TW201722470A - 一種預防和治療肝組織損傷及其相關病症的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及纖溶酶原在治療和/或消除肝損傷方面的用途,為治療不同類型的肝損傷提供一條新的治療途徑。
Description
本發明涉及纖溶酶原或纖溶酶在預防和/或治療各種原因導致的肝組織損傷方面的用途,進而為治療肝組織損傷及其相關病症提供全新的治療策略。
肝損傷或稱肝組織損傷是各種原因導致的肝臟實質病變,是肝組織炎症、肝臟細胞變性、壞死、肝組織纖維化等一系列病理變化的總稱。常見的原因有炎症、肝臟淤血、病毒感染、中毒、藥物、輻射等。一些疾病也伴發肝臟組織細胞的損傷,例如糖尿病、肝炎、高血壓、動脈粥樣硬化等。
藥物是引起肝組織損害的一個非常常見的原因。引起肝臟組織損害的常用藥物包括:抗結核藥物:利福平、異煙肼、乙胺丁醇等;抗腫瘤藥物:環磷醯胺、甲氨疊呤、5-氟尿嘧啶、卡鉑、順鉑等;調降血脂類:他汀類(阿托伐他汀、洛伐他汀)、非諾貝特、氯貝丁酯、煙酸等;類固醇激素:雌激素類藥物、口服避孕藥、雄性同化激素等;心血管藥物:胺碘酮、華法令、鈣離子拮抗劑等;抗風濕藥物:消炎痛、芬布芬、阿司匹林、吲哚美辛等;抗生素:氯黴素、羅紅黴素、酮康唑、青黴素類、磺胺類等;抗過敏藥物:異丙嗪(非那根)、氯苯那敏(撲爾敏)、氯雷他定(開瑞坦)等;抗潰瘍藥物:西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁等;抗真菌的藥物例如利巴韋林等等。
酒精是肝臟的巨大威脅,長期或間斷性大量飲酒可引起肝組織損傷,飲酒量大、持續飲用時間越長,其後果越嚴重。酒精會直接毒害肝細胞,影響其結構及功能。
酒精性肝損傷是一種慢性中毒性肝損傷,是由於長期大量飲酒導致的肝臟疾病。初期通常表現為脂肪肝,進而可發展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化。其主要臨床特徵是噁心、嘔吐、黃疸、可有肝臟腫大和壓痛。嚴重
酗酒時可誘發廣泛肝細胞壞死,甚至肝功能衰竭。酒精性肝病是我國常見的肝臟疾病之一,嚴重危害人民健康[1]。
除了酒精導致的中毒性肝損傷外,其它"親肝毒物",例如環境中的化學有毒物質及某些藥物也可造成肝損傷。作為人體的重要解毒器官,肝臟,具有肝動脈和肝靜脈雙重血液供應。化學物質可通過胃腸道門靜脈或體循環進入肝臟進行轉化,因此肝臟容易受到化學物中的毒性物質損害。大自然和人類工業生產過程中均存在一些對肝臟有毒性的物質,稱為"親肝毒物",這些毒物在人群中普遍易感,潛伏期短,病變的過程與化學物質的量直接相關,可引起肝臟不同程度的肝細胞壞死、脂肪變性、肝硬化。病理表現包括(1)脂肪變性。四氯化碳、黃磷等可干擾脂蛋白的合成與轉運,形成脂肪肝。(2)脂質過氧化反應,這是中毒性肝損傷的特殊表現形式,如四氯化碳在體內代謝產生一種氧化能力很強的中間產物,導致生物膜上的脂質過氧化,破壞膜的磷脂,改變細胞的結構與功能。(3)膽汁鬱積反應,主要與肝細胞膜和微絨毛受損,引起膽汁酸排泄障礙有關[2]。
輻射也可以導致肝臟組織損傷。一般來說,輻射源是天然或人工能源產生的高能電磁波或高能粒子。大劑量射線瞬間照射或低劑量射線長時間照射都可能引起組織損傷,輻射的能量破壞細胞的染色體、酶,使細胞的正常功能發生紊亂。
糖尿病性肝組織損傷是指由糖尿病引起的肝臟組織學和功能變化的病變。已知糖尿病可引起的肝損傷包括:肝酶學異常,其可引起肝細胞內二氧化碳蓄積、酸中毒、氧供減少、氧消耗增加,使肝臟轉氨酶活性增加,膽紅素代謝紊亂,重者可引起肝細胞壞死;脂肪肝,在引起脂肪肝的所有病因中,糖尿病占第三位,其中21%~78%糖尿病患者伴有脂肪肝;肝炎、硬化和肝癌,其中糖尿病患者中病毒性肝炎的患病率約為正常人的2~4倍,原發性肝癌的發生率約為正常人的4倍。糖尿病性肝病不僅損害數以百萬計的患者的生活品質,同時也造成一個巨大的負擔成本和醫療保健系統強度所需的護理。
肝臟的病毒感染也是導致肝損傷的一個常見原因,例如乙型病毒性肝炎、丙型病毒肝炎、戊型病毒肝炎等。
肝內血液淤積也可以造成肝臟組織損傷。血液在肝內淤積主要由以下幾種因素引起:肝小靜脈閉塞病、巴德一基亞利綜合征、慢性右心功能不全和縮窄性心包炎。
任何導致下腔靜脈血回心受阻的疾病都可導致肝臟淤血,如風濕性心臟瓣膜病,慢性縮窄性心包炎,高血壓性心臟病,缺血性心臟病,肺心病,先天性心臟病等。
淤血性肝損傷最初累及小葉中央區,小葉中央靜脈淤血,擴張,肝竇擴張程度與肝竇距小葉中央靜脈的遠近而有所不同,小葉中央肝細胞受壓,變形和萎縮,細胞漿內呈顆粒樣變,有核固縮,核分裂,細胞壞死,伴有棕色色素沉著,棕色色素位於小葉中央,可能因淤膽所致,鄰近中央靜脈的肝實質變性壞死最嚴重,隨淤血的加重,壞死組織向門區延伸,嚴重淤血患者僅在門區有較正常的肝組織,隨時間延長,中央靜脈周圍的網狀纖維可塌陷,可見網狀纖維組織和細纖維束自中央靜脈延伸到另一中央靜脈。
對於肝組織損傷的治療目前主要包括病因的控制和治療,以及支持治療。長期以來,科學家們一直在尋找對損傷肝組織有直接的、良好修復效果的藥物。本發明對此也進行了深入的研究。實驗發現,人體內天然存在的一種蛋白質物質,纖溶酶原對中毒、輻射、化療藥物和糖尿病導致的肝組織損傷有良好的修復作用。纖溶酶原有望成為治療肝組織損傷及其相關病症的一種新策略。
纖溶酶原(plasminogen,plg)是纖溶酶的非活性前體,是一種單鏈糖蛋白,由791個氨基酸組成,分子量約為92kDa[3,4]。纖溶酶原主要在肝臟合成,大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約為2μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潛在來源[5,6]。纖溶酶原存在兩種分子形式:谷氨酸-纖溶酶原(Glu-plasminogen)和賴氨酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個氨基末端(N-末端)谷氨酸,因此被稱為谷氨酸-纖溶酶原。然而,在纖溶酶存在時,谷氨酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成為賴氨酸-纖溶酶原。與谷氨酸-纖溶酶原相比,賴氨酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力,並可以更高的速率被PA啟動。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割,導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成[7]。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個同源三環,即所謂的kringle,羧
基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringle含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的賴氨酸結合位點。最新發現一個為38kDa的纖維蛋白溶酶原片段,其中包括kringle1-4,是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名為血管抑素,可通過幾個蛋白酶水解纖溶酶原產生。
一方面,本發明涉及纖溶酶原或纖溶酶在製備預防和/或治療受試者肝組織損傷及其相關病症的藥物、製品、藥盒中的用途。本發明還涉及一種製藥方法,包括將纖溶酶原與藥學可接受載體共同製備成預防和/或治療受試者肝組織損傷及其相關病症的藥物、製品、藥盒。
在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為輻射或化學物質引起的肝損傷及其相關病症。在一個實施方案中,輻射或化學物質引起的肝損傷及其相關病症為癌症治療所使用的放化療方法和藥物。在一個實施方案中,所述輻射是由於意外事件或工作環境等其他事件導致的輻射。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為中毒性肝損傷及其相關病症。在一個實施方案中,所述中毒性肝損傷為包括酒精在內的"親肝毒物"造成的中毒性肝損傷。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為糖尿病引起的,是糖尿病的併發症之一。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為病毒感染肝臟導致的肝炎所致,例如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒導致的肝炎。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為藥物性肝損傷及其相關病症。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症是肝內血液淤積(肝臟淤血)導致的。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為糖尿病性肝損傷及其相關病症、中毒性肝損傷及其相關病症、藥物性肝損傷或其相關病症、輻射性肝損傷及其相關病症、病毒感染性肝損傷及其相關病症、淤血性肝損傷及其相關病症。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症包括肝組織損傷導致的肝功能異常、肝酶學異常、肝區不適和觸痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、膽管炎、肝硬化、肝壞死和肝癌。
在一個實施方案,所述纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,並且
仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施方案,所述纖維蛋白溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。
在一個實施方案,所述纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施方案,所述纖溶酶原或纖溶酶全身或局部施用,包括表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內、局部注射、關節內注射或直腸施用。在一個實施方案,所述糖尿病性肝損傷的相關病症或中毒性肝損傷的相關病症包括:肝酶學異常、肝區不適和觸痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、膽管炎、肝硬化、肝壞死和肝癌。在一個實施方案,所述糖尿病性肝損傷及其相關病症是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病變導致。在一個實施方案,所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物聯合施用。在一個實施方案,所述其它藥物包括:保肝藥物、抗糖尿病藥物、抗血栓藥物、抗凝藥物、降血脂藥物、抗心腦血管疾病藥物、抗感染藥物。
在一個實施方案,所述所述受試者為哺乳動物,較佳為人。
在一個實施方案中,所述由糖尿病引起的肝損傷是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病變導致。
在一個實施方案中,所述受試者纖維蛋白溶酶或者纖溶酶原低下。具體地,所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。
在一個實施方案中,纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施方案中,纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上,添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸,並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中,纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中,纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施方案中,纖溶酶原是選自如下的保守取代變體:Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個實施方案中,纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原,例如序列2所示的纖溶
酶原的直向同系物,例如,來自靈長類動物或齧齒類動物的纖維蛋白溶酶原直向同系物,例如來自大猩猩、恒河猴、鼠、牛、馬,狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最佳,本發明的纖維蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
在一個實施方案中,所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施方案中,所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用,較佳至少重複一次,較佳至少每天施用。在局部施用的情況下,上述劑量還可以根據情況進一步調整。
在一個實施方案中,所述纖溶酶原通過全身或局部給藥,較佳通過以下途徑施用:表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內、局部注射、關節內注射或通過直腸。在一個實施方案中,所述局部給藥通過在肝部區域應用含有纖溶酶原的導管來進行。
一方面,本發明涉及一種預防和/或治療受試者肝組織損傷及其相關病症的方法,包括給藥受試者有效量的纖溶酶原或纖溶酶。本發明還涉及纖溶酶原或纖溶酶用於預防和/或治療受試者肝組織損傷及其相關病症的用途。
在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為輻射或化學物質引起的肝損傷及其相關病症。在一個實施方案中,輻射或化學物質引起的肝損傷及其相關病症為癌症治療所使用的放化療方法和藥物。在一個實施方案中,所述輻射是由於意外事件導致的輻射。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為中毒性肝損傷及其相關病症。在一個實施方案中,所述中毒性肝損傷為包括酒精在內的"親肝毒物"造成的中毒性肝損傷。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為糖尿病引起的,是糖尿病的併發症之一。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為病毒感染肝臟導致的肝炎所致,例如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒導致的肝炎。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為藥物性肝損傷及其相關病症。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症是肝內血液淤積(肝臟淤血)導致的。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其
相關病症為糖尿病性肝損傷及其相關病症、中毒性肝損傷及其相關病症、藥物性肝損傷或其相關病症、輻射性肝損傷及其相關病症、病毒感染性肝損傷及其相關病症、淤血性肝損傷及其相關病症。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症包括肝組織損傷導致的肝功能異常、肝酶學異常、肝區不適和觸痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、膽管炎、肝硬化、肝壞死和肝癌。
在一個實施方案,所述纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施方案,所述纖維蛋白溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案,所述纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施方案,所述纖溶酶原或纖溶酶全身或局部施用,包括表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內、局部注射、關節內注射或直腸施用。在一個實施方案,所述糖尿病性肝損傷的相關病症或中毒性肝損傷的相關病症包括:肝酶學異常、肝區不適和觸痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、膽管炎、肝硬化、肝壞死和肝癌。在一個實施方案,所述糖尿病性肝損傷及其相關病症是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病變導致。在一個實施方案,所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物聯合施用。在一個實施方案,所述其它藥物包括:保肝藥物、抗糖尿病藥物、抗血栓藥物、抗凝藥物、降血脂藥物、抗心腦血管疾病藥物、抗感染藥物。
在一個實施方案,所述受試者為哺乳動物,較佳為人。
在一個實施方案中,所述由糖尿病引起的肝損傷是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病變導致。
在一個實施方案中,所述受試者纖維蛋白溶酶或者纖溶酶原低下。具體地,所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。
在一個實施方案中,纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施方案中,纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上,添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、
1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸,並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中,纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中,纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施方案中,纖溶酶原是選自如下的保守取代變體:Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個實施方案中,纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原,例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物,例如,來自靈長類動物或齧齒類動物的纖維蛋白溶酶原直向同系物,例如來自大猩猩,恒河猴、鼠、牛、馬,狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最佳,本發明的纖維蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
在一個實施方案中,所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施方案中,所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用,較佳至少重複一次,較佳至少每天施用。在局部施用的情況下,上述劑量還可以根據情況進一步調整。
在一個實施方案中,所述纖溶酶原通過全身或局部給藥,較佳通過以下途徑施用:表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內、局部注射、關節內注射或通過直腸。在一個實施方案中,所述局部給藥通過在肝部區域應用含有纖溶酶原的導管來進行。
一方面,本發明涉及一種預防和/或治療受試者肝組織損傷及其相關病症的纖溶酶原或纖溶酶、包含所述纖溶酶原或纖溶酶的藥物組合物、或包含所述纖溶酶原或纖溶酶的製品或藥盒。
在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為輻射或化學物質引起的肝損傷及其相關病症。在一個實施方案中,輻射或化學物質引起的肝損傷及其相關病症為癌症治療所使用的放化療方法和藥物。在一個實施方案中,所述輻射是由於意外事件導致的輻射。在一個實施方案中,所述肝組織損
傷及其相關病症為中毒性肝損傷及其相關病症。在一個實施方案中,所述中毒性肝損傷為包括酒精在內的"親肝毒物"造成的中毒性肝損傷。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為糖尿病引起的,是糖尿病的併發症之一。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為病毒感染肝臟導致的肝炎所致,例如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒導致的肝炎。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為藥物性肝損傷及其相關病症。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症是肝內血液淤積(肝臟淤血)導致的。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症為糖尿病性肝損傷及其相關病症、中毒性肝損傷及其相關病症、藥物性肝損傷或其相關病症、輻射性肝損傷及其相關病症、病毒感染性肝損傷及其相關病症、淤血性肝損傷及其相關病症。在一個實施方案中,所述肝組織損傷及其相關病症包括肝組織損傷導致的肝功能異常、肝酶學異常、肝區不適和觸痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、膽管炎、肝硬化、肝壞死和肝癌。
在一個實施方案,所述纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施方案,所述纖維蛋白溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案,所述纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施方案,所述纖溶酶原或纖溶酶全身或局部施用,包括表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內、局部注射、關節內注射或直腸施用。在一個實施方案,所述糖尿病性肝損傷的相關病症或中毒性肝損傷的相關病症包括:肝酶學異常、肝區不適和觸痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、膽管炎、肝硬化、肝壞死和肝癌。在一個實施方案,所述糖尿病性肝損傷及其相關病症是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病變導致。在一個實施方案,所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物聯合施用。在一個實施方案,所述其它藥物包括:保肝藥物、抗糖尿病藥物、抗血栓藥物、抗凝藥物、降血脂藥物、抗心腦血管疾病藥物、抗感染藥物。
在一個實施方案,所述受試者為哺乳動物,較佳為人。
在一個實施方案中,所述由糖尿病引起的肝損傷是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病變導致。
在一個實施方案中,所述受試者纖維蛋白溶酶或者纖溶酶原低下。具體地,所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。
在一個實施方案中,纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施方案中,纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上,添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸,並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中,纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施方案中,纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施方案中,纖溶酶原是選自如下的保守取代變體:Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個實施方案中,纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原,例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物,例如,來自靈長類動物或齧齒類動物的纖維蛋白溶酶原直向同系物,例如來自大猩猩,恒河猴、鼠、牛、馬,狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最佳,本發明的纖維蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
在一個實施方案中,所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施方案中,所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用,較佳至少重複一次,較佳至少每天施用。在局部施用的情況下,上述劑量還可以根據情況進一步調整。
在一個實施方案中,所述纖溶酶原通過全身或局部給藥,較佳通過以下途徑施用:表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內、局部注射、關
節內注射或通過直腸。在一個實施方案中,所述局部給藥通過在肝部區域應用含有纖溶酶原的導管來進行。
在一個實施方案中,所述纖溶酶原或纖溶酶被分裝在容器中。較佳,該製品或藥盒還包含其它的藥物,分裝在該藥盒的其它容器中。該藥盒還可包含使用說明書,說明所述纖溶酶原可以用於治療肝組織損傷及其相關病症,具體的,例如糖尿病引起的糖尿病肝損傷及其相關病症、中毒性肝損傷及其相關病症、藥物性肝損傷或其相關病症、輻射導致的肝損傷及其相關病症、病毒感染引起的肝損傷及其相關病症、淤血導致的肝損傷及其相關病症,並且可以進一步說明,所述纖溶酶原或纖溶酶可以在其它藥物或療法施用之前,同時,和/或之後施用。
本發明明確涵蓋了屬於本發明實施方案之間的技術特徵的所有組合,並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確公開,就像上述技術方案已經單獨且明確公開一樣。另外,本發明還明確涵蓋各個實施方案及其要素的所有亞組合,並且在本文中公開,就像每一個此類亞組合單獨且明確在本文中公開一樣。
圖1顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在給予纖溶酶原後體重的變化。
圖2顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在連續15天給藥纖溶酶原後肝臟HE染色觀察結果。
圖3顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在連續15天給予纖溶酶原後肝臟纖維蛋白免疫染色鏡檢觀察結果。
圖4顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在連續31天給予纖溶酶原後體重變化。
圖5顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在連續31天給予纖溶酶原後肝臟HE染色觀察結果。
圖6顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在連續31天給予纖溶酶原後肝臟纖維蛋白免疫染色觀察結果。
圖7顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在連續31天給予纖溶酶原後肝F4/80免疫染色觀察結果。
圖8顯示24-25周糖尿病小鼠給予PBS或纖溶酶原31天後血清穀丙轉氨酶(ALT)檢測結果。
圖9顯示給予纖溶酶原的第0、2、7天四氯化碳致急性肝損傷小鼠肝臟HE染色觀察結果。
圖10顯示plg-/-四氯化碳致急性肝損傷小鼠給予纖溶酶原18、24、48小時後肝臟HE染色觀察結果。
圖11顯示plg-/-四氯化碳致急性肝損傷小鼠給予纖溶酶原18、24、48小時後肝臟纖維蛋白免疫染色觀察結果。
圖12顯示5.0Gy X射線輻射的小鼠纖溶酶原10天後肝臟F4/80免疫染色觀察結果。
圖13顯示10mg/Kg順鉑化療損傷模型小鼠纖溶酶原7天後肝臟纖維蛋白免疫染色觀察結果。
圖14顯示plg-/-四氯化碳致急性肝損傷小鼠給予纖溶酶原18、24、48小時及7天後肝臟HE染色觀察結果。
“糖尿病性肝損傷”是指由糖尿病引起的肝臟組織學和功能變化的病變。其主要由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病變導致。已知糖尿病可引起的肝損傷包括:肝酶學異常,其可引起肝細胞內二氧化碳蓄積、酸中毒、氧供減少、氧消耗增加,使肝臟轉氨酶活性增加,膽紅素代謝紊亂,重者可引起肝細胞壞死;脂肪肝,在引起脂肪肝的所有病因中,糖尿病占第三位,其中21%~78%糖尿病患者伴有脂肪肝;肝炎、硬化和肝癌,其中糖尿病患者中病毒性肝炎的患病率約為正常人的2~4倍,原發性肝癌的發生率約為正常人的4倍。
“化學性肝損傷”或“中毒性肝損傷”是指由化學性肝毒性物質所造成的肝損害。這些化學物質包括酒精、環境中的化學有毒物質及某些藥物。大自然和人類工業生產過程中均存在一些對肝臟有毒性的物質,稱為"親肝毒物",這些毒物在人群中普遍易感,潛伏期短,病變的過程與化學物質的量直接相關,可引起肝臟不同程度的肝細胞壞死、脂肪變性、肝硬化。
“親肝毒物”是指對肝臟有毒性的物質的總稱。酒精是生活中最常見的“親肝毒物”。除酒精外,環境中的化學有毒物質及某些藥物也可造成肝損傷。作為人體的重要解毒器官,肝臟具有肝動脈和肝靜脈雙重血液供應。化學
物質可通過胃腸道門靜脈或體循環進入肝臟進行轉化,因此肝臟容易受到化學物中的毒性物質損害。大自然和人類工業生產過程中均存在一些對肝臟有毒性的物質,稱為"親肝毒物"。他們進入肝臟,可引起肝臟不同程度的肝細胞壞死、脂肪變性、肝硬化。病理表現包括(1)脂肪變性。四氯化碳、黃磷等可干擾脂蛋白的合成與轉運,形成脂肪肝。(2)脂質過氧化反應,這是中毒性肝損傷的特殊表現形式,如四氯化碳在體內代謝產生一種氧化能力很強的中間產物,導致生物膜上的脂質過氧化,破壞膜的磷脂,改變細胞的結構與功能。(3)膽汁鬱積反應,主要與肝細胞膜和微絨毛受損,引起膽汁酸排泄障礙有關。
“藥物性肝損傷”為藥物使用過程中,因藥物本身或/及其代謝產物或由於特殊體質對藥物的超敏感性或耐受性降低所導致的肝臟損傷稱為藥物性肝損傷,亦稱藥物性肝病,臨床上可表現為各種急慢性肝病,輕者停藥後可自行恢復,重者可能危及生命、需積極治療、搶救。“藥物性肝損傷”可以發生在以往沒有肝病史的健康者或原來就有嚴重疾病的患者身上;可發生在用藥超量時,也可發生在正常用量的情況下。
“輻射性肝損傷”是指高能電離輻射包括α、β粒子、γ射線、χ射線和中子射線導致的一種放射性損傷。大劑量射線瞬間照射或低劑量射線長時間照射都可能引起組織損傷,輻射的能量破壞細胞的染色體、酶,使細胞的正常功能發生紊亂。
“病毒感染性肝損傷”為病毒感染導致的肝損傷總稱。所述病毒感染常見有甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒導致的感染。
“淤血性肝損傷”為血液在肝內淤積導致的肝臟組織損傷病變。任何導致下腔靜脈血回心受阻的疾病都可導致肝臟淤血,如風濕性心臟瓣膜病,慢性縮窄性心包炎,高血壓性心臟病,缺血性心臟病,肺心病,先天性心臟病等。
“纖溶酶原”是纖溶酶的酶原形式,根據swiss prot中的序列,按含有信號肽的天然人源纖溶酶原氨基酸序列(序列4)計算由810個氨基酸組成,分子量約為92kD,主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白,編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域:位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域
(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列,其信號肽包括殘基Met1-Gly19,PAp包括殘基Glu20-Val98,Kringle1包括殘基Cys103-Cys181,Kringle2包括殘基Glu184-Cys262,Kringle3包括殘基Cys275-Cys352,Kringle4包括殘基Cys377-Cys454,Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI資料,絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。
Glu-纖溶酶原是天然全長的纖溶酶原,由791個氨基酸組成(不含有19個氨基酸的信號肽),編碼該序列的cDNA序列如序列1所示,其氨基酸序列如序列2所示。在體內,還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原,如序列6所示,編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。△-纖溶酶原(δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段,僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域[8,9],有文獻報導了δ-纖溶酶原的氨基酸序列(序列8)[9],編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7。小纖溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成,有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)[10],其氨基酸序列如序列10所示,編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原(Micro-plasminogen)僅含有絲氨酸蛋白酶結構域,有文獻報導其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)[11],也有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸),本專利序列參考專利文獻CN102154253A,其氨基酸序列如序列12所示,編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。
本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用,含義相同;“纖溶酶原”與“纖維蛋白溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用,含義相同。
本領域技術人員可以理解,本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶,因此,本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。
在循環過程中,纖溶酶原採用封閉的非活性構象,但當結合至血栓或細胞表面時,在纖溶酶原啟動劑(plasminogen activator,PA)的介導下,其轉變為呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體,進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構
域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定簇,而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。已知多種能夠作為纖溶酶原啟動劑的酶,包括:組織纖溶酶原啟動劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原啟動劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因數XII(哈格曼因數)等。
“纖溶酶原活性片段”是指在纖溶酶原蛋白中,能夠與底物中的靶序列結合並發揮蛋白水解功能的活性片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。本發明所述的纖溶酶原活性片段為包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶域的蛋白質,較佳,本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列的蛋白質。因此,本發明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、並且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。
目前,對於血液中纖維蛋白溶酶原及其活性測定方法包括:對組織纖維蛋白溶酶原啟動劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖維蛋白溶酶原啟動劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg)、血漿組織纖維蛋白溶酶原啟動劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖維蛋白溶酶原啟動劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法為發色底物法:向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物,受檢血漿中的PLG在SK的作用下,轉變成PLM,後者作用於發色底物,隨後用分光光度計測定,吸光度增加與纖維蛋白溶酶原活性成正比。此外也可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖維蛋白溶酶原活性進行測定。
“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物種之間的同源物,既包括蛋白同源物也包括DNA同源物,也稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原,還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。
“保守取代變體”是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能,這包括但不限於以相似特性(如酸性,鹼性,疏水性等)的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是眾所周知的。例如,精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可
以互換。同樣,異亮氨酸是疏水氨基酸,則可被亮氨酸,蛋氨酸或纈氨酸替換。因此,相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如,基於MEGALIGN演算法的70%至99%的相似度(同一性)。“保守取代變體”還包括通過BLAST或FASTA演算法確定具有60%以上的氨基酸同一性的多肽或酶,若能達75%以上更好,最好能達85%以上,甚至達90%以上為最佳,並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。
“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中,所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計),如通過Lowry法所確定的,例如超過99%(按重量計),(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度,或(3)至同質性,該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原也包括通過生物工程技術從重組細胞製備,並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。
術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用,指任何長度的氨基酸的聚合形式,其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸,化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸,和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白,包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白,具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物等等。
關於參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分數(%)”定義為在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後,且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時,候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現,例如使用公眾可得到的電腦軟體,諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員能決定用於比對序列的適宜參數,包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何演算法。然而,為了本發明的目的,氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生的。
在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中,給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對
於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算。
分數X/Y乘100
其中X是由序列比對程式ALIGN-2在該程式的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基的數目,且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會,在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情況下,A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明,本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述,使用ALIGN-2電腦程式獲得的。
如本文中使用的,術語“治療”和“處理”指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀,和/或部分或完全治癒疾病和/或其症狀,並且包括:(a)預防疾病在受試者體內發生,所述受試者可以具有疾病的素因,但是尚未診斷為具有疾病;(b)抑制疾病,即阻滯其形成;和(c)減輕疾病和/或其症狀,即引起疾病和/或其症狀消退。
術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用,指哺乳動物,包括但不限於鼠(大鼠,小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。
“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。“治療有效量”會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。
纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途,也可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時,可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中將序列的C末端氨基酸附接於不溶性支援物,接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS,諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis;第3-284頁於The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷:Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963);Stewart等,Solid Phase Peptide
Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984);和Ganesan A.2006 Mini Rev.Med Chem.6:3-10和Camarero JA等2005 Protein Pept Lett.12:723-8中。簡言之,用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複循環後,將附接的固相遊離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後,將此單元去保護,露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上,之後將其切掉。
可以使用標準重組方法來生產本發明的纖溶酶原。例如,將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中,使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啟動子(例如天然關聯的或異源的啟動子)、信號序列、增強子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啟動子系統,所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中,在適合於核苷酸序列的高水準表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。
合適的表達載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分複製。通常,表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。
大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於克隆主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌,諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(Enterobacteriaceae),諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中,也可以生成表達載體,其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外,會存在許多公知的啟動子,諸如乳糖啟動子系統,色氨酸(trp)啟動子系統,β-內醯胺酶啟動子系統,或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常會控制表達,任選在操縱基因序列的情況中,並且具有核糖體結合位點序列等,以啟動並完成轉錄和翻譯。
其他微生物,諸如酵母也可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子,其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列等。典型的啟動子
包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啟動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。
在微生物外,哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)也可以用於表達並生成本發明的纖溶酶原(例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列,如複製起點,啟動子和增強子(Queen等,Immunol.Rev.89:49(1986)),以及必需的加工資訊位元點,諸如核糖體結合位點,RNA剪接位點,多聚腺苷酸化位點,和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等,J.Immunol.148:1149(1992)。
一旦合成(化學或重組方式),可以依照本領域的標準規程,包括硫酸銨沉澱,親和柱,柱層析,高效液相層析(HPLC),凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的,例如至少約80%至85%純的,至少約85%至90%純的,至少約90%至95%純的,或98%至99%純的或更純的,例如不含污染物,所述污染物如細胞碎片,除主題抗體以外的大分子等等。
可以通過將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體、賦形劑、或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版,Osol,A.ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性,並包括緩衝劑例如磷酸鹽,檸檬酸鹽及其它有機酸;抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸;防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨;氯化己烷雙胺;氯化苄烷銨(benzalkonium chloride),苯索氯銨;酚、丁醇或苯甲醇;烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯;鄰苯二酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;間甲酚);低分子量多肽(少於約10個殘基);蛋白質如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸;單糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精;螯合劑如EDTA;糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇;成鹽反離子如鈉;金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物);和/或非
離子表面活性劑,例如TWEENTM,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。較佳凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述,其包含在本文中作為參考。
本發明的配製劑也可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物,較佳活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如,抗高血壓的藥物、抗心律失常的藥物、治療糖尿病的藥物等。
本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或介面聚合而製備的微膠囊中,例如,可置入在膠質藥物傳送系統(例如,脂質體,白蛋白微球,微乳劑,奈米顆粒和奈米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。
本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質,例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981);Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利3773919,EP 58,481)、L-谷氨酸與乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman,等,Biopolymers 22:547(1983)),不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer,等,出處同上),或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體),以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上,而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如,如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵,則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。
可以通過不同方式,例如通過靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)、肌內、鼻內、表面或皮內施用或脊髓或腦投遞來實現本發明藥物組合物的施用。氣溶膠製劑如鼻噴霧製劑包含活性劑的純化的
水性或其它溶液及防腐劑和等滲劑。將此類製劑調節至與鼻黏膜相容的pH和等滲狀態。
用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油,和可注射有機酯,如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液,包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑,諸如例如,抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體等等。
醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的,任一患者的劑量取決於多種因素,包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以例如為每天約0.0001至2000mg/kg,或約0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg,0.25mg/kg,0.5mg/kg,0.75mg/kg,10mg/kg,50mg/kg等等)受試者體重。例如,劑量可以是1mg/kg體重或50mg/kg體重或在1-50mg/kg的範圍,或至少1mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量也涵蓋在內,特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量也包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每週或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1-10mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要即時評估、定期評估糖尿病肝病及其相關病症的治療效果和安全性。
本發明的一個實施方案涉及使用纖溶酶原治療受試者後,對治療效力和治療安全性的判斷。其中對所述治療效力的判斷方法包括但不限於:1)對受試者肝功能的檢查,例如對患者體內酶學水準如血清門冬氨酸氨基轉移酶(ALT)、穀丙轉氨酶(AST)、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、白蛋白、球蛋白、膽鹼酯酶、鹼性磷酸酶、轉肽酶等水準是否處於正常值範圍進行檢查,使用本發明中的纖溶酶原對受試者進行治療後,預期上述肝功能指標將恢復至正常值或得到改善,例如,穀丙轉氨酶(ALT):0~40μ/L、穀草轉氨酶(AST):0~40μ/L、穀氨醯轉移酶(GGT):小於40單位、總膽紅素:3.4~20.5μmol/L;2)
對受試者凝血酶原時間(PT)和活動度(PTA)進行檢查:PT是反映肝臟凝血因數合成功能的重要指標,PTA是PT測定值的常用表示方法,對判斷肝病進展和預後有較大價值,其中PTA進行性降至40%以下為肝衰竭的重要診斷標準之一,<20%者提示肝功能不良,使用本發明中的纖溶酶原及其變體對受試者進行治療後,患者體內PTA的下降預期將得到明顯改善;3)影像學檢查:包括腹部肝膽脾彩超、CT或核磁,以瞭解肝損傷恢復程度;4)腫瘤標誌物檢查,如甲胎蛋白AFP、CA199、AFU等;5)肝組織活檢,以判斷纖維化及其他損傷的恢復程度。此外,本發明還涉及使用纖溶酶原及其變體對受試者進行治療過程中和治療後,所述該治療方案安全性的判斷,包括但不限於對受試者的血清半衰期、治療半衰期、半數中毒量(TD50)、半數致死量(LD50)進行統計,或對在治療過程中或治療後發生的各種不良事件如致敏反應進行觀察。
本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒,其包含可用於治療由糖尿病引起的肝損傷及其相關病症的的本發明纖溶酶原。所述製品較佳包括一個容器,標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子,小瓶,注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。所述容器含有組合物,所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶,其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖溶酶原/纖溶酶。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述由糖尿病引起的肝損傷及其相關病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器,諸如磷酸鹽緩衝的鹽水,林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質,包括其它緩衝液、稀釋劑、過濾物、針和注射器。此外,所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁,包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。
24-25周齡db/db雄鼠10隻,隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組,實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天,連續給藥15天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/
隻/天尾靜脈注射纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在給纖溶酶原第0、4、7、11、16天分別稱體重。結果顯示給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組在第0、4、7、11、16天體重(圖1)無顯著差異,說明纖溶酶原對動物體重影響不大。
24-25周齡db/db雄鼠10隻,隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組,實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天,連續給藥15天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第16天處死小鼠並取肝臟組織在10%中性福馬林固定液中固定24-48小時固定後的肝組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色),1%鹽酸酒精分化,氨水返藍,並酒精梯度脫水封片。
HE染色結果顯示,給溶媒PBS對照組,肝細胞呈重度脂肪變,脂質沉積,細胞核被擠至邊緣,細胞輕度水樣變性,肝索紊亂;給纖溶酶原組較之於給溶媒對照組,肝細胞脂肪變性減輕,呈輕度脂肪變,以中度水樣變性為主。說明纖溶酶原能促進糖尿病肝損傷的修復。
24-25周齡db/db雄鼠10隻,隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組,實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天,連續給藥15天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第16天處死小鼠並取肝臟組織在10%中性福馬林固定液中固定24-48小時。固定後的肝臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘,水洗2次,每次5分鐘。10%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時;時間到後,棄除羊血清液,用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠纖維蛋白(原)抗體(Abcam)4℃孵育過夜,TBS洗2次,每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時,TBS洗2次,每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色,水洗3次後蘇
木素複染30秒,流水沖洗5分鐘,然後TBS洗1次。梯度脫水透明並封片,切片在顯微鏡下200倍下觀察。
纖維蛋白原是纖維蛋白的前體,在組織存在損傷的情況下,作為機體對損傷的一種應激反應,纖維蛋白原水解成纖維蛋白[12-14]。因此可將纖維蛋白原水準作為損傷程度的一個標誌。
研究發現,給纖溶酶原組(圖3B)與給溶媒PBS對照組(圖3A)相比,給纖溶酶原組的小鼠其肝臟組織纖維蛋白的水準降低,說明纖溶酶原具有抑制纖維蛋白水準沉積的功能,損傷得到一定程度的修復。
24-25周齡db/db雄鼠20隻,隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每組各10隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組,實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天,連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第0,4,7,11,16,21,26,31天分別稱體重。
結果顯示,給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組在第0,4,7,11,16,21,26,31天體重無顯著差異(圖4),說明纖溶酶原對動物體重影響不大。
24-25周齡db/db雄鼠10隻,隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組,實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天,連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第32天處死小鼠並取肝臟組織在10%中性福馬林固定液中固定24-48小時固定後的肝組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色),1%鹽酸酒精分化,氨水返藍,並酒精梯度脫水封片。
HE染色結果顯示,給溶媒PBS對照組(圖5A)肝臟呈重度脂肪變性,脂質沉積,融合成大的脂肪空泡,細胞核被擠至邊緣(↗),肝索紊亂,肝竇變窄,且在肝索處有數量不等的炎性灶(↑);給纖溶酶原組(圖5B)肝臟輕度脂肪變性,損傷以輕度水樣變性為主,胞漿溶解(◥),主要分佈在匯管區與中央靜脈
中間的區域,匯管區及中央靜脈周圍受累較輕,同時可見肝索處輕度炎細胞浸潤。說明給纖溶酶原後肝臟的損傷得到明顯修復。
24-25周齡db/db雄鼠10隻,隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組,實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天,連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第32天處死小鼠並取肝臟組織在10%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的肝臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘,水洗2次,每次5分鐘。10%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時;時間到後,棄除羊血清液,用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠纖維蛋白(原)抗體(Abcam)4℃孵育過夜,TBS洗2次,每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時,TBS洗2次,每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色,水洗3次後蘇木素複染30秒,流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片,切片在顯微鏡下200倍下觀察。
纖維蛋白原是纖維蛋白的前體,在組織存在損傷的情況下,作為機體對損傷的一種應激反應,纖維蛋白原水解成纖維蛋白[12-14]。因此可將纖維蛋白原水準作為損傷程度的一個標誌。
研究發現,給纖溶酶原組(圖6B)與給溶媒PBS對照組(圖6A)相比,給纖溶酶原組的小鼠其肝臟組織纖維蛋白的水準明顯降低,說明注射纖溶酶原能夠顯著降低糖尿病小鼠的纖維蛋白沉積,反映出纖溶酶原對糖尿病小鼠的機體損傷有顯著修復功能。
24-25周齡db/db雄鼠10隻,隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組,實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天,連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。給纖溶酶原31天後處死小鼠並取肝臟組織在10%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的肝臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,
切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘,水洗2次,每次5分鐘。10%正常羊血清封閉1小時,時間到後甩去血清,用PAP筆圈出組織。針對F4/80的兔多克隆抗體(Abcam)4℃孵育過夜,TBS洗2次,每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時,TBS洗2次。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色,水洗3次後蘇木素複染30秒,流水沖洗5分鐘,梯度脫水透明並封片,切片在顯微鏡下400倍下觀察。
F4/80巨噬細胞標誌物,可以表示炎症反應的程度和階段。結果顯示,給纖溶酶原組(圖7B)與給溶媒PBS對照組(圖7A)相比,給纖溶酶原組小鼠的F4/80陽性水準明顯降低,說明給纖溶酶原後肝臟組織炎症程度減輕。圖7C為F4/80免疫組化陽性表達數定量分析結果,給纖溶酶原組F4/80表達量顯著減少,且具有統計學差異,說明注射纖溶酶原能夠顯著促進糖尿病小鼠肝臟炎症的修復。
25-28周齡db/db雄鼠9隻,隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組3隻,給纖溶酶原組6隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組,實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天,連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。給纖溶酶原31天後摘眼球採全血,待血清析出後4℃ 3500r/min離心10分鐘,取上清液進行檢測。本實驗使用穀丙轉氨酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號C009-2),運用賴氏比色法(Reitman-Frankel)檢測血清中穀丙轉氨酶(ALT)的含量。
穀丙轉氨酶是肝臟健康狀態的一個重要指標[15,16],穀丙轉氨酶的正常參考值區間為9~50U/L。檢測結果顯示,給溶媒PBS對照組血清中ALT的含量顯著高於正常生理指標,而給纖溶酶原組已經恢復到體內的正常水準,並且給纖溶酶原組要顯著低於給溶媒PBS對照組,且具有統計學差異(圖8)。說明在糖尿病晚期模型小鼠中,注射纖溶酶原能有效地修復肝損傷。
7-8周齡plg+/+小鼠18隻,雌雄不限,隨機分為兩組,分別為給溶媒PBS對照組和纖溶酶原給藥組,每組9隻。兩組小鼠按0.5mL/kg體重經腹腔注射給予四氯化碳,連續給予兩天,建立急性肝損傷模型[17,18]。四氯化碳使用前需用玉米油稀釋,前者與後者的體積比1:7。造模當天為第0天,第1天開始給纖溶
酶原或PBS。給纖溶酶原組小鼠按每天1mg/0.1mL/隻/天給予纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS,連續給藥7天。在第0,2,7天分別取兩組小鼠各3隻處死,解剖觀察記錄肝臟情況,然後肝臟組織在10%中性福馬林固定液中固定24-48小時。固定後的肝臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色),1%鹽酸酒精分化,氨水返藍,並酒精梯度脫水封片,在顯微鏡下200倍下觀察。
HE染色結果顯示,給溶媒PBS對照組(圖9A-C)和給纖溶酶原組(圖9D-F)小鼠的肝臟第0天主要以中央靜脈周圍碎片狀壞死為主,壞死區域胞核碎裂,胞漿淡染,其他未壞死區也發生了中度水樣變性,細胞水腫;第2天中央靜脈擴張,肝細胞結構紊亂,少量炎性細胞浸潤,兩組並無明顯差異。但在第7天時,給溶媒PBS對照組仍可見少量的肝細胞變性,細胞輕度水腫,肝索紊亂,肝血竇變窄,且在匯管區周圍輕度炎細胞浸潤,而給纖溶酶原組的肝臟基本恢復正常胞漿紅染,肝索規則,肝竇清晰。說明纖溶酶原能夠促進肝損傷的修復。
7-11周齡plg-/-雄性小鼠18隻,隨機分為兩組,分別為給溶媒PBS對照組和纖溶酶原給藥組,每組9隻。兩組小鼠按0.5mL/kg體重經腹腔注射給予四氯化碳,單次處理,建立急性肝損傷模型[17,18]。四氯化碳使用前需用玉米油稀釋,前者與後者的體積比1:7。造模給完成後半小時內給予纖溶酶原或溶媒PBS。給纖溶酶原組小鼠按每天1mg/0.1mL/隻/天給予纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS,連續給藥2天。在給藥後第18,24,48小時分別取兩組小鼠各3隻處死,解剖觀察記錄肝臟情況,然後肝臟組織在10%中性福馬林固定液中固定24-48小時。固定後的肝臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色),1%鹽酸酒精分化,氨水返藍,並酒精梯度脫水封片,在顯微鏡下200倍下觀察。
結果顯示,給溶媒PBS對照組(圖10A-C)在18h、24h、48h均呈現不同程度的壞死,18h、24h以片狀壞死為主,48h時已經發生了橋接壞死,核碎裂,胞漿淡染,而且損傷不斷加劇,主要分佈在中央靜脈周圍,壞死區中度炎細胞浸潤(↓),匯管區周圍壞死較輕,以輕度水樣變性為主,伴以輕度的炎細胞浸潤,輕度膽管增生(◥);給纖溶酶原組(圖10D-F)在18h、24h、48h較之於對照
組,均未出現明顯的壞死,損傷以輕度水樣變性為主,分佈在匯管區周圍,而中央靜脈周圍肝細胞未受累,而24h時比之18h有好轉,水樣變性減輕,中央靜脈周圍肝細胞輕度脂肪變性,胞漿淡染,均伴以輕度炎細胞浸潤。說明纖溶酶原能夠促進plg-/-急性肝損傷模型小鼠肝臟損傷的修復。
7-11周齡plg-/-雄性小鼠18隻,隨機分為兩組,分別為給溶媒PBS對照組和纖溶酶原給藥組,每組9隻。兩組小鼠按0.5mL/kg體重經腹腔注射四氯化碳,單次處理,建立急性肝損傷模型[17,18]。四氯化碳使用前需用玉米油稀釋,前者與後者的體積比1:7。造模給完成後半小時內給予纖溶酶原或溶媒PBS。給纖溶酶原組小鼠按每天1mg/0.1mL/隻/天給予纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS,連續給藥2天。在給藥後第18,24,48小時分別取兩組小鼠各3隻處死,解剖觀察記錄肝臟情況,然後肝臟組織在10%中性福馬林固定液中固定24-48小時。固定後的肝臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘,水洗2次,每次5分鐘。10%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時;時間到後,棄除羊血清液,用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠纖維蛋白(原)抗體(Abcam)4℃孵育過夜,TBS洗2次,每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時,TBS洗2次,每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色,水洗3次後蘇木素複染30秒,流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片,切片在顯微鏡下200倍下觀察。
纖維蛋白原是纖維蛋白的前體,在組織存在損傷的情況下,作為機體對損傷的一種應激反應,纖維蛋白原水解成纖維蛋白[12-14]。因此可將纖維蛋白原水準作為損傷程度的一個標誌。
結果顯示,第18、24、48小時三個時間點給纖溶酶原組(圖11D-F)纖維蛋白的陽性著色都顯著淺於給溶媒PBS對照組(圖11A-C),並且隨著時間的延長纖維蛋白的著色也有逐漸變淺的趨勢。說明注射纖溶酶原能夠減少纖維蛋白的沉積,促進肝損傷的修復。
本實驗使用6-8周齡健康的雄性C57小鼠10隻,隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每組各5隻。分組完成後,建立放射損傷模型,
採用直線加速器6 MV X射線按5.0Gy對小鼠全身單次均勻照射,吸收劑量率2.0Gy/min,吸收劑量為5.0Gy(照射2.5分鐘)。建立模型後,3個小時內給予纖溶酶原。實驗開始當天為第0天稱量體重並分組,第1天開始輻射處理並給予纖溶酶原或溶媒PBS,給藥期為10天給藥完成後對動物進行停藥觀察11天,整個實驗期為21天。給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/隻/天經尾靜脈注射給藥,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第21天處死解剖小鼠並取肝臟在10%中性福馬林固定液中固定24-48小時。固定後的肝臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水後水洗1次。Tris-EDTA修復30分鐘,室溫冷卻20分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水孵育15分鐘,用PAP筆圈出組織。10%的正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時;時間到後,棄除羊血清液。兔抗小鼠F4/80抗體(Abcam)4℃孵育過夜,TBS洗2次,每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時,TBS洗2次,每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色,水洗3次後蘇木素複染30秒,流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片,切片在顯微鏡下200倍下觀察。
F4/80免疫組化結果顯示,5.0Gy X射線照射造模後給溶媒PBS對照組(圖12A)的小鼠巨噬細胞標誌物的表達量高於給纖溶酶原組(圖12B),說明給纖溶酶原後,動物肝臟組織的炎症顯著減輕。
8-9周齡健康的雄性C57小鼠10隻,隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每組各5隻。分組完成後,建立化療損傷模型,按10mg/Kg體重單次腹腔注射順鉑。建立模型後,給纖溶酶原組按1mg/隻/天經尾靜脈注射給予纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。實驗開始當天為第0天稱量體重並分組,第1天開始腹腔注射順鉑造模,造模後3小時內給予纖溶酶原或溶媒PBS,給藥期為7天。第8天處死小鼠,取肝臟在10%中性福馬林固定液中固定24-48小時。固定後的肝臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水後水洗1次。檸檬酸修復30分鐘,室溫冷卻10分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水孵育15分鐘,用PAP筆圈出組織。10%的正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時;時間到後,棄除羊血清液。兔抗小鼠纖維蛋白抗體(Abcam)4℃孵育過夜,TBS洗2次,每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時,TBS洗2次,每次5分鐘。按DAB
試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色,水洗3次後蘇木素複染30秒,流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片,切片在顯微鏡下200倍下觀察。
纖維蛋白原是纖維蛋白的前體,在組織存在損傷的情況下,作為機體對損傷的一種應激反應,纖維蛋白原水解成纖維蛋白[12-14]。因此可將纖維蛋白原水準作為損傷程度的一個標誌。
結果顯示,給溶媒PBS對照組(圖13A)肝臟組織中纖維蛋白陽性著色明顯深於纖溶酶原給藥組(圖13B)。說明纖溶酶原能夠使損傷的肝臟組織中沉積的纖維蛋白顯著減少,表明纖溶酶原能夠促進化療藥順鉑所致的肝臟損傷的修復。
7-11周齡plg-/-雄性小鼠6隻,隨機分為兩組,分別為給溶媒PBS對照組和纖溶酶原給藥組,每組3隻。兩組小鼠按0.5mL/kg體重經腹腔注射給予四氯化碳,單次處理,建立急性肝損傷模型[17,18]。四氯化碳使用前需用玉米油稀釋,前者與後者的體積比1:7。造模給完成後半小時內給予纖溶酶原或溶媒PBS。給纖溶酶原組小鼠按每天1mg/0.1mL/隻/天給予纖溶酶原,給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS,連續給藥7天。在第8天處死小鼠,解剖觀察記錄肝臟情況,然後肝臟組織在10%中性福馬林固定液中固定24-48小時。固定後的肝臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色),1%鹽酸酒精分化,氨水返藍,並酒精梯度脫水封片,在顯微鏡下200倍下觀察。
結果顯示,給溶媒PBS對照組(圖14A),肝臟中央靜脈擴張,內皮細胞壞死,中央靜脈的周圍肝細胞均發生大面積灶狀壞死,核碎裂深染,其他未發生壞死的區域有輕度的水樣變性,細胞水腫,胞漿透亮,伴以壞死區輕度炎細胞浸潤;給纖溶酶原組(圖14B),肝臟未發生明顯的壞死,損傷以輕度的水樣變性為主,有少量肝細胞胞漿嗜酸性增強,紅染。給纖溶酶原組損傷明顯輕於給溶媒PBS對照組,說明纖溶酶原能夠促進plg-/-急性肝損傷模型小鼠肝臟損傷的修復。
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Claims (10)
- 一種預防和/或治療受試者肝組織損傷及其相關病症的方法,包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中所述肝組織損傷及其相關病症為輻射或化學物質引起的肝損傷及其相關病症。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中所述肝組織損傷及其相關病症為中毒性肝損傷及其相關病症。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中所述肝組織損傷及其相關病症為糖尿病性肝損傷及其相關病症。
- 如申請專利範圍第4項所述的方法,其中所述糖尿病性肝損傷及其相關病症是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病變導致。
- 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的方法,其中所述肝組織損傷及其相關病症包括肝組織損傷導致的肝功能異常、肝酶學異常、肝區不適和觸痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、膽管炎、肝硬化、肝壞死和肝癌。
- 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的方法,其中所述纖溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。
- 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之方法,其中所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。
- 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述的方法,其中所述纖溶酶原是選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ(delta)-纖溶酶原或其任意組合。
- 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述的方法,其中所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物聯合施用。
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