ES2968254T3 - Plasminógeno para su uso en la prevención o el tratamiento de la trombosis aguda y la trombosis crónica - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Plasminógeno para su uso en la prevención o el tratamiento de la trombosis aguda y la trombosis crónica

Campo de la invención

La invención se refiere a una composición para su uso en el tratamiento de la trombosis mediante el uso de plasminógeno. El plasminógeno puede disolver específicamente los trombos sin provocar efectos secundarios tales como sangrado. El fármaco de la presente invención también tiene las ventajas de poder disolver trombos nuevos y viejos y de tener un periodo de semivida prolongado y una fuerza trombolítica controlable. Por tanto, el plasminógeno puede convertirse en una nueva estrategia para disolver trombosin vivo.

Antecedentes de la invención

La formación y el daño del trombo

Trombo se refiere a coágulos de sangre que se forman de manera anómala a partir de elementos de la sangre circulante o depósitos de sangre que se producen en la pared interna del corazón o en la pared de los vasos sanguíneos. Comprende infarto de miocardio, embolia cerebral, trombosis/tromboembolia pulmonar, trombosis venosa profunda, embolia vascular periférica, etc. Es una enfermedad que daña gravemente la salud humana. Sus tasas de morbilidad, discapacidad y mortalidad son altas. Según las estadísticas de la Organización Mundial de la Salud, el número de personas que mueren por tromboembolia en el mundo es de aproximadamente 26 millones cada año, cifra muy superior a la de otras causas de muerte, convirtiéndose en el enemigo número uno de la salud humana [1].

La plasmina es un componente clave del sistema de activación del plasminógeno (sistema de PA). Es una proteasa de amplio espectro que puede hidrolizar varios componentes de la matriz extracelular (MEC), incluyendo fibrina, gelatina, fibronectina, laminina y proteoglicanos [2]. Además, la plasmina puede activar algunas prometaloproteinasas (pro-MMP) para formar metaloproteinasas activas (MMP). Por tanto, se considera que la plasmina es un importante regulador de la proteólisis extracelular [3, 4]. La plasmina se forma por proteólisis del plasminógeno mediante dos PA fisiológicos: el activador tisular del plasminógeno (tPA) o el activador del plasminógeno urocinasa (uPA). Debido al nivel relativamente alto de plasminógeno en el plasma y otros líquidos corporales, tradicionalmente se cree que la regulación del sistema de PA se logra principalmente a través de la síntesis y el nivel de actividad de PA. La síntesis de los componentes del sistema de PA está estrictamente regulada por diferentes factores tales como hormonas, factores de crecimiento y citocinas. Además, también existen inhibidores fisiológicos específicos de la plasmina y de PA. El principal inhibidor de la plasmina es la a2-antiplasmina. Existen receptores de superficie celular específicos de uPA (uPAR) que tienen actividad hidrolítica directa en determinadas superficies celulares [5, 6].

El plasminógeno (plg) es una glicoproteína de cadena sencilla con un peso molecular de aproximadamente 92 kDa [7, 8]. El plasminógeno se sintetiza principalmente en el hígado y está presente en abundancia en el líquido extracelular. La concentración de plasminógeno en plasma es de aproximadamente 2 pM. Por tanto, el plasminógeno es una enorme fuente potencial de actividad proteolítica en tejidos y líquidos corporales [9, 10]. Hay dos formas moleculares de plasminógeno: glutamato-plasminógeno (Glu-plasminógeno) y lisina-plasminógeno (Lysplasminógeno). Las formas naturales secretadas y no escindidas de plasminógeno tienen un ácido glutámico aminoterminal (N-terminal) y, por tanto, se denominan Glu-plasminógeno. Sin embargo, en presencia de plasmina, el Gluplasminógeno se hidroliza en Lys76-Lys77 para convertirse en Lys-plasminógeno. En comparación con el Gluplasminógeno, el Lys-plasminógeno tiene una mayor afinidad por la fibrina y puede ser activado por PA a una tasa mayor. El enlace peptídico Arg560-Val561 de estas dos formas de plasminógeno puede ser escindido por uPA o tPA, lo que conduce a la formación de plasmina proteasa de cadena doble unida por puentes disulfuro [11]. La porción amino terminal del plasminógeno contiene cinco anillos tricíclicos homólogos, los denominados kringles, y la porción carboxilo terminal contiene un dominio de proteasa. Algunos kringles contienen sitios de unión a lisina que median la interacción específica del plasminógeno con la fibrina y su inhibidor a2-AP. Un fragmento de plasminógeno de 38 kDa descubierto recientemente, que incluye kringle 1-4, es un inhibidor eficaz de la angiogénesis. Este fragmento se denomina angiostatina y puede ser producido por plasminógeno hidrolizado por varias proteasas.

El principal sustrato de la plasmina es la fibrina, y la disolución de la fibrina es la clave para prevenir la trombosis patológica [12]. La plasmina también tiene especificidad de sustrato para varios componentes de la MEC, incluyendo la laminina, la fibronectina, los proteoglicanos y la gelatina, lo que indica que la plasmina también desempeña un papel importante en la remodelación de la MEC [8, 13, 14]. Indirectamente, la plasmina también puede degradar otros componentes de la MEC al convertir determinados precursores de proteasas en proteasas activas, incluyendo MMP-1, MMP-2, MMP-3 y MMP-9. Por tanto, se ha sugerido que la plasmina puede ser un importante regulador de la proteólisis extracelular [15]. Además, la plasmina tiene la capacidad de activar determinadas formas potenciales de factores de crecimiento [16-18].In vitro,la plasmina también puede hidrolizar componentes del sistema del complemento y liberar fragmentos quimiotácticos del complemento.

Terapia trombolítica existente

Las terapias farmacológicas actuales relacionadas con los trombolíticos son tratamientos no quirúrgicos comunes que incluyen terapia trombolítica, terapia anticoagulante, fármacos antiplaquetarios y vasodilatadores. Actualmente, el método más usado comúnmente y eficaz es la terapia trombolítica. Hay tres generaciones de fármacos trombolíticos de uso común. La primera generación está representada por la estreptocinasa (SK) y la urocinasa (UK). Tiene una fuerte actividad trombolítica, pero no tiene especificidad trombolítica, lo que es propenso a la hiperfibrinolisis sistémica y luego provoca sangrado [19, 20]. La segunda generación está representada por el activador tisular del plasminógeno tPA, cuya actividad trombolítica es mejor que la de SK y UK, pero su semivida es cortain vivo[21]. La tercera generación transforma la primera y segunda generación de fármacos mediante el uso de técnicas de ingeniería genética y técnicas monoclonales, pero se encuentra básicamente en etapa experimental. Estos fármacos se basan en aumentar el activador en el equilibrio fibrinolítico, produciendo plasmina (Plm) para promover la fibrinólisis, para lograr el propósito de la trombólisis [22].

Actualmente existen dos categorías de fármacos trombolíticos aprobados. La gran mayoría de los fármacos trombolíticos usan activadores del plasminógeno, incluyendo las formas naturales y diversas recombinantes de tPA, uPA y estreptocinasa. El activador del plasminógeno no puede disolver el trombo por sí solo. Las moléculas de plasminógeno cercanas al trombo deben activarse para convertirse en plasmina activa para la trombólisis. En los últimos años, se ha aprobado la plasmina activa para la trombólisis local directa. El método específico consiste en liberar localmente plasmina activa cuando se pasa el catéter al sitio del trombo para la trombólisis directa.

Tradicionalmente se considera que el plasminógeno (plg), una forma inactiva de plasmina (plm), es excesivo e inerte en el cuerpo. El proceso trombolítico del cuerpo sólo se realiza cuando el plasminógeno es activado por su activador en plasmina activa, que a su vez ejerce la función de disolver los coágulos de fibrina. Tradicionalmente se cree que el plasminógeno por sí solo no desempeña ningún papel en la trombólisis.

Sin embargo, la presente invención ha descubierto sorprendentemente que el plasminógeno natural tiene una buena función de disolver trombos nuevos y viejos, y tiene las ventajas de buena seguridad, fácil ajuste de la fuerza trombolítica, buena especificidad, etc.

El mecanismo trombolítico de la presente invención es completamente diferente de las estrategias trombolíticas actualmente conocidas.

Los métodos de trombólisis de la técnica anterior se logran aumentando el catalizador de trombólisis, concretamente el activador de plasminógeno, incluyendo tPA, uPA, estreptocinasa y sus derivados, o el producto de la reacción de trombólisis, es decir, plasmina activa. El método para disolver trombos de la presente invención se logra mediante una estrategia de modular el plasminógeno sustrato de la reacción trombolítica.

En comparación con los fármacos trombolíticos de la técnica anterior, la trombólisis por plasminógeno en la presente invención tiene al menos las siguientes ventajas.

1. Buen efecto trombolítico

Para los trombos largos y los trombos antiguos progresivamente constreñidos que se forman en el caso de la oclusión arterial periférica (PAO) y la trombosis venosa profunda (DVT), los fármacos trombolíticos de la técnica anterior son menos eficaces [23-25]. Y la presente invención usa plasminógeno o una combinación de plasminógeno y PA para lograr un buen efecto trombolítico sobre el trombo anterior. Por tanto, la presente invención puede resolver eficazmente los problemas anteriores de tPA, uPA.

2. Larga semivida

Una característica importante de las sustancias trombolíticas actuales es que la semividain vivoes demasiado corta. Por ejemplo, la semividain vivode uPA natural es de 5-10 minutos, la semividain vivode tPA natural es de 3-5 minutos y la semividain vivode la plasmina natural es aún más transitoria. Aunque actualmente se está ampliando la semivida de estas sustancias mediante ingeniería genética, el efecto no es satisfactorio y la corta semivida sigue limitando gravemente la aplicación de estas sustancias.

Sin embargo, la semividain vivodel plasminógeno es de hasta 53 horas, lo que indica que el uso de plasminógeno o una combinación de plasminógeno y PA puede prolongar significativamente el efecto de la trombólisisin vivo,logrando el propósito de una trombólisis sostenida y estable.

3. Más suave y controlable

Para la plasmina activa, dado que es una proteasa altamente activa, la trombólisis mediante el uso de plasmina activa debe ser un proceso de reacción muy rápido, provocando entonces que en el uso actual deba introducirse directamente en el trombo a través del catéter.

Para el activador de plasminógeno, dado que está en la posición de catalizador en la reacción trombolítica, añadir una pequeña cantidad de activador de plasminógeno formará rápidamente una gran cantidad de plasmina activa en poco tiempo, lo cual es un proceso de reacción enzimática drástico.

Sin embargo, el experimento de la presente invención demuestra que el proceso de trombólisis modulando el sustrato de la reacción trombolítica, el plasminógeno, es más suave. Además, mediante el estudio de diferentes cantidades de consumo de plasminógeno y eficacia trombolítica, la tasa trombolítica de plasminógeno también puede controlarse mediante la dosis de plasminógeno.

4. Especificidad y bajos efectos secundarios

Un efecto secundario importante de la técnica anterior que usa el activador del plasminógeno como fármaco trombolítico es el sangrado, especialmente en el intestino y el cerebro. Dado que en el cuerpo normal el plasminógeno está ampliamente presente en todos los líquidos corporales, el depósito fisiológico de fibrina está presente en el cuerpo en circunstancias normales y el aumento del activador del plasminógeno a menudo se produce en condiciones especiales tales como traumatismos, sangrados, ejercicio extenuante, etc. Por tanto, una vez que se inyecta el activador del plasminógeno, la reacción que el plasminógeno activó para formar plasmina activa se producein vivode manera no específica, lo que luego da como resultado la disolución del depósito de fibrina normal original y el sangrado. Clínicamente, el riesgo de hemorragia intracraneal es un riesgo de sangrado importante. Se ha informado que la incidencia de hemorragia intracraneal es de entre el 1 % y el 2 % durante el periodo de administración continua de 2-24 horas. No hay mejor manera de evitar el riesgo de sangrado por el momento.

En la presente invención, dado que el plasminógeno no es una enzima activa, la reacción de activación del plasminógeno para formar plasmina activa no se produce de forma no específica después de la inyección de plasminógeno. El sitio de esta reacción depende de dónde se expresa el activador del plasminógeno, es decir, dónde se produce el trombo. El experimento de la invención demuestra que el plasminógeno puede adsorberse específicamente en el sitio del trombo, tiene la especificidad de la trombólisis y el experimento demuestra que no hay efectos secundarios de sangrado.

5. Disuelve eficazmente el trombo antiguo

La acción trombolítica de los fármacos trombolíticos actuales se centra en la fase inicial de la trombosis, es decir, “trombo nuevo”. Tal como se demostró en estudios sobre accidente cerebrovascular isquémico, la inyección de tPA recombinante dentro de las 3 horas posteriores a la trombosis puede disolver eficazmente el trombo. Estudios posteriores han demostrado que el tPA recombinante puede disolver el trombo hasta 4,5 horas después de la trombosis. Si supera las 4,5 horas, el riesgo de la inyección de tPA recombinante puede superar el efecto eficaz. Por tanto, en la situación actual de los fármacos, es necesario inyectar tPA recombinante en la etapa inicial de la trombosis lo antes posible (menos de 4,5 horas) [26, 27]. En otras palabras, existe una necesidad urgente en el campo actual de encontrar un fármaco trombolítico potente para los trombos antiguos.

En la presente invención, el uso de plasminógeno solo (así como niveles fisiológicos de tPA) o el uso de plasminógeno y activador de plasminógeno (tPA o uPA) son todos eficaces para disolver trombos nuevos (trombosis durante 0,5 horas), o trombos antiguos (20 horas), o incluso trombos muy antiguos (72 horas). Estos datos demuestran claramente la gran ventaja del plasminógeno en la disolución de trombos antiguos.

Por tanto, se espera que el plasminógeno se convierta en un fármaco trombolítico nuevo y más prometedor.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que consiste en plasminógeno y un portador, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de una trombosis arterial y venosa en un sujeto.

La presente invención incluye este uso de plasminógeno para tratar la trombosis arterial y venosa en un sujeto. En una realización, el trombo comprende trombo nuevo y trombo antiguo. En una realización, la trombosis es una trombosis provocada por una enfermedad del sistema sanguíneo, una enfermedad del sistema circulatorio, una enfermedad autoinmunitaria, un trastorno metabólico o una enfermedad infecciosa. En una realización, la trombosis es una trombosis vascular grande y/o pequeña, y/o una trombosis microvascular, secundaria a diabetes. En una realización, la trombosis es una trombosis provocada por lesiones vasculares grandes y/o pequeñas.

En un aspecto, la presente invención se refiere al uso anterior que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de plasminógeno. El método está relacionado con la disolución de un trombo mediante la administración sistémica o local de plasminógeno. El trombo anterior es un trombo nuevo y/o un trombo antiguo. Las enfermedades relacionadas con la trombosis son aquellas inducidas o provocadas por un trombo nuevo y/o un trombo antiguo. El sujeto es un mamífero, preferiblemente un humano.

En una realización, el sujeto tiene un nivel bajo de plasmina o plasminógeno.

Específicamente, el bajo nivel de plasmina o plasminógeno es innato, secundario y/o local.

En una realización, la trombosis de la invención es una trombosis venosa y/o una trombosis arterial. Las enfermedades relacionadas con la trombosis incluyen pancreatitis y cirrosis provocadas por trombosis de la vena porta; embolia renal provocada por trombosis de la vena renal; septicemia sistémica, embolia pulmonar, trombosis cerebral provocadas por trombosis de la vena yugular interna; infartos de órganos provocados por trombosis arterial, que incluyen, pero no se limitan a: infarto cerebral, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular trombótico, fibrilación auricular, angina de pecho inestable, angina de pecho intratable, ataque isquémico transitorio, embolia pulmonar, embolia vascular grande y/o pequeña inducida por diabetes, etc.

En una realización, las enfermedades relacionadas con la trombosis son nefropatía diabética, retinopatía diabética, enfermedad hepática diabética, enfermedad cardíaca diabética, enteropatía diabética, neuropatía diabética incluyendo neuralgia diabética y similares.

En una realización, la trombosis es una trombosis secundaria y/o local; la enfermedad relacionada con la trombosis es una enfermedad secundaria y/o relacionada con la trombosis local.

En una realización, el plasminógeno tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % con SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10 ó 12, y todavía tiene actividad de plasminógeno. En una realización, el plasminógeno es una proteína que añadió, delecionó y/o sustituyó 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ó 1 aminoácido basado en SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10 ó 12, y todavía tiene actividad de plasminógeno. En una realización, el plasminógeno se selecciona del grupo que consiste en Glu-plasminógeno, Lys-plasminógeno, mini-plasminógeno, micro-plasminógeno, 8-plasminógeno o cualquier combinación de los mismos. En una realización, el plasminógeno es una variante sustituida de manera conservadora seleccionada de las variantes de Glu-plasminógeno, Lys-plasminógeno, mini-plasminógeno, 8-plasminógeno o micro-plasminógeno. En una realización, el plasminógeno es un plasminógeno natural humano, tal como ortólogos de plasminógeno mostrados en SEQ ID NO. 2, por ejemplo, ortólogos de plasminógeno de primates o roedores, tales como ortólogos de plasminógeno de gorilas, macacos cangrejeros, ratas, vacas, caballos y perros. Lo más preferiblemente, el plasminógeno de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10 ó 12.

En una realización, el plasminógeno se administra por vía sistémica o tópica, preferiblemente por las siguientes vías: superficial, intravenosa, intramuscular, subcutánea, inhalación, intraespinal, inyección local, inyección intraarticular o por el recto. En una realización, la administración tópica se realiza aplicando un apósito y/o catéter que contiene plasminógeno al área del trombo.

En una realización, el plasminógeno se administra en combinación con un portador o estabilizador polipeptídico adecuado. En una realización, el plasminógeno se administra a una dosis de 0,0001-2000 mg/kg, 0,001-800 mg/kg, 0,01-600 mg/kg, 0,1-400 mg/kg, 1-200 mg/kg, 1-100 mg/kg, 10-100 mg/kg (calculado por kilogramo de peso corporal) o 0,0001-2000 mg/cm2, 0,001-800 mg/cm2, 0,01-600 mg/cm2, 0,1-400 mg/cm2, 1-200 mg/cm2, 1-100 mg/cm2, 10-100 mg/cm2 (calculado por centímetro cuadrado de superficie corporal) al día, preferiblemente repetir al menos una vez, preferiblemente al menos diariamente. En el caso de aplicación tópica, la dosis anterior puede ajustarse adicionalmente según la situación.

El plasminógeno anterior puede administrarse solo o en combinación con otros fármacos para prevenir y/o tratar otras enfermedades asociadas con la trombosis patológica. Los otros fármacos incluyen, por ejemplo, fármacos terapéuticos para enfermedades cardiovasculares, fármacos terapéuticos para arritmias, fármacos terapéuticos para diabetes, etc.

En otro aspecto, la presente memoria descriptiva se refiere al uso de plasminógeno en la preparación de fármacos, artículos de fabricación, kits para prevenir y/o eliminar la trombosis arterial y venosa en un sujeto. La memoria descriptiva también se refiere a un método para preparar un fármaco, artículo de fabricación y kit para prevenir y/o eliminar la trombosis arterial y venosa en un sujeto, que comprende preparar el plasminógeno y un portador farmacéuticamente aceptable juntos en un fármaco, un artículo de fabricación y un kit para prevenir y/o eliminar la trombosis arterial y venosa en un sujeto. En una realización, el trombo comprende un trombo nuevo (trombo agudo) y un trombo antiguo (trombo crónico). En una realización, la trombosis es una trombosis provocada por una enfermedad del sistema sanguíneo, una enfermedad del sistema circulatorio, una enfermedad autoinmunitaria, un trastorno metabólico o una enfermedad infecciosa. En una realización, la trombosis es una trombosis vascular grande y/o pequeña, y/o una trombosis microvascular, secundaria a diabetes. En una realización, la trombosis es una trombosis provocada por lesiones vasculares grandes y/o pequeñas.

Además de la invención descrita anteriormente, la memoria descriptiva se refiere a un uso de plasminógeno en la preparación de un fármaco, un artículo de fabricación o un kit para prevenir y/o eliminar la trombosis patológica en un sujeto, y el uso de plasminógeno en la preparación de un fármaco, un artículo de fabricación o un kit para prevenir y/o tratar enfermedades relacionadas con la trombosis en un sujeto. La memoria descriptiva también se refiere a un método para preparar un fármaco, un artículo de fabricación o un kit para prevenir y/o eliminar la trombosis patológica en un sujeto, que comprende preparar un plasminógeno y un portador farmacéuticamente aceptable juntos en el fármaco, artículo de fabricación o kit, o un método para preparar un fármaco, un artículo de fabricación o un kit para prevenir y/o tratar enfermedades relacionadas con la trombosis en un sujeto, que comprende preparar un plasminógeno y un portador farmacéuticamente aceptable juntos en el fármaco, artículo de fabricación o kit. El trombo es un trombo nuevo y/o un trombo antiguo. La enfermedad relacionada con la trombosis es una enfermedad inducida por un trombo nuevo y/o un trombo antiguo. El sujeto es un mamífero, preferiblemente un humano.

En una realización, el sujeto tiene un nivel bajo de plasmina o plasminógeno. Específicamente, el bajo nivel de plasmina o plasminógeno es innato, secundario y/o local.

En una realización, la trombosis anterior es una trombosis venosa y/o trombosis arterial. Las enfermedades relacionadas con la trombosis incluyen pancreatitis y cirrosis provocadas por trombosis de la vena porta; embolia renal provocada por trombosis de la vena renal; septicemia sistémica, embolia pulmonar, trombosis cerebral provocadas por trombosis de la vena yugular interna; infartos de órganos provocados por trombosis arterial, que incluyen, pero no se limitan a: infarto cerebral, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular trombótico, fibrilación auricular, angina de pecho inestable, angina de pecho intratable, ataque isquémico transitorio, embolia pulmonar, embolia vascular grande y/o pequeña inducida por diabetes, etc.

En una realización, las enfermedades relacionadas con la trombosis son nefropatía diabética, retinopatía diabética, enfermedad hepática diabética, enfermedad cardíaca diabética, enteropatía diabética, neuropatía diabética incluyendo neuralgia diabética y similares.

En una realización, la trombosis es una trombosis secundaria y/o local; la enfermedad relacionada con la trombosis es una enfermedad secundaria y/o relacionada con la trombosis local.

En una realización, el plasminógeno tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % con las SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10 ó 12, y todavía tiene actividad de plasminógeno. En una realización, el plasminógeno es una proteína que añadió, delecionó y/o sustituyó 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1 -25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 o 1 aminoácido basado en SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10 ó 12, y todavía tiene actividad de plasminógeno. En una realización, el plasminógeno se selecciona del grupo que consiste en Glu-plasminógeno, Lys-plasminógeno, mini-plasminógeno, micro-plasminógeno, 8-plasminógeno o cualquier combinación de los mismos. En una realización, el plasminógeno es una variante sustituida de manera conservadora seleccionada de las variantes de Glu-plasminógeno, Lys-plasminógeno, mini-plasminógeno, 8-plasminógeno o micro-plasminógeno. En una realización, el plasminógeno es un plasminógeno natural humano, tal como ortólogos de plasminógeno mostrados en SEQ ID NO. 2, por ejemplo, ortólogos de plasminógeno de primates o roedores, tales como ortólogos de plasminógeno de gorilas, macacos cangrejeros, ratas, vacas, caballos y perros. Lo más preferiblemente, el plasminógeno de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10 ó 12.

En una realización, el plasminógeno se administra por vía sistémica o tópica, preferiblemente por las siguientes vías: superficial, intravenosa, intramuscular, subcutánea, inhalación, intraespinal, inyección local, inyección intraarticular o por el recto. En una realización, la administración tópica se realiza aplicando un apósito y/o catéter que contiene plasminógeno al área del trombo.

El plasminógeno anterior puede administrarse solo o en combinación con otros fármacos para el tratamiento de otras enfermedades asociadas con trombosis patológica. Los otros fármacos incluyen, por ejemplo, fármacos terapéuticos para enfermedades cardiovasculares, fármacos terapéuticos para arritmias, fármacos terapéuticos para diabetes, etc.

En una realización, el plasminógeno se administra en combinación con un portador o estabilizador polipeptídico adecuado. En una realización, el plasminógeno se administra a una dosis de 0,0001-2000 mg/kg, 0,001-800 mg/kg, 0,01-600 mg/kg, 0,1-400 mg/kg, 1-200 mg/kg, 1-100 mg/kg, 10-100 mg/kg (calculado por kilogramo de peso corporal) o 0,0001-2000 mg/cm2, 0,001-800 mg/cm2, 0,01-600 mg/cm2, 0,1-400 mg/cm2, 1-200 mg/cm2, 1-100 mg/cm2, 10-100 mg/cm2 (calculado por centímetro cuadrado de superficie corporal) al día, preferiblemente repetir al menos una vez, preferiblemente al menos diariamente. En el caso de aplicación tópica, la dosis anterior puede ajustarse adicionalmente según la situación.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un plasminógeno para su uso en el tratamiento de la trombosis arterial y venosa en un sujeto, y a una composición farmacéutica que comprende un plasminógeno para prevenir y/o eliminar la trombosis arterial y venosa en un sujeto. En una realización, el trombo comprende trombo nuevo y trombo antiguo. En una realización, la trombosis es una trombosis provocada por una enfermedad del sistema sanguíneo, una enfermedad del sistema circulatorio, una enfermedad autoinmunitaria, un trastorno metabólico o una enfermedad infecciosa. En una realización, la trombosis es una trombosis vascular grande y/o pequeña, y/o una trombosis microvascular, secundaria a diabetes. En una realización, la trombosis es una trombosis provocada por lesiones vasculares grandes y/o pequeñas. En un aspecto, la presente invención se refiere a un plasminógeno para prevenir y/o tratar enfermedades relacionadas con la trombosis, y a una composición farmacéutica que comprende un plasminógeno para prevenir y/o tratar enfermedades relacionadas con la trombosis. El trombo anterior es un trombo nuevo y/o un trombo antiguo, y la enfermedad relacionada con la trombosis es una enfermedad inducida por un trombo nuevo y/o un trombo antiguo. En una realización, la trombosis anterior es una trombosis venosa y/o trombosis arterial. Las enfermedades relacionadas con la trombosis incluyen pancreatitis y cirrosis provocadas por trombosis de la vena porta; embolia renal provocada por trombosis de la vena renal; septicemia sistémica, embolia pulmonar, trombosis cerebral provocadas por trombosis de la vena yugular interna; infartos de órganos provocados por trombosis arterial, que incluyen, pero no se limitan a: infarto cerebral, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular trombótico, fibrilación auricular, angina de pecho inestable, angina de pecho intratable, ataque isquémico transitorio, embolia pulmonar, embolia vascular grande y/o pequeña inducida por diabetes, etc.

En una realización, las enfermedades relacionadas con la trombosis son nefropatía diabética, retinopatía diabética, enfermedad hepática diabética, enfermedad cardíaca diabética, enteropatía diabética, neuropatía diabética incluyendo neuralgia diabética y similares.

En una realización, la trombosis anterior es una trombosis innata, secundaria y/o local; la enfermedad relacionada con la trombosis anterior es una enfermedad relacionada con la trombosis innata, secundaria y/o local.

En una realización, el plasminógeno tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % con las SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10 ó 12, y todavía tiene actividad de plasminógeno. En una realización, el plasminógeno es una proteína que añadió, delecionó y/o sustituyó 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1 -25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 o 1 aminoácido basado en SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10 ó 12, y todavía tiene actividad de plasminógeno.

En una realización, el plasminógeno se selecciona del grupo que consiste en Glu-plasminógeno, Lys-plasminógeno, mini-plasminógeno, micro-plasminógeno, 8-plasminógeno o cualquier combinación de los mismos. En una realización, el plasminógeno es una variante sustituida de manera conservadora seleccionada de las variantes de Glu-plasminógeno, Lys-plasminógeno, mini-plasminógeno, 8-plasminógeno o micro-plasminógeno. En una realización, el plasminógeno es un plasminógeno natural humano, tal como ortólogos de plasminógeno mostrados en SEQ ID NO. 2, por ejemplo, ortólogos de plasminógeno de primates o roedores, tales como ortólogos de plasminógeno de gorilas, macacos cangrejeros, ratas, vacas, caballos y perros. Lo más preferiblemente, el plasminógeno de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10 ó 12.

En una realización, el plasminógeno se administra por vía sistémica o tópica, preferiblemente por las siguientes vías: superficial, intravenosa, intramuscular, subcutánea, inhalación, intraespinal, inyección local, inyección intraarticular o por el recto. En una realización, la administración tópica se realiza aplicando un apósito y/o catéter que contiene plasminógeno al área del trombo.

En una realización, el plasminógeno se administra en combinación con un vehículo polipeptídico o estabilizador adecuado. En una realización, el plasminógeno se administra a una dosis de 0,0001-2000 mg/kg, 0,001-800 mg/kg, 0,01-600 mg/kg, 0,1-400 mg/kg, 1-200 mg/kg, 1-100 mg/kg, 10-100 mg/kg (calculado por kilogramo de peso corporal) o 0,0001-2000 mg/cm2, 0,001-800 mg/cm2, 0,01-600 mg/cm2, 0,1-400 mg/cm2, 1-200 mg/cm2, 1-100 mg/cm2, 10-100 mg/cm2 (calculado por centímetro cuadrado de superficie corporal) al día, preferiblemente repetir al menos una vez, preferiblemente al menos diariamente. En el caso de aplicación tópica, la dosis anterior puede ajustarse adicionalmente según la situación.

En otro aspecto, la presente memoria descriptiva se refiere a un artículo de fabricación o un kit que comprende un plasminógeno para prevenir y/o eliminar una trombosis arterial y venosa en un sujeto. En una realización, el trombo comprende trombo nuevo y trombo antiguo. En una realización, la trombosis es una trombosis provocada por una enfermedad del sistema sanguíneo, una enfermedad del sistema circulatorio, una enfermedad autoinmunitaria, un trastorno metabólico o una enfermedad infecciosa. En una realización, la trombosis es una trombosis vascular grande y/o pequeña, y/o una trombosis microvascular, secundaria a diabetes. En una realización, la trombosis es una trombosis provocada por lesiones vasculares grandes y/o pequeñas. En una realización, el artículo o kit comprende un recipiente que contiene una cantidad eficaz de plasminógeno. Además, el artículo o kit también incluye un recipiente que contiene uno o más fármacos diferentes, en el que el otro fármaco es un fármaco terapéutico para otras enfermedades que acompañan a la trombosis. El kit también puede comprender instrucciones de uso, que indican que el plasminógeno puede usarse para prevenir y/o tratar la trombosis arterial y venosa, o enfermedades relacionadas con la trombosis, y puede ilustrar además que el plasminógeno puede administrarse antes, simultáneamente y /o después de la administración de otro(s) fármaco(s). En una realización, el otro fármaco puede ser un fármaco terapéutico para enfermedades cardiovasculares, un fármaco terapéutico para arritmias, un fármaco terapéutico para diabetes o similares, para tratar otras enfermedades acompañadas de trombosis patológica. En realizaciones específicas, el trombo es un trombo nuevo y/o un trombo antiguo, y la enfermedad relacionada con la trombosis es una enfermedad inducida por un trombo nuevo y/o una enfermedad inducida por un trombo antiguo. En una realización, la trombosis anterior es una trombosis venosa y/o trombosis arterial. Las enfermedades relacionadas con la trombosis incluyen pancreatitis y cirrosis provocadas por trombosis de la vena porta; embolia renal provocada por trombosis de la vena renal; septicemia sistémica, embolia pulmonar, trombosis cerebral provocadas por trombosis de la vena yugular interna; infartos de órganos provocados por trombosis arterial, que incluyen, pero no se limitan a: infarto cerebral, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular trombótico, fibrilación auricular, angina de pecho inestable, angina de pecho intratable, ataque isquémico transitorio, embolia pulmonar, embolia vascular grande y/o pequeña inducida por diabetes, etc.

En una realización, las enfermedades relacionadas con la trombosis son nefropatía diabética, retinopatía diabética, enfermedad hepática diabética, enfermedad cardíaca diabética, enteropatía diabética, neuropatía diabética incluyendo neuralgia diabética y similares.

En una realización, la trombosis anterior es una trombosis innata, secundaria y/o local; la enfermedad relacionada con la trombosis anterior es una enfermedad relacionada con la trombosis innata, secundaria y/o local.

En una realización, el plasminógeno tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % con las SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10 ó 12, y todavía tiene actividad de plasminógeno. En una realización, el plasminógeno es una proteína que añadió, delecionó y/o sustituyó 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1 -25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 o 1 aminoácido basado en SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10 ó 12, y todavía tiene actividad de plasminógeno.

En una realización, el plasminógeno se selecciona del grupo que consiste en Glu-plasminógeno, Lys-plasminógeno, mini-plasminógeno, micro-plasminógeno, 8-plasminógeno o cualquier combinación de los mismos. En una realización, el plasminógeno es una variante sustituida de manera conservadora seleccionada de las variantes de Glu-plasminógeno, Lys-plasminógeno, mini-plasminógeno, 8-plasminógeno o micro-plasminógeno. En una realización, el plasminógeno es un plasminógeno natural humano, tal como ortólogos de plasminógeno mostrados en SEQ ID NO. 2, por ejemplo, ortólogos de plasminógeno de primates o roedores, tales como ortólogos de plasminógeno de gorilas, macacos cangrejeros, ratas, vacas, caballos y perros. Lo más preferiblemente, el plasminógeno de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10 ó 12.

En una realización, el sujeto tiene un nivel bajo de plasmina o plasminógeno. Específicamente, el bajo nivel de plasmina o plasminógeno es innato, secundario y/o local.

La invención se define en las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

1. Definición

Un “trombo” es el producto del proceso de coagulación. El proceso de coagulación es el mecanismo de defensa que usa el cuerpo para mantener la integridad del sistema circulatorio cerrado de alta presión. En circunstancias normales, el proceso debería permanecer inactivado, pero cuando el tejido está dañado, el mecanismo debe activarse inmediatamente para reducir la extravasación de sangre. Cuando los vasos sanguíneos se dañan, el fibrinógeno disuelto en plasma bajo la acción de la trombina eventualmente se convertirá en polímeros de fibrina que son insolubles en agua y se entrelazarán entre sí para formar una red que atrapa las células sanguíneas en su interior para formar un coágulo de sangre, completando el proceso de coagulación. En este proceso, la razón del tamaño del coágulo de sangre con respecto a la herida es crucial. Por tanto, debe existir un equilibrio entre las moléculas que inician la formación de coágulos (fibrina, trombina) y las moléculas que disuelven los coágulos sanguíneos (plasmina, activador del plasminógeno, etc.). Pero en el proceso patológico, la alteración de este equilibrio dará lugar a un exceso de moléculas formadoras de coágulos sanguíneos, que a su vez formarán un trombo, que es un “trombo patológico”.

En el cuerpo humano, la trombosis puede producirse en cualquier lugar con flujo sanguíneo y actualmente se divide en dos categorías principales: trombosis venosa y trombosis arterial. La trombosis venosa está provocada por un coágulo de sangre producido en la vena. El tipo más común de trombosis venosa es: la trombosis venosa profunda (DVT), que suele afectar a las venas de las extremidades, tales como la vena femoral, provocando dolor e hinchazón de la zona afectada; trombosis de la vena porta, que puede afectar la vena porta hepática y provocar pancreatitis, cirrosis, diverticulitis o colangiocarcinoma; trombosis de la vena renal, que conduce a embolia renal; trombosis de la vena yugular interna, que puede provocar diversas complicaciones tales como septicemia sistémica y embolia pulmonar; trombosis de las venas cerebrales, que provoca dolores de cabeza, anomalías visuales, accidentes cerebrovasculares y otros síntomas en los pacientes. La trombosis arterial puede provocar un infarto de casi cualquier órgano del cuerpo. Las enfermedades que provoca incluyen, pero no se limitan a: infarto cerebral, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular trombótico, enfermedad aterosclerótica, angina inestable, angina intratable, ataque isquémico transitorio, embolia pulmonar, etc. Las enfermedades relacionadas con la trombosis son enfermedades provocadas por dos procesos patológicos de Trombosis y tromboembolia. El término enfermedad relacionada con la trombosis de la presente invención cubre específicamente todas las enfermedades provocadas por la trombosis y la tromboembolia.

La trombosis se refiere a un proceso patológico en el que elementos de la sangre forman émbolos en los vasos sanguíneos (principalmente vasos sanguíneos pequeños) en determinadas condiciones, lo que da como resultado un bloqueo parcial o completo de los vasos sanguíneos y trastornos del suministro de sangre en los sitios correspondientes. Según la composición del trombo, la trombosis puede dividirse en trombosis de plaquetas, trombosis de glóbulos rojos, trombosis de fibrina, trombosis mixta, etc. Según el tipo de vasos sanguíneos, la trombosis puede dividirse en trombosis arterial, trombosis venosa y trombosis capilar. La tromboembolia es un proceso patológico que se produce cuando un trombo se desprende del sitio de formación y bloquea parcial o completamente ciertos vasos sanguíneos durante el movimiento con el flujo sanguíneo, provocando isquemia, hipoxia, necrosis (trombosis arterial), congestión y edema (trombosis venosa). en los tejidos y (u) órganos correspondientes.

La trombosis venosa profunda de las extremidades inferiores es la forma más común de trombosis venosa que se observa comúnmente en venas profundas tales como las venas poplíteas, las venas femorales, las venas mesentéricas, las venas porta, etc. Se trata principalmente de trombos de glóbulos rojos o trombos de fibrina. Las principales manifestaciones son: (1) hinchazón local y dolor de la trombosis; (2) trastorno por reflujo sanguíneo en trombosis distal, tal como edema distal, dolor, cambio de color de la piel, ascitis, etc.; (3) disfunción orgánica relacionada provocada por la embolización de los vasos sanguíneos después del desprendimiento del coágulo, tales como síntomas, signos, etc. de infarto pulmonar.

La trombosis arterial es más común en las arterias coronarias, arterias cerebrales, arterias mesentéricas y arterias de las extremidades, cuyo tipo es principalmente trombosis plaquetaria en las primeras etapas, seguida de trombosis de fibrina. Las manifestaciones clínicas son: (1) aparición mayoritariamente repentina, con dolor local intenso, tal como angina, dolor abdominal, dolor físico intenso, etc.; (2) anomalías de la estructura y función de órganos y tejidos provocadas por isquemia e hipoxia en sitios relevantes de suministro de sangre, tales como infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, choque cardiogénico, arritmia, alteración de la conciencia y hemiplejía, etc.; (3) embolia cerebral, embolia renal, embolia del bazo y otros síntomas y signos relacionados provocados por la rotura de coágulos; (4) manifestaciones clínicas provocadas por necrosis isquémica del suministro de sangre, tales como fiebre, etc.

La trombosis capilar es común en DIC, TTP y síndrome urémico hemolítico (HUS). Las manifestaciones clínicas a menudo son falta de especificidad y son principalmente necrosis embólica mucocutánea, insuficiencia de la microcirculación y disfunción orgánica.

La “diabetes mellitus” es un síndrome de trastorno metabólico de una serie de sustancias tales como azúcar, proteína, grasa, agua y electrolitos, desencadenado por diversos factores patógenos tales como factores genéticos, trastornos inmunitarios, infecciones microbianas y sus toxinas, toxinas de radicales libres, factores mentales, etc., que actúan sobre el cuerpo dando como resultado la disminución de la función de los islotes del páncreas y la resistencia a la insulina, etc. Se caracteriza clínicamente por niveles altos de azúcar en sangre.

Las “complicaciones diabéticas” son deterioros o disfunciones de otros órganos o tejidos del cuerpo provocados por un control deficiente de la glucosa en sangre durante la diabetes, incluyendo daño o disfunción del hígado, riñón, corazón, retina, sistema nervioso y similares. Según las estadísticas de la Organización Mundial de la Salud, existen más de 100 complicaciones de la diabetes, que actualmente se sabe que tiene la mayor cantidad de complicaciones. Estas complicaciones de la diabetes se deben principalmente al daño de los vasos sanguíneos principales, los vasos sanguíneos pequeños y los microvasos de diversos órganos del paciente.

“Macroangiopatía diabética” se refiere principalmente a la aterosclerosis en la aorta y en las arterias de diversos órganos. Su patogénesis incluye los siguientes aspectos: (1) la hiperglucemia sostenida aumenta la viscosidad y la coagulación de la sangre, lo que a su vez hace que la elasticidad vascular arterial se debilite e incluso pierda; (2) metabolismo anómalo de los lípidos, que promueve la acumulación de colesterol y ésteres de colesterilo en las células, lo que conduce a la aparición y desarrollo de aterosclerosis; (3) lesión de las células endoteliales de la pared arterial. Los cambios hemodinámicos hacen que la sangre actúe mecánicamente a largo plazo sobre el endotelio vascular, provocando daño endotelial, lo que luego da como resultado la adhesión de plaquetas, fibrina, etc. en el sitio de la lesión para formar una trombosis y, en el futuro, puede provocar inflamación; (4) el aumento de glicoproteínas implicadas en el mecanismo de coagulación promueve la agregación de plaquetas y fibrina y su adhesión a la capa subendotelial dañada, y provoca una disminución de la solvencia y una mayor formación de trombos.

“Microangiopatía diabética” se refiere a una enfermedad microvascular provocada por diferentes grados de anomalías en la microcirculación de diversos órganos o tejidos del cuerpo de un paciente diabético. El proceso de formación de la microangiopatía es aproximadamente tal como sigue: cambios funcionales de la microcirculación, lesión endotelial, engrasamiento de la membrana basal, aumento de la viscosidad de la sangre, agregación de glóbulos rojos, adhesión y agregación de plaquetas y, finalmente, como resultado de microtrombosis y/u oclusión microvascular.

Las dos “vasculopatías diabéticas” anteriores provocan daño vascular local, flujo sanguíneo deficiente, hipoxia celular, formación de coágulos, trombosis e inflamación en tejidos u órganos, y afectan aún más la función de los tejidos y órganos circundantes, lo que conduce a complicaciones diabéticas tales como enfermedad cardíaca diabética, enteropatía diabética, nefropatía diabética, retinopatía diabética, enfermedad hepática diabética y neuropatía diabética.

La “nefropatía diabética” es una complicación microvascular diabética, que se refiere principalmente a la glomeruloesclerosis diabética, una lesión glomerular basada principalmente en lesiones vasculares. Sus características incluyen proteinuria, hipertensión, edema, glomeruloesclerosis, cambios estructurales vasculares y enfermedad tubulointersticial. La primera evidencia clínica de nefropatía diabética es habitualmente la presencia de albuminuria en la orina, tal como microalbuminuria o macroalbuminuria.

La “neuropatía diabética” está provocada por daño al sistema nervioso inducido por diabetes, incluido daño a los nervios sensoriales, daño a los nervios motores y daño a los nervios autónomos, en los cuales el daño a los nervios sensoriales es habitualmente más grave. Los síntomas comunes incluyen, pero no se limitan a: dolor físico, hipoestesia, entumecimiento, ardor, frío y dolor neuropático diabético que incluye, pero no se limita a, dolor espontáneo, hipoalgesia e hiperalgesia inducida por complicaciones diabéticas.

La “neuralgia diabética” es la forma más común de neuropatía diabética, generalmente provocada por una alteración de los nervios sensoriales diabéticos. El dolor principal va acompañado habitualmente de pérdida de temperatura y tacto. El dolor se produce con mayor frecuencia en las extremidades inferiores, pero también en las extremidades superiores y el torso, y generalmente puede dividirse en dolor nervioso periférico y central. El dolor de los nervios periféricos está provocado por daño a los nervios periféricos, mientras que el dolor del nervio central está provocado por daño al sistema nervioso central y/o a la médula espinal.

“Lesión hepática diabética” se refiere a un cambio patológico en el que la histología y la función del hígado cambian debido a la diabetes. Está provocada principalmente por lesiones macrovasculares y microvasculares inducidas por la diabetes. Se sabe que el daño hepático provocado por la diabetes incluye: anomalías de la enzimología hepática, que pueden provocar acumulación de dióxido de carbono en las células del hígado, acidosis, reducción del suministro de oxígeno, aumento del consumo de oxígeno, aumento de la actividad de las transaminasas hepáticas, trastorno del metabolismo de la bilirrubina y casos graves que pueden provocar necrosis de células hepáticas; el hígado graso, en todas las causas del cual la diabetes ocupa el tercer lugar, y entre el 21 % y el 78 % de los pacientes diabéticos tienen hígado graso; hepatitis, cirrosis y cáncer de hígado, en los que la prevalencia de hepatitis viral en pacientes diabéticos es aproximadamente de 2-4 veces mayor que la de las personas normales, y la incidencia de cáncer primario de hígado es aproximadamente 4 veces mayor que la de las personas normales. Clínicamente, la enfermedad hepática y sus síntomas asociados provocados por la diabetes incluyen, pero no se limitan a: anomalías de la enzimología hepática, malestar y sensibilidad hepática, hepatomegalia, esplenomegalia, hepatoesplenomegalia, hepatitis, hígado graso, colangitis, cirrosis, necrosis hepática, cáncer de hígado, etc.

“Enfermedad cardiovascular diabética” se refiere a un cambio patológico en el que la histología y la función del sistema cardiovascular cambian debido a la diabetes, que es una de las complicaciones diabéticas más comunes, provocada principalmente por lesiones macrovasculares y microvasculares inducidas por la diabetes. Entre ellas, las manifestaciones clínicas del paciente incluyen electrocardiograma anómalo, agrandamiento del corazón, arritmia, angina de pecho, infarto de miocardio indoloro e insuficiencia cardíaca. Según las estadísticas, entre el 70 % y el 80 % de los diabéticos acaban muriendo por complicaciones cardiovasculares.

“Retinopatía diabética” se refiere a un cambio patológico en el que la histología y la función de la retina cambian debido a la diabetes, provocada principalmente por lesiones macrovasculares y microvasculares inducidas por la diabetes. La retinopatía diabética es la enfermedad ocular diabética más común y, a menudo, conduce a pérdida de visión o ceguera. Según las estadísticas, el 50 % de los pacientes diabéticos padecerán esta enfermedad dentro de aproximadamente 10 años siguientes al curso de la enfermedad, y el 80 % durante más de 15 años. Cuanto más grave es la afección de diabetes, cuanto más antigua es, mayor es la incidencia de diabetes.

Cuando se examina el tejido del trombo del paciente mediante técnicas de tomografía computarizada o resonancia magnética, la lesión se ve como un trombo nuevo o antiguo. La primera lesión es una lesión reciente durante el periodo de ataque agudo. El centro isquémico de la lesión está parcialmente necrótico y es probable que algunas de las lesiones se recuperen, sin afectar el área circundante. El objetivo del tratamiento en este momento debe ser principalmente prevenir la expansión de la “zona central del infarto”. El trombo antiguo es la necrosis completa del centro isquémico del tejido. El objetivo del tratamiento debe ser lograr que se siga mejorando la función del tejido circundante de la zona del infarto. Existe un alto riesgo de recurrencia de trombos antiguos, por lo que el tratamiento y la prevención son igualmente importantes para los pacientes con trombosis antiguas, y la alta tasa de recurrencia debe reducirse mientras se reduce el grado de los síntomas. Muchos fármacos trombolíticos actuales son eficaces para el tratamiento de trombos nuevos en la fase aguda, pero son menos eficaces para el tratamiento de trombos antiguos.

La “plasmina” es una enzima muy importante que existe en la sangre y puede hidrolizar los coágulos de fibrina en productos de degradación de fibrina y dímeros D.

“Plasminógeno” es la forma zimógena de la plasmina y se compone de 810 aminoácidos calculados a partir de la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO. 4) del plasminógeno humano natural que contiene un péptido señal, basado en la secuencia en Swiss-Prot, con un peso molecular de aproximadamente 92 kD. Es una glicoproteína sintetizada principalmente en el hígado y capaz de circular en la sangre, y la secuencia de ADNc que codifica para la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO. 3. La PLG de longitud completa contiene siete dominios: un dominio de serina proteasa en el extremo C-terminal, un dominio Pan Apple (PAp) en el extremo N-terminal y cinco dominios Kringle (Kringle1-5). Haciendo referencia a la secuencia en Swiss-Prot, su péptido señal incluye residuos Met1-Gly19, PAp incluye residuos Glu20-Val98, Kringle1 incluye residuos Cys103-Cys181, Kringle2 incluye residuos Glu184-Cys262, Kringle3 incluye residuos Cys275-Cys352, Kringle4 incluye residuos Cys377- Cys454 y Kringle5 incluyen los residuos Cys481-Cys560. Según datos del NCBI, el dominio de serina proteasa incluye los residuos Val581-Arg804.

El Glu-plasminógeno es un plasminógeno natural de longitud completa y consiste en 791 aminoácidos (sin incluir el péptido señal de 19 aminoácidos). La secuencia de ADNc que codifica para la secuencia se muestra como SEQ ID NO. 1 y su secuencia de aminoácidos se muestra como SEQ ID NO. 2.In vivo,existe Lys-plasminógeno que se forma mediante hidrólisis de los aminoácidos 76-77 del Glu-plasminógeno, tal como se muestra en la SEQ ID NO. 6, y la secuencia de ADNc que codifica para la secuencia de aminoácidos se muestra como SEQ ID NO. 5 El 8-plasminógeno es un fragmento de plasminógeno de longitud completa que carece de la estructura Kringle2-Kringle5 y sólo contiene dominios Kringle1 y serina proteasa [28, 29]. La secuencia de aminoácidos del 8-plasminógeno se ha informado en la bibliografía (SEQ ID NO. 8) [30], y la secuencia de ADNc que codifica para la secuencia de aminoácidos se muestra como SEQ ID NO. 7. El mini-plasminógeno se compone de Kringle5 y un dominio de serina proteasa y se ha informado en la bibliografía que incluye los residuos Val443-Asn791 (con el residuo Glu de secuencia Glu-plg que no contiene un péptido señal como aminoácido de partida) [31]. Su secuencia de aminoácidos se muestra como SEQ ID NO. 10, y la secuencia de ADNc que codifica para esta secuencia de aminoácidos se muestra como SEQ ID NO. 9. El micro-plasminógeno sólo contiene un dominio de serina proteasa, y su secuencia de aminoácidos se ha informado en la bibliografía incluye residuos Ala543-Asn791 (con el residuo Glu de una secuencia Glu-plg que no contiene un péptido señal como aminoácido inicial) [32]. La patente CN102154253A también informó que su secuencia incluye residuos Lys531-Asn791 (con el residuo Glu de una secuencia Glu-plg que no contiene un péptido señal como aminoácido inicial). La secuencia de la presente solicitud de patente se refiere al documento de patente CN102154253A. Su secuencia de aminoácidos se muestra como SEQ ID NO. 12, y la secuencia de ADNc que codifica para esta secuencia de aminoácidos se muestra como SEQ ID NO. 11.

En la presente memoria descriptiva, “plasmina” se usa de manera intercambiable con “fibrinolisina” y “fibrinoclasa”, y los términos tienen el mismo significado; y “plasminógeno” se usa de manera intercambiable con “zimógeno fibrinolítico” y “zimógeno de fibrinoclasa”, y los términos tienen el mismo significado.

El “trombo nuevo” y el “trombo agudo” de la presente invención pueden usarse de manera intercambiable; “trombo antiguo” y “trombo crónico” pueden usarse de manera intercambiable.

En el curso de la circulación, el plasminógeno adopta una conformación cerrada e inactiva, pero cuando se une al trombo o a la superficie celular, se convierte en una plasmina activa en una conformación abierta mediada por el activador del plasminógeno (PA). La plasmina activa puede hidrolizar adicionalmente los coágulos de fibrina en productos de degradación de fibrina y dímero D, que a su vez disuelve los coágulos. El dominio PAp del plasminógeno contiene un determinante importante que mantiene el plasminógeno en una conformación cerrada inactiva, mientras que el dominio KR es capaz de unirse a residuos de lisina presentes en receptores y sustratos. Se sabe que una variedad de enzimas son capaces de actuar como activadores del plasminógeno, que incluyen: activador del plasminógeno tisular (tPA), activador del plasminógeno urocinasa (uPA), calicreína, factor XII de coagulación sanguínea (factor de Hageman), etc.

“Fragmento activo de plasminógeno”, que no forma parte de la presente invención, se refiere a un fragmento activo en una proteína de plasminógeno capaz de unirse a una secuencia diana en un sustrato y ejercer una función proteolítica. El fragmento activo de plasminógeno es una proteína que comprende un dominio de serina proteasa de plasminógeno. Preferiblemente, el fragmento activo de plasminógeno comprende la proteína de SEQ ID NO. 14, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % de homología con SEQ ID NO. 14. Esta realización no está cubierta por la invención reivindicada.

En la actualidad, los métodos para la determinación del plasminógeno y su actividad en sangre incluyen: detección de la actividad del activador del plasminógeno tisular (t-PAA), detección del antígeno activador del plasminógeno tisular (t-PAAg), detección de la actividad del plasminógeno tisular (plgA), detección del antígeno del plasminógeno tisular plasmático (plgAg), detección de la actividad inhibidora del activador del plasminógeno tisular plasmático, detección del antígeno inhibidor del activador del plasminógeno tisular plasmático, detección del complejo plasminaantiplasmina plasmática (PAP). El método de detección más usado es el método del sustrato cromogénico: añadir estreptocinasa (SK) y sustrato cromogénico al plasma analizado; PLG en el plasma analizado se convierte en PLM bajo la acción de SK, actuando este último sobre el sustrato cromogénico, y luego se mide con un espectrofotómetro; el aumento de la absorbancia es proporcional a la actividad del plasminógeno. Además, la actividad del plasminógeno en sangre también puede medirse mediante inmunoquímica, electroforesis en gel, inmunoturbidimetría, radioinmunoensayo y similares.

“Ortólogos” se refiere a homólogos entre diferentes especies, incluyendo tanto homólogos de proteínas como homólogos de ADN, y también se conocen como homólogos ortólogos y homólogos verticales. Se refiere específicamente a proteínas o genes que han evolucionado a partir del mismo gen ancestral en diferentes especies. El plasminógeno de la presente invención incluye plasminógeno natural humano y también incluye ortólogos u ortólogos de plasminógenos derivados de diferentes especies y que tienen actividad de plasminógeno.

“Variante sustitutiva conservadora” se refiere a un cambio en uno de los residuos de aminoácidos dados sin alterar la conformación y función general de la proteína o enzima, incluyendo, pero sin limitarse a, el reemplazo de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de una proteína original con aminoácidos de propiedades similares (por ejemplo, ácidos, básicos, hidrófobos, etc.). Son bien conocidos los aminoácidos con propiedades similares. Por ejemplo, la arginina, la histidina y la lisina son aminoácidos básicos hidrófilos y son intercambiables. De manera similar, la isoleucina es un aminoácido hidrófobo que puede ser reemplazado por leucina, metionina o valina. Por tanto, la similitud de dos proteínas o secuencias de aminoácidos de funciones similares puede ser diferente. Por ejemplo, del 70 % al 99% de similitud (identidad) según el algoritmo MEGALIGN. Una “variante conservadora sustituida” también incluye un polipéptido o enzima que tiene una identidad de aminoácidos del 60 % o más, preferiblemente del 75 % o más, más preferiblemente del 85 % o más, incluso más preferiblemente del 90 % o más según lo determinado por el algoritmo BLAST o FASTA, y que tiene propiedades o funciones iguales o sustancialmente similares a las de la proteína o enzima natural u original.

Plasminógeno “aislado” se refiere a proteína de plasminógeno aislada y/o recuperada de su entorno natural. En algunas realizaciones, el plasminógeno se purificará (1) hasta más del 90 %, más del 95 % o más del 98 % de pureza (en peso) según se determina mediante el método de Lowry, por ejemplo, más del 99 % (en peso), (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna usando un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad, la homogeneidad determinada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) usando tinción con azul de Coomassie o plata en condiciones reductoras o no reductoras. El plasminógeno aislado también incluye plasminógeno preparado a partir de células recombinantes mediante técnicas de bioingeniería y separados mediante al menos una etapa de purificación.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a una forma polimérica de un aminoácido de cualquier longitud. Puede incluir aminoácidos codificados genéticamente y no codificados genéticamente, aminoácidos derivatizados o modificados química o bioquímicamente y polipéptidos que tienen una estructura peptídica modificada. El término incluye proteínas de fusión que incluyen, entre otras, proteínas de fusión que tienen secuencias de aminoácidos heterólogas, fusiones que tienen secuencias líderes heterólogas y homólogas (con o sin residuos de metionina N-terminales), etc. El “porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (%) “con respecto a la secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a aquellos en la secuencia polipeptídica de referencia, cuando se introducen espacios según sea necesario para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia y no se consideran sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Las comparaciones con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos pueden lograrse de diversas maneras dentro de los conocimientos de la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo contraste en toda la longitud de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos de la presente invención, el valor porcentual de identidad de secuencia de aminoácidos se genera usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2.

En el caso de comparar secuencias de aminoácidos usando ALIGN-2, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A determinada con respecto a una secuencia de aminoácidos B determinada (alternativamente, puede expresarse como una secuencia de aminoácidos A determinada que tiene o que contiene un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o para una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula tal como sigue:

fracción X/Y entre 100

donde X es el número de residuos de aminoácidos idénticamente coincidentes puntuados por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en las alineaciones A y B del programa, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtuvieron usando el programa informático ALIGN-2 tal como se describe en el párrafo anterior.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “tratamiento” y “que trata” se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser la prevención completa o parcial de una enfermedad o sus síntomas y/o la curación parcial o completa de la enfermedad y/o sus síntomas, e incluye: (a) prevención del desarrollo de la enfermedad en un sujeto que puede tener una predisposición a la enfermedad, pero no se le ha diagnosticado que la padece; (b) supresión de la enfermedad, es decir, bloqueo de su formación; y (c) alivio de la enfermedad y/o sus síntomas, es decir, eliminar la enfermedad y/o sus síntomas.

Los términos “individuo”, “sujeto” y “paciente” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a mamíferos, incluyendo, pero sin limitarse a, murinos (ratas y ratones), primates no humanos, humanos, perros, gatos, animales con pezuñas (por ejemplo, caballos, vacas, ovejas, cerdos, cabras), etc.

“Cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad de plasminógeno suficiente para lograr la prevención y/o tratamiento descrito de una enfermedad cuando se administra a un mamífero u otro sujeto para tratar la enfermedad. La “cantidad terapéuticamente eficaz” variará dependiendo del plasminógeno usado, la afección del sujeto que va a tratarse y/o la gravedad de sus síntomas, así como la edad, el peso y similares.

2. Preparación de plasminógeno de la presente invención

El plasminógeno puede aislarse y purificarse de la naturaleza para usos terapéuticos adicionales y también puede sintetizarse mediante técnicas químicas convencionales de síntesis de péptidos. Cuando se sintetizan químicamente polipéptidos, pueden sintetizarse en fase líquida o sólida. La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) (en la que el aminoácido C-terminal de la secuencia se une al soporte insoluble, seguido de la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia) es un método adecuado para la síntesis química de plasminógeno. Pueden usarse diversas formas de SPPS, tales como Fmoc y Boc, para sintetizar plasminógeno. Las técnicas para la síntesis en fase sólida se describen en Barany and Solid-Phase Peptide Synthesis; páginas 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, parte A., Merrifieldet al.,J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewartet al.,Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Illinois (1984); y Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10 y Camarero JAet al.,2005 Protein Pept Lett. 12:723-8. Brevemente, tratar pequeñas perlas porosas insolubles con unidades funcionales sobre las que se construyen cadenas peptídicas. Después de ciclos repetidos de acoplamiento/desprotección, la amina N-terminal libre sólida unida se acopla a una única unidad de aminoácido N-protegido. Luego, la unidad se desprotege para exponer nuevas aminas N-terminales que pueden unirse a otros aminoácidos. El péptido permanece inmovilizado en la fase sólida, después de lo cual se corta.

Pueden usarse métodos recombinantes convencionales para producir el plasminógeno de la invención. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para plasminógeno se inserta en un vector de expresión de modo que esté unido operativamente a una secuencia reguladora en el vector de expresión. Las secuencias de control de expresión incluyen, pero no se limitan a, promotores (por ejemplo, promotores heterólogos o asociados naturalmente), secuencias señal, elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción. La regulación de la expresión puede ser un sistema promotor eucariota en un vector, el vector que es capaz de transformar o transfectar una célula huésped eucariota (por ejemplo, células COS o CHO). Una vez que el vector se incorpora a un huésped adecuado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de la secuencia de nucleótidos y la recogida y purificación del plasminógeno.

Un vector de expresión adecuado normalmente se replica en el organismo huésped como un episoma o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. En general, los vectores de expresión contienen un marcador de selección (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a kanamicina o resistencia a neomicina) para facilitar la detección de aquellas células que se transforman exógenamente con la secuencia de ADN deseada.

Escherichia colies un ejemplo de una célula huésped procariota que puede usarse para clonar un polinucleótido que codifica para plasminógeno. Otros huéspedes microbianos adecuados para su uso incluyen bacilos, tales comoBacillus subtilisy otrasEnterobacteriaceae,tales comoSalmonella, Serratia,y diversas especies dePseudomonas.En estos huéspedes procariotas, también pueden generarse vectores de expresión que normalmente contendrán secuencias de control de expresión (por ejemplo, orígenes de replicación) que son compatibles con la célula huésped. Además, habrá muchos promotores conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, el sistema promotor de triptófano (trp), el sistema promotor de p-lactamasa o el sistema promotor del fago X. Un promotor normalmente controla la expresión, opcionalmente en el caso de manipulación de secuencias genéticas, y tiene secuencias de sitios de unión a ribosomas, etc., para iniciar y completar la transcripción y traducción.

También pueden usarse para la expresión otros microorganismos tales como levaduras. Levadura (tal como S.cerevisiae)yPichiason ejemplos de células huésped de levadura adecuadas, donde los vectores apropiados tienen secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores), orígenes de replicación, secuencias de terminación, etc., según se desee. Los promotores típicos incluyen la 3-fosfoglicerato cinasa y otras enzimas sacarolíticas. La levadura inducible inicia promotores que incluyen específicamente enzimas derivadas de la alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C, y responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

Además de los microorganismos, también pueden usarse células de mamíferos (por ejemplo, células de mamíferos cultivadas en cultivo celularin vitro)para expresar y producir la proteína de la invención (por ejemplo, polinucleótidos que codifican para la proteína en cuestión). Véase Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Las células huésped de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares CHO, diversas líneas celulares Cos, células HeLa, líneas celulares de mieloma y células B transformadas o hibridomas. Los vectores de expresión para estas células pueden contener secuencias de control de expresión, tales como orígenes de replicación, promotores y potenciadores (Queenet al.,Immunol. Apocalipsis 89:49 (1986)), y requirieron sitios de información de procesamiento como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Ejemplos de secuencias de control de expresión adecuadas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina blanca, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, citomegalovirus y similares. Véase Coet al.,J. Immunol. 148: 1149 (1992).

Una vez sintetizado (por medios químicos o recombinantes), el plasminógeno de la presente invención puede purificarse según procedimientos convencionales en la técnica, incluyendo la precipitación con sulfato de amonio, columna de afinidad, cromatografía en columna, cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), electroforesis en gel, etc. El plasminógeno es sustancialmente puro, por ejemplo, al menos aproximadamente del 80 % al 85 % puro, al menos aproximadamente del 85 % al 90 % puro, al menos aproximadamente del 90 % al 95 % puro, o del 98 % al 99 % puro, o más puro, por ejemplo, libre de contaminantes, contaminantes tales como restos celulares, macromoléculas distintas del plasminógeno y similares.

3. Formulaciones farmacéuticas

Puede prepararse una formulación terapéutica mezclando un plasminógeno de la pureza deseada con un portador, excipiente o estabilizador farmacéutico opcional (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. ed. (1980)) para formar una formulación liofilizada o solución acuosa. Los portadores, excipientes y estabilizadores aceptables no son tóxicos para el receptor en las dosis y concentraciones usadas e incluyen tampones tales como fosfatos, citratos y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (por ejemplo, cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexanodiamina; cloruro de benzalconio, cloruro de benzoxonio; fenol, butanol o alcohol bencílico, p-hidroxibenzoato de alquilo tal como p-hidroxibenzoato de metilo o propilo; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agente quelante tal como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, fucosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de zinc-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEENTM, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Las formulaciones también pueden contener más de un compuesto activo requerido para la afección particular que está tratándose, preferiblemente aquellos que tienen actividad complementaria y no tienen efectos secundarios entre sí. Por ejemplo, fármacos antihipertensivos, fármacos antiarrítmicos, fármacos para el tratamiento de la diabetes, etc.

El plasminógeno de la presente invención puede encapsularse en microcápsulas preparadas mediante técnicas tales como coacervación o polimerización interfacial, por ejemplo, puede colocarse en un sistema de administración de fármacos coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o puede colocarse en microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gel y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo) en macroemulsiones. Estas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).

El plasminógeno de la presente invención para administraciónin vivodebe ser estéril. Esto puede lograrse fácilmente mediante filtración a través de un filtro estéril antes o después de la liofilización y la reconstitución.

El plasminógeno de la presente invención puede preparar una preparación de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que tienen una forma y contienen glicoproteínas, tales como películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliéster, hidrogel (tal como poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langeret al.,J. Biomed. Madre. Res., 15: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)) o poli(alcohol vinílico), polilactida (patente estadounidense 3.773.919, documento EP 58.81), copolímero de ácido L-glutámico y ácido y etilL-glutámico (Sidmanet al.,Biopolymers 22:547 (1983)), acetato de etilenvinilo no degradable (Langer,et al.,ibid.), o copolímero de ácido láctico-ácido glicólico degradable tal como Lupron DepotTM (microesferas inyectables que se componen de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli D-(-)-3-hidroxibutírico. Polímeros tales como acetato de etilenvinilo y ácido láctico-glicólico pueden mantener la liberación de moléculas durante más de 100 días, mientras que algunos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Puede diseñarse una estrategia racional para la estabilización de proteínas basada en mecanismos relevantes. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de aglomeración es la formación de enlaces S-S intermoleculares mediante el intercambio de enlaces tiodisulfuro, la estabilización puede lograrse modificando los residuos de tiol, liofilizando a partir de disoluciones ácidas, controlando la humedad, usando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.

4. Administración y dosificación

La composición farmacéutica de la invención puede administrarse de diferentes maneras, por ejemplo, mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intracraneal, intratecal, intraarterial (tal como a través de la carótida), intramuscular, intranasal, tópica o intradérmica o administración en la médula espinal o el cerebro. Las formulaciones tales como formulaciones de aerosol nasal contienen disoluciones acuosas purificadas u otras disoluciones de agentes activos con conservantes y agentes isotónicos. Tales formulaciones se ajustan a un pH y un estado isotónico compatibles con la mucosa nasal.

En algunos casos, la composición farmacéutica de plasminógeno de la presente invención puede modificarse o formularse de la siguiente manera para proporcionar su capacidad para cruzar la barrera hematoencefálica. Las composiciones de tal plasminógeno pueden administrarse a individuos que padecen trombosis y/o enfermedades relacionadas con la trombosis a través de una variedad de vías de administración enteral y parenteral que incluyen oral, intravenosa y similares.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo agua salada y medios tampón. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro de sodio, dextrosa Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen suplementos líquidos y nutritivos, suplementos de electrolitos, etc. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, etc.

En algunas realizaciones, el plasminógeno de la presente invención se formula con un agente que promueve el cruce de la barrera hematoencefálica. En algunos casos, el plasminógeno de la presente invención se fusiona directamente o mediante un ligador con una molécula portadora, péptido o proteína que promueve el cruce de la barrera hematoencefálica. En algunas realizaciones, el plasminógeno de la presente invención se fusiona con un polipéptido que se une al receptor endógeno de la barrera hematoencefálica (BHE). El polipéptido que se une al plasminógeno y al receptor endógeno de la BHE facilita el cruce de la BHE. Los polipéptidos adecuados que se unen a receptores de la BHE endógenos incluyen anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a receptores de la BHE endógenos. Los receptores de la BHE endógenos adecuados incluyen, pero no se limitan a, receptores de insulina, receptores de transferrina, receptores de lipoproteínas y receptores de factores de crecimiento similares a la insulina. En algunos casos, los anticuerpos están encapsulados en liposomas. Véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2009/0156498.

El personal médico determinará el esquema de dosis en función de diversos factores clínicos. Tal como se sabe en el campo médico, la dosis de cualquier paciente depende de una variedad de factores, incluyendo el tamaño del paciente, la superficie corporal, la edad, el compuesto específico que se administrará, el sexo, el número y la vía de administración, la salud general y otros medicamentos administrados simultáneamente. El intervalo de dosis de la composición farmacéutica que contiene plasminógeno de la presente invención puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 a 2000 mg/kg, o de aproximadamente 0,001 a 500 mg/kg (por ejemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 10 mg/kg, 50 mg/kg, etc.) del peso del sujeto por día. Por ejemplo, la dosis puede ser de 1 mg/kg de peso corporal o de 50 mg/kg de peso corporal o en el intervalo de 1-50 mg/kg, o al menos 1 mg/kg. También se cubren las dosis por encima o por debajo de este intervalo a modo de ejemplo, especialmente considerando los factores anteriores. La dosis intermedia en el intervalo anterior también está incluida en el alcance de la presente invención. A los sujetos pueden administrárseles dichas dosis diariamente, en días alternos, semanalmente o en cualquier otro horario determinado mediante análisis empírico. Los esquemas de dosis ejemplares incluyen de 1 a 10 mg/kg durante días consecutivos. En el proceso de administración de fármacos de la presente invención, se requiere una evaluación en tiempo real y una evaluación regular del efecto terapéutico y la seguridad de la trombosis y las enfermedades relacionadas con la trombosis.

5. Evaluación de eficacia y seguridad terapéutica

Eficacia terapéutica

La evaluación de la eficacia terapéutica del plasminógeno se realiza principalmente mediante el seguimiento de los siguientes indicadores:

(1) Tasa de trombólisis después de 1 semana de tratamiento. Por ejemplo, pueden inyectarse agentes de contraste a través de catéteres para evaluar la trombólisis diariamente y puntuar el área de cada vaso sanguíneo. 0 significa completamente abierto, 1 oclusión parcial y 2 oclusión completa. Según la razón entre la puntuación total antes de la trombólisis menos la puntuación total después de la trombólisis y dividida entre la puntuación total antes de la trombólisis, la trombólisis se divide en diferentes niveles. El primer nivel es <50 %, el segundo nivel es del 50 % al 90 % y el tercer nivel es la disolución completa del trombo.

(2) Tasa de permeabilidad vascular después de 6 meses. Por ejemplo, la tasa de permeabilidad vascular puede evaluarse mediante endoscopia, análisis de angiografía por TC, ecografía Doppler color y similares. La eficacia del tratamiento se juzga en función de si existe un aumento estadísticamente significativo en el porcentaje de permeabilidad vascular después del tratamiento en comparación con antes del mismo.

(3) Oclusión vascular y/o tasa de reflujo venoso a los 6 meses. La mejora de la tasa de trombólisis de los fármacos se juzga contando la disminución de la oclusión vascular y/o la tasa de reflujo venoso después del tratamiento. (4) Otros indicadores de evaluación. Por ejemplo, cambios en el eco endovascular, comparación del grosor de la pared vascular, incidencia de secuelas trombóticas después de 2 años, etc. Por ejemplo, el grosor de la pared vascular y el eco intraluminal pueden evaluarse mediante ecografía en escala de grises, mientras que el flujo sanguíneo de la vena ilíaca y femoral y la insuficiencia valvular de la vena femoral pueden permitir que los pacientes adopten posturas de pie para la evaluación con ecografía Doppler.

Evaluación de seguridad

Se evalúa la seguridad después del tratamiento con medicamentos de plasminógeno para la trombosis. La evaluación incluye principalmente el seguimiento de la incidencia de acontecimientos adversos después del tratamiento. El sangrado grave, la embolia, el accidente cerebrovascular y la muerte generalmente se definen como acontecimientos adversos graves, mientras que el sangrado secundario y otros síntomas menores de complicaciones se definen como acontecimientos adversos menores.

Para la evaluación de seguridad, los acontecimientos adversos más comunes son el sangrado, tales como la hemorragia intracraneal (también conocida como accidente cerebrovascular hemorrágico, que incluye hemorragia subaracnoidea, hemorragia subdural, etc.). Dicho sangrado grave en la presente invención se refiere generalmente a sangrado intracerebral o sangrado que es lo suficientemente grave como para provocar la muerte, cirugía, cese del tratamiento o sangrado que requiere transfusión de sangre, incluyendo “hemorragia importante” y “hemorragia potencialmente mortal”. El sangrado secundario se refiere al sangrado alrededor de la vaina del catéter y/o al sangrado que puede detenerse cambiando la dosis de un agente trombolítico, anticoagulante o antiplaquetario, o mediante compresión. Los términos “hemorragia importante” y “acontecimiento hemorrágico importante” se refieren específicamente a un contenido de hemoglobina reducido en al menos 2,0 g/l o a una transfusión de sangre de al menos 2 unidades de sangre, o a un sangrado sintomático en un sitio u órgano clave. Los acontecimientos hemorrágicos que son más graves que la “hemorragia importante”, es decir, una subcategoría de acontecimientos hemorrágicos importantes, se denominan “acontecimientos hemorrágicos potencialmente mortales”, que incluyen hemorragia fatal, hemorragia intracerebral sintomática, reducción de la hemoglobina de al menos 5,0 g/l o transfusión de sangre que requiera más de 4 unidades o sangrado que requiera agente de contracción del miocardio o cirugía.

Además, para la evaluación de pacientes con factores de riesgo de acontecimientos hemorrágicos importantes, ajustar sus dosis y monitorizar los acontecimientos adversos después de su administración durante al menos 3 meses, preferiblemente 6 meses o más, dependiendo de la gravedad de la afección. El riesgo de hemorragia importante incluye, pero no se limita a, (1) tener 75 años o más, (2) antecedentes de acontecimientos hemorrágicos previos y (3) tener un aclaramiento de creatinina reducido que sea inferior a 80 ml/minuto o inferior a 50 ml/minuto.

6. Artículos de fabricación o kits

La memoria descriptiva también se refiere a un artículo o kit que comprende plasminógeno que puede usarse para tratar la trombosis. El artículo incluye preferiblemente un recipiente, etiqueta o prospecto. Los recipientes adecuados incluyen botellas, viales, jeringas, etc. El recipiente puede estar elaborado de diversos materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición. La composición es eficaz para tratar la enfermedad o afección tal como se describe en la presente invención y tiene una entrada estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o vial de disolución intravenosa que contiene un tapón que puede perforarse con una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es plasminógeno. El recipiente o la etiqueta adjunta indica que la composición se usa para tratar la trombosis y las enfermedades relacionadas con la trombosis de la presente invención. El artículo puede comprender además un segundo recipiente que contiene un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y disolución de glucosa. Además, puede contener otras sustancias requeridas desde una perspectiva comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Además, el artículo contiene un prospecto con instrucciones de uso, que incluyen, por ejemplo, instrucciones para que el usuario de la composición administre la composición de plasminógeno y otros medicamentos para tratar la enfermedad acompañante al paciente.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el efecto trombolítico de diferentes dosis de plasminógeno en un trombo antiguo de 20 horas en presencia de 125 ng de tPA, incubación a 37 °C durante 1 hora.

La figura 2 muestra el efecto trombolítico de diferentes dosis de plasminógeno en un trombo antiguo de 20 horas en presencia de 125 ng de tPA, incubación a 37 °C durante 2 horas.

La figura 3 muestra el efecto trombolítico de diferentes dosis de plasminógeno en un trombo antiguo de 20 horas cuando se incuba a 37 °C durante 2 horas con 10 ng de tPA.

La figura 4 muestra el efecto trombolítico de diferentes dosis de plasminógeno en un trombo antiguo de 72 horas cuando se incuba a 37 °C durante 2 horas a 125 ng de tPA.

La figura 5 muestra el efecto trombolítico de diferentes dosis de plasminógeno en un trombo antiguo de 72 horas cuando se incuba a 37 °C durante 2 horas con 10 ng de tPA.

La figura 6 muestra cambios en las tasas de trombólisis a lo largo del tiempo con la adición de 10 ng de tPA y 1 mg de plg o 5 pg de tPA solo a un trombo antiguo de 20 horas.

La figura 7 muestra el efecto trombolítico de diferentes dosis de plasminógeno en un trombo antiguo de 20 horas cuando se incuba a 37 °C durante 1 hora con 100 ng de uPA.

La figura 8 muestra el efecto trombolítico de diferentes dosis de plasminógeno en un trombo antiguo de 20 horas cuando se incuba a 37 °C durante 2 horas con 1 ng de uPA.

La figura 9 muestra los resultados de un experimento de adsorción específica de plasminógeno para tromboin vivo.La figura 10 muestra el efecto trombolítico de diferentes dosis de plasminógeno en un trombo nuevo de 30 minutos cuando se incuba a 37 °C durante 2 horas a 125 ng de tPA.

La figura 11 muestra los resultados de la detección de la concentración de dímero D en suero después de 15 días de administración de plasminógeno en ratones diabéticos de 24-25 semanas de edad.

La figura 12 muestra los resultados de la tinción inmunohistoquímica de fibrina cardíaca después de 31 días de administración de PBS (A) o plasminógeno (B) en ratones diabéticos de 24-25 semanas de edad.

La figura 13 muestra los resultados de la tinción inmunohistoquímica de fibrina renal después de 31 días de administración de PBS (A) o plasminógeno (B) en ratones diabéticos de 24-25 semanas de edad.

La figura 14 muestra los resultados de la tinción inmunohistoquímica de fibrina hepática después de 31 días de administración de PBS (A) o plasminógeno (B) en ratones diabéticos de 24-25 semanas de edad.

La figura 15 muestra la tinción inmunohistoquímica de fibrina del nervio ciático después de 15 días de administración de PBS (A) o plasminógeno (B) en ratones de 24-25 semanas de edad con daño nervioso diabético avanzado.Ejemplo

Materiales y métodos:

Experimentosin vivo:

Animales de experimentación

Se adquieren ratones C57 (de 6-8 semanas de edad) del Centro Experimental de Animales de la Universidad Médica del Sur. Los ratones adquiridos se mantienen en habitaciones para animales con un entorno de barrera. Los ratones Db/db se adquieren del Instituto de Investigación Biomédica de Nanjing.

Diseño y administración experimental

Después de la disección de las arterias carótidas de todos los animales del grupo control y del grupo experimental, se modela la trombosis de la arteria carótida unilateral con un papel de filtro que contiene FeCb al 10 % durante 5 minutos. La inyección intravenosa de plasminógeno se inicia en el plazo de 1 hora después de que se establece el modelo, y al grupo de control se le inyecta por vía intravenosa un volumen igual de PBS. Después de 3 horas, se retiran los trombos de la vena yugular correspondientes y los músculos cercanos a la vena contralateral. Los trombos y los músculos cercanos a la vena contralateral se homogeneizan usando un triturador y el sobrenadante se retira después de la centrifugación. Se somete a ensayo el sobrenadante para determinar la proteína total mediante el método BCA y se mide el contenido de plasminógeno en el homogeneizado mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para calcular el contenido de plasminógeno en una determinada cantidad de proteína total. Estudiar la especificidad de la trombólisisin vivopor plasminógeno.

Además, a ratones db/db de 24-25 semanas de edad se les administra disolvente PBS o plasminógeno a través de las venas de la cola respectivamente, como animales de control y de experimentación. Después de 31 días, se toman los globos oculares para la detección del dímero D y se realiza una tinción inmunohistoquímica de fibrina en los nervios, el hígado, los riñones y el corazón para estudiar el efecto trombolítico del plasminógenoin vivo.

Análisis de dímero D en sangre

Se extraen globos oculares de los ratones para extraerles sangre y obtener plasma. Los experimentos se realizan según el kit de dímero D (Wuhan USCN, China). Una vez completada la prueba, se realiza una lectura a 450 nm usando un lector de microplacas (Biotek, EE.UU.) para el análisis de datos.

Análisis inmunohistoquímico

Se recogen nervios, hígado, riñones y corazón y se fijan en formalina neutra al 10 % durante más de 24 horas. Los tejidos fijados se deshidratan mediante gradiente de etanol y se incrustan en parafina. La parafina se corta hasta un grosor de 5 pm y las secciones se lavan una vez después de la desparafinación en agua. Luego dibujar un círculo alrededor de los tejidos con una pluma PAP. Incubar con peróxido de hidrógeno diluido con metanol al 0,3 % durante 15 minutos y lavar tres veces. Bloquear con suero normal al 10 % homólogo al anticuerpo secundario durante 10 minutos y absorber el exceso de suero. Incubar con anticuerpo primario durante 30 minutos a temperatura ambiente 0 durante la noche a 4^ y lavar tres veces con TBS. Incubar con anticuerpo secundario marcado con HRP durante 30 minutos a temperatura ambiente y lavar tres veces con TBS. Teñir según el kit DAB (Vector laboratories, Inc., EE.UU.), contrateñir con hematoxilina durante 30 segundos, enjuagar con agua durante 5 minutos y luego lavar una vez con TBS. Se siguen deshidratación en gradiente, aclarado y montaje. Los anticuerpos usados son: el anticuerpo marcador es el anticuerpo antifibrinógeno (Abcam). Los cortes se observan bajo un microscopio óptico (Olympus, BX43).

Diseño experimental trombolíticoin vitro:

Se recoge plasma humano sano en una placa ELISA de 96 pocillos. Añadir una cantidad fija de trombina (Sigma, EE.UU.) para formar un trombo y luego realizar los siguientes experimentos diferentes. Añadir cantidades fijas de tPA, uPA (sigma, EE.UU.) y diferentes cantidades de plasminógeno, cantidades fijas de plasminógeno y diferentes cantidades de tPA, uPA, estreptocinasa (sigma, EE.UU.) y añadir PBS en el grupo de control. Incubar durante diferentes periodos de tiempo hasta que se produzca la trombólisis. Las lecturas de absorbancia y el momento de cada medición se observan y registran en un lector de microplacas (Biotek, EE.UU.) a la longitud de onda de DO405. Se analizan los datos.

Ejemplo 1. Efecto trombolítico de diferentes dosis de plasminógeno en un trombo antiguo de 20 horas cuando se incuba a 37 °C durante 1 hora con 125 ng de tPA

Se recoge individualmente sangre completa de dos ratas SD en tubos Eppendorf (EP) y el sobrenadante se descarta después de la incubación a 37 °C durante 20 h para formar trombos antiguos [33, 34]. Añadir PBS y lavar repetidamente de 5-10 veces hasta que la disolución de PBS añadida se vuelva transparente. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible. Luego colocar el trombo de manera uniforme en cada tubo EP y pesar el trombo. Procurar que el peso de cada trombo sea constante. Los trombos se dividen en un grupo de control en blanco de PBS, un grupo de control de 125 ng de tPA, un grupo de control de 20 pg de tPA, un grupo de plasminógeno de 0,2 mg, un grupo de plasminógeno de 1 mg y un grupo de plasminógeno de 2 mg. 3 tubos por grupo. Se añade 1 ml de PBS al grupo de control en blanco de PBS; se añaden 1 ml de PBS y 125 ng de tPA en el grupo de control de 125 ng de tPA; se añaden 1 ml de PBS y 20 pg de tPA en un grupo de control de 20 pg de tPA; se añaden 1 ml de PBS, 125 ng de tPA y 0,2 mg de plasminógeno en un grupo de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 125 ng de tPA y 1 mg de plasminógeno en un grupo de 1 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 125 ng de tPA y 2 mg de plasminógeno en un grupo de 2 mg de plasminógeno. Todas las reacciones se realizan en una incubadora a 37 °C. Después de una incubación de 1 hora, se aspira el sobrenadante. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible y pesar el trombo. Calcular la tasa de trombólisis.

Según la bibliografía, el contenido de tPA es de 5-10 ng/ml en condiciones fisiológicas normales [35], mientras que, en el caso de ejercicio extenuante o congestión venosa, el contenido de tPA en el cuerpo aumenta de desde 20 hasta 100 veces, es decir, más de 100 ng/ml [36]. Por tanto, la dosis de tPA usada en este experimento es de 125 ng/ml para imitar el contenido de tPA que se produce de manera natural en el caso de trombosisin vivo.Los resultados muestran que, para los trombos antiguos formadosin vitrodurante 20 horas, las tasas de trombólisis cuando se añaden 0,2 mg, 1 mg, 2 mg de plasminógeno en la condición de 125 ng de tPA son significativamente mayores que cuando se añaden 125 ng de tPA solo y las diferencias estadísticas son extremadamente significativas, lo que indica que en el caso de niveles de tPA que se producen de manera natural en presencia de trombosis en el cuerpo, la adición de 0,2 mg o más de plasminógeno durante 1 hora puede promover significativamente la trombólisis. En la condición de 125 ng de tPA, la adición de 1 mg de plasminógeno puede lograr el mismo efecto trombolítico que la inyecciónin vivode 20 pg de tPA (según las instrucciones para la alteplasa inyectable producida por Boehringer Ingelheim, la dosis requerida para la trombólisis en el caso de trombosisin vivose convierte en la dosis de inyección requerida en ratas). Es decir, para lograr la misma tasa de trombólisis, si hay 1 mg de plasminógenoin vivo,la cantidad de tPA requerida puede reducirse al 1/160 original. Además, en la condición de 125 ng de tPA, la adición de 1 mg de plasminógeno alcanza el pico de trombólisis de plasminógeno, y la adición de 1 vez más de plasminógeno tiene una tendencia decreciente en cuanto a la tasa de trombólisis, lo que indica que hay saturación para la adición de plasminógeno y la saturación es de aproximadamente 1 a 2 mg (figura 1).

Ejemplo 2. Efecto trombolítico de diferentes dosis de plasminógeno en un trombo antiguo de 20 horas cuando se incuba a 37 °C durante 2 horas con 125 ng de tPA

Se recoge individualmente sangre completa de dos ratas SD en tubos EP y el sobrenadante se descarta después de la incubación a 37 °C durante 20 h para formar trombos antiguos [33, 34]. Añadir PBS y lavar repetidamente de 5-10 veces hasta que la disolución de PBS añadida se vuelva transparente. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible. Luego colocar el trombo de manera uniforme en cada tubo EP y pesar el trombo. Procurar que el peso de cada trombo sea constante. Los trombos se dividen en un grupo de control en blanco de PBS, un grupo de control de 125 ng de tPA, un grupo de control de 20 pg de tPA, un grupo de plasminógeno de 0,2 mg, un grupo de plasminógeno de 1 mg y un grupo de plasminógeno de 2 mg. 3 tubos por grupo. Se añade 1 ml de PBS al grupo de control en blanco de PBS; se añaden 1 ml de PBS y 125 ng de tPA en el grupo de control de 125 ng de tPA; se añaden 1 ml de PBS y 20 pg de tPA en un grupo de control de 20 pg de tPA; se añaden 1 ml de PBS, 125 ng de tPA y 0,2 mg de plasminógeno en un grupo de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 125 ng de tPA y 1 mg de plasminógeno en un grupo de 1 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 125 ng de tPA y 2 mg de plasminógeno en un grupo de 2 mg de plasminógeno. Todas las reacciones se realizan en una incubadora a 37 °C. Después de una incubación de 2 horas, se aspira el sobrenadante. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible y pesar el trombo. Calcular la tasa de trombólisis.

Según la bibliografía, el contenido de tPA es de 5-10 ng/ml en condiciones fisiológicas normales [35], mientras que, en el caso de ejercicio extenuante o congestión venosa, el contenido de tPA en el cuerpo aumenta de desde 20 hasta 100 veces, es decir, más de 100 ng/ml [36]. Por tanto, la dosis de tPA usada en este experimento es de 125 ng/ml para imitar el contenido de tPA que se produce de manera natural en el caso de trombosisin vivo.Los resultados muestran que, para los trombos antiguos formadosin vitrodurante 20 horas, en comparación con el ejemplo 1, la tasa de trombólisis aumenta a medida que se prolonga el tiempo de reacción en cada grupo. Las tasas de trombólisis cuando se añaden 0,2 mg, 1 mg, 2 mg de plasminógeno en la condición de 125 ng de tPA son significativamente más altas que cuando se añaden 125 ng de tPA solo y las diferencias estadísticas son extremadamente significativas, lo que indica que en el caso de dosis de tPA que se producen de manera natural en presencia de trombosis en el cuerpo, la adición de 0,2 mg o más de plasminógeno durante 2 horas puede promover significativamente la trombólisis. Después de 2 horas de reacción, los efectos trombolíticos del grupo de plasminógeno de 1 mg y 2 mg son superiores a la dosis de inyección normalin vivodel grupo de control de 20 pg de tPA (según las instrucciones para la alteplasa inyectable producida por Boehringer Ingelheim, la dosis requerida para la trombólisis en el caso de la trombosisin vivose convierte en la dosis de inyección requerida en ratas). Es decir, para lograr la misma tasa de trombólisis, si hay 1 mg de plasminógeno en el sistema, la cantidad requerida de tPA puede reducirse a menos de 1/160 de la cantidad de tPA requerida (20 pg) sin 1 mg de plasminógeno en el sistema (figura 2).

Ejemplo 3. La tasa de trombólisis en un trombo antiguo de 20 horas con 10 ng de tPA aumenta al aumentar la dosis de plasminógeno

Se recoge individualmente sangre completa de dos ratas SD en tubos EP y el sobrenadante se descarta después de la incubación a 37 °C durante 20 h para formar trombos antiguos [33, 34]. Añadir PBS y lavar repetidamente de 5-10 veces hasta que la disolución de PBS añadida se vuelva transparente. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible. Luego colocar el trombo de manera uniforme en cada tubo EP y pesar el trombo. Procurar que el peso de cada trombo sea constante. Los trombos se dividen en un grupo de control en blanco de PBS, un grupo de control de 10 ng de tPA, un grupo de control de 0,2 mg de plasminógeno, un grupo de 0,2 mg de plasminógeno, un grupo de 1 mg de plasminógeno y un grupo de 2 mg de plasminógeno. 3 tubos por grupo. Se añade 1 ml de PBS al grupo de control en blanco de PBS; se añaden 1 ml de PBS y 10 ng de tPA en el grupo de control de 10 ng de tPA; se añaden 1 ml de PBS y 0,2 mg de plasminógeno al grupo de control de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 10 ng de tPA y 0,2 mg de plasminógeno en un grupo de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 10 ng de tPA y 1 mg de plasminógeno en un grupo de 1 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 10 ng de tPA y 2 mg de plasminógeno en un grupo de 2 mg de plasminógeno. Todas las reacciones se realizan en una incubadora a 37 °C. Después de una incubación de 2 horas, se aspira el sobrenadante. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible y pesar el trombo. Calcular la tasa de trombólisis.

Según la bibliografía, el contenido de tPA es de 5-10 ng/ml en condiciones fisiológicas normales [35]. Por tanto, la dosis de tPA usada en este experimento es de 10 ng/ml para imitar el contenido de tPA que se produce de manera natural en condiciones fisiológicas normalesin vivo.

Los resultados muestran que, para los trombos antiguos formadosin vitrodurante 20 horas, la tasa de trombólisis de cada grupo al que se le añadió plasminógeno es mayor que la del grupo de control en el que se añadió la dosis fisiológica de tPA solo, en la condición del contenido de tPA que se produce de manera natural (10 ng) en condiciones fisiológicas normales del cuerpo y las diferencias estadísticas son extremadamente significativas. Además, con el aumento de la cantidad de aditivo de plasminógeno, la tasa de trombólisis correspondiente también muestra una tendencia de aumento en gradiente, lo que indica que la velocidad de disolución del trombo antiguo de 20 horas puede ajustarse ajustando la dosis de plasminógeno. Además, en presencia de 0,2 mg de plasminógeno, la eficacia de la trombólisis es significativamente mayor en el grupo con el nivel fisiológicoin vivode tPA (10 ng) que en el grupo sin la adición de tPA, y el efecto trombolítico de la adición de 0,2 mg de plasminógeno solo es similar al de añadir PBS de control, lo que indica que los niveles fisiológicos de tPA desempeñan un papel clave en la trombólisis por el plasminógeno (figura 3).

Ejemplo 4. La tasa de trombólisis en un trombo antiguo de 72 horas con 125 ng de tPA aumenta al aumentar la dosis de plasminógeno

Se recoge individualmente sangre completa de dos ratas SD en tubos EP y el sobrenadante se descarta después de la incubación a 37 °C durante 72 horas para formar trombos antiguos [36]. Añadir PBS y lavar repetidamente de 5-10 veces hasta que la disolución de PBS añadida se vuelva transparente. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible. Luego colocar el trombo de manera uniforme en cada tubo EP y pesar el trombo. Procurar que el peso de cada trombo sea constante. Los trombos se dividen en un grupo de control en blanco de PBS, un grupo de control de 125 ng de tPA, un grupo de control de 0,2 mg de plasminógeno, un grupo de 0,2 mg de plasminógeno, un grupo de 1 mg de plasminógeno y un grupo de 2 mg de plasminógeno. 3 tubos por grupo. Se añade 1 ml de PBS al grupo de control en blanco de PBS; se añaden 1 ml de PBS y 125 ng de tPA en el grupo de control de 125 ng de tPA; se añaden 1 ml de PBS y 0,2 mg de plasminógeno al grupo de control de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 125 ng de tPA y 0,2 mg de plasminógeno en un grupo de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 125 ng de tPA y 1 mg de plasminógeno en un grupo de 1 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 125 ng de tPA y 2 mg de plasminógeno en un grupo de 2 mg de plasminógeno. Todas las reacciones se realizan en una incubadora a 37 °C. Después de una incubación de 2 horas, se aspira el sobrenadante. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible y pesar el trombo. Calcular la tasa de trombólisis.

Según la bibliografía, el contenido de tPA es de 5-10 ng/ml en condiciones fisiológicas normales [35], mientras que, en el caso de ejercicio extenuante o congestión venosa, el contenido de tPA en el cuerpo aumenta de desde 20 hasta 100 veces, es decir, más de 100 ng/ml [36]. Por tanto, la dosis de tPA usada en este experimento es de 125 ng/ml para imitar el contenido de tPA que se produce de manera natural en el caso de trombosisin vivo.Los resultados muestran que, para los trombos antiguos formadosin vitrodurante 72 horas, las tasas de trombólisis con la adición de plasminógeno en la condición de 125 ng de tPA son más altas que cuando se añaden 125 ng de tPA solo y las diferencias estadísticas son extremadamente significativas, lo que indica que en el caso de una dosis de tPA que se produce de manera natural (125 ng) en presencia de trombosis en el cuerpo, la adición de 0,2 mg o más de plasminógeno durante 2 horas puede promover significativamente la trombólisis en un trombo antiguo de 72 horas. Además, con el aumento en gradiente de la dosis del aditivo de plasminógeno, su tasa de trombólisis también muestra una tendencia de aumento en gradiente, lo que indica que la velocidad de disolución del trombo antiguo puede ajustarse ajustando la dosis de plasminógeno. Además, la tasa de trombólisis al añadir 4 mg de plasminógeno excede la tasa de trombólisis de 20 pg de tPA de dosis inyectable normal (según las instrucciones para la alteplasa inyectable producida por Boehringer Ingelheim, la dosis requerida para la trombólisis en el caso de trombosisin vivose convierte en la dosis de inyección requerida en ratas)in vivoen este experimento, lo que indica que en la condición de una dosis de tPA que se produce de manera natural (125 ng) en presencia de trombosis en el cuerpo, el efecto de añadir plasminógeno solo para disolver el trombo antiguo es superior al de los fármacos trombolíticos existentes (figura 4), lo que muestra que el plasminógeno puede ser un material trombolítico con mejor efecto trombolítico.

Además, en el ejemplo 2, la adición de 125 ng de tPA solo aumenta significativamente la capacidad de disolver el trombo de 20 horas en comparación con el grupo de control de PBS. Sin embargo, en el presente ejemplo, para el trombo antiguo de 72 horas, similar a la situaciónin vivo,el efecto trombolítico es casi el mismo para el grupo que añade 125 ng de tPA solo y el grupo de control de PBS, lo que indica que a medida que el trombo se vuelve más antiguo, la capacidad trombolítica del tPA producido de manera natural en condiciones fisiológicas disminuye gradualmente, lo que en un aspecto indica que el modelo usado en los ejemplos puede imitar la situaciónin vivohasta cierto punto.

Ejemplo 5. La tasa de trombólisis en un trombo antiguo de 72 horas con 10 ng de tPA aumenta al aumentar la dosis de plasminógeno

Se recoge individualmente sangre completa de dos ratas SD en tubos EP y el sobrenadante se descarta después de la incubación a 37 °C durante 72 h para formar trombos antiguos [36]. Añadir PBS y lavar repetidamente de 5-10 veces hasta que la disolución de PBS añadida se vuelva transparente. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible. Luego colocar el trombo de manera uniforme en cada tubo EP y pesar el trombo. Procurar que el peso de cada trombo sea constante. Los trombos se dividen en un grupo de control en blanco de PBS, un grupo de control de 10 ng de tPA, un grupo de control de 20 pg de tPA, un grupo de control de 0,2 mg de plasminógeno, un grupo de 0,2 mg de plasminógeno, un grupo de 1 mg de plasminógeno, un grupo de 2 mg de plasminógeno y un grupo de 4 mg de plasminógeno. 3 tubos por grupo. Se añade 1 ml de PBS al grupo de control en blanco de PBS; se añaden 1 ml de PBS y 10 ng de tPA en el grupo de control de 10 ng de tPA; se añaden 1 ml de PBS y 20 pg de tPA en un grupo de control de 20 pg de tPA; se añaden 1 ml de PBS y 0,2 mg de plasminógeno al grupo de control de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 10 ng de tPA y 0,2 mg de plasminógeno en un grupo de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 10 ng de tPA y 1 mg de plasminógeno en un grupo de 1 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 10 ng de tPA y 2 mg de plasminógeno en un grupo de 2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 10 ng de tPA y 4 mg de plasminógeno en un grupo de 4 mg de plasminógeno. Todas las reacciones se realizan en una incubadora a 37 °C. Después de una incubación de 2 horas, se aspira el sobrenadante. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible y pesar el trombo. Calcular la tasa de trombólisis.

Según la bibliografía, el contenido de tPA es de 5-10 ng/ml en condiciones fisiológicas normales [35]. Por tanto, la dosis de tPA usada en este experimento es de 10 ng/ml para imitar el contenido de tPA que se produce de manera natural en condiciones fisiológicas normalesin vivo.

El resultado experimental muestra que, para los trombos antiguos formadosin vitrodurante 72 horas, la tasa de trombólisis al añadir plasminógeno es mayor que la de añadir 10 ng de tPA solo cuando el contenido fisiológico normal de tPA es de 10 ng/ml en el cuerpo y la diferencia es extremadamente significativa. Está demostrado que en la condición de una dosis de tPA que se produce de manera natural (10 ng) en presencia de trombosis en el cuerpo, la adición de 0,2 mg o más de plasminógeno durante 2 horas puede promover significativamente la disolución de un trombo antiguo de 72 horas. A medida que aumenta la dosis de plasminógeno añadido, la tasa de trombólisis también muestra un aumento en gradiente, lo que indica que la tasa de disolución del trombo antiguo puede ajustarse ajustando la dosis de plasminógeno. Además, la tasa de trombólisis del grupo al que se le han añadido 4 mg de plasminógeno es similar a la de la dosis normal de inyección de tPA (según las instrucciones para la alteplasa inyectable de Boehringer Ingelheim, la dosis necesaria para la trombólisis en caso de trombosisin vivose convierte a la dosis de inyección requerida en ratas) (figura 5), lo que indica que en la condición del nivel fisiológico de la dosis de tPA (10 ng), el efecto de añadir plasminógeno solo para disolver trombos antiguos puede alcanzar el efecto de los fármacos trombolíticos existentes. En este sentido, se espera que el plasminógeno se convierta en un nuevo fármaco trombolítico para trombos antiguos.

Ejemplo 6. El plasminógeno disuelve moderadamente un trombo antiguo de 20 horas

Se recoge individualmente sangre completa de dos ratas SD en tubos EP y se descarta el sobrenadante después de la incubación a 37 °C durante 20 horas para formar trombos antiguos [33, 34]. Añadir PBS y lavar repetidamente de 5 10 veces hasta que la disolución de<p>B<s>añadida se vuelva transparente. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible. Luego colocar el trombo de manera uniforme en cada tubo EP y pesar el trombo. Procurar que el peso de cada trombo sea constante. Los trombos se dividen en dos grupos y 12 muestras por grupo. El primer grupo es el grupo de control de tPA, en el que se añaden 1 ml de PBS y 5 pg de tPA; el segundo grupo es el grupo del plasminógeno, en el que se añaden 1 ml de PBS, 10 ng de tPA y 1 mg de plasminógeno. Los experimentos previos demuestran que las tasas de trombólisis de estos dos grupos para trombos antiguos de 20 horas son similares en 2 horas (datos no mostrados). Todas las reacciones se realizan en una incubadora a 37 °C. Las muestras se recogen a las 0,5 h, 1 h, 1,5 h y 2 h respectivamente y se recogen tres muestras de los dos grupos respectivamente en cada momento. Aspirar el sobrenadante. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible y pesar el trombo. Calcular la tasa de trombólisis.

Según la bibliografía, el contenido de tPA es de 5-10 ng/ml en condiciones fisiológicas normales [35]. Por tanto, la dosis de tPA usada en este experimento es de 10 ng/ml para imitar el contenido de tPA que se produce de manera natural en condiciones fisiológicas normalesin vivo.

Los experimentos muestran que, para un trombo antiguo de 20 horas, la tasa de trombólisis total aumenta en ambos grupos con el tiempo, pero entre 0 y 0,5 horas y entre 0,5 y 1 hora, la pendiente de la curva trombolítica del grupo de plasminógeno es menor que la del grupo de tPA (figura 6). La tabla 1 muestra la comparación de la eficacia trombolítica de 1 mg de plasminógeno y la eficacia trombolítica de 5 pg de tPA solo a lo largo del tiempo en presencia de 10 ng de tPA. Tal como se muestra en la tabla 1, el 75 % de la tasa de trombólisis total durante 2 horas en el grupo de plasminógeno se concentra en aproximadamente 1 hora, y el 75 % de la tasa de trombólisis total durante 2 horas en el grupo de control de tPA se concentra en aproximadamente 0,5 horas. Estos datos muestran claramente que, en relación con el tPA, la tasa de trombólisis del plasminógeno es más moderada que la del tPA (figura 6, tabla 1).

Tabla 1. Cambios de la eficacia trombolítica de 1 mg de plasminógeno y la eficacia trombolítica de 5 pg de tPA solo a lo largo del tiempo en presencia de 10 ng de tPA

Ejemplo 7. El plasminógeno promueve la disolución de un trombo antiguo de 20 horas en la condición de 100 ng de uPA

Se recoge individualmente sangre completa de dos ratas SD en tubos EP y se descarta el sobrenadante después de la incubación a 37 °C durante 20 horas para formar trombos antiguos [33, 34]. Añadir PBS y lavar repetidamente de 5 10 veces hasta que la disolución de PBS añadida se vuelva transparente. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible. Luego colocar el trombo de manera uniforme en cada tubo EP y pesar el trombo. Procurar que el peso de cada trombo sea constante. Los trombos se dividen en un grupo de control en blanco de PBS, un grupo de control de 100 ng de uPA, un grupo de control de 0,2 mg de plasminógeno, un grupo de 0,2 mg de plasminógeno, un grupo de 1 mg de plasminógeno y un grupo de 2 mg de plasminógeno. 3 tubos por grupo. Se añade 1 ml de PBS al principio en el grupo de control en blanco de PBS; se añaden 1 ml de PBS y 100 ng de uPA en un grupo de control de 100 ng de uPA; se añaden 1 ml de PBS y 0,2 mg de plasminógeno al grupo de control de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 100 ng de uPA y 0,2 mg de plasminógeno en un grupo de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 100 ng de uPA y 1 mg de plasminógeno en un grupo de 1 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 100 ng de uPA y 2 mg de plasminógeno en un grupo de 2 mg de plasminógeno. Todas las reacciones se realizan en una incubadora a 37 °C. Después de una incubación de 1 hora, se aspira el sobrenadante. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible y pesar el trombo. Calcular la tasa de trombólisis.

Según la bibliografía, la constante de Michaelis tPA es de 0,18*10-7 mol/l durante la reacción enzimática con plasminógeno como sustrato [37], mientras que la constante de Michaelis de uPA es de 2,43*10-7 mol/l [38]. En otras palabras, en las mismas condiciones de reacción, la afinidad del tPA es aproximadamente 10 veces mayor que la del uPA en el mismo tiempo de reacción. Por tanto, en este experimento, se estima que la dosis de uPA es de 100 ng/ml según los 10 ng de tPA/ml usados en el ejemplo 3.

Los resultados muestran que, para los trombos antiguos formadosin vitrodurante 20 horas, después de cambiar el activador del plasminógeno de 10 ng de tPA a 100 ng de uPA, las tasas de trombólisis de los grupos que añadieron 0,2 mg, 1 mg y 2 mg de plasminógeno son significativamente más altas que las de los grupos que añadieron 100 ng de uPA solo, las diferencias estadísticas son extremadamente significativas (**P<0,01; ***P<0,001).

Está demostrado que, en el caso de una dosis de 100 ng de uPA, la adición de 0,2 mg o más de plasminógeno durante 1 hora puede promover significativamente la trombólisis y con el aumento del gradiente de aditivo de plasminógeno, la tasa de trombólisis también aumenta significativamente (figura 7). Indica que, en la condición de 100 ng de uPA, el plasminógeno puede promover la disolución de trombos antiguos.

Ejemplo 8. El plasminógeno promueve la disolución de un trombo antiguo de 20 horas en la condición de 1 ng de uPA.

Se recoge individualmente sangre completa de dos ratas SD en tubos EP y se descarta el sobrenadante después de la incubación a 37 °C durante 20 horas para formar trombos antiguos [33, 34]. Añadir PBS y lavar repetidamente de 5 10 veces hasta que la disolución de<p>B<s>añadida se vuelva transparente. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible. Luego colocar el trombo de manera uniforme en cada tubo EP y pesar el trombo. Procurar que el peso de cada trombo sea constante. Los trombos se dividen en un grupo de control en blanco de PBS, un grupo de control de 1 ng de uPA, un grupo de control de 0,2 mg de plasminógeno, un grupo de 0,2 mg de plasminógeno, un grupo de 1 mg de plasminógeno y un grupo de 2 mg de plasminógeno. 3 tubos por grupo. Se añade 1 ml de PBS al grupo de control en blanco de PBS; se añaden 1 ml de PBS y 1 ng de uPA en 1 ng de uPA del grupo de control; se añaden 1 ml de PBS y 0,2 mg de plasminógeno al grupo de control de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 1 ng de uPA y 0,2 mg de plasminógeno en un grupo de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 1 ng de uPA y 1 mg de plasminógeno en un grupo de 1 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 1 ng de uPA y 2 mg de plasminógeno en un grupo de 2 mg de plasminógeno. Todas las reacciones se realizan en una incubadora a 37 °C. Después de una incubación de 2 horas, se aspira el sobrenadante. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible y pesar el trombo. Calcular la tasa de trombólisis.

Según la bibliografía, el contenido de uPA es de 1 ng/ml en condiciones fisiológicas normales [35]. Por tanto, la dosis de uPA usada en este experimento es 1 ng/ml para imitar el contenido de uPA que se produce de manera natural en condiciones fisiológicas normalesin vivo.Los resultados muestran que, para los trombos antiguos formadosin vitrodurante 20 horas, cuando el uso de uPA se reduce a 1 ng de contenido corporal normal, la tasa de trombólisis de los trombos antiguos es generalmente lenta. Sin embargo, las tasas de trombólisis en los grupos de plasminógeno de 1 mg y 2 mg son significativamente más altas que las del grupo de control de 1 ng de uPA, con diferencias estadísticas. Indica que, en la condición de 1 ng de uPA, la adición de plasminógeno promueve significativamente la disolución del trombo antiguo (figura 8).

Ejemplo 9. Experimento de resangrado después de inyección intravenosa de tPA y plasminógeno en ratones Se seleccionan cincuenta y cinco ratones macho de tipo natural C57 de 11 semanas de edad y se realiza anestesia general con pentobarbital al 3 %. Cortar 3 mm de colas respectivamente, colocar las colas en agua tibia a 37^ y observar el estado del sangrado de la cola [39]. Después de la hemostasia, los ratones se dividen aleatoriamente en dos grupos, 5 en el grupo de tPA y 50 en el grupo de plasminógeno. En el grupo de tPA, se inyectan 400 pg/0,05 ml/cuerpo de tPA a través de la vena orbitaria; en el grupo del plasminógeno se inyecta 1 mg/0,05 ml/cuerpo de plasminógeno a través de la vena orbitaria. Durante el experimento, la vena de la cola del ratón siempre se coloca en agua tibia a 37 °C. Se observa la condición del sangrado experimental durante 20 minutos y se registra. Los resultados experimentales muestran que la inyección intravenosa de 400 pg de tPA puede provocar un resangrado en las heridas de la cola de ratones heridos que ya han coagulado, lo cual es un efecto secundario común de los fármacos con tPA. Sin embargo, los ratones a los que se les inyectó por vía intravenosa 1 mg de plasminógeno no tuvieron tales efectos secundarios (tabla 2), lo que sugiere que el plasminógeno es más seguro que el tPA.

Tabla 2. Resultados experimentales de hemorragiain vivodespués de la inyección intravenosa de tPA o plasminógeno en ratones

Ejemplo 10. Experimento de adsorción específica de plasminógeno sobre tromboin vivo

Se seleccionan nueve ratones de tipo natural y se dividen aleatoriamente en tres grupos, grupo de control con disolvente PBS, grupo con 0,2 mg de plasminógeno y grupo con 1 mg de plasminógeno. 3 ratones por grupo. La anestesia general se realiza usando pentobarbital al 3 % y se aíslan las venas yugulares de los ratones. El trombo venoso se forma aplicando papel absorbente (3 mm*5 mm) impregnado con disolución de FeCb al 10 % a la vena yugular durante 5 minutos. Inmediatamente después de la formación del trombo, se administra plasminógeno o disolvente PBS. En el grupo de control con disolvente PBS, se inyectan 100 pl de PBS a través de la vena de la cola y en el grupo de 1 mg de plasminógeno y de 0,2 mg de plasminógeno, se administran 1 mg y 0,2 mg de plasminógeno mediante inyección en la vena de la cola, respectivamente. Después de 3 horas, se retiran los trombos de la vena yugular correspondientes y los músculos cercanos a la vena contralateral. Los trombos y los músculos cercanos a la vena contralateral se homogeneizan usando un triturador y se retira el sobrenadante después de la centrifugación. Se somete a ensayo el sobrenadante para determinar la proteína total mediante el método BCA y se mide el contenido de plasminógeno en el homogeneizado mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas para calcular el contenido de plasminógeno en una determinada cantidad de proteína total.

Los resultados muestran que el contenido de plasminógeno en el trombo después de la formación de trombo es significativamente mayor que el del músculo. Además, el contenido de plasminógeno en el trombo aumentó adicionalmente después de la inyección intravenosa de plasminógeno. Estos resultados indican que, en presencia de trombosin vivo,el plasminógeno puede unirse específicamente a los trombos (figura 9) y ejercer además efectos trombolíticos, mientras que una vez que se inyecta tPA en los vasos sanguíneos, catalizará de forma no específica la trombólisis en los vasos sanguíneos. Los resultados de este experimento indican que el plasminógeno tiene una ventaja significativa de trombólisis específica con respecto al tPA.

Ejemplo 11. La tasa de trombólisis de un trombo nuevo de 30 minutos después de añadir plasminógeno aumenta significativamente

Se recoge individualmente sangre completa de dos ratas SD en tubos EP y se descarta el sobrenadante después de la incubación a 37 °C durante 30 minutos para formar un trombo nuevo [33]. Añadir PBS y lavar repetidamente de 5 10 veces hasta que la disolución de PBS añadida se vuelva transparente. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible. Luego colocar el trombo de manera uniforme en cada tubo EP y pesar el trombo. Procurar que el peso de cada trombo sea constante. Los trombos se dividen en un grupo de control en blanco de PBS, un grupo de control de 125 ng de tPA, un grupo de plasminógeno de 0,2 mg, un grupo de plasminógeno de 1 mg y un grupo de plasminógeno de 2 mg. 2 tubos por grupo. Se añade 1 ml de PBS al grupo de control en blanco de PBS; se añaden 1 ml de PBS y 125 ng de tPA en el grupo de control de tPA; se añaden 1 ml de PBS, 125 ng de tPA y 0,2 mg de plasminógeno en un grupo de 0,2 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 125 ng de tPA y 1 mg de plasminógeno en un grupo de 1 mg de plasminógeno; se añaden 1 ml de PBS, 125 ng de tPA y 2 mg de plasminógeno en un grupo de 2 mg de plasminógeno. Todas las reacciones se realizan en una incubadora a 37 °C. Después de una incubación de 2 horas, se aspira el sobrenadante. Secar el trombo con papel absorbente tanto como sea posible y pesar el trombo. Calcular la tasa de trombólisis.

Según la bibliografía, el contenido de tPA es de 5-10 ng/ml en condiciones fisiológicas normales [35], mientras que, en el caso de ejercicio extenuante o congestión venosa, el contenido de tPA en el cuerpo aumenta de desde 20 hasta 100 veces, es decir, más de 100 ng/ml [36]. Por tanto, la dosis de tPA usada en este experimento es de 125 ng/ml para imitar el contenido de tPA que se produce de manera natural en el caso de trombosisin vivo.Este experimento muestra que, para trombos nuevos formadosin vitrodurante 30 minutos, la tasa de trombólisis muestra una tendencia de aumento en gradiente en la condición de aumento en gradiente de la dosis de plasminógeno. Además, las tasas de trombólisis en cada grupo de plasminógeno son más altas que las del grupo de control donde se añade tPA solo, y las diferencias estadísticas son extremadamente significativas. Estos resultados indican que en el caso de niveles de tPA que se producen de manera natural en presencia de trombosis en el cuerpo, la adición de 0,2 mg o más de plasminógeno durante 1 hora puede promover significativamente la trombólisis (figura 10). Está demostrado que el plasminógeno no sólo puede promover la disolución de trombos antiguos, sino también la disolución de trombos nuevos.

Ejemplo 12. El plasminógeno promueve la disolución del microtrombo provocado por la diabetes

Diez ratones macho db/db de 24-25 semanas de edad se dividen aleatoriamente en dos grupos, un grupo de control tratado con disolvente PBS y un grupo tratado con plasminógeno. 5 ratones por grupo. El día de inicio del experimento se registra como día 0 cuando se pesan y agrupan los ratones. El segundo día del experimento cuando se inicia la administración de plasminógeno o PBS se registra como día 1. La administración continua se realiza durante 15 días. A los ratones del grupo tratado con plasminógeno se les inyecta plasminógeno a una dosis de 2 mg/0,2 ml/cuerpo/día a través de la vena de la cola, y a los del grupo de control tratado con disolvente PBS se les administra el mismo volumen de PBS. El día 16, se extraen los globos oculares para extraer sangre y, una vez que se deja reposar la sangre completa, se usa suero para detectar el contenido de dímero D en la sangre.

Los resultados muestran que después de 15 días de administración, el contenido de dímero D en el grupo tratado con plasminógeno aumenta significativamente (figura 11), lo que sugiere que el microtrombo provocado por la diabetes se disuelve significativamente después de la administración de plasminógeno.

Ejemplo 13. El plasminógeno promueve la trombólisis en tejido cardíaco en ratones diabéticos en fase avanzada Diez ratones macho db/db de 24-25 semanas de edad se dividen aleatoriamente en dos grupos, un grupo de control tratado con disolvente PBS y un grupo tratado con plasminógeno. 5 ratones por grupo. El día de inicio del experimento se registra como día 0 cuando se pesan y agrupan los ratones. El segundo día del experimento cuando se inicia la administración de plasminógeno o PBS se registra como día 1. La administración continua se realiza durante 31 días. A los ratones del grupo tratado con plasminógeno se les inyecta plasminógeno a una dosis de 2 mg/0,2 ml/cuerpo/día a través de la vena de la cola, y a los del grupo de control tratado con disolvente PBS se les administra el mismo volumen de PBS. Los ratones se sacrifican el día 32 y los corazones se recogen y se fijan en formalina neutra al 10 % durante 24 horas. El tejido cardíaco fijado se deshidrata en etanol en gradiente y se aclara en xileno, seguido de incrustación en parafina. El grosor de la sección de tejido es de 5 |im. Después de desparafinar y rehidratar, las secciones se lavan con agua una vez, se incuban con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 15 minutos y se lavan con agua dos veces durante 5 minutos cada vez. Bloquear con suero de oveja normal al 10 % (Vector laboratories, Inc., EE.UU.) durante 1 hora; luego descartar el suero de oveja y dibujar un círculo alrededor del tejido con una pluma PAP. Incubar con anticuerpo de conejo anti-fibrinógeno de ratón (Abcam) a 4 °C durante la noche y lavar con TBS dos veces durante 5 minutos cada vez. Incubar con el anticuerpo secundario, anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (HRP) (Abcam) durante 1 hora a temperatura ambiente y lavar con TBS dos veces durante 5 minutos cada vez. Teñir según el kit DAB (Vector laboratories, Inc., EE.UU.), contrateñir con hematoxilina durante 30 segundos después de lavar con agua 3 veces y aclarar con agua durante 5 minutos. Se siguen deshidratación en gradiente, aclarado y montaje. Las secciones se observan bajo un microscopio a 400 veces.

El fibrinógeno es un precursor de la fibrina. En presencia de daño tisular, como respuesta al estrés al daño del cuerpo, el fibrinógeno se hidroliza en fibrina [40'42], por lo que el nivel de fibrina puede usarse como un signo del grado de daño. La fibrina también es un componente importante de los trombos que se forman después de un daño tisular. Por tanto, el nivel de fibrina también puede usarse como marcador de trombo.

Los resultados muestran que, en comparación con el grupo de control tratado con disolvente PBS (figura 12A), el grupo tratado con plasminógeno (figura 12B) tiene una tinción positiva más clara de fibrina en el tejido cardíaco de ratones, lo que indica la reducción del depósito de fibrina en el tejido cardíaco del grupo tratado con plasminógeno, lo que refleja que el plasminógeno puede promover la reparación del daño del tejido cardíaco provocado por la diabetes, y también demuestra que el plasminógeno puede promover la disolución del trombo del tejido cardíaco. Ejemplo 14. El plasminógeno promueve la trombólisis en tejido renal en ratones diabéticos en fase avanzada Veinte ratones macho db/db de 24-25 semanas de edad se dividen aleatoriamente en dos grupos, un grupo de control tratado con disolvente PBS y un grupo tratado con plasminógeno. 10 ratones por grupo. El día de inicio del experimento se registra como día 0 cuando se pesan y agrupan los ratones. El segundo día del experimento cuando se inicia la administración de plasminógeno o PBS se registra como día 1. La administración continua se realiza durante 31 días. A los ratones del grupo tratado con plasminógeno se les inyecta plasminógeno a una dosis de 2 mg/0,2 ml/cuerpo/día a través de la vena de la cola, y a los del grupo de control tratado con disolvente PBS se les administra el mismo volumen de PBS. Los ratones se sacrifican el día 32 y los riñones se recogen y se fijan en formalina neutra al 10 % durante 24 horas. El tejido renal fijado se deshidrata en etanol en gradiente y se aclara en xileno, seguido de incrustación en parafina. El grosor de la sección de tejido es de 5 |im. Después de desparafinar y rehidratar, las secciones se lavan con agua una vez, se incuban con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 15 minutos y se lavan con agua dos veces durante 5 minutos cada vez. Bloquear con suero de oveja normal al 10 % (Vector laboratories, Inc., EE.UU.) durante 1 hora; cuando se acabe el tiempo, descartar el suero de oveja y dibujar un círculo alrededor del tejido con una pluma PAP. Incubar con anticuerpo de conejo anti-fibrinógeno de ratón (Abcam) a 4 °C durante la noche y lavar con TBS dos veces durante 5 minutos cada vez. Incubar con el anticuerpo secundario, anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (HRP) (Abcam) durante 1 hora a temperatura ambiente y lavar con TBS dos veces durante 5 minutos cada vez. Teñir según el kit DAB (Vector laboratories, Inc., e E.UU.), contrateñir con hematoxilina durante 30 segundos después de lavar con agua 3 veces y enjuagar con agua durante 5 minutos. Se siguen deshidratación en gradiente, aclarado y montaje. Las secciones se observan bajo un microscopio a 200 veces.

El fibrinógeno es un precursor de la fibrina. En presencia de daño tisular, como respuesta al estrés al daño del cuerpo, el fibrinógeno se hidroliza en fibrina [40'42], por lo que el nivel de fibrina puede usarse como un signo del grado de daño. La fibrina también es un componente importante de los trombos que se forman después de un daño tisular. Por tanto, el nivel de fibrina también puede usarse como marcador de trombo.

Los resultados muestran que el grupo tratado con plasminógeno (figura 13B) tiene una tinción positiva más clara de fibrinógeno que el grupo de control tratado con disolvente PBS (figura 13A). Indica que la inyección de plasminógeno puede reducir significativamente el depósito de fibrina renal en ratones diabéticos, lo que demuestra que el plasminógeno tiene un efecto reparador significativo sobre el daño renal en ratones diabéticos, y también demuestra que el plasminógeno puede promover la disolución del trombo en el tejido renal.

Ejemplo 15. El plasminógeno promueve la trombólisis en el tejido hepático en la diabetes en etapa avanzada Diez ratones macho db/db de 24-25 semanas de edad se dividen aleatoriamente en dos grupos, un grupo de control tratado con disolvente PBS y un grupo tratado con plasminógeno. 5 ratones por grupo. El día de inicio del experimento se registra como día 0 cuando se pesan y agrupan los ratones. El segundo día del experimento cuando se inicia la administración de plasminógeno o PBS se registra como día 1. La administración continua se realiza durante 31 días. A los ratones del grupo tratado con plasminógeno se les inyecta plasminógeno a una dosis de 2 mg/0,2 ml/cuerpo/día a través de la vena de la cola, y a los del grupo de control tratado con disolvente PBS se les administra el mismo volumen de PBS. Los ratones se sacrifican el día 32 y los hígados se recogen y se fijan en formalina neutra al 10 % durante 24 horas. El tejido hepático fijado se deshidrata en etanol en gradiente y se aclara en xileno, seguido de incrustación en parafina. El grosor de la sección de tejido es de 5 |im. Después de desparafinar y rehidratar, las secciones se lavan con agua una vez, se incuban con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 15 minutos y se lavan con agua dos veces durante 5 minutos cada vez. Bloquear con suero de oveja normal al 10 % (Vector laboratories, Inc., EE.UU.) durante 1 hora; cuando se acabe el tiempo, descartar el suero de oveja y dibujar un círculo alrededor del tejido con una pluma PAP. Incubar con anticuerpo de conejo anti-fibrinógeno de ratón (Abcam) a 4 °C durante la noche y lavar con TBS dos veces durante 5 minutos cada vez. Incubar con el anticuerpo secundario, anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (HRP) (Abcam) durante 1 hora a temperatura ambiente y lavar con TBS dos veces durante 5 minutos cada vez. Teñir según el kit DAB (Vector laboratories, Inc., EE.UU.), contrateñir con hematoxilina durante 30 segundos después de lavar con agua 3 veces y enjuagar con agua durante 5 minutos. Se siguen deshidratación en gradiente, aclarado y montaje. Las secciones se observan bajo un microscopio a 200 veces.

El fibrinógeno es un precursor de la fibrina. En presencia de daño tisular, como respuesta al estrés al daño del cuerpo, el fibrinógeno se hidroliza en fibrina í40-42l, por lo que el nivel de fibrina puede usarse como un signo del grado de daño. La fibrina también es un componente importante de los trombos que se forman después de un daño tisular. Por tanto, el nivel de fibrina también puede usarse como marcador de trombo.

El estudio encuentra que, en comparación con el grupo de control tratado con disolvente PBS (figura 14A), el grupo tratado con plasminógeno (figura 14B) tiene una tinción positiva más clara de fibrina en el tejido hepático de ratones, lo que indica que la inyección de plasminógeno puede reducir significativamente el depósito de fibrina hepática en ratones diabéticos, lo que refleja que el plasminógeno tiene un efecto reparador significativo sobre el daño hepático en ratones diabéticos, y también demuestra que el plasminógeno puede promover la disolución del trombo en el tejido hepático.

Ejemplo 16. El plasminógeno promueve la trombólisis en tejido nervioso en ratones con daño nervioso diabético en fase avanzada

Diez ratones macho db/db de 24-25 semanas de edad se dividen aleatoriamente en dos grupos, un grupo de control tratado con disolvente PBS y un grupo tratado con plasminógeno. 5 ratones por grupo. El día de inicio del experimento se registra como día 0 cuando se pesan y agrupan los ratones. El segundo día del experimento cuando se inicia la administración de plasminógeno o PBS se registra como día 1. La administración continua se realiza durante 15 días. A los ratones del grupo tratado con plasminógeno se les inyecta plasminógeno a una dosis de 2 mg/0,2 ml/cuerpo/día a través de la vena de la cola, y a los del grupo de control tratado con disolvente PBS se les administra el mismo volumen de PBS. Los ratones se sacrifican el día 16 y los nervios ciáticos se recogen y se fijan en formalina neutra al 10 % durante 24 horas. El nervio ciático fijo se deshidrata en etanol en gradiente y se aclara en xileno, seguido de incrustación en parafina. El grosor de la sección de tejido es de 5 |im. Después de la desparafinación y la rehidratación, las secciones se lavan con agua una vez y luego se dibuja un círculo alrededor de los tejidos con una pluma PAP. Incubar con peróxido de hidrógeno diluido al 3 % de TBS durante 15 minutos y lavar con agua 3 veces. Bloquear con suero de oveja normal al 10 % (Vector laboratories, Inc., EE.UU.) durante 1 hora y absorber el exceso de suero. Incubar con anticuerpo de conejo anti-fibrinógeno de ratón (Abcam) a temperatura ambiente durante 1 hora o a 4 °C durante la noche y lavar con TBS 3 veces. Incubar con el anticuerpo secundario, anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (HRP) (Abcam) durante 1 hora a temperatura ambiente y lavar con TBS 3 veces. Teñir según el kit DAB (Vector laboratories, Inc., EE.UU.), contrateñir con hematoxilina durante 30 segundos después de lavar con agua 3 veces y enjuagar con agua durante 5 minutos. Se siguen deshidratación en gradiente, aclarado y montaje. Las secciones se observan bajo un microscopio a 400 veces.

El fibrinógeno es un precursor de la fibrina. En presencia de daño tisular, como respuesta al estrés al daño del cuerpo, el fibrinógeno se hidroliza en fibrina í40-42l, por lo que el nivel de fibrina puede usarse como un signo del grado de daño. La fibrina también es un componente importante de los trombos que se forman después de un daño tisular. Por tanto, el nivel de fibrina también puede usarse como marcador de trombo.

El estudio encuentra que, en comparación con el grupo de control tratado con disolvente PBS (figura 15A), los niveles de fibrina del nervio ciático se reducen en ratones en el grupo tratado con plasminógeno (figura 15B), lo que indica que el plasminógeno tiene la función de degradar los niveles de fibrina y el daño se repara hasta cierto punto, lo que también demuestra que el plasminógeno puede promover la disolución de los trombos alrededor del tejido nervioso.

Resumen de resultados experimentales:

Los experimentos en las realizaciones de la presente invención incluyen dos partes de trombólisisin vitroy trombólisisin vivode plasminógeno.

La trombólisisin vitroimita las condiciones de la trombólisisin vivo.Se seleccionan 10 ng/ml de tPA para imitar los niveles de tPA que se producen de manera natural en el cuerpo en condiciones fisiológicas normales, y se seleccionan 125 ng/ml de tPA para imitar los niveles de tPA que se producen de manera natural en el caso de trombosis en el cuerpo, para estudiar la capacidad trombolítica del plasminógeno.

El estudio experimental de la presente invención muestra que en la condición de 10 ng/ml de tPA o 125 ng/ml de tPA, el plasminógeno tiene un efecto trombolítico muy bueno, ya sea un trombo antiguo de 20 horas o un trombo antiguo de 72 horas. Y con el aumento de la dosis de plasminógeno, aumenta la eficacia trombolítica.

El plasminógeno tiene una gran capacidad para disolver trombos nuevos y la tasa de trombólisis puede alcanzar más del 80 % después de dos horas de incubación.

También se estudió el efecto trombolítico del plasminógeno en presencia de uPA. En condiciones de 1 ng/ml de uPA o 100 ng/ml de uPA, el plasminógeno también tiene un efecto trombolítico muy bueno. Y con el aumento de la dosis de plasminógeno, aumenta la eficacia trombolítica.

En los experimentosin vivo,a ratones diabéticos en fase avanzada se les administran 2 mg de plasminógeno al día durante 15 días consecutivos y el contenido de dímero D en el suero aumenta significativamente. Al mismo tiempo, los niveles de fibrina en el corazón, el hígado, los riñones y los tejidos nerviosos disminuyen significativamente, lo que indica que el plasminógeno puede obviamente promover la disolución de los trombos provocados por el daño inducido por la diabetes en estos tejidos y la degradación de la fibrina, lo que demuestra que la administración de plasminógeno en animales de experimentación también puede lograr un efecto trombolítico significativo.

El experimento del modelo de trombosis de la vena yugular del ratón muestra que el plasminógeno puede unirse al tromboin vivode manera muy específica.

Además, el estudio demostró que la trombólisis del plasminógeno es más moderada que la del tPA, y los experimentos de sangrado de la cola en ratones no mostraron efectos secundarios de sangrado del plasminógeno. En resumen, el plasminógeno tiene una muy buena capacidad trombolítica, especialmente para los trombos antiguos, y tiene las características de alta especificidad, fuerza moderada, efecto rápido y sin efectos secundarios de sangrado.

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Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   i.Composición farmacéutica que consiste en plasminógeno y un portador, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de una trombosis arterial y venosa en un sujeto.
2. 2. Plasminógeno para su uso según la reivindicación 1, en el que dicho trombo comprende trombo nuevo y trombo antiguo.
3. 3. Plasminógeno para su uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que la trombosis es una trombosis provocada por una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad del sistema sanguíneo, una enfermedad del sistema circulatorio, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad de trastorno metabólico y una enfermedad infecciosa.
4. 4. Plasminógeno para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la trombosis es una trombosis vascular grande, una trombosis vascular pequeña o una trombosis microvascular, secundaria a diabetes.
5. 5. Plasminógeno para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la trombosis es una trombosis provocada por lesiones vasculares grandes y/o pequeñas.
6. 6. Composición farmacéutica que consiste en plasminógeno y un portador, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con la trombosis en un sujeto, en la que el plasminógeno previene y/o trata la enfermedad relacionada con la trombosis en el sujeto mediante la eliminación del trombo y en la que la enfermedad relacionada con la trombosis es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en pancreatitis y cirrosis provocadas por trombosis de la vena porta; embolia renal provocada por trombosis de la vena renal; septicemia sistémica, embolia pulmonar, trombosis cerebral y trombosis venosa profunda provocadas por trombosis de la vena yugular interna; infarto de órgano provocado por trombosis arterial o venosa, incluyendo pero sin limitarse a: infarto cerebral, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular trombótico, fibrilación auricular, angina de pecho inestable, angina de pecho intratable, ataque isquémico transitorio y embolia pulmonar, en la que las enfermedades están inducidas o provocadas por un trombo nuevo o un trombo antiguo.
7. 7. Plasminógeno para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el plasminógeno es una proteína que tiene al menos el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO. 2.