TWI653982B - Method for preventing or treating acute and chronic thrombosis - Google Patents

Abstract

本發明涉及纖溶酶原在溶解新鮮和陳舊血栓方面的作用。與現有其它溶解血栓的藥物相比，本發明纖溶酶原可特異性溶解血栓而不會造成出血等副作用。本發明的藥物還具有可溶解新鮮和陳舊血栓且具有半衰期長和溶血栓強度可控的優勢，因此，纖溶酶原可能成為全新的溶解體內血栓的策略。

Description

用於預防或治療急性及慢性血栓的方法

本發明涉及一種新的使用纖溶酶原預防和/或治療血栓的方法。纖溶酶原可特異性溶解血栓而不會造成出血等副作用。本發明的藥物還具有可溶解新鮮和陳舊血栓且具有半衰期長和溶血栓強度可控的優勢，因此，纖溶酶原可能成為全新的溶解體內血栓的策略。

血栓的形成及危害

血栓是指人體或動物在存活期間因某些誘因，血液有形成分在循環血中異常發生的血凝塊，或者在心臟內壁或血管壁上發生的血液沉積物。其包括心肌梗死、腦栓塞、肺血栓、深部靜脈血栓和周圍血管栓塞等，是嚴重危害人類健康的疾病，其發病率、致殘率、致死率都很高。據世界衛生組織統計，世界上每年死於血栓塞疾病的人數約為2600萬，遠高於其他死亡原因，成為危害人類健康頭號敵人^[1]。

纖溶酶是纖溶酶原激活系統(PA系統)的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細胞外基質(ECM)的幾個組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層黏連蛋白和蛋白聚糖^[2]。此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體(pro-MMP)激活形成具有活性的金屬蛋白酶(MMP)。因此纖溶酶被認為是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物^[3,4]。纖溶酶是由纖溶酶原通過兩種生理性的PA：組織型纖溶酶原激活劑(tPA)或尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水平較高，傳統上認為PA系統的調節主要通過PA的合成和活性水平實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節，如激素、生長因數和細胞因數。此外，還存在纖溶酶和PA的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α2-抗纖溶酶(α2-antiplasmin)。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體(uPAR)^[5,6]。

纖溶酶原(plasminogen，plg)是一個單鏈糖蛋白，分子量約為92kDa^[7,8]。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約為2μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潛在來源^[9,10]。纖溶酶原存在兩種分子形式：谷氨酸-纖溶酶原(Glu-plasminogen)和賴氨酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被稱為谷氨酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時，谷氨酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成為賴氨酸-纖溶酶原。與谷氨酸-纖溶酶原相比，賴氨酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，並可以更高的速率被PA激活。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割，導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成^[11]。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個同源三環，即所謂的kringle，羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringle含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的賴氨酸結合位點。最新發現一個為38kDa的纖溶酶原片段，其中包括kringle1-4，是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名為血管抑素，可通過幾個蛋白酶水解纖溶酶原產生。

纖溶酶的主要底物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵^[12]。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的底物特異性，包括層黏連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中也起著重要作用^[8,13,14]。間接地，纖溶酶還可以通過將某些蛋白酶前體轉化為活性蛋白酶來降解ECM的其他組分，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器^[15]。此外，纖溶酶具有激活某些潛在形式的生長因數的能力^[16-18]。在體外，纖溶酶還能水解補體系統的組分並釋放趨化補體片段。

現有溶血栓治療方法

目前減少血栓的相關藥物治療是常見的非手術治療方法，包括溶栓療法、抗凝療法、抗血小板藥物和血管擴張藥物。現在最常用最有效的方法就是採用溶栓療法，常用的溶血栓藥物有三代：第一代以鏈激酶(SK)和尿激酶(UK)為代表，溶栓能力強，但沒有溶栓特異性，容易出現全身溶栓亢進而導致出血^[19,20]。第二代以組織型纖溶酶原激活劑tPA為代表，其溶栓作用優於 SK、UK，但在體內半衰期短^[21]。第三代以基因工程技術，單克隆技術對第一代，第二代藥物進行改造，但基本都在試驗階段。這些藥物都基於增加纖溶平衡中的激活劑，產生纖溶酶(Plm)促進纖溶，從而達到溶栓目的^[22]。

目前已批准的溶栓藥物分為兩類：絕大多數溶栓藥物使用的是纖溶酶原激活劑，包括天然和不同重組形式的tPA、uPA，以及鏈激酶(streptokinase)。纖溶酶原激活劑自身不能溶解血栓，必須將血栓附近的纖溶酶原分子激活成活性的纖溶酶後才能進行溶栓作用。最近幾年，活性纖溶酶獲得批准用於直接局部溶栓，具體方法是將導管通到血栓部位的情況下局部釋放活性纖溶酶從而直接溶栓。

纖溶酶原(plg)是纖溶酶(Plm)的非活性形式，傳統上認為其在體內是過量和惰性的，機體的溶解血栓過程只有通過纖溶酶原在其激活劑的作用下激活為有活性的纖溶酶，活性纖溶酶進而行使溶解纖維蛋白血凝塊(fibrin clot)的功能。傳統上認為纖溶酶原本身不起溶解血栓的作用。

然而，本發明驚奇地發現天然纖溶酶原具有良好的溶解新鮮和陳舊血栓的功能，且具有安全性好，溶解血栓強度便於調節，特異性好等優點。

本發明的溶栓機理與目前已知的溶栓策略完全不同。現有技術溶解血栓的方法是通過增加溶栓反應的催化劑，即纖溶酶原激活劑，包括tPA、uPA、鏈激酶及其衍生物或者溶栓反應的產物，即活性纖溶酶來實現。本發明溶解血栓的方法是通過調節溶栓反應的底物纖溶酶原的策略來實現的。

相對於現有技術中的溶栓藥物，本發明的纖溶酶原溶栓至少具備以下優點。

1. 良好的溶栓效果

外周動脈堵塞(peripheral arterial occlusion,PAO)和深靜脈血栓(deep vein thrombosis,DVT)的情況下形成的長的血栓和逐步收縮的陳舊血栓，現有技術的溶栓藥物效果較差^[23-25]，而本發明使用纖溶酶原或者纖溶酶原與PA的組合，對上述血栓實現了良好的溶栓效果。因此，本發明可以有效解決tPA,uPA的上述問題。

2. 半衰期長

目前的溶栓物質一個重要特點是體內半衰期過短，如天然uPA的體內半衰期為5-10分鐘，天然tPA的體內半衰期為3-5分鐘，天然纖溶酶的體內半衰期更是極為短暫。即使目前通過基因工程改造以圖延長這些物質的半衰期，但是效果並不理想，半衰期過短仍然極大地限制了這些物質的應用。

然而，纖溶酶原的體內半衰期長達53小時，這說明使用纖溶酶原或者纖溶酶原與PA的組合，均能顯著的延長體內溶血栓的作用期，達到持續、穩定溶栓的目的。

3. 更具溫和性和可調控性

對於活性纖溶酶來講，由於其是一個高活性的蛋白酶，因此通過使用活性纖溶酶來溶栓必須是一個非常快速的反應過程，從而導致目前的使用中必須通過導管直接引到血栓部位。

對於纖溶酶原激活劑來講，由於其在溶栓反應中處於催化劑的位置，添加少量的纖溶酶原激活劑會在很短時間裡迅速形成大量活性纖溶酶，是一個劇烈的酶反應過程。

然而，本發明實驗證明通過調節溶栓反應的底物纖溶酶原溶解血栓的過程更溫和，而且，通過不同纖溶酶原使用量和溶栓效果的研究發現，纖溶酶原溶栓速率也可以通過纖溶酶原的劑量來調控。

4. 特異性和副作用低

現有技術使用纖溶酶原激活劑作為溶栓藥物的一個主要副作用是出血，特別是腸道和腦部的出血。由於正常體內纖溶酶原廣泛存在於所有的體液，正常情況下體記憶體在生理性的纖維蛋白沉積，而纖溶酶原激活劑的增加往往發生於創傷、出血、劇烈運動等特殊情況下。因此，一旦注射纖溶酶原激活劑，體內會非特異性地廣泛發生激活纖溶酶原形成活性纖溶酶這一反應，從而造成原有正常的纖維蛋白沉積的溶解並發生出血。在臨床上，顱內出血風險是一個主要的出血風險。有報導指出，在持續2-24小時的持續給藥過程中，顱內出血的發生率為1%-2%，目前還沒有更好的辦法避免出血這種風險。

在本發明中，由於纖溶酶原不是活性酶，因此注射纖溶酶原後不會非特異性地廣泛發生激活纖溶酶原形成活性纖溶酶這一反應。這一反應發 生的部位取決於哪裡表達纖溶酶原激活劑，也就是發生血栓的部位。本發明實驗證明纖溶酶原可以特異性地吸附於血栓部位，具有溶栓特異性，並且實驗證明未發生出血的副作用。

5. 有效溶解陳舊血栓

目前的溶栓藥物的溶栓作用集中在血栓形成的初期，即「新鮮血栓」。如在缺血性中風中的研究中證實，在血栓形成3個小時內注射重組tPA可以有效的溶解血栓。後續的研究證明，重組tPA最多可以在血栓形成4.5小時內溶解血栓，如果超過4.5小時的話，注射重組tPA的風險可能要超過有效作用。因此，在目前藥物的情況下，要盡可能的在血栓形成的早期(小於4.5小時)注射重組tPA^[26，27]。換句話說，目前本領域急需找到一種強有力的陳舊血栓溶栓藥物。

在本發明中，單獨使用纖溶酶原(以及生理水平的tPA)或者使用纖溶酶原和纖溶酶原激活劑(tPA或uPA)，均可有效地溶解新鮮血栓(血栓形成0.5小時)，或者陳舊血栓(20小時)，甚至極其陳舊血栓(72小時)。這些資料清楚地表明瞭纖溶酶原在溶解陳舊血栓上的巨大優勢。

因此，纖溶酶原有望成為一種新的更具優勢的溶栓新藥。

一方面，本發明涉及預防和/或消除受試者動、靜脈血栓的方法，包括給藥受試者纖溶酶原。本發明還包括纖溶酶原用於預防和/或消除受試者動、靜脈血栓的用途。在一個實施方案中，其中所述血栓包括新鮮血栓和陳舊血栓。在一個實施方案中，所述血栓為血液系統疾病、循環系統疾病、自身免疫疾病、代謝紊亂疾病或感染性疾病導致的血栓。在一個實施方案中，所述血栓為繼發於糖尿病的大、小血管、微血管血栓。在一個實施方案中，所述血栓為大小血管病變導致的血栓。

同時，本發明涉及一種新的預防和/或治療血栓相關疾病的方法，該方法包括向受試者體內給藥有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於預防和/或治療血栓相關疾病的用途。本發明涉及一種新的預防和/或消除受試者病理性血栓的方法，該方法通過全身或局部給藥纖溶酶原來溶解所述血 栓。以上所述血栓為新鮮血栓和/或陳舊血栓，所述血栓相關疾病為新鮮血栓和/或陳舊血栓誘導或導致的疾病。所述受試者為哺乳動物，較佳為人。

在一個實施方案中，所述受試者纖溶酶或者纖溶酶原低下。具體地，所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。

在一個實施方案中，本發明的血栓為靜脈血栓和/或動脈血栓。所述血栓相關疾病包括門靜脈血栓導致的胰腺炎、肝硬化；腎靜脈血栓導致的腎栓塞；頸內靜脈血栓引起的全身性敗血症、肺栓塞、腦血栓；動脈血栓導致的器官的梗死，包括但不限於：腦梗塞、心肌梗死、血栓性中風、房顫、不穩定性心絞痛、頑固性心絞痛、短暫性腦缺血發作、肺栓塞、糖尿病大小血管栓塞等。

在一個實施方案中，所述血栓相關疾病為糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、糖尿病性肝病、糖尿病性心臟病、糖尿病性腸病、包括糖尿病性神經痛等的糖尿病性神經病變。

在一個實施方案中，上述血栓是繼發的和/或局部的血栓；上述血栓相關疾病是繼發的和/或局部的血栓相關疾病。

在一個實施方案中，纖溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性。在一個實施方案中，纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施方案中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖溶酶原。在一個實施方案中，纖溶酶原為人天然纖溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動物或嚙齒類動物的纖溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩、恒河猴、鼠、牛、馬、狗的纖溶酶原直向同系物。最佳，本發明的纖溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在一個實施方案中，所述纖溶酶原通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內、局部注射、關節內注射或通過直腸。在一個實施方案中，所述局部給藥通過在血栓區域應用含有纖溶酶原的敷料和/或導管來進行。

在一個實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200mg/cm²、1-100mg/cm²、10-100mg/cm²(以每平方公分體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據情況進一步調整。

上述纖溶酶原可以單獨施用，也可以與其它藥物聯合使用以預防和/或治療與病理性血栓發生相伴的其它疾病，所述其它藥物包括，例如，心血管疾病治療藥物、心律失常治療藥物、糖尿病治療藥物等。

另一方面，本發明涉及纖溶酶原在製備預防和/或消除受試者動、靜脈血栓的藥物、製品、藥盒中的用途。本發明還涉及一種製藥方法，包括將纖溶酶原與藥學可接受載體共同製備成預防和/或消除受試者動、靜脈血栓的藥物、製品、藥盒。在一個實施方案中，其中所述血栓包括新鮮血栓(急性血栓)和陳舊血栓(慢性血栓)。在一個實施方案中，所述血栓為血液系統疾病、循環系統疾病、自身免疫疾病、代謝紊亂疾病或感染性疾病導致的血栓。在一個實施方案中，所述血栓為繼發於糖尿病的大、小血管、微血管血栓。在一個實施方案中，所述血栓為大小血管病變導致的血栓。

同時，本發明涉及纖溶酶原在製備預防和/或消除受試者病理性血栓的藥物、製品、藥盒中的用途，以及纖溶酶原在製備預防和/或治療受試者血栓相關疾病的藥物、製品、藥盒中的用途。本發明還涉及一種製備藥物的方法，包括將纖溶酶原與藥學可接受載體一起製備成預防和/或消除受試者病理性血栓的藥物、製品、藥盒，或預防和/或治療受試者血栓相關疾病的藥物、製品、藥盒。所述血栓為新鮮血栓和/或陳舊血栓，所述血栓相關疾病為新鮮血栓和/或陳舊血栓誘導的疾病。所述受試者為哺乳動物，較佳為人。

在一個實施方案中，所述受試者纖溶酶或者纖溶酶原低下。具體地，所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。

在一個實施方案中，上述血栓為靜脈血栓和/或動脈血栓。所述血栓相關疾病包括門靜脈血栓導致的胰腺炎、肝硬化；腎靜脈血栓導致的腎栓塞；頸內靜脈血栓引起的全身性敗血症、肺栓塞、腦血栓；動脈血栓導致的器官的梗死，包括但不限於：腦梗塞、心肌梗死、血栓性中風、房顫、不穩定性心絞痛、頑固性心絞痛、短暫性腦缺血發作、肺栓塞、糖尿病大小血管栓塞等。

在一個實施方案中，所述血栓相關疾病為糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、糖尿病性肝病、糖尿病性心臟病、糖尿病性腸病、包括糖尿病性神經痛等的糖尿病性神經病變。

在一個實施方案中，上述血栓是繼發的和/或局部的血栓；上述血栓相關疾病是繼發的和/或局部的血栓相關疾病。

在一個實施方案中，纖溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性。在一個實施方案中，纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施方案中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖溶酶原。在一個實施方案中，纖溶酶原為人天然纖溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動物或嚙齒類動物的纖溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、馬，狗的纖溶酶原直向同系物。最佳，本發明的纖溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在一個實施方案中，所述纖溶酶原通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內、局部注射、 關節內注射或通過直腸。在一個實施方案中，所述局部給藥通過在血栓區域應用含有纖溶酶原的敷料和/或導管來進行。

上述纖溶酶原可以單獨施用，也可以與其它藥物聯合使用以治療與病理性血栓發生相伴的其它疾病，所述其它藥物包括，例如，心血管疾病治療藥物，心律失常治療藥物，糖尿病治療藥物等。

在一個實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200mg/cm²、1-100mg/cm²、10-100mg/cm²(以每平方公分體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據情況進一步調整。

另一方面，本發明涉及用於預防和/或消除受試者動、靜脈血栓的纖溶酶原，以及用於預防和/或消除受試者動、靜脈血栓的、包含纖溶酶原的藥物組合物。在一個實施方案中，其中所述血栓包括新鮮血栓和陳舊血栓。在一個實施方案中，所述血栓為血液系統疾病、循環系統疾病、自身免疫疾病、代謝紊亂疾病或感染性疾病導致的血栓。在一個實施方案中，所述血栓為繼發於糖尿病的大、小血管、微血管血栓。在一個實施方案中，所述血栓為大小血管病變導致的血栓。同時，本發明涉及用於預防和/或治療血栓相關疾病的纖溶酶原，以及用於預防和/或治療血栓相關疾病的、包含纖溶酶原的藥物組合物。上述血栓為新鮮血栓和/或陳舊血栓，所述血栓相關疾病為新鮮血栓和/或陳舊血栓誘導的疾病。在一個實施方案中，上述血栓為靜脈血栓和/或動脈血栓。所述血栓相關疾病包括門靜脈血栓導致的胰腺炎、肝硬化；腎靜脈血栓導致的腎栓塞；頸內靜脈血栓引起的全身性敗血症、肺栓塞、腦血栓；動脈血栓導致的器官的梗死，包括但不限於：腦梗塞、心肌梗死、血栓性中風、房顫、不穩定性心絞痛、頑固性心絞痛、短暫性腦缺血發作、肺栓塞、糖尿病大小血管栓塞等。

在一個實施方案中，所述血栓相關疾病為糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、糖尿病性肝病、糖尿病性心臟病、糖尿病性腸病、包括糖尿病性神經痛等的糖尿病性神經病變。

在一個實施方案中，上述血栓是先天的、繼發的和/或局部的血栓；上述血栓相關疾病是先天的、繼發的和/或局部的血栓相關疾病。

在一個實施方案中，纖溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性。在一個實施方案中，纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施方案中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖溶酶原。在一個實施方案中，纖溶酶原為人天然纖溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動物或嚙齒類動物的纖溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩、恒河猴、鼠、牛、馬、狗的纖溶酶原直向同系物。最佳，本發明的纖溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在一個實施方案中，所述纖溶酶原通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內、局部注射、關節內注射或通過直腸。在一個實施方案中，所述局部給藥通過在血栓區域應用含有纖溶酶原的敷料和/或導管來進行。

在一個實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200mg/cm²、1-100mg/cm²、10-100 mg/cm²(以每平方公分體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據情況進一步調整。

另一個方面，本發明涉及用於預防和/或消除受試者動、靜脈血栓的、包含纖溶酶原的製品或藥盒。在一個實施方案中，其中所述血栓包括新鮮血栓和陳舊血栓。在一個實施方案中，所述血栓為血液系統疾病、循環系統疾病、自身免疫疾病、代謝紊亂疾病或感染性疾病導致的血栓。在一個實施方案中，所述血栓為繼發於糖尿病的大、小血管、微血管血栓。在一個實施方案中，所述血栓為大小血管病變導致的血栓。在一個實施方案中，所述製品或藥盒包含含有有效劑量的纖溶酶原的容器。進一步的，所述製品或藥盒還包含包含含有一種或多種其它藥物的容器，其中所述其它藥物為伴隨血栓形成的其它疾病的治療藥物。該藥盒還可包含使用說明書，說明所述纖溶酶原可以用於預防和/或治療所述動、靜脈血栓，或血栓相關疾病，並且可以進一步說明，所述纖溶酶原可以在其它藥物施用之前，同時，和/或之後施用。在一個實施方案中，所述其它藥物可以是心血管疾病治療藥物，心律失常治療藥物，糖尿病治療藥物等，以治療與病理性血栓發生相伴的其它疾病。在具體的上述方案中，上述血栓為新鮮血栓和/或陳舊血栓，所述血栓相關疾病為新鮮血栓和/或陳舊血栓誘導的疾病。在一個實施方案中，上述血栓為靜脈血栓和/或動脈血栓。所述血栓相關疾病包括門靜脈血栓導致的胰腺炎、肝硬化；腎靜脈血栓導致的腎栓塞；頸內靜脈血栓引起的全身性敗血症、肺栓塞、腦血栓；動脈血栓導致的器官的梗死，包括但不限於：腦梗塞、心肌梗死、血栓性中風、房顫、不穩定性心絞痛、頑固性心絞痛、短暫性腦缺血發作、肺栓塞、糖尿病大小血管栓塞等。

在一個實施方案中，所述血栓相關疾病為糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、糖尿病性肝病、糖尿病性心臟病、糖尿病性腸病、包括糖尿病性神經痛等的糖尿病性神經病變。

在一個實施方案中，上述血栓是先天的、繼發的和/或局部的血栓；上述血栓相關疾病是先天的、繼發的和/或局部的血栓相關疾病。

在一個實施方案中，纖溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具 有纖溶酶原活性。在一個實施方案中，纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中，纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施方案中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖溶酶原。在一個實施方案中，纖溶酶原為人天然纖溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動物或嚙齒類動物的纖溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、馬，狗的纖溶酶原直向同系物。最佳，本發明的纖溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在一個實施方案中，所述受試者纖溶酶或者纖溶酶原低下。具體地，所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。

本發明明確涵蓋了屬於本發明實施方案之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確公開，就像上述技術方案已經單獨且明確公開一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施方案及其要素的所有子組合，並且在本文中公開，就像每一個此類子組合單獨且明確在本文中公開一樣。

圖1顯示在125ng tPA存在的條件下，37℃溫育1小時，不同劑量纖溶酶原對20小時陳舊血栓溶解效果。

圖2顯示125ng tPA存在時，37℃溫育2小時，不同劑量纖溶酶原對20小時陳舊血栓的溶解效果。

圖3顯示在10ng tPA條件下，37℃溫育2小時，不同劑量的纖溶酶原對20小時陳舊血栓溶栓效果。

圖4顯示在125ng tPA條件下，37℃溫育2小時，不同劑量的纖溶酶原對72小時陳舊血栓的溶栓效果。

圖5顯示在10ng tPA條件下，37℃溫育2小時，不同劑量的纖溶酶原對72小時陳舊血栓的溶栓效果。

圖6顯示20小時陳舊血栓在加入10ng的tPA和1mg的plg或者單獨加入5μg的tPA後隨著時間的延長血栓溶栓率的變化。

圖7顯示在100ng uPA條件下，37℃溫育1小時，不同劑量的纖溶酶原對20小時陳舊血栓溶效果。

圖8顯示在1ng uPA條件下，37℃溫育2小時，不同劑量的纖溶酶原對20小時陳舊血栓溶效果。

圖9顯示纖溶酶原對於體內血栓的特異性吸附實驗結果。

圖10顯示在125ng tPA條件下，37℃溫育2小時，不同濃度的纖溶酶原對於30分鐘新鮮血栓的溶栓效果。

圖11顯示24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原15天后血清中D-二聚體的濃度檢測結果。

圖12顯示24-25周糖尿病小鼠給予PBS(A)或纖溶酶原(B)31天心臟纖維蛋白免疫組化染色結果。

圖13顯示24-25周糖尿病小鼠給予PBS(A)或纖溶酶原(B)31天后腎臟纖維蛋白免疫組化染色結果。

圖14 24-25顯示周糖尿病小鼠給予PBS(A)或纖溶酶原(B)31天后肝臟纖維蛋白免疫組化染色結果。

圖15 24-25周糖尿病後期神經損傷小鼠給予PBS(A)或纖溶酶原(B)15天后坐骨神經纖維蛋白免疫組化染色。

1. 定義

「血栓」是凝血過程中形成的產物。凝血過程是機體保持封閉高壓循環系統完整性的防禦機制。在正常情況下，該過程應保持非活化狀態， 但當組織受到損傷時，需要立即啟動該機制以減少血液外滲。當血管受損時，在凝血酶的作用下溶於血漿中的纖維蛋白原(fibrinogen)將最終轉變為不溶於水的纖維蛋白(fibrin)多聚體，並彼此交織成網，將血細胞網羅在內，形成血凝塊，完成凝血過程。在該過程中，血凝塊與傷處的大小比例至關重要。因此初始血凝塊形成的分子(纖維蛋白，凝血酶)和溶解血凝塊的分子(纖溶酶、纖溶酶原激活劑等)間應存在平衡。但在病理過程中，該平衡的破壞將導致過量的血凝塊形成分子，進而形成血栓(thrombus)，該血栓為「病理性血栓」。

在人體中，血栓可在具有血流的任何位置發生，目前主要將其分為兩大類：靜脈血栓和動脈血栓。靜脈血栓由在靜脈中產生的血凝塊導致。最常見的靜脈血栓類型為：深靜脈血栓(DVT)，其通常影響肢體靜脈如股靜脈，導致受影響部位的疼痛和紅腫；門靜脈血栓，其可影響肝門靜脈，進而導致胰腺炎、肝硬化、憩室炎或膽管癌；腎靜脈血栓，導致腎栓塞；頸內靜脈血栓，其可引起全身性敗血症、肺栓塞等多種併發症；腦靜脈血栓，導致患者呈現頭痛、視覺異常中風等症狀。動脈血栓則可能導致在體內幾乎任何器官的梗死，其引發的病症包括但不限於：腦梗塞、心肌梗死、血栓性中風、動脈粥樣硬化疾病、不穩定性心絞痛、頑固性心絞痛、短暫性腦缺血發作、肺栓塞等。

「血栓相關疾病」為血栓形成和血栓栓塞兩種病理過程所引起的疾病。本發明血栓相關疾病的術語明確涵蓋由血栓形成和血栓栓塞引起的所有疾病。

血栓形成(thrombosis)是指在一定條件下，血液有形成分在血管內(多數為小血管)形成栓子，造成血管部分或完全堵塞，相應部位血液供應障礙的病理過程。依血栓組成成分可分為血小板血栓、紅細胞血栓、纖維蛋白血栓、混合血栓等。按血管種類可分為動脈性血栓、靜脈性血栓及毛細血管性血栓。

血栓栓塞(thromboembolism)是血栓由形成部位脫落，在隨血流移動的過程中部分或全部堵塞某些血管，引起相應組織和(或)器官缺血、缺氧、壞死(動脈血栓)及淤血、水腫(靜脈血栓)的病理過程。

靜脈血栓形成以下肢深靜脈血栓形成最為多見，常見於深靜脈如膕靜脈、股靜脈、腸系膜靜脈及門靜脈等。多為紅細胞血栓或纖維蛋白血栓。 主要表現有：(1)血栓形成的局部腫脹、疼痛；(2)血栓遠端血液回流障礙：如遠端水腫、脹痛、皮膚顏色改變、腹水等；(3)血栓脫落後栓塞血管引起相關臟器功能障礙，如肺梗死的症狀、體徵等。

動脈血栓形成多見於冠狀動脈、腦動脈、腸系膜動脈及肢體動脈等，血栓類型早期多為血小板血栓，隨後為纖維蛋白血栓。臨床表現有：(1)發病多較突然，可有局部劇烈疼痛，如心絞痛、腹痛、肢體劇烈疼痛等；(2)相關供血部位組織缺血、缺氧所致的器官、組織結構及功能異常，如心肌梗死、心力衰竭、心源、性休克、心律失常、意識障礙及偏癱等；(3)血栓脫落引起腦栓塞、腎栓塞、脾栓塞等相關症狀及體徵；(4)供血組織缺血性壞死引發的臨床表現，如發熱等。毛細血管血栓形成常見於DIC、TTP及溶血尿毒症綜合徵(HUS)等。臨床表現往往缺乏特異性，主要為皮膚黏膜栓塞性壞死、微循環衰竭及器官功能障礙。

「糖尿病」是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因數作用於機體導致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發的糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂綜合徵，臨床上以高血糖為主要特點。

「糖尿病併發症」是由糖尿病過程中血糖控制不良導致的身體其他器官或組織的損害或功能障礙，其中包括肝臟、腎臟、心臟、視網膜、神經系統的損害或功能障礙等。據世界衛生組織統計，糖尿病併發症高達100多種，是目前已知併發症最多的一種疾病。而這些糖尿病的併發症主要是由於患者各器官的大血管、小血管和微血管受損所致。

「糖尿病性大血管病變」主要指主動脈及各器官動脈等發生的動脈粥樣硬化。其發病機理包括以下方面：(1)持續性高血糖使血液黏滯度和凝固性升高，進而引起動脈血管彈性減弱乃至喪失；(2)脂類代謝異常，其促使膽固醇和膽固醇脂在細胞內堆積，導致動脈粥樣硬化發生與發展；(3)動脈壁內皮細胞損傷，血流動力學改變使血液機械性地長期衝擊血管內皮，引起內皮損傷，進而導致血小板、纖維蛋白等在損傷部位黏附聚集形成血栓，並可進一步導致炎症；(4)參與凝血機制的糖蛋白因數增多，促進血小板和纖維蛋白聚集黏附於損傷的內皮下層而溶解能力下降，進而形成血栓。

「糖尿病性微血管病變」指糖尿病患者機體各器官或組織微循環不同程度的異常導致的微血管病變。微血管病變形成的過程大致為：微循環功能性改變，內皮損傷，基膜增厚，血黏度增高，紅細胞聚集，血小板黏附和聚集，最後導致微血栓形成和/或微血管閉塞。

上述的兩種「糖尿病性血管病變」導致組織或器官局部血管損傷、血流不暢、細胞缺氧、形成血凝塊、血栓和炎症，並進一步影響周邊的組織及器官功能，進而導致糖尿病併發症，例如，糖尿病性心臟病、糖尿病性腸病、糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、糖尿病性肝病、糖尿病性神經病變。

「糖尿病性腎病」是糖尿病微血管併發症，主要指糖尿病性腎小球硬化症，一種以血管損害為主的腎小球病變，其特徵包括蛋白尿、高血壓、水腫、腎小球硬化症、血管結構改變和小管間質性疾病(tubulointerstitial disease)。糖尿病腎病的第一臨床證據通常是尿液中存在白蛋白尿，例如微白蛋白尿(microalbuminuria)或大量白蛋白尿(macroalbuminuria)。

「糖尿病性神經病變」或稱為「糖尿病性神經病」是由糖尿病引起的神經系統損傷造成，包括感覺神經受損、運動神經受損和自主神經受損。其中感覺神經受損通常較為嚴重，常見症狀包括但不限於：肢體疼痛、感覺減退、麻木、灼熱、冰涼，以及糖尿病神經性疼痛，包括但不限於糖尿病併發症引發的自發性疼痛、痛覺減退(hypoalgesia)、痛覺超敏(hyperalgesia)等等。

「糖尿病性神經痛」是糖尿病神經病變的最常見形式，通常由糖尿病感覺神經受損所致。主要的疼痛通常伴有溫度和觸覺喪失，疼痛發生以下肢感覺居多，同時也發生在上肢和軀幹。一般可分為周圍和中樞神經疼痛。周圍神經疼痛通過周圍神經的損傷引起，而中樞神經疼痛通過中樞神經系統和/或脊髓損傷引起。

「糖尿病肝損傷」是指由糖尿病引起的肝臟組織學和功能變化的病變。其主要由糖尿病引起的大血管、微血管病變導致。已知糖尿病可引起的肝損傷包括：肝酶學異常，其可引起肝細胞內二氧化碳蓄積、酸中毒、氧供減少、氧消耗增加，使肝臟轉氨酶活性增加，膽紅素代謝紊亂，重者可引起肝細胞壞死；脂肪肝，在引起脂肪肝的所有病因中，糖尿病占第三位，其中21%~78%糖尿病患者伴有脂肪肝；肝炎、硬化和肝癌，其中糖尿病患者中病 毒性肝炎的患病率約為正常人的2-4倍，原發性肝癌的發生率約為正常人的4倍。

在臨床上，由糖尿病引起的肝病及其相關症狀包括但不限於：肝酶學異常、肝區不適和觸痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、膽管炎、肝硬化、肝壞死和肝癌等。

「糖尿病性心血管病」指由糖尿病引起的心血管系統的組織學和功能變化的病變，其為最常見的糖尿病併發症之一，主要由糖尿病引起的大血管、微血管病變導致。其中，患者臨床可表現為心電圖異常、心臟擴大、心率失常、心絞痛、無痛性心肌梗死、心力衰竭。據統計，大約70%~80%的糖尿病患者最後死於心血管併發症。

「糖尿病視網膜病變」也稱「糖尿病視網膜病」，指由糖尿病引起的視網膜組織學和功能變化的病變，主要由糖尿病引起的大血管、微血管病變導致。糖尿病性視網膜病變是最常見的糖尿病眼病，常造成視力減退或失明。據統計，50%的糖尿病患者在病程的10年左右將出現該病變，15年以上則達80%。糖尿病病情越重，年齡越大，發病的幾率越高。

通過CT或MRI等技術檢查患者血栓組織時，可見病灶呈新鮮或陳舊血栓。首發病灶在急性發作期為新鮮灶，病灶組織缺血中心部分壞死，部分有恢復可能，周邊區域未受影響。此時的治療目的應主要是防止「中心梗死區」擴大。而陳舊血栓則為組織缺血中心的完全壞死，治療目的應致力於使梗死區周邊組織功能繼續得到改善。陳舊性血栓存在較高的復發風險，因此對陳舊性血栓的患者，治療和預防同樣重要，在減少症狀程度的同時也應降低高復發率。目前的多種溶栓藥物對於急性期的新鮮血栓治療效果尚可，但治療陳舊性血栓則效果較差。

「纖溶酶」是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體。

「纖溶酶原」是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源plasminogen氨基酸序列(序列4)計算由810個氨基酸組成，分子量約為92kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的PLG包含七個結構域：位 於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI資料，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是天然全長的纖溶酶原，由791個氨基酸組成(不含有19個氨基酸的信號肽)，編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。δ-plasminogen(δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域^[28，29]，有文獻報導了δ-plasminogen的氨基酸序列(序列8)^[30]，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7。Mini-plasminogen由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791(以不含有信號肽的Glu-plg序列的Glu殘基為起始氨基酸)^[31]，其氨基酸序列如序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而Micro-plasminogen僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791(以不含有信號肽的Glu-plg序列的Glu殘基為起始氨基酸)^[32]，也有專利CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791(以不含有信號肽的Glu-plg序列的Glu殘基為起始氨基酸)，本專利序列參考專利CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

本發明的「纖溶酶」與「纖維蛋白溶酶」、「纖維蛋白溶解酶」可互換使用，含義相同；「纖溶酶原」與「纖維蛋白溶酶原」、「纖維蛋白溶解酶原」可互換使用，含義相同。

本發明的「新鮮血栓」和「急性血栓」可以互換使用；「陳舊血栓」和「慢性血栓」可以互換使用。

在循環過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原激活劑(plasminogen activator，PA)的介導下， 其轉變為呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。已知多種能夠作為纖溶酶原激活劑的酶，包括：組織纖溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因數XII(哈格曼因數)等。

「纖溶酶原活性片段」指在纖溶酶原蛋白中，能夠與底物中的靶序列結合並發揮蛋白水解功能的活性片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。本發明所述的纖溶酶原活性片段為包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶域的蛋白質，較佳，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列的蛋白質。因此，本發明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、並且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。

目前，對於血液中纖溶酶原及其活性測定的方法包括：對組織纖溶酶原激活劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖溶酶原激活劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg)、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物抗原的檢測、血漿纖溶酶-抗纖溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法為發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外也可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖溶酶原活性進行測定。

「直系同源物或直系同系物(ortholog)」指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。

「保守取代變體」是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性(如酸性、鹼性、疏水性，等)的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是眾所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸、蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN演算法的70%至99%的相似度(同一性)。「保守取代變體」還包括通過BLAST或FASTA演算法確定具有60%以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達75%以上更好，最好能達85%以上，甚至達90%以上為最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。

「分離的」纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例如超過99%(按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原也包括通過生物工程技術從重組細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。

術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。

關於參照多肽序列的「氨基酸序列同一性百分數(%)」定義為在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公眾可得到的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員能決定用於 比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何演算法。然而，為了本發明的目的，氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生的。

在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算：分數X/Y乘100

其中X是由序列比對程式ALIGN-2在該程式的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情況下，A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2電腦程式獲得的。

如本文中使用的，術語「治療」、「處理」和「消除」指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀，和/或部分或完全治癒疾病和/或其症狀，並且包括：(1)預防疾病在受試者體內發生，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷為具有疾病；(2)抑制疾病，即阻滯其形成；和(3)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退。

術語「個體」、「受試者」和「患者」在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠，小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。

「治療有效量」或「有效量」指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。「治療有效量」會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。

2. 本發明纖溶酶原的製備

纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，也可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中將序列的C末端氨基酸附接於不溶性支援物，接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284頁於The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield，等J.Am.Chem.Soc.,85：2149-2156(1963)；Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006 Mini Rev.Med Chem.6：3-10和Camarero JA等2005 Protein Pept Lett.12：723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複循環後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。

可以使用標準重組方法來生產本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啟動子(例如天然關聯的或異源的啟動子)、信號序列、增強子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啟動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水平表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於克隆主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物 種。在這些原核宿主中，也可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啟動子，諸如乳糖啟動子系統、色氨酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統，或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情況中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啟動並完成轉錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母也可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列等。典型的啟動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啟動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。

除微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)也可以用於表達並生成本發明的纖溶酶原(例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啟動子和增強子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，以及必需的加工資訊位元點，諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。

一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱、親和柱、柱層析、高效液相層析(HPLC)、凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除主題抗體以外的大分子，等等。

3. 藥物配製劑

可以通過將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體、賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980)) 混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。較佳凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作為參考。

本發明的配製劑也可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，較佳活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，抗高血壓的藥物、抗心律失常的藥物、治療糖尿病的藥物等。

本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或介面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。

本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15：167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利3773919,EP 58,481)、L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯 乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。

4. 給藥和劑量

可以通過不同方式，例如通過靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)、肌內、鼻內、表面或皮內施用或脊髓或腦投遞來實現本發明藥物組合物的施用。氣溶膠製劑如鼻噴霧製劑包含活性劑的純化的水性或其它溶液及防腐劑和等滲劑。將此類製劑調節至與鼻黏膜相容的pH和等滲狀態。

在一些情況中，可以以下方式修飾或配製本發明的纖溶酶原藥物組合物，從而提供其穿過血腦屏障的能力。可以通過各種腸內和胃腸外施用路徑，包括口服、靜脈內等對患有血栓和/或血栓相關疾病的個體施用此類纖溶酶原的組合物。

用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。

在一些實施方案中，本發明的纖溶酶原與促進穿過血腦屏障的藥劑配製在一起。在一些情況中，本發明的纖溶酶原直接或經接頭與促進穿過血腦屏障的載體分子、肽或蛋白質融合。在一些實施方案中，本發明的纖溶酶原與結合內源血腦屏障(BBB)受體的多肽融合。連接纖溶酶原與結合內源BBB 受體的多肽，促進穿過BBB。結合內源BBB受體的合適的多肽包括抗體，例如單克隆抗體，或其抗原結合片段，其特異性結合內源BBB受體。合適的內源BBB受體包括但不限於胰島素受在一些情況中，抗體是囊封於脂質體中的。體、轉鐵蛋白受體、脂蛋白受體、和胰島素樣生長因數受體。參見例如美國專利公開文本第2009/0156498號。

醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取決於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以為例如每天約0.0001至2000mg/kg，或約0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或50mg/kg體重或在1-50mg/kg的範圍，或至少1mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量也涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量也包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每週或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1~10mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要即時評估、定期評估血栓和血栓相關疾病的治療效果和安全性。

5. 治療效力和安全性評價

治療效力

對纖溶酶原的治療效力評價主要通過監測以下指標的來進行：

(1)治療1周後血栓溶解率。例如，可以通過導管注入造影劑，每日評估溶栓情況，對每一個血管區域進行評分，完全開放者為0分，部分閉塞者為1分，完全閉塞為2分。按照溶栓前總分減去溶栓後總分，除以溶栓前總分所得的比率劃分不同的溶栓等級，一級<50%，二級為50%~90%，三級為血栓完全溶解。

(2)6個月後血管通暢率，例如可通過內窺鏡、CT血管造影分析、彩色多普勒超聲等方法評估血管通暢率。通過治療後血管通暢率百分比與治療前是否有統計學顯著的提高來判斷治療有效性。

(3)6個月後血管閉塞和/或靜脈返流率。通過統計治療後血管閉塞和/或靜脈返流率的降低來判斷藥劑對於溶栓率的改善。

(4)其他評估指標；例如，血管腔內回聲改變、血管壁厚度對比、和2年後血栓後遺症發生率等。例如，血管壁厚度和腔內回聲可以通過灰階超聲進行評估，而髂、股靜脈血流和股靜脈瓣膜功能膜不全可以使病人採取站立姿勢用多普勒超聲進行評估。

安全性評估

對纖溶酶原藥物治療血栓後的安全性進行評估，所述評估主要包括監測治療後不良事件的發生率。一般將嚴重出血、栓塞、中風和死亡定為嚴重不良事件，而次要出血和其他輕微症狀的併發症定為次要不良事件。

對於安全性評估而言，最為常見的不良事件是出血，如顱內出血(又稱出血性中風，包括蛛膜下出血、硬膜下出血等)。本發明所述嚴重出血一般指顱內出血或出血嚴重程度足以導致死亡、手術、停止治療或需要輸血的出血事件，包括「大出血(major hemorrhage)事件」和「威脅生命的出血事件」。而次要出血是指導管鞘邊的出血、和/或改變溶血栓藥劑、抗凝劑或抗血小板藥物的劑量、或通過壓迫可以止住的出血。所述「大出血」、「大出血事件」具體是指血色素含量降低至少2.0g/L或輸血至少2單位的血液，或關鍵部位或器官中的症狀性出血。而比“大出血”嚴重程度更高的出血事件，即大出血事件的子類，稱為「威脅生命的出血事件」，包括致命性出血、症狀性顱內出血、血色素降低至少5.0g/L或需要輸血超過4單位的血液或需要心肌收縮劑或必需手術的出血。

此外，對於評估具有大出血事件風險因數的患者，視情況嚴重程度對其施用劑量進行微調並對其用藥後不良事件進行隨訪監測至少3個月，較佳為6個月及以上。所述大出血風險包括但不限於(1)年齡75歲及以上，(2)具有先前出血事件的病史，(3)具有降低的肌酸酐清除率，其小於80mL/分鐘或小於50mL/分鐘。

6. 製品或藥盒

本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含可用於治療血栓的本發明纖溶酶原。所述製品較佳包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子、小瓶、注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖溶酶原。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述血栓和血栓相關疾病。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水、林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液、稀釋劑、過濾物、針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

材料與方法：

體內實驗：

實驗動物

C57小鼠(6-8周齡)購自南方醫科大學實驗動物中心。購買的小鼠飼養在屏障環境動物房內。db/db小鼠購自南京生物醫藥研究所。

實驗設計及給藥方式

對照組和實驗組所有動物經手術方式游離頸動脈後，用含10%FeCl3的濾紙外敷5min進行單側頸動脈血栓造模，造模後1h內開始靜脈注射纖溶酶原，對照組靜脈注射等體積PBS來進行。3小時後取出相應頸靜脈血栓及對側靜脈附近的肌肉。將血栓及對側靜脈附近肌肉使用研磨器進行勻漿，離心後取上清，將上清利用BCA法檢測其總蛋白，酶聯免疫法檢測勻漿液中的纖溶酶原含量，計算出一定蛋白總量中的纖溶酶原含量。研究纖溶酶原體內溶栓的特異性。

此外，24-25周齡db/db小鼠作為對照組和實驗組動物，分別尾靜脈給予溶媒PBS或纖溶酶原。31天后摘眼球取血行D-二聚體檢測，取神經、肝、腎、心臟行纖維蛋白免疫組化染色，研究纖溶酶原體內溶栓效果。

血液D-二聚體分析

小鼠摘眼球取血，獲得血漿，按照D-二聚體試劑盒(武漢優爾生，中國)進行實驗操作，試驗完成後使用酶標儀(Biotek美國)在450nm處進行讀數，進行資料分析。

免疫組化分析

取神經、肝、腎、心臟，在10%中性福馬林固定24小時以上。固定後的組織經過乙醇梯度脫水，包埋在石蠟中，並進行石蠟切片，切片厚度5μm，切片脫蠟至水後水洗1次，然後用PAP筆圈出組織。以0.3%甲醇稀釋的雙氧水孵育15分鐘，水洗3次。10%與二抗同源的正常血清封閉10分鐘，吸走多餘血清。一抗室溫孵育30分鐘或4度過夜，TBS洗3次。HRP標記的二抗室溫孵育30分鐘，TBS洗3次。按DAB試劑盒(vector laboratories，Inc.,USA)顯色，蘇木素複染30秒，流水返藍5分鐘，然後TBS洗1次。梯度脫水透明並封片。用到的抗體有：標誌物抗體有Fibrin(ogen)(Abcam)。切片在光學顯微鏡(Olympus，BX43)下觀察。

體外溶血栓實驗設計：

取健康人血漿於ELISA 96孔板中，加入固定量的凝血酶(Sigma，美國)形成血栓，然後進行下面的不同實驗。加入固定量tPA、uPA(sigma，美國)和不同量的纖溶酶原，固定量的纖溶酶原和不同量的tPA、uPA、鏈激酶(sigma，美國)，對照組加入PBS。孵育不同時間至有血栓溶解，在酶標儀(Biotek，美國)上OD405的波長觀察記錄吸光值讀數和每次測量的時間。進行分析資料。

實施例1：20小時陳舊血栓在125ng tPA條件下，37℃溫育1小時，不同劑量纖溶酶原的溶栓效果

採集2隻SD大鼠全血至Eppeudorf(EP)管內，37℃溫育20h後棄上清，形成陳舊血栓^[33，34]。加入PBS反復清洗5-10次，直至所加PBS溶液變澄清。用吸水紙儘量吸乾血栓水分，然後將血栓平均分佈各個EP管內，稱量血栓重量，儘量使每管血栓重量一致。將血栓分為PBS空白對照組、125ng tPA對照組、20μg tPA對照組，0.2mg纖溶酶原組，1mg纖溶酶原組以及2mg纖溶酶 原組，每組3管。PBS空白對照組加入1mL PBS；125ng tPA對照組加入1mL PBS和125ng tPA；20μg tPA對照組加入1mL PBS和20μg tPA；0.2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和125ng tPA以及0.2mg纖溶酶原；1mg纖溶酶原組加入1mL PBS和125ng tPA以及1mg纖溶酶原；2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和125ng tPA以及2mg纖溶酶原。所有反應在37℃培養箱中進行，溫育1小時後吸去上清，吸水紙儘量吸乾血栓，並稱血栓的重量，計算溶栓率。

根據文獻報導，在正常生理情況下tPA的含量為5-10ng/mL^[35]，而當劇烈運動或靜脈淤血情況下，體內tPA的含量會增至20倍至100倍，即達到100ng/mL以上^[36]。因此，本實驗中使用的tPA劑量為125ng/mL以模仿體內血栓情況下自然產生的tPA含量。

結果顯示，對於體外20個小時形成的陳舊血栓，在125ng的tPA條件下，添加纖溶酶原0.2mg、1mg、2mg的溶栓率比單獨添加125ng tPA的溶栓率有明顯的升高，統計差異均極顯著，說明在體內出現血栓時自然產生的tPA水平的情況下，添加0.2mg或更多的纖溶酶原1小時可以顯著促進溶栓。在125ng tPA條件下，添加纖溶酶原1mg就可以達到體內注射劑量20μg tPA(根據Boehringer Ingelheim公司生產的注射用阿普替酶說明書在體內血栓情況下溶栓需使用的劑量換算成的大鼠所需注射劑量)相同的溶栓效果。即達到同樣的溶栓率，如果體內存在1mg纖溶酶原，所需tPA量可以減少到原有的1/160。此外，在125ng tPA條件下，添加纖溶酶原1mg達到了纖溶酶原溶栓的峰值，再添加多1倍的纖溶酶原其溶栓率有下降趨勢，說明纖溶酶原的添加存在飽和度，飽和度在1到2mg左右(圖1)。

實施例2：20小時陳舊血栓在125ng tPA條件下，37℃溫育2小時，不同劑量纖溶酶原的溶栓效果

採集2隻SD大鼠全血至EP管內，37℃溫育20h後棄上清，形成陳舊血栓^[33，34]。加入PBS反復清洗5-10次，直至所加PBS溶液變澄清。用吸水紙儘量吸乾血栓水分，然後將血栓平均分佈各個EP管內，稱量血栓重量，儘量使每管血栓重量一致。將血栓分為PBS空白對照組、125ng tPA對照組、20μg tPA對照組，0.2mg纖溶酶原組，1mg纖溶酶原組以及2mg纖溶酶原組，每組3管。PBS空白對照組開始時加入1mL PBS；125ng tPA對照組加入1mLPBS和125ng tPA；20μg tPA對照組加入1mL PBS和20μg tPA；0.2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和125ng tPA以及0.2mg纖溶酶原；1mg纖溶酶原組加入1mL PBS和125ng tPA以及1mg纖溶酶原；2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和125ng tPA以及2mg纖溶酶原。所有反應在37℃培養箱中進行，溫育2小時後，吸去上清，吸水紙儘量吸乾血栓，並稱血栓的重量，計算溶栓率。

根據文獻報導，在正常生理情況下tPA的含量為5-10ng/mL^[35]，而當劇烈運動，或靜脈淤血情況下，體內tPA的含量會增至20倍至100倍，即達到100ng/mL以上^[36]。因此，本實驗中使用的tPA劑量為125ng/mL以模仿體內血栓情況下自然產生的tPA含量。

結果顯示，對於在體外20個小時形成的陳舊血栓，與實施例1相比，每組隨著反應時間的延長，溶栓率也相應增加。在125ng的tPA條件下，添加纖溶酶原0.2mg、1mg、2mg的溶栓率比單獨添加125ng tPA的溶栓率有明顯的升高，統計差異均極顯著。說明在體內出現血栓時自然產生的tPA劑量的情況下，添加0.2mg或更多的纖溶酶原2小時可以顯著促進溶栓。在反應2小時後，1mg、2mg纖溶酶原組的溶栓效果要優於體內正常注射劑量20μg tPA對照組(根據Boehringer Ingelheim公司生產的注射用阿普替酶說明書在體內血栓情況下溶栓需使用的劑量換算成的大鼠所需注射劑量)，即達到同樣的溶栓率，如果體系記憶體在1mg纖溶酶原，所需tPA量可以減少到體系內沒有1mg纖溶酶原時所需tPA量(20μg)的不到1/160(圖2)。

實施例3：20小時陳舊血栓在10ng tPA條件下溶栓率隨著纖溶酶原劑量增加而升高

採集2隻SD大鼠全血至EP管內，37℃溫育20h後棄上清，形成陳舊血栓^[33，34]。加入PBS反復清洗5-10次，直至所加PBS溶液變澄清。用吸水紙儘量吸乾血栓水分，然後將血栓平均分佈各個EP管內，稱量血栓重量，儘量使每管血栓重量一致。將血栓分為PBS空白對照組、10ng tPA對照組、0.2mg纖溶酶原對照組，0.2mg纖溶酶原組，1mg纖溶酶原組以及2mg纖溶酶原組，每組3管。PBS空白對照組開始時加入1mL PBS；10ng tPA對照組加入1mL PBS和10ng tPA；0.2mg纖溶酶原對照組加入1mL PBS和0.2mg纖溶酶原；0.2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和10ng tPA以及0.2mg纖溶酶原；1mg纖溶酶原組加入 1mL PBS和10ng tPA以及1mg纖溶酶原；2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和10ng tPA以及2mg纖溶酶原。所有反應在37℃培養箱中進行，溫育2小時後，吸去上清，吸水紙儘量吸乾血栓，並稱血栓的重量，計算溶栓率。

根據文獻報導，在正常生理情況下tPA的含量為5-10ng/mL^[35]，因此，本實驗中使用的tPA劑量為10ng/mL以模仿體內正常生理情況下自然產生的tPA含量。

結果顯示，對於在體外20個小時形成的陳舊血栓，在體內正常生理情況下自然產生的tPA含量(10ng)的條件下，添加纖溶酶原的各組溶栓率均高於只添加體內生理劑量tPA的對照組的溶栓率，統計差異均極顯著。而且隨著纖溶酶原添加劑量的增加，相應的溶栓率也呈梯度升高趨勢，說明了可以通過調節纖溶酶原的劑量調節溶解20小時血栓的速度。此外，在0.2mg纖溶酶原存在的情況下，添加體內生理水平的tPA(10ng)的組的溶栓效率要極顯著地高於不添加tPA的組，而只添加0.2mg的纖溶酶原的溶栓效果與添加對照PBS的溶栓效果類似，說明生理水平的tPA對於纖溶酶原發揮溶栓作用起到關鍵作用(圖3)。

實施例4：72小時陳舊血栓在125ng tPA條件下溶栓率隨著纖溶酶原劑量增加而升高

採集2隻SD大鼠全血至EP管內，37℃溫育72小時後棄上清，形成陳舊血栓^[36]。加入PBS反復清洗5-10次，直至所加PBS溶液變澄清。用吸水紙儘量吸乾血栓水分，然後將血栓平均分佈各個EP管內，稱量血栓重量，儘量使每管血栓重量一致。將血栓分為PBS空白對照組、125ng tPA對照組、0.2mg纖溶酶原對照組，0.2mg纖溶酶原組，1mg纖溶酶原組以及2mg纖溶酶原組，每組3管。PBS空白對照組開始時加入1mL PBS；125ng tPA對照組加入1mL PBS和125ng tPA；0.2mg Plg對照組加入1mLPBS和0.2mg Plg；0.2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和125ng tPA以及0.2mg纖溶酶原；1mg纖溶酶原組加入1mL PBS和125ng tPA以及1mg纖溶酶原；2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和125ng tPA以及2mg纖溶酶原。所有反應在37℃培養箱中進行，溫育2小時後，吸去上清，吸水紙儘量吸乾血栓，並稱血栓的重量，計算溶栓率。

根據文獻報導，在正常生理情況下tPA的含量為5-10ng/mL^[35]，而當劇烈運動，或靜脈淤血情況下，體內tPA的含量會增至20倍至100倍，即達到100ng/ml以上^[36]。因此，本實驗中使用的tPA劑量為125ng/ml以模仿體內血栓情況下自然產生的tPA含量。

結果顯示，對於體外72個小時形成的陳舊血栓，在125ng tPA條件下，添加纖溶酶原的溶栓率要高於單獨添加125ng tPA的溶栓率，且差異極顯著，說明在體內出現血栓時自然產生的tPA劑量(125ng)的情況下，添加0.2mg或更多的纖溶酶原2小時可以顯著促進溶解72小時的陳舊血栓。而且隨著添加纖溶酶原劑量梯度的增加，其溶栓率也呈梯度遞增趨勢，說明了可以通過調節纖溶酶原的劑量調節溶解陳舊血栓的速度。此外，添加纖溶酶原4mg的溶栓率在本次實驗中超過了體內正常注射劑量20μg tPA(根據Boehringer Ingelheim公司生產的注射用阿普替酶說明書在體內血栓情況下溶栓需使用的劑量換算成的大鼠所需注射劑量)的溶栓率，說明在體內出現血栓時自然產生的tPA劑量(125ng)的情況下，只添加纖溶酶原溶解陳舊血栓的效果優於現有溶栓藥物的效果(圖4)，表明纖溶酶原可以成為溶栓效果更優的溶栓物質。

此外，在實施例2中，相較於對照PBS組，單獨添加125ng的tPA能顯著增加溶解20小時血栓的能力。但是，在本實施例中，對於72小時的陳舊血栓，與體內情況類似，單獨添加125ng的tPA組與對照PBS組的溶栓效果幾乎相同，說明隨著血栓逐漸陳舊，生理情況下自然產生的tPA的溶栓能力逐步下降，從側面說明了實施例使用的模型能夠一定程度模仿體內情況。

實施例5：72小時陳舊血栓在10ng tPA條件下溶栓率隨著纖溶酶原劑量增加而升高

採集2隻SD大鼠全血至EP管內，37℃溫育72h後棄上清，形成陳舊血栓^[36]。加入PBS反復清洗5-10次，直至所加PBS溶液變澄清。用吸水紙儘量吸乾血栓水分，然後將血栓平均分佈各個EP管內，稱量血栓重量，儘量使每管血栓重量一致。將血栓分為PBS空白對照組、10ng tPA對照組、20μg tPA對照組，0.2mg纖溶酶原對照組，0.2mg纖溶酶原組，1mg纖溶酶原組，2mg纖溶酶原組以及4mg纖溶酶原組，每組3管。PBS空白對照組加入1mL PBS；10ng tPA對照組加入1mL PBS和10ng tPA；20μg tPA對照組加入1mL PBS和20μg tPA；0.2mg Plg對照組加入1mL PBS和0.2mg Plg；0.2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和10ng tPA以及0.2mg纖溶酶原；1mg纖溶酶原組加入1mL PBS和10ng tPA以及1mg纖溶酶原；2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和10ng tPA以及2mg纖溶酶原；4mg纖溶酶原組加入1mL PBS和10ng tPA以及4mg纖溶酶原。所有反應在37℃培養箱中進行，反應2小時，吸去上清，吸水紙儘量吸乾血栓，並稱血栓的重量，計算溶栓率。

根據文獻報導，在正常生理情況下tPA的含量為5-10ng/mL^[35]，因此，本實驗中使用的tPA劑量為10ng/mL以模仿體內正常生理情況下自然產生的tPA含量。

此實驗結果表明，對於在體外72個小時形成的陳舊血栓，在體內正常生理tPA含量10ng/mL的條件下，添加纖溶酶原的溶栓率要高於單獨添加10ng tPA的溶栓率，且差異極顯著。說明在體內出現血栓時自然產生的tPA劑量(10ng)的情況下，添加0.2mg或更多的纖溶酶原2小時可以顯著促進溶解72小時的陳舊血栓。並且隨著添加纖溶酶原劑量的增加，其溶栓率也呈梯度增加，說明了可以通過調節纖溶酶原的劑量調節溶解陳舊血栓的速度。而且添加4mg纖溶酶原組的溶栓率接近正常tPA注射劑量(根據Boehringer Ingelheim公司生產的注射用阿普替酶說明書在體內血栓情況下溶栓需使用的劑量換算成的大鼠所需注射劑量)的溶栓率(圖5)，說明在生理水平的tPA劑量(10ng)的情況下，只添加纖溶酶原後其溶解陳舊血栓的效果就可以達到現有溶栓藥物的效果，在這個意義上，纖溶酶原有希望成為一種新的陳舊血栓溶解藥物。

實施例6：纖溶酶原溫和溶解20小時陳舊血栓

採集2隻SD大鼠全血至EP管內，37℃溫育20h後棄上清，形成陳舊血栓^[33，34]。加入PBS反復清洗5-10次，直至所加PBS溶液變澄清。用吸水紙儘量吸乾血栓水分，然後將血栓平均分佈各個EP管內，稱量血栓重量，儘量使每管血栓重量一致。將血栓分為兩組，每組12個樣品。第一組為tPA對照組，加入1mL PBS及5μg tPA；第二組為纖溶酶原組，加入1mL PBS、10ng tPA及1mg纖溶酶原。預實驗證明，這兩組對於20小時陳舊血栓在2小時內的溶解率類似(資料未顯示)。所有反應在37℃培養箱中進行，分別在第0.5h、1h、1.5h、2h 取樣，每個時間點兩組分別取三個樣品，吸去上清，吸水紙儘量吸乾血栓，並稱血栓的重量，計算溶栓率。

根據文獻報導，在正常生理情況下tPA的含量為5-10ng/mL^[35]，因此，本實驗中使用的tPA劑量為10ng/mL以模仿體內正常生理情況下自然產生的tPA含量。

實驗顯示，對於20小時陳舊血栓，兩組總溶栓率隨著時間的延長而升高，但在0到0.5小時和0.5到1小時兩個區間，纖溶酶原組的溶栓曲線斜率均低於tPA組(圖6)。表1顯示10ng tPA存在條件下，1mg纖溶酶原溶栓效率與單獨5ug tPA的溶栓效率隨時間變化的對比。如表1所示，纖溶酶原組2小時的總溶栓率的75%集中在約1小時內，而tPA對照組2小時總溶栓率的75%集中在約0.5小時。這些資料清楚地說明，相對於tPA，纖溶酶原的溶栓速度相對於tPA的溶栓速度更為溫和(圖6，表1)。

實施例7：在100ng uPA條件下，纖溶酶原促進20小時陳舊血栓溶解

採集2隻SD大鼠全血至EP管內，37℃溫育20h後棄上清，形成陳舊血栓^[33，34]。加入PBS反復清洗5-10次，直至所加PBS溶液變澄清。用吸水紙儘量吸乾血栓水分，然後將血栓平均分佈各個EP管內，稱量血栓重量，儘量 使每管血栓重量一致。將血栓分為PBS空白對照組、100ng uPA對照組、0.2mg纖溶酶原對照組，0.2mg纖溶酶原組，1mg纖溶酶原組以及2mg纖溶酶原組，每組3管。PBS空白對照組開始時加入1mL PBS；100ng uPA對照組加入1mL PBS和100ng uPA；0.2mg纖溶酶原對照組加入1mLPBS和0.2mg纖溶酶原；0.2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和100ng uPA以及0.2mg纖溶酶原；1mg纖溶酶原組加入1mL PBS和100ng uPA以及1mg纖溶酶原；2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和100ng uPA以及2mg纖溶酶原。所有反應在37℃培養箱中進行，溫育1小時後，吸去上清，吸水紙儘量吸乾血栓，並稱血栓的重量，計算溶栓率。

根據文獻報導，在以纖溶酶原為底物的酶促反應過程中tPA米氏常數為0.18×10-7mol/L^[37]，而uPA的米氏常數為2.43×10-7mol/L^[38]，也就是說，在相同的反應條件，相同的反應時間內tPA的親和力約為uPA的10倍，所以本次實驗中，根據實施例3使用的10ng tPA/ml估算出uPA的使用劑量為100ng/ml。

結果顯示，對於在體外20個小時形成的陳舊血栓，在改變纖溶酶原激活劑10ng tPA為100ng uPA後，添加纖溶酶原0.2mg、1mg、2mg各組的溶栓率比單獨添加100ng uPA的溶栓率有明顯的升高，統計差異均極顯著(**P<0.01；***P<0.001)。說明在100ng的uPA劑量的情況下，添加0.2mg或更多的纖溶酶原1小時可以顯著促進溶栓，並且隨著纖溶酶原添加劑量梯度的增加，其溶栓率也顯著升高(圖7)。說明100ng uPA條件下，纖溶酶原能夠促進陳舊血栓溶解。

實施例8：在1ng uPA條件下，纖溶酶原促進20小時陳舊血栓溶解

採集2隻SD大鼠全血至EP管內，37℃溫育20h後棄上清，形成陳舊血栓^[33，34]。加入PBS反復清洗5-10次，直至所加PBS溶液變澄清。用吸水紙儘量吸乾血栓水分，然後將血栓平均分佈各個EP管內，稱量血栓重量，儘量使每管血栓重量一致。將血栓分為PBS空白對照組、1ng uPA對照組、0.2mg Plg對照組，0.2mg纖溶酶原組，1mg纖溶酶原組以及2mg纖溶酶原組，每組3管。PBS空白對照組加入1mL PBS；1ng uPA對照組加入1mL PBS和1ng uPA；0.2mg Plg對照組加入1mL PBS和0.2mg Plg；0.2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和1ng uPA以及0.2mg纖溶酶原；1mg纖溶酶原組加入1mL PBS和1ng uPA以及1mg纖 溶酶原；2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和1ng uPA以及2mg纖溶酶原。所有反應在37℃培養箱中進行，溫育2小時後，吸去上清，吸水紙儘量吸乾血栓，並稱血栓的重量，計算溶栓率。

根據文獻報導，在正常生理情況下uPA的含量為1ng/mL^[35]，因此，本實驗中使用的uPA劑量為1ng/mL以模仿體內正常生理情況下自然產生的uPA含量。

結果顯示，對於在體外20個小時形成的陳舊血栓，在把uPA的使用量降為體內正常含量1ng時，陳舊血栓的溶栓率的溶栓總體較為緩慢。但1mg和2mg的纖溶酶原組溶栓率顯著高於1ng uPA對照組，具有統計差異。說明1ng uPA條件下，添加纖溶酶原對於陳舊血栓的溶解有顯著的促進作用(圖8)。

實施例9：小鼠靜脈注射tPA及纖溶酶原後再出血實驗

選擇11周齡C57野生型雄性小鼠55隻，使用3%戊巴比妥進行全身麻醉，分別剪尾3mm，將尾巴置於37℃溫水中，觀察尾巴出血狀況^[39]。止血後隨機分成兩組，tPA組5隻，纖溶酶原組50隻。tPA組眼眶靜脈注射tPA 400μg/0.05mL/隻；纖溶酶原組眼眶靜脈注射1mg/0.05mL/隻纖溶酶原，實驗過程中始終將小鼠尾靜脈放置於37℃溫水中，觀察實驗出血狀況20分鐘，並記錄。

實驗結果顯示，靜脈注射400μg tPA能夠致使受傷小鼠原已凝結的尾部傷口發生再出血現象，此為tPA藥物的一個普遍的副作用。但靜脈注射1mg纖溶酶原的小鼠沒有此種副作用出現(表2)，說明纖溶酶原相較於tPA的安全性更好。

實施例10：纖溶酶原對體內血栓的特異性吸附實驗

選擇野生型雄性小鼠9隻，隨機分為3組，溶媒PBS對照組、0.2mg纖溶酶原組和1mg纖溶酶原組，每組3隻。使用3%戊巴比妥進行全身麻醉，將 小鼠頸靜脈分離，用浸有10%的FeCl3溶液的吸水紙(3mm×5mm)敷於頸靜脈5分鐘形成靜脈血栓。形成血栓後立即開始給予纖溶酶原或溶媒PBS。溶媒PBS對照組尾靜脈注射100ul的PBS，1mg纖溶酶原組和0.2mg纖溶酶原組分別尾靜脈注射給予1mg、0.2mg纖溶酶原。3小時後取出相應頸靜脈血栓及對側靜脈附近的肌肉。將血栓及對側靜脈附近肌肉使用研磨器進行勻漿，離心後取上清，將上清利用BCA法檢測其總蛋白，酶聯免疫法檢測勻漿液中的纖溶酶原含量，計算出一定蛋白總量中的纖溶酶原含量。

結果顯示，血栓形成後血栓中纖溶酶原的含量均明顯高於肌肉中的纖溶酶原含量。而且靜脈注射纖溶酶原後血栓中纖溶酶原的含量進一步增加。這些結果說明在體內血栓的存在下，纖溶酶原能夠特異性地結合到血栓上(圖9)並進一步發揮溶血栓作用，而tPA一旦注射進入血管，就會非特異性地在血管內催化溶栓反應。該實驗結果說明纖溶酶原相較於tPA有顯著的特異性溶栓優點。

實施例11：30分鐘的新鮮血栓在添加纖溶酶原後的溶栓率顯著升高

採集2隻SD大鼠全血至EP管內，37℃溫育30分鐘後，棄上清，形成新鮮血栓^[33]。加入PBS反復清洗5-10次，直至所加PBS溶液變澄清。用吸水紙儘量吸乾血栓水分，然後將血栓平均分佈各個EP管內，稱量血栓重量，儘量使每管血栓重量一致。將血栓分為PBS空白對照組、125ng tPA對照組、0.2mg纖溶酶原組，1mg纖溶酶原組以及2mg纖溶酶原組，每組2管。PBS空白對照組加入1mL PBS；tPA對照組加入1mL PBS和125ng tPA；0.2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和125ng tPA以及0.2mg纖溶酶原；1mg纖溶酶原組加入1mL PBS和125ng tPA以及1mg纖溶酶原；2mg纖溶酶原組加入1mL PBS和125ng tPA以及2mg纖溶酶原。所有反應在37℃培養箱中進行，溫育2小時後，吸去上清，吸水紙儘量吸乾血栓，並稱血栓的重量，計算溶栓率。

根據文獻報導，在正常生理情況下tPA的含量為5-10ng/mL^[35]，而當劇烈運動，或靜脈淤血情況下，體內tPA的含量會增至20倍至100倍，即達到100ng/mL以上^[36]。因此，本實驗中使用的tPA劑量為125ng/mL以模仿體內血栓情況下自然產生的tPA含量。

此實驗說明對於在體外30分鐘形成的新鮮血栓，在梯度增加纖溶酶原使用劑量的條件下，溶栓率呈梯度升高趨勢，並且纖溶酶原各組溶栓率均高於單獨添加tPA對照組的溶栓率，統計差異極其顯著。這些結果說明在體內出現血栓時自然產生的tPA水平的情況下，添加0.2mg或更多的纖溶酶原1小時可以顯著促進溶栓(圖10)，說明纖溶酶原不僅能夠促進溶解陳舊血栓，也能夠促進溶解新鮮血栓。

實施例12：纖溶酶原促進糖尿病造成的微血栓的溶解

24-25周齡db/db雄鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥15天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第16天摘眼球取血，全血靜置後血清用於檢測血液中D-二聚體含量。

結果顯示，給藥15天後，給纖溶酶原組血清中D-二聚體含量顯著上升(圖11)，說明給纖溶酶原後，由於糖尿病造成的微血栓顯著溶解。

實施例13：纖溶酶原促進糖尿病晚期小鼠心臟組織血栓溶解

24-25周齡db/db雄鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第32天處死小鼠並取心臟在10%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的心臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次，以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。10%的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封閉1小時；之後棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠纖維蛋白(原)抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下400倍下觀察。

纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，在組織存在損傷的情況下，作為機體對損傷的一種應激反應，纖維蛋白原水解成纖維蛋白^[40-42]，因此可將纖維蛋白水平作為損傷程度的一個標誌。纖維蛋白也是組織損傷後形成血栓的主要成分，因此，也可將纖維蛋白水平作為血栓的一個標誌。

結果顯示，與給溶媒PBS對照組(圖12A)相比，給纖溶酶原組(圖12B)的小鼠心臟組織纖維蛋白陽性著色較淺，說明給纖溶酶原組心臟組織沉積的纖維蛋白減少，反映纖溶酶原能夠促進糖尿病所致心臟組織損傷修復，也說明纖溶酶原能夠促進心臟組織血栓的溶解。

實施例14：纖溶酶原促進糖尿病後期小鼠腎臟組織血栓溶解

24-25周齡db/db雄鼠20隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各10隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第32天處死小鼠並取腎臟在10%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的腎臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。10%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠纖維蛋白(原)抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，在組織存在損傷的情況下，作為機體對損傷的一種應激反應，纖維蛋白原水解成纖維蛋白^[40-42]，因此可將纖維蛋白水平作為損傷程度的一個標誌。纖維蛋白也是組織損傷後形成血栓的主要成分，因此，也可將纖維蛋白水平作為血栓的一個標誌。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖13B)比給溶媒PBS對照組(圖13A)纖維蛋白原陽性著色淺。說明注射纖溶酶原能夠顯著降低糖尿病小鼠腎臟纖維 蛋白沉積，反映出纖溶酶原對糖尿病小鼠腎臟損傷有顯著的修復作用，也說明纖溶酶原能夠促進腎臟組織血栓的溶解。

實施例15：纖溶酶原促進糖尿病晚期肝組織血栓溶解

24-25周齡db/db雄鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第32天處死小鼠並取肝臟組織在10%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的肝臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。10%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠纖維蛋白(原)抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，在組織存在損傷的情況下，作為機體對損傷的一種應激反應，纖維蛋白原水解成纖維蛋白^[40-42]，因此可將纖維蛋白水平作為損傷程度的一個標誌。纖維蛋白也是組織損傷後形成血栓的主要成分，因此，也可將纖維蛋白水平作為血栓的一個標誌。

研究發現，與給溶媒PBS對照組(圖14A)相比，給纖溶酶原組(圖14B)的小鼠其肝臟組織纖維蛋白陽性著色淺，說明注射纖溶酶原能夠顯著降低糖尿病小鼠肝臟纖維蛋白沉積，反映出纖溶酶原對糖尿病小鼠肝臟損傷有顯著修復作用，也說明纖溶酶原能夠促進肝臟組織血栓的溶解。

實施例16：纖溶酶原促進糖尿病後期神經損傷小鼠神經組織血栓溶解

24-25周齡db/db雄鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥15天。給纖溶酶原組小鼠按 2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第16天處死小鼠並取坐骨神經在10%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的坐骨神經經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次，然後用PAP筆圈出組織。以3%TBS稀釋的雙氧水孵育15分鐘，水洗3次。10%正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時，吸走多餘血清。兔抗小鼠纖維蛋白(原)抗體(Abcam)室溫孵育1小時或4℃孵育過夜，TBS洗3次。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，TBS洗3次。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下400倍下觀察。

纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，在組織存在損傷的情況下，作為機體對損傷的一種應激反應，纖維蛋白原水解成纖維蛋白^[40-42]，因此可將纖維蛋白水平作為損傷程度的一個標誌。纖維蛋白也是組織損傷後形成血栓的主要成分，因此，也可將纖維蛋白水平作為血栓的一個標誌。

研究發現，與給溶媒PBS對照組(圖15A)相比，給纖溶酶原組(圖15B)的小鼠其坐骨神經纖維蛋白的水平降低，說明纖溶酶原具有降解纖維蛋白水平的功能，損傷得到一定程度的修復，也說明纖溶酶原能夠促進神經組織周圍血栓的溶解。

實驗結果總結：

本發明實施例實驗包括纖溶酶原體外溶栓和體內溶栓兩部分。

體外溶栓模擬體內溶栓條件，選取10ng/mL tPA模仿正常生理情況下體內自然產生的tPA量，125ng/mL tPA模仿體內血栓情況下自然產生的tPA量，來研究纖溶酶原的溶栓能力。

本發明實驗研究顯示，10ng/mL tPA或125ng/mL tPA條件下，無論是20小時的陳舊血栓還是72小時的陳舊血栓，纖溶酶原都具有非常好的溶栓效果，並且隨著纖溶酶原劑量的增大溶栓效率隨之增大。

纖溶酶原對新鮮血栓具有很強的溶解能力，溫育兩小時溶栓率可達到80%以上。

我們也研究了uPA存在條件下纖溶酶原溶栓效果。1ng/mL uPA或100ng/mL uPA條件下，纖溶酶原同樣都具有非常好的溶栓效果，並且隨著纖溶酶原劑量的增加溶栓效率隨之增大。

體內實驗中，糖尿病後期小鼠連續15天每天給予2mg纖溶酶原，血清中D-二聚體的含量顯著增加。同時，心臟、肝臟、腎臟、神經組織纖維蛋白水平顯著下降，說明纖溶酶原能明顯促進這些組織中由糖尿病組織損傷引發的血栓的溶解，纖維蛋白降解，證明給藥實驗動物纖溶酶原同樣可以達到顯著的溶栓效果。

小鼠頸靜脈血栓模型實驗顯示，纖溶酶原能夠非常特異地結合體內血栓。

此外，我們研究顯示與tPA相比纖溶酶原對血栓的溶解更加溫和，並且小鼠的tail-bleeding實驗表明纖溶酶原沒有出血副作用。

綜上所述，纖溶酶原具有非常好的溶栓能力，特別是針對陳舊血栓，並且具有特異性高、溫和、見效快以及無出血副作用的特點。

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<110> 深圳瑞健生命科學研究院有限公司

<120> 一種用於預防或治療急性及慢性血栓的方法

<130> FCW0287TW

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG,Glu-纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 2433

<212> DNA

<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的核酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 810

<212> PRT

<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的氨基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 2145

<212> DNA

<213> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)核酸序列

<400> 5

<210> 6

<211> 714

<212> PRT

<213> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)氨基酸序列

<400> 6

<210> 7

<211> 1245

<212> DNA

<213> delta-plg(delta-纖溶酶原)核酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 414

<212> PRT

<213> delta-plg(delta-纖溶酶原)氨基酸序列

<400> 8

<210> 9

<211> 1104

<212> DNA

<213> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 9

<210> 10

<211> 367

<212> PRT

<213> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 10

<210> 11

<211> 750

<212> DNA

<213> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 11

<210> 12

<211> 249

<212> PRT

<213> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 12

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的核酸序列

<400> 13

<210> 14

<211> 228

<212> PRT

<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的氨基酸序列

<400> 14

Claims (10)

1. 一種纖溶酶原在製備預防和/或消除受試者動、靜脈血栓藥物的用途。
2. 根據申請專利範圍第1項所述的用途，其中所述血栓包括新鮮血栓和陳舊血栓。
3. 根據申請專利範圍第1項或第2項所述的用途，其中所述血栓為血液系統疾病、循環系統疾病、自身免疫疾病、代謝紊亂疾病或感染性疾病導致的血栓。
4. 根據申請專利範圍第1項或第2項所述的用途，其中所述血栓為繼發於糖尿病的大、小血管、微血管血栓。
5. 根據申請專利範圍第1項或第2項所述的用途，其中所述血栓為大小血管病變導致的血栓。
6. 一種纖溶酶原在製備預防和/或治療受試者血栓相關疾病藥物的用途，其中所述纖溶酶原通過消除血栓預防和/或治療受試者所述血栓相關疾病。
7. 根據申請專利範圍第6項所述的用途，其中所述血栓相關疾病為門靜脈血栓導致的胰腺炎、肝硬化；腎靜脈血栓導致的腎栓塞；頸內靜脈血栓引起的全身性敗血症、肺栓塞、腦血栓、深靜脈血栓；動脈和靜脈血栓導致的器官的梗死，包括但不限於：腦梗塞、心肌梗死、血栓性中風、房顫、不穩定性心絞痛、頑固性心絞痛、短暫性腦缺血發作、肺栓塞。
8. 根據申請專利範圍第6項所述的用途，其中所述血栓相關疾病為糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、糖尿病性肝病、糖尿病性心臟病、糖尿病性腸病、糖尿病性神經病變。
9. 根據申請專利範圍第1-2、6-8項中任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原可與伴隨血栓形成的其它疾病的治療藥物聯合施用。
10. 根據申請專利範圍第1-2、6-8項中任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原為序列2和與序列2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的蛋白質，並且仍然具有纖溶酶原活性。