸糜爛的主因，通常是婦女在產後或者術後造成子子宮頸的損傷，並隨後伴隨著病原體的侵入而形成的。20世紀80年代以前，導致慢性子宮頸炎的病原體主要為葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌及厭氧菌[2]。近年來，隨著性病的發病率逐年上升和性傳播疾病的增加，子宮頸糜爛亦呈日益增多之趨勢，嚴重影響婦女的生殖健康和生活品質，同時子宮頸糜爛的病原體也發生了變化，越來越多的資料表明，沙眼衣原體(CT)、奈瑟淋病雙球菌(NG)、單純皰疹病毒(HSV)、解尿素支原體(Uu)、陰道毛滴蟲(TV)和念珠菌(CA)等感染均與子宮頸炎有關[3-5]。
子宮頸糜爛主要症狀為白帶增多且常為膿性、接觸性出血、腰骶部疼痛、不孕等。目前，治療子宮頸糜爛的方法很多，包括口服藥、陰道上藥、子宮頸局部物理療法、手術治療等。對於子宮頸糜爛病情輕者，不論哪種治療方法，雖治療時間長短不同，都可收到較好的療效。但子宮頸糜爛中、重度患者，口服藥物治療，起效慢、局部血藥濃度低，難以達到預期效果；單純陰道上藥治療療程長、療效欠佳，且療效不穩定，復發的幾率大。手術治療費用高、創傷大、癒合時間長，一般患者很難接受。
纖溶酶是纖溶酶原啟動系統(PA系統)的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細胞外基質(ECM)的幾個組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層黏連蛋白和蛋白聚糖[6]，此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體(pro-MMP)啟動形成具有活性的金屬蛋白酶(MMP)。因此纖溶酶被認為是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物[7,8]。纖溶酶是由纖溶酶原通過兩種生理性的PA：組織型纖溶酶原啟動劑(tPA)或尿激酶型纖溶酶原啟動劑(uPA)蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水準較高，傳統上認為PA系統的調節主要通過PA的合成和活性水準實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節，如激素、生長因數和細胞因數。此外，還存在纖溶酶和PA的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α 2-抗纖溶酶(α2-antiplasmin)。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體(uPAR)[9,10]。
纖溶酶原(plasminogen，plg)是一個單鏈糖蛋白，由791個氨基酸組成，分子量約為92kDa[11,12]。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約為2μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潛在來源[13,14]。纖溶酶原存在兩種分子形式：谷氨酸-纖溶酶原(Glu-plasminogen)和賴氨酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被稱為谷氨酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時，谷氨酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成為賴氨酸-纖溶酶原。與谷氨酸-纖溶酶原相比，賴氨酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，並可以更高的速率被PA啟動。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割，導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成[15]。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個同源三環，即所謂的kringle，羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringle含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α 2-AP特異性相互作用的賴氨酸結合位點。最新發現一個纖維蛋白溶酶原為38kDa的片段，其中包括kringle1-4，是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名為血管抑素，可通過幾個蛋白酶水解纖溶酶原產生。
纖溶酶的主要底物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵[16]。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的底物特異性，包括層黏連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中也起著重要作用[12,17,18]。間接地，纖溶酶還可以通過轉化某些蛋白酶前體為活性蛋白酶來降解 ECM的其他組分，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器[19]。此外，纖溶酶具有啟動某些潛在形式的生長因數的能力[20-22]。
本發明經過研究發現，纖維蛋白溶酶原在預防和/或治療子宮頸糜爛時具有意想不到的效果，其具體表現在能促進損傷和炎症的修復。使用纖維蛋白溶酶原預防和/或治療子宮頸糜爛，無論是從療效上、患者承受能力上、治療的簡便性上，都具有不可比擬的優勢。因此，纖維酶原可能成為一種新穎的預防和/或治療子宮頸糜爛的策略。
本發明涉及纖溶酶原對子宮頸糜爛的預防和/或治療。本發明驚奇地發現，纖維蛋白溶酶原在預防和/或治療子宮頸糜爛時，表現出突出的預防和/或治療效果，能有效促進損傷組織的修復。
一方面，本發明涉及一種新的預防和/或治療子宮頸糜爛及其相關病症的方法，以及纖溶酶原或纖溶酶用於預防和/或治療子宮頸糜爛及其相關病症的用途，該方法或用途包括向受試者體內施用纖溶酶原或纖溶酶。以上所述子宮頸糜爛包括真性糜爛和假性糜爛。所述受試者為哺乳動物，較佳為人。在一個實施方案中，所述子宮頸糜爛可以是任何原因導致的子宮頸糜爛，具體地，為炎症等損傷導致的子宮頸糜爛。
在一個實施方案中，所述受試者纖溶酶原或纖溶酶低下。具體地，所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。
在一個實施方案中，纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施方案中，纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。 在一個實施方案中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個實施方案中，纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動物或齧齒類動物的纖維蛋白溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩，恆河猴、鼠、牛、馬，狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最佳，本發明的纖維蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
在一個實施方案中，所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：靜脈內、肌肉、皮下、局部注射、通過直腸、陰道施用。在一個實施方案中，所述局部給藥通過在子宮頸糜爛區域應用含有纖維蛋白溶酶原的敷料來進行。
在一個實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據情況進一步調整。
上述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可以單獨施用，也可以與其它藥物或療法聯合使用，所述其它藥物或療法包括抗細菌感染藥物，抗病毒感染藥物，抗真菌藥物、抗滴蟲藥物、抗血栓藥物、抗糖尿病藥物、物理療法、鐳射療法、局部手術療法等。
另一方面，本發明涉及纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶在製備預防和/或治療受試者子宮頸糜爛的藥物中的用途。本發明還涉及一種藥物的製備方法，包括將纖溶酶原或纖溶酶與藥學可接受載體製備成治療受試者子宮頸糜爛的藥物。在一個實施方案中，所述子宮頸糜爛包括真性糜爛和假性糜爛。所述受試者為哺乳動物，較佳為人。在一個實施方案中，所述子宮頸糜爛可以是任何原因導致的子宮頸糜爛，具體地，為炎症等損傷導致的子宮頸糜爛。
在一個實施方案中，所述受試者纖溶酶原或纖溶酶低下。具體地，所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。
在一個實施方案中，纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施方案中，纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施方案中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個實施方案中，纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動物或齧齒類動物的纖維蛋白溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩，恆河猴、鼠、牛、馬，狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最佳，本發明的纖維蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
在一個實施方案中，所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：靜脈內、肌肉、皮下、局部注射、通過直腸、陰道施用。在一個實施方案中，所述局部給藥通過在子宮頸糜爛區域應用含有纖維蛋白溶酶原的敷料來進行。
在一個實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據情況進一步調整。
上述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可以單獨施用，也可以與其它藥物或療法聯合使用，所述其它藥物或療法包括抗細菌感染藥物，抗病毒感 染藥物，抗真菌藥物、抗滴蟲藥物、抗血栓藥物、抗糖尿病藥物、物理療法、鐳射療法、局部手術療法等。
另一方面，本發明涉及用於預防和/或治療子宮頸糜爛的纖溶酶原或纖溶酶，以及用於預防和/或治療子宮頸糜爛的、包含纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶的藥物組合物。在一個實施方案中，所述子宮頸糜爛包括真性糜爛和假性糜爛。所述受試者為哺乳動物，較佳為人。在一個實施方案中，所述子宮頸糜爛可以是任何原因導致的子宮頸糜爛，具體地，為炎症等損傷導致的子宮頸糜爛。
在一個實施方案中，所述受試者纖溶酶原或纖溶酶低下。具體地，所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。
在一個實施方案中，纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施方案中，纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施方案中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個實施方案中，纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動物或齧齒類動物的纖維蛋白溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩，恆河猴、鼠、牛、馬，狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最佳，本發明的纖維蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
在一個實施方案中，所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：靜脈內、肌肉、皮下、局部注射、通過直腸、陰道施用。在一個實施方案中，所述局部給藥通過在子宮頸糜爛區域應用含有纖維蛋白溶酶原的敷料來進行。
在一個實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據情況進一步調整。
上述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可以單獨施用，也可以與其它藥物或療法聯合使用，所述其它藥物或療法包括抗細菌感染藥物、抗病毒感染藥物、抗真菌藥物、抗滴蟲藥物、抗血栓藥物、抗糖尿病藥物、物理療法、鐳射療法、局部手術療法等。
另一個方面，本發明涉及用於預防和/或治療受試者子宮頸糜爛的、包含纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶的製品或藥盒。較佳，該製品或藥盒進一步包含含有一種或多種其它的藥物的容器。該製品或藥盒還可包含使用說明書，說明所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可以用於預防和/或治療所述子宮頸糜爛，並且可以進一步說明，所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可以在其它藥物或療法施用之前，同時，和/或之後施用。在一個實施方案中，所述其它藥物或療法包括抗細菌感染藥物，抗病毒感染藥物，抗真菌藥物、抗滴蟲藥物、抗血栓藥物、抗糖尿病藥物、物理療法、鐳射療法、局部手術療法等。
在一個實施方案中，所述說明書進一步說明所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：靜脈內、肌肉、皮下、局部注射、通過直腸、陰道施用。在一個實施方案中，所述局部給藥通過在子宮頸糜爛區域應用含有纖維蛋白溶酶原的敷料來進行。
在一個實施方案中，所述子宮頸糜爛包括真性糜爛和假性糜爛。所述受試者為哺乳動物，較佳為人。在一個實施方案中，所述子宮頸糜爛可以是任何原因導致的子宮頸糜爛，具體地，為炎症等損傷導致的子宮頸糜爛。
在一個實施方案中，所述受試者纖溶酶原或纖溶酶低下。具體地，所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。
在一個實施方案中，纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施方案中，纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、或其任意組合。在一個實施方案中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個實施方案中，纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動物或齧齒類動物的纖維蛋白溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩、恆河猴、鼠、牛、馬，狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最佳，本發明的纖維蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
本發明明確涵蓋了屬於本發明實施方案之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確公開，就像上述技術方案已經單獨且明確公開一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施方案及其要素的所有亞組合，並且在本文中公開，就像每一個此類亞組合單獨且明確在本文中公開一樣。
圖1 顯示plg+/+子宮頸糜爛模型小鼠給予纖溶酶原或PBS的第5和第9天子宮頸HE染色觀察結果；圖2 顯示plg-/-子宮頸糜爛模型小鼠給予纖溶酶原或PBS的第5、9和13天子宮頸HE染色觀察結果；圖3 顯示plg+/+子宮頸糜爛模型小鼠給予纖溶酶原或PBS的第5和第9天子宮頸纖維蛋白免疫染色觀察結果； 圖4 顯示plg-/-子宮頸糜爛模型小鼠給予纖溶酶原或PBS的第5、9和13天子宮頸纖維蛋白免疫染色觀察結果；圖5 顯示plg+/+子宮頸糜爛模型小鼠給予纖溶酶原或PBS的第5和第9天子宮頸F4/80免疫染色觀察結果；圖6 顯示plg-/-子宮頸糜爛模型小鼠給予纖溶酶原或PBS的第5、9和13天子宮頸F4/80免疫染色觀察結果。
1.定義
「子宮頸糜爛」是慢性子宮頸炎症最常見的一種表現形式，常見子宮頸口表面上皮脫落或是被子宮頸口另外一種組織所代替，甚至可以看到下方的血管和紅色的組織，形成真性糜爛或假性糜爛。
「真性糜爛」是由於子宮頸表面分泌物長期刺激、浸漬子宮頸外口周圍的鱗狀上皮，伴隨炎性浸潤，使覆在子宮頸表面的鱗狀上皮脫落，形成潰瘍。
「假性糜爛」是指子宮頸鱗狀上皮損傷脫落後，由子子宮頸管黏膜的柱狀上皮增生、外移所取代，由於所覆蓋的單層柱狀上皮很薄，其下血管清晰可見，肉眼看起來狀似糜爛，實際上為假性糜爛。假性糜爛是臨床上最常見的子宮頸糜爛。
子宮頸糜爛根據糜爛表面狀況可以分為3型：1).在炎症初期，糜爛面僅為單層柱狀上皮所覆蓋，表面平坦，稱單純型糜爛；2).隨後由於腺上皮過度增生並伴有間質增生，糜爛面凸凹不平呈顆粒狀，稱顆粒型糜爛；3).當間質增生顯著，表面不平現象更加明顯呈乳突狀，稱乳突型糜爛。
「柱狀上皮細胞」為子宮頸柱狀上皮細胞。其中單層柱狀上皮由一層棱柱形細胞組成。細胞核呈橢圓形，位於細胞基底部。單層柱狀上皮分佈於胃、腸、子宮和輸卵管的內腔面，其功能主要是吸收和分泌。
「鱗狀上皮細胞」是上皮細胞組織的一種。上皮組織也叫做上皮，它是襯貼或覆蓋在其它組織上的一種重要結構。由密集的上皮細胞和少量細胞 間質構成。結構特點是細胞結合緊密，細胞間質少。通常具有保護、吸收、分泌、排泄的功能。上皮組織可分成被覆上皮、腺上皮和感覺上皮三類。被覆上皮按其細胞在與上皮表面垂直的切面中所呈現的形狀分為鱗狀上皮、柱狀上皮、立方上皮、移行上皮。
就子宮頸糜爛的病理表現而言，由於子宮頸管柱狀上皮抵抗力低，病原體容易侵入發生炎症，當柱狀上皮損傷後，由子子宮頸管黏膜的柱狀上皮增生，並向子宮陰道部磷狀上皮的缺損處延伸，覆蓋創面，取代了原磷狀上皮缺損的區域，由於柱狀上皮較薄，黏膜下方充血的毛細血管明顯易見，所以肉眼見子宮頸外口病變黏膜呈鮮紅色糜爛樣區，因此，國際上，子宮頸糜爛也稱為「子宮頸上皮異位」。
「纖溶酶」是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體。
「纖溶酶原」是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源纖溶酶原氨基酸序列(序列4)計算由810個氨基酸組成，分子量約為90kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI資料，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。
Glu-纖溶酶原是天然全長的纖溶酶原，由791個氨基酸組成(不含有19個氨基酸的信號肽)，編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。△-纖溶酶原(δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域[23,24]，有文獻報導了δ-纖溶酶原的氨基酸序列(序列8)[24]，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7。小纖溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文 獻報導其包括殘基Val443-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)[25]，其氨基酸序列如序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原(Micro-plasminogen)僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)[26]，也有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)，本專利序列參考專利文獻CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。
本發明的「纖溶酶」與「纖維蛋白溶酶」、「纖維蛋白溶解酶」可互換使用，含義相同；「纖溶酶原」與「纖維蛋白溶酶原」、「纖維蛋白溶解酶原」可互換使用，含義相同。
本領域技術人員可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。
本領域技術人員可以理解，本發明通過預防和/或治療子宮頸糜爛可以預防由於子宮頸糜爛引發的其它疾病，例如子宮頸癌、子宮頸炎、輸卵管炎、附件炎、盆腔炎等疾病的發生。因此，對於這些疾病的預防也涵蓋在本發明的範圍內。
在循環過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原啟動劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變為呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。已知多種能夠作為纖溶酶原啟動劑的酶，包括：組織纖溶酶原啟動劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原啟動劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因數XII(哈格曼因數)等。
「纖溶酶原活性片段」是指在纖溶酶原蛋白中，能夠與底物中的靶序列結合並發揮蛋白水解功能的活性片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。本發明所述的纖溶酶原活性片段為包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶域的蛋白質，較佳，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、 98%、99%同源性的氨基酸序列的蛋白質。因此，本發明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、並且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。
目前，對於血液中纖維蛋白溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖維蛋白溶酶原啟動劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖維蛋白溶酶原啟動劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg)、血漿組織纖維蛋白溶酶原啟動劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖維蛋白溶酶原啟動劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法為發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖維蛋白溶酶原活性成正比。此外也可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖維蛋白溶酶原活性進行測定。
「直系同源物或直系同系物(ortholog)」指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖維蛋白溶酶原包括人的天然纖維蛋白溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖維蛋白溶酶原活性的纖維蛋白溶酶原直系同源物或直系同系物。
「保守取代變體」是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性(如酸性，鹼性，疏水性，等)的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是眾所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN演算法的70%至99%的相似度(同一性)。「保守取代變體」還包括通過BLAST或FASTA演算法確定具有60%以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達75%以上更好，最好能達85%以上，甚至達90%以上為最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。
「分離的」纖維蛋白溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖維蛋白溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖維蛋白溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例 如超過99%(按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖維蛋白溶酶原也包括通過生物工程技術從重組細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖維蛋白溶酶原。
術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物等等。
關於參照多肽序列的「氨基酸序列同一性百分數(%)」定義為在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公眾可得到的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員能決定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何演算法。然而，為了本發明的目的，氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生的。
在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算。
分數X/Y乘100
其中X是由序列比對程式ALIGN-2在該程式的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情況下，A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2電腦程式獲得的。
如本文中使用的，術語「治療」、「處理」和「消除」指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀，和/或部分或完全治癒疾病和/或其症狀，並且包括：(a)預防疾病在受試者體內發生，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷為具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；和(c)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退。
術語「個體」、「受試者」和「患者」在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠，小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。
「治療有效量」或「有效量」指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。「治療有效量」會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。
2.本發明纖維蛋白溶酶原的製備
纖維蛋白溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，也可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中將序列的C末端氨基酸附接於不溶性支援物，接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖維蛋白溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖維蛋白溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284頁於The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield，等J.Am.Chem.Soc.,85：2149-2156(1963)；Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006 Mini Rev.Med Chem.6：3-10和Camarero JA等2005 Protein Pept Lett.12：723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複循環後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。
可以使用標準重組方法來生產本發明的纖維蛋白溶酶原。例如，將編碼纖維蛋白溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啟動子(例如天然關聯的或異源的啟動 子)、信號序列、增強子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啟動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水準表達及纖維蛋白溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。
合適的表達載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。
大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於克隆主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啟動子，諸如乳糖啟動子系統，色氨酸(trp)啟動子系統，β-內醯胺酶啟動子系統，或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情況中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啟動並完成轉錄和翻譯。
其他微生物，諸如酵母也可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列等。典型的啟動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啟動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。
在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)也可以用於表達並生成本發明的抗-Tau抗體(例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啟動子和增強子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，以及必需的加工資訊位元點，諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白 免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。
一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱、親和柱、柱層析、高效液相層析(HPLC)、凝膠電泳等來純化本發明所述的纖維蛋白溶酶原。該纖維蛋白溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除主題抗體以外的大分子等等。
3.藥物配製劑
可以通過將具有所需純度的纖維蛋白溶酶原與可選的藥用載體、賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。較佳凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作為參考。
本發明的配製劑也可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，較佳活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，抗感染的藥物等。
本發明的纖維蛋白溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或介面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素 或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
用於體內給藥的本發明的纖維蛋白溶酶原必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。
本發明的纖維蛋白溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15：167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利3773919,EP 58,481)、L-谷氨酸與乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。
4.給藥和劑量
可以通過不同方式，例如通過靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)、肌肉、鼻內、表面或皮內施用或脊髓或腦投遞來實現本發明藥物組合物的施用。氣溶膠製劑如鼻噴霧製劑包含活性劑的純化的水性或其它溶液及防腐劑和等滲劑。將此類製劑調節至與鼻黏膜相容的pH和等滲狀態。
在一些情況中，可以以下方式修飾或配製本發明的纖維蛋白溶酶原藥物組合物，從而提供其穿過血腦屏障的能力。可以通過各種腸內和胃腸外施用路徑，包括口服，靜脈內等對患有血栓和/或血栓相關疾病的個體施用此類纖維蛋白溶酶原的組合物。
用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有 機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體等等。
醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取決於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以為例如每天約0.0001至2000mg/kg，或約0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或50mg/kg體重或在1-50mg/kg的範圍，或至少1mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量也涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量也包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每週或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1-10mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要即時評估、定期評估血栓和血栓相關疾病的治療效果和安全性。
5.子宮頸糜爛治療效果的評價方法
1)婦科檢查：重點檢查子宮頸的大小、外形、質地、子宮頸管粗細，是否有接觸性出血。
2)子宮頸抹片：細胞學檢查為婦科常規檢查，簡便易行，經濟有效，是最重要的輔助檢查及防癌普查首選的初篩方法。
子宮頸抹片，是指從子子宮頸部取少量的細胞樣品，放在玻璃片上，然後在顯微鏡下研究是否異常。
3)陰道鏡檢查：能迅速發現肉眼看不見的病變，在陰道鏡檢查中取可疑部位活檢，能顯著提高活檢的準確率。
4)TCT檢查：TCT是液基薄層細胞檢測的簡稱
TCT檢查是採用液基薄層細胞檢測系統檢測子宮頸細胞並進行細胞學分類診斷，它是目前國際上最先進的一種子宮頸癌細胞學檢查技術，與 傳統的子宮頸抹片巴氏塗片檢查相比明顯提高了標本的滿意度及子宮頸異常細胞檢出率。
5)子宮頸活檢：子宮頸活體組織的病理檢查是確診子宮頸癌的依據。子宮頸活檢就是子子宮頸的活體組織檢查，即從子宮頸上取一小塊或幾塊組織作病理檢查，以確定診斷。
6.製品或藥盒
本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含本發明纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶。所述製品較佳包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子、小瓶、注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖維蛋白溶酶原或纖溶酶。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述子宮頸糜爛。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液、稀釋劑、過濾物、針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖維蛋白溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。
實施例
實施例1纖溶酶原對plg+/+子宮頸糜爛模型小鼠的保護作用
本實驗使用6-7周齡健康的雌性plg+/+小鼠12隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各6隻。造模前一天稱量小鼠體重並分組，分組完成後建立子宮頸糜爛模型，小鼠子宮頸口注入苯酚膠漿0.01mL/次/天，連續造模處理4次。酚膠的配製方案：苯酚於60℃熔融，取3mL，加入4g阿拉伯樹膠粉及5mL蒸餾水，攪拌混勻得乳白色黏稠狀的苯酚膠漿[27]。建立模型後，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/隻/天經尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。造模結束當天為第0天，第1天開始給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為8天。兩組分別於第5天、第9天，隨機抓取3隻小鼠，摘眼球取血處死小鼠，取子宮頸組織在4%多聚甲醛固定液中固定24-48小時。固定後的子宮頸組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織 切片厚度為5μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，並酒精梯度脫水封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。
HE染色結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠第5天黏膜角質層角化過度，脫落(↓)，鱗狀上皮輕度增生(△)，第9天時角化的角質層基本已脫落，表面不平整(↓)，未伴隨上皮修復，鱗狀上皮增生嚴重(圖1A，B)；給纖溶酶原組第5天時部分角質層脫落消失(↓)，損傷的上皮表面被新生的上皮所覆蓋()，而至第9天時新生的上皮進一步修復，發生鱗狀上皮化生(↓)，覆蓋至損傷的黏膜表面(圖1C，D)。可見給溶媒PBS對照組小鼠子宮頸損傷愈加嚴重，而給纖溶酶原組已經發生了修復，而且隨著時間的推移，損傷的黏膜表面不斷好轉，說明纖溶酶原對子宮頸糜爛組織有保護作用。
實施例2纖溶酶原促進plg-/-子宮頸糜爛模型小鼠子宮頸損傷的修復
本實驗使用6-7周齡健康的雌性plg-/-小鼠18隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各9隻。造模前一天稱量小鼠體重並分組，分組完成後建立子宮頸糜爛模型，小鼠子宮頸口注入苯酚膠漿0.01mL/次/天，連續造模處理4次。酚膠的配製方案：苯酚於60℃熔融，取3mL，加入4g阿拉伯樹膠粉及5mL蒸餾水，攪拌混勻得乳白色黏稠狀的苯酚膠漿[27]。建立模型後，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/隻/天經尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。造模結束當天為第0天，第1天開始給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為12天。兩組分別於第5天、第9天、第13天，隨機抓取3隻小鼠，摘眼球取血處死小鼠，取子宮頸組織在4%多聚甲醛固定液中固定24-48小時。固定後的腎臟經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，並酒精梯度脫水封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。
HE染色結果顯示，給溶媒PBS對照組在第5、9、13天鱗狀上皮角質層均已脫落，表面形成糜爛，腔內可見有脫落的角質層(↓)，且見大量炎性細胞浸潤()，隨著時間的推移，炎症不斷加重，黏膜表面的潰瘍也不斷加重(圖2A-C)；給纖溶酶原組(圖2D-F)第5天雖然有黏膜變性壞死脫落形成(↓)，但表面已經發生了新生的上皮修復，第9天宮腔僅有少量的炎性細胞浸潤，新生的上皮進一步增生，且在新生上皮下已經出現了鱗狀上皮角質層(↓)，第13天宮腔內無異物，潰瘍已經癒合，鱗狀上皮表面已經被修復的角質層所覆蓋。plg-/- 小鼠體內缺乏纖溶酶原，所以給溶媒PBS對照組小鼠體內仍然缺乏纖溶酶原，而給纖溶酶原組小鼠纖溶酶原得到補充。給溶媒PBS對照組損傷嚴重，並且隨著時間的延長損傷未見修復，給纖溶酶原組子宮頸損傷較輕，並且隨著給藥時間的延長，損傷逐漸修復。意味著纖溶酶原能夠顯著的促進plg-/-子宮頸糜爛模型小鼠子宮頸損傷的修復。
實施例3纖溶酶原促進plg+/+子宮頸糜爛模型小鼠子宮頸纖維蛋白的降解
本實驗使用6-7周齡健康的雌性plg+/+小鼠12隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各6隻。造模前一天稱量小鼠體重並分組，分組完成後建立子宮頸糜爛模型，小鼠子宮頸口注入苯酚膠漿0.01mL/次/天，連續造模處理4次。苯酚膠的配製方案：苯酚於60℃熔融，取3mL，加入4g阿拉伯樹膠粉及5mL蒸餾水，攪拌混勻得乳白色黏稠狀的苯酚膠漿[27]。建立模型後，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/隻/天經尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。造模結束當天為第0天，第1天開始給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為8天。兩組分別於第5天、第9天，隨機抓取3隻小鼠，摘眼球取血處死小鼠，取子宮頸組織在4%多聚甲醛固定液中固定24-48小時。固定後的子宮頸組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次。檸檬酸修復30分鐘，室溫冷卻10分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水孵育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10%的正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液。兔抗小鼠纖維蛋白(原)抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。
纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，在組織存在損傷的情況下，作為機體對損傷的一種應激反應，纖維蛋白原水解成纖維蛋白[28-30]。因此可將纖維蛋白水準作為損傷程度的一個標誌。
結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖3A、B)和給纖溶酶原組(圖3C、D)小鼠子宮頸纖維蛋白陽性著色均是第9天深於第5天，但是給溶媒PBS對照組的陽性著色均深於給纖溶酶原組，且均有統計學差異(圖3E)。說明纖溶酶原 能夠使沉積的纖維蛋白減少，顯示plg+/+子宮頸糜爛模型小鼠子宮頸的損傷減輕。
實施例4纖溶酶原促進plg-/-子宮頸糜爛模型小鼠子宮頸纖維蛋白的降解
本實驗使用6-7周齡健康的雌性plg-/-小鼠18隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各9隻。造模前一天稱量小鼠體重並分組，分組完成後建立子宮頸糜爛模型，小鼠子宮頸口注入苯酚膠漿0.01mL/次/天，連續造模處理4次。苯酚膠的配製方案：苯酚於60℃熔融，取3mL，加入4g阿拉伯樹膠粉及5mL蒸餾水，攪拌混勻得乳白色黏稠狀的苯酚膠漿[27]。建立模型後，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/隻/天經尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。造模結束當天為第0天，第1天開始給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為12天。兩組分別於第5天、第9天、第13天，隨機抓取3隻小鼠，摘眼球取血處死小鼠，取子宮頸組織在4%多聚甲醛固定液中固定24-48小時。固定後的子宮頸組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次。檸檬酸修復30分鐘，室溫冷卻10分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水孵育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10%的正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液。兔抗小鼠纖維蛋白抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。
纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，在組織存在損傷的情況下，作為機體對損傷的一種應激反應，纖維蛋白原水解成纖維蛋白[28-30]。因此可將纖維蛋白水準作為損傷程度的一個標誌。
結果顯示，給溶媒PBS對照組纖維蛋白陽性著色逐漸加深(圖4A-C)。給纖溶酶原組(圖4D-F)陽性著色在逐漸變淺，且第13天與第5、9天有顯著統計學差異；與給溶媒PBS對照組相比其著色較淺，並且在第13天二者有統計學差異(圖4G)。plg-/-小鼠體內缺乏纖溶酶原，所以給溶媒PBS對照組小鼠體內仍然缺乏纖溶酶原，而給纖溶酶原組小鼠纖溶酶原得到補充。說明纖溶酶原顯著減少沉積的纖維蛋白，顯示纖溶酶原能促進plg-/-子宮頸糜爛模型小鼠子宮頸損傷的修復。
實施例5纖溶酶原促進plg+/+子宮頸糜爛模型小鼠的炎症修復
本實驗使用6-7周齡健康的雌性plg+/+小鼠12隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各6隻。分組完成後，建立子宮頸糜爛模型，小鼠子宮頸口注入苯酚膠漿0.01mL/1次/天，連續造模給藥4次。苯酚膠的配製方案：苯酚於60℃熔融，取3mL，加入4g阿拉伯樹膠粉及5mL蒸餾水，攪拌混勻得乳白色黏稠狀的苯酚膠漿[27]。建立模型後，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/隻/天經尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。造模前一天稱量小鼠體重並分組，造模結束當天為第0天，第1天開始給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為8天。兩組分別於第5天、第9天，隨機抓取3隻小鼠，摘眼球取血處死小鼠，取子宮頸組織在4%多聚甲醛固定液中固定24-48小時。固定後的子宮頸組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。10%正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時，時間到後甩去血清，用PAP筆圈出組織。針對F4/80的兔多克隆抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，TBS洗2次。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下400倍下觀察。
F4/80巨噬細胞標誌物，可以表示炎症反應的程度和階段。結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖5A、B)和給纖溶酶原組(圖5C、D)子宮頸F4/80陽性表達量均是第9天高於第5天，但是給纖溶酶原組要明顯的少於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能夠減輕損傷組織的炎症，顯示纖溶酶原能促進plg+/+子宮頸糜爛模型小鼠損傷子宮頸炎症的修復。
實施例6纖溶酶原促進plg-/-子宮頸糜爛模型小鼠的炎症修復
本實驗使用6-7周齡健康的雌性plg-/-小鼠18隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各9隻。分組完成後，建立子宮頸糜爛模型，小鼠子宮頸口注入苯酚膠漿0.01ml，1次/天，連續造模給藥4次。苯酚膠的配製方案：苯酚於60℃熔融，取3mL，加入4g阿拉伯樹膠粉及5mL蒸餾水，攪拌混勻得乳白色黏稠狀的苯酚膠漿[27]。建立模型後，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/隻/天經尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積 的PBS。造模前一天稱量小鼠體重並分組，造模結束當天為第0天，第1天開始給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為12天。兩組分別於第5天、第9天、第13天，隨機抓取3隻小鼠，摘眼球取血處死小鼠，取子宮頸組織在4%多聚甲醛固定液中固定24-48小時。固定後的子宮頸組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。10%正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時，時間到後甩去血清，用PAP筆圈出組織。針對F4/80的兔多克隆抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，TBS洗2次。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下400倍下觀察。
F4/80巨噬細胞標誌物，可以表示炎症反應的程度和階段。結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖6A-C)和給纖溶酶原組(圖6D-F)，在第5、9、13天F4/80陽性表達量均無沒有明顯的改變，但是給纖溶酶原組陽性表達量低於給溶媒PBS對照組。plg-/-小鼠體內缺乏纖溶酶原，所以給溶媒PBS對照組小鼠體內仍然缺乏纖溶酶原，而給纖溶酶原組小鼠纖溶酶原得到補充。結果表明，纖溶酶原能夠減輕損傷組織炎症水準，顯示纖溶酶原能促進plg-/-子宮頸糜爛模型小鼠損傷子宮頸的炎症修復。
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<210> 1
<211> 2376
<212> DNA
<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)核酸序列
<400> 1
<210> 2
<211> 791
<212> PRT
<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列
<400> 2
<210> 3
<211> 2433
<212> DNA
<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的核酸序列
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<212> PRT
<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的氨基酸序列
<400> 4
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<212> DNA
<213> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)核酸序列
<400> 5
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<212> PRT
<213> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)氨基酸序列
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<212> PRT
<213> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列
<400> 10
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<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的核酸序列
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<210> 14
<211> 228
<212> PRT
<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的氨基酸序列
<400> 14

Claims (10)

  1. 一種纖溶酶原用於製備預防和/或治療受試者子宮頸糜爛及其相關病症之藥物的用途。
  2. 根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中所述子宮頸糜爛包括真性糜爛和假性糜爛。
  3. 根據申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中所述纖溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。
  4. 根據申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。
  5. 根據申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中所述纖溶酶原是選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。
  6. 根據申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中所述在一個實施方案中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ(delta)-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。
  7. 根據申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中所述纖溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原，與序列2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。
  8. 根據申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中所述纖溶酶原或纖維蛋白溶酶全身或局部施用，且通過靜脈內、肌肉、皮下、局部注射、直腸施用、陰道施用。
  9. 根據申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中所述纖溶酶原或纖維蛋白溶酶可與其它藥物或療法組合施用。
  10. 根據申請專利範圍第9項的所述之用途，其中所述其它藥物或療法包括抗細菌感染藥物、抗病毒感染藥物、抗真菌藥物、抗滴蟲藥物、抗血栓藥物、抗糖尿病藥物、物理療法、鐳射療法、局部手術療法。
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