TWI599366B - 含地榆之抗流感病毒醫藥組合物 - Google Patents

Description

含地榆之抗流感病毒醫藥組合物

本發明係關於一種抗流感病毒之醫藥組合物，特別是包含有地榆萃取物或其活性化合物之醫藥組合物。

流行性感冒病毒(簡稱流感病毒)是人類生命中最具威脅性的病毒之一，自20世紀就發生四次流行性感冒大流行，分別是1918~1919年(西班牙流感，H1N1)、1957年(亞洲流感，H2N2)、1968年(香港流感，H3N2)及1977年(俄羅斯流感，H1N1)。其中，又以1918年西班牙流感最為嚴重，其H1N1病毒株是由禽流感以及人類流感病毒突變而成，在全世界造成2~4千萬人的死亡。而，2009年墨西哥爆發新型H1N1流感疫情，已懷疑有一百多萬人感染，造成一萬多人的喪命，目前也持續蔓延中(Neumann,G.；Noda,T.；Kawaoka,Y.Emergence and Pandemic Potential of Swine-Origin H1N1 Influenza Virus.Nature.459：931-939,2009)。另外，在2010年全國流感防控會中提出要特別注意季節性A型H3N2流感的侵襲，此病毒株也在過去造成不少的傷亡。

流感病毒是一種造成人類與動物患流行性感冒的負鏈單股RNA病毒，是屬於正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)，依據病毒核蛋白、遺傳物質、基質蛋白抗原特性的不同，可分為A、B、C三個血清型。其中，A型流感病毒會導致不同宿主間的流行性感冒，因其病毒外表的兩種抗原血凝素(hemagglutinin,HA)及神經胺酸酶(neuraminidase,NA)為多型性，目前已發現16種HA(H1~16)及9種NA(N1~N9)，可發生遺傳性抗原變異；B型流感病毒抗原變異較少只會引起地區性感染，C型流感病毒主要是以豬為宿主，對人體的感染較少見，因此上述所說的世界性大流感就是由A型流感病毒所導致的疫情。

A型流感病毒結構自外而內可分為外膜、基質蛋白及核心三 個部分。外膜有約500個放射狀向外排列的突起，為上述兩種抗原類型：柱狀突起(HA)及蘑菇狀突起(NA)。HA能與多種動物紅血球的表面受體吸附引起凝集，經裂解後可分為重鏈及輕鏈，使得病毒與宿主細胞相互融合；NA主要具有水解唾液酸的活性，切斷病毒與宿主細胞最後的聯繫，使病毒從吸附的紅血球脫落，防止病毒的聚集，促進在黏液中的移動。基質蛋白是由M1、M2所組成，有保護病毒核心及維繫病毒的結構。另外核心是由8個負鏈單股RNA片段所組成，其與核蛋白(NP)及RNA聚合酶(PB1、PB2及PA)相結合纏繞成核糖核蛋白體。而流感病毒之所以會造成人們的恐慌主要是由於它的變異方式會產生新的亞型而讓我們措手不及，其突變方式有兩種，一為抗原飄移(antigenic drift)，其是指流感病毒亞型的抗原(NA)胺基酸序列的點突變所產生小變異；另一個為抗原轉變(antigenic shift)，是流感病毒變異最常見的類型，每隔十年就會發生一次抗原性大變異，造成的原因是由於宿主同時受到兩種不同病毒株感染，病毒RNA進行基因重組而產生新的病毒株，影響甚大(陳鴻珊，張興權，抗病毒藥物及其研究方法，化學工業出版社，328-331,2006.)。

流行性感冒大多發生在秋冬、早春，其侵襲的目標為呼吸道黏膜上皮細胞，並在宿主細胞內繁殖，導致黏膜充血、水腫及細胞變性、脫落等病變。潛伏期通常1至3天，開始出現發燒、發冷、頭痛、鼻塞、全身痠痛等徵狀，當蔓延至下呼吸道，則可能引起支氣管炎和間質性肺炎，由於流感病毒會降低呼吸道黏膜上皮細胞清除和黏附異物的能力，因此經常造成繼發性肺炎感染，是其主要造成流感疾病死亡原因之一(Morens,D.M.；Taubenberger,J.K.；Fauci,A.S.Predominant Role of Bacterial Pneumonia as a Cause of Death in Pandemic Influenza：Implications for Pandemic Influenza Preparedness.J.Infect.Dis.198：962-970,2008)。

目前，對於流感的防疫與治療大多採取社區隔離及支持性藥物治療，而使用治療預防方式分為疫苗和抗病毒藥物。但是對於 日趨變異的病毒，疫苗防護還是有風險性；而目前抗病毒藥物主要有三種，第一種為M2抑制劑(M2 protein inhibitor)，作用於病毒穿膜蛋白M2離子通道，阻礙H⁺進入病毒內部，使得病毒外膜無法與endosome融合，病毒便無法釋放RNA，這類藥物為Adamantan衍生物(amantadine、rimantadine)；第二種為NA抑制劑(neuraminidase inhibitors)，作用在神經胺酸酶(NA)，使病毒無法水解唾液酸，進而無法離開宿主細胞，阻止病毒擴散，這類藥物有oseltamivir、zanamivir、peramivir和cyclopentane或pyrrolidine derivatives；第三種為RNA polymerase抑制劑，主要抑制RNA polymerase(PB1、PB2、PA)合成病毒蛋白質的路徑，藥物有2'-deoxy-2'-fluoroguanosine(FdG)、T-705；另外也有利用干擾素及SiRNA(small interfering RNAs)等治療方式來防止病毒的感染(Clercq,E.D.Antiviral Agents Active against Influenza A Viruses.Nat.Rev.Drug.Discov.5：1015-1025,2006)。

然而，上述的藥物皆無法達到全面抑制各種類型的流感病毒，且有抗藥性及藥物副作用的缺失。A型流感病毒的抗原變異性大，傳染性強，每年全球約有5億人感染流感，常造成很高的死亡率，對於社會產生巨大的負擔和經濟損失，因此積極開發新的抗流感藥物實為一重要課題。

本發明係首次提出以地榆(S.officinalis L.)萃取物製備抗流感病毒之醫藥組合物。

因此，本發明一方面提供一種抗流感病毒之醫藥組合物，其包括有效量之地榆萃取物及醫藥學上可接受之載劑。

在一特定實施例中，地榆萃取物係由乙醇萃取地榆製備而得。

另一方面，本發明提供一種抗流感病毒之醫藥組合物，其包括有效量之式(I)化合物、其水解物或藥物上可接受之鹽類，以及醫藥學上可接受之載劑：

本發明之其他特徵將經由以下詳細說明、各個具體實例及申請專利範圍而清楚呈現。

本發明說明中之用詞通常具有在本技術領域中、在本發明內容中、及各用語所在之特定內容中的原始意義。

本文所使用的「一」乙詞，如未特別指明，係指至少一個(一個或一個以上)之數量。

本文中所述之「流感病毒」係為流行性感冒病毒之簡稱，係為一種造成人類與動物患流行性感冒的負鏈單股RNA病毒，是屬於正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)，依據病毒核蛋白、遺傳物質、基質蛋白抗原特性的不同，可分為A型流感病毒、B型流感病毒及C型流感病毒，再根據血凝素和神經胺酸酶的抗原性分為不同的亞型。根據世界衛生組織(WHO)流感病毒株的命名包含6個要素：型別/宿主/分離地區/毒株序號/分離年份(HnNn)，其中對於人類流感病毒，省略宿主信息，對於乙型和丙型流感病毒省略亞型信息。本發明中所稱之流感病毒包括A型流感病毒、B型流感病毒及C型流感病毒。在一特定實施例中，流感病毒特別為H1N1、H3N2或其具抗藥性之變種病毒株，尤指對克流感(Tamiflu)具抗藥性之變種病毒株。

本文中所述之「治療有效量」係指本發明地榆萃取物或式(I)化合物、其水解物或藥物可接受之鹽類對個體可產生治療效果所需之含量。熟習本項技術者將瞭解一活性成分或組合物之有效量將視情形而定，包括但不侷限於例如該藥物的種類和劑型以及該生物體的體重、年齡和健康狀況。

本文中所述之「萃取物」指針對一物質進行萃取所得之產物，通常是藉由將所欲萃取的物質浸泡或混合於溶劑中而獲得的萃取層。一般萃取物之製備係自新鮮植物或經研磨或乾燥之植物樣本以此領域已知各種萃取方法，包括但不限於浸漬、滲濾、再滲濾、消解、逆流萃取、渦輪萃取、擠壓/壓擠/壓榨或超臨界流體二氧化碳萃取之。適當的溶劑包括但不限於乙醇、正己烷、甲醇、二氯甲烷、水、正丁醇或其他溶劑。可視需要地選擇試劑之種類或調配溶劑之濃度，以達適當極性而進行萃取。不同階段的萃取物可相互合併，亦可於後續再進行濃縮步驟，例如，蒸發，或純化或分離步驟，例如，過濾、離心和色層分析。在一實例中，將新鮮植物或乾燥的植物樣本之全部或部分(視需要地經切碎或磨碎)與適當的溶劑混合或浸泡於其中並攪拌達一段足夠的時間，在室溫進行或加熱進行，經由過濾移除固體殘留物(濾渣)，然後收集所獲得的汁液(萃取液)；視需要重複浸泡或混合步驟，合併所得汁液，進一步予以濃縮、純化或分離。

本文中所述之「地榆」又名玉鼓、酸赭、紅繡球，為薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.、長葉地榆S.officinalisL.var.longifolia(Bert.)Yu et Li的乾燥根，係由陶弘景曰：「其葉似榆而長，初生步地」而得其名，始載於「本經」，列為中品。性微寒、味苦酸、無毒，歸大腸、肝、胃、腎經，具有涼血止血、解毒斂瘡等功效。地榆為多年生草本植物。根多呈紡錘形，表面棕褐色或紫褐色，有縱皺紋及橫裂紋。莖直立，有棱，無毛或基部有稀疏腺毛。基生葉為羽狀複葉，小葉4~6對；葉柄無毛。穗狀花序橢圓形、圓柱形或卵球形，直立，長1~3公分，寬0.5~1公分，紫色至暗紫色，從花序頂端像下開放；苞片2，披針形，背 面及邊緣有柔毛；萼片4，橢圓形至寬卵形，紫紅色；雄蕊4，花絲絲狀，柱頭先端盤形。瘦果包藏在萼筒內，倒卵狀長圓形。花期7~10月，果期9~11月。生於海拔30~3000公尺的草原、山坡草地，主要分布於東北、華東、西南及河南、湖北、廣西等地。通常在春、秋季均可採收地榆根部，其性狀為圓柱形，略扭曲狀彎曲，長18~22 cm，直徑0.5~2 cm，有時可見側生支根。質堅，稍脆，折斷面平整，略具粉質。橫斷面形成層環明顯，皮部淡黃色，木部棕黃色或帶粉紅色，呈顯著放射狀排列。氣微，味微苦澀(宋立人，中華本草，上海科學技術出版社4：281-286,1999)。在本發明之一具體實施例中，係使用地榆Sanguisorba officinalis L.，其使用基部為根部。

本文中所述溶劑之「百分比」或「%」係指溶劑溶於水的體積百分比，例如，95%乙醇是指含有95體積百分比乙醇之水溶液或例如，80%甲醇是指含有80體積百分比甲醇之水溶液。

根據本發明，不可預期地發現地榆(S.officinalis L.)萃取物具有抗流感病毒之功效，包括但不限於H1N1及H3N2流感病毒。因此提供一種抗流感病毒之醫藥組合物，其包括治療有效量之地榆萃取物及醫藥學上可接受之載劑。

根據本發明之實施例，該地榆萃取物係由乙醇萃取地榆製備而得，其亦可包含進一步之精萃。例如，該地榆萃取物可由具下述步驟之方法製備而得：(1)以乙醇萃取地榆，以取得乙醇萃取物；以及(2)以甲醇與正己烷(1：1)萃取該乙醇萃取物，以獲得甲醇萃取物。

又可進一步以二氯甲烷與水(1：1)萃取該甲醇萃取物，以獲得二氯甲烷萃取物。

根據本發明之另一實施例，該地榆萃取物係由前述甲醇萃取物以二氯甲烷與水(1：1)萃取，取水萃取物再以正丁醇與水(1：1)萃取該水萃取物，以獲得正丁醇萃取物。

前述製備方法中，所使用之乙醇係為50%至99%乙醇，較佳 為95%乙醇。

前述製備方法中，所使用之甲醇係為50%至99%甲醇，較佳為90%甲醇。

根據本發明，由該地榆萃取物進一步分離純化出活性成分，並經生物實驗證實其具有極佳之抗流感病毒活性，甚至具有對抗具抗藥性之流感病毒株之活性。

因此，本發明另一方面提供一種抗流感病毒之醫藥組合物，其包括治療有效量之式(I)化合物、其水解物或藥物上可接受之鹽類，以及醫藥學上可接受之載劑：

根據本發明，式(I)化合物可進一步水解而得其水解物麥考酚酸(Mycophenolic acid)，式(I)化合物及其水解物經生物實驗驗證具有其具有極佳之抗流感病毒活性，甚至具有對抗具抗藥性之流感病毒株之活性。咸信其藥物上可接受之鹽類亦當然具有抗流感病毒活性。

本文所使用之「藥物上可接受之鹽類」係指對於人類或哺乳動物服用具安全且有效之鹽類化合物，具有其所需之生物活性。藥物上可接受之鹽類包括但不限於本發明式(I)化合物的酸性或鹼性鹽類，例如與鹽酸、氫溴酸、碘酸、硝酸、硫酸、硫酸氫鈉、磷酸、磷酸酯、醋酸、乳酸、水楊酸、檸檬酸、酒石酸、泛酸、重酒石酸、抗壞血酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、葡萄糖酸、甲酸、苯甲酸、谷氨酸、甲基磺酸、對甲苯磺酸合成的鹼性鹽；或與鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉、鋅和二乙醇胺鹽合成的鹼性鹽。

根據本發明，該醫藥組合物可以包括但不限於非經腸道或口服投藥。非經腸道投藥之醫藥組合物其形式包括溶液、懸浮液、 乳液，及可在使用前刻溶解或懸浮於溶劑中之固體可注射組合物。可藉由溶解、懸浮或乳化一或多活性成分於稀釋劑中來製備該注射液。前述稀釋劑之實例為用於注射之蒸餾水、生理鹽水、植物油、醇類及其組合。又，該注射液可含有安定劑、助溶劑、懸浮劑、乳化劑、平滑劑、緩衝液、保存劑等。該等注射液係在最終製劑步驟中滅菌或以無菌程序製備。本發明之醫藥組合物亦可被製劑成無菌固體配製品，例如，藉由冷凍乾燥，並可在使用前刻滅菌或溶解於無菌可注射水或其他無菌稀釋劑。該醫藥組合物亦可經口投藥，其中該組合物可為固體或液體形式。固體組合物包括錠劑、丸劑、膠囊、分散性粉劑、顆粒及其類似物。口服組合物亦包括漱口藥及舌下片劑。膠囊包括硬膠囊及軟膠囊。在此類口服固體組合物中，一或多活性化合物可自行混合，或與稀釋劑、結合劑、散解劑、潤滑劑、安定劑、助溶劑混合，接著以習知方法製劑成配製品。當需要時，此等配製品可以塗佈劑塗佈，或可以二或多種塗佈層塗佈。另一方面，口服液體組合物包括醫藥上可接受之液態溶液、懸浮液、乳液、糖漿、藥酒，及類似物。在此類組合物中，一或多活性化合物可被溶解、懸浮或乳化在通用稀釋劑中(如純化水、乙醇或其等之混合物等等)。除了此類稀釋劑，前述組合物亦可含有潤濕劑、懸浮劑、乳化劑、甜味劑、調味劑、香料、保存劑及緩衝液及其類似物。

無須進一步的闡述，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。下述實施例僅僅是作為例示說明之用，而非以任何方式限制其餘的揭露內容。

[實施例] 實驗材料

溶媒與試劑：除特別註明外，實施例之成分分離所用試劑、溶媒，均購自景明化學工業公司及友和貿易股份有限公司，而且均為試藥級或液相層析級之純品。

層析材料：除特別註明以外，實施例之層析材料均購自於台灣默克(Merck Taiwan)公司及友和貿易股份有限公司。

(1)吸附性層析矽膠：Silica gel 60，70-230 mesh、230-400 mesh，Diaion HP-20離子交換樹脂。

(2)薄層層析片(TLC plate)：DC Kieselgel 60 F254(正相薄層色層層析片)，DC Kieselgel RP-18 F254S(逆相薄層色層層析片)。

(3)低壓製備式碳18型逆相層析柱：Lichroprep RP-18，40-63μm。

(4)製備式高效液相層析儀用碳18型層析柱：Nacalai Teaque公司出品之Cosmosil-pack，Prep-C18，10 μm，20 mm×250 mm。

設備儀器

低壓液相層析幫浦：係採用FMI公司出品之RP-SY-ICSC型低壓幫浦，使用於逆相低壓層析。

高效液相層析儀：

1.系統控制器：Shimadzu SCL-8A；2.幫浦：Shimadzu LC-8A；3.檢測器：Shimadzu SPD-10A UV spectrophotometric detector；4.分段收集器：Shimadzu FCV-100B fraction collector；5.紀錄器：Shimadzu C-R7A。

濃縮機

1. Buchi B-480 Waterbath；2. Buchi R-114 Rotavapor；3. Buchi V-800 Vacuum controller。

TLC spots之檢出：

1. UV(波長360 nm，短波254 nm)；2. p-Anisaldehyde呈色試劑檢測。

核磁共振光譜儀：除使用國防醫學院之Varian GEMINI-300(300 MHz)外，並委託國立台灣大學貴重儀器中心代為測定(使 用儀器：Bruker Avance 500 MHz FT-NMR)。測定之氫光譜與碳光譜以δ值表示化學位移，單位為ppm，而以TMS(tetramethylsilane)當內部標準。s表示單峰(singlet)；d表示雙重峰(doublet)；t表示三重峰(triplet)；br表示寬峰(broad)；dd表示兩組雙重峰(doublet doublet)。

熔點測定器：化合物熔點測定係採用美國Fischer-Johns公司之熔點測定器(未校正)。

紅外線光譜儀：Shimadzu FT-IR8700型。聚乙烯(polystyrene)校正波長，除特別說明，均以溴化鉀(KBr)打錠方式測定；並於中央研究院基因體中心Theremo Nicolet 380型之傅立葉轉換紅外線光譜儀測定。

紫外線光譜(Ultraviolet spectra,UV)以Shimadzu UV-160 spectrophotometer測定。

質譜儀：委託國立交通大學、清華大學以及國立中興大學貴重儀器中心代為測定，其質譜儀器分別為Micromas TRIO-2000 GC-MS、MAT-95XL High Resolution Mass Spectrometer、High Resolution Mass Spectrometer。

細胞藥理實驗材料

細胞株(Cell line)：MDCK：Madin-Darby canine kidney cells(Madin-Darby氏狗腎小管細胞株)。

細胞培養液：

1. 10% Fetal bovine serum(FBS)；2. TPCK培養液(tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone-treated trypsin)；3. DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)。

細胞生理緩衝液：Phosphate-buffered saline(PBS)。

病毒株：Influenza A(H1N1/H3N2)(來源：姚振文教授，三軍總醫院病理部)。

ELISA讀數測定儀：BIOTEK CERES 900 EIR READER。

實施例1. 萃取物之製備

如圖1所示，將地榆樣品磨碎後秤重共10公斤，於室溫下以95%乙醇冷浸抽取後，以減壓濃縮機濃縮，得乙醇萃取物共總重3400公克。乙醇萃取物再以90%甲醇溶解後與正己烷以等體積比例進行萃取，得正己烷萃取物(SAOF-H)134.20 g及甲醇萃取物。

將甲醇萃取物以等體積二氯甲烷和水進行萃取，得二氯甲烷萃取物(SAOF-D)159.50 g。其中，水層再與等體積的正丁醇進行萃取，因兩者無法分離，於合併後得正丁醇萃取物(SAOF-B)3100 g。

實施例2. 萃取物之抗病毒活性試驗

抗病毒活性試驗是以病毒宿主細胞的存活率來評估宿主細胞感染病毒的程度，而宿主細胞的存活率是以細胞存活率分析(MTT assay)的方法。原理為3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)黃色水溶液固體可被活細胞的粒腺體(mitochondria)中的脫氫酵素(dehydrogenase)代謝，將重氮環(tetrazolium ring)還原呈紫色不溶性沉澱結晶物formazan(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基甲臢3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-formazan)而堆積在細胞中，因活細胞的粒線體酵素才具有催化活性，故所測得的吸光值會與活細胞數量成正比關係，因此本實施例係利用formazan產量的多寡來評估細胞的存活率。

具體地說明，本實施例選用H1N1及H3N2的病毒株進行抗流感病毒之活性試驗，其細節如下：

一、細胞培養

細胞解凍後培養在37℃、5%二氧化碳培養箱中，等至細胞長滿八成左右時，以磷酸緩衝液(PBS)清洗細胞，加入胰蛋白脢(trypsin)反應5分鐘，使貼附在培養皿的細胞脫落，加入DMEM 細胞培養基中和trypsin的反應，離心(1200 rpm、5分鐘)，吸除上清液，以少量培養基混勻細胞，計數細胞後加入DMEM細胞培養液稀釋成實驗所需的細胞濃度，以便進行抗流感病毒活性篩選。

二、實驗步驟

1.將細胞稀釋至指定濃度(2×104 cells/well)植入96孔培養皿(96-well plate)中，於37℃、5%二氧化碳培養箱(incubator)培養20~24小時；2.每個well的細胞以100 μl的細胞生理緩衝液(PBS)清洗兩次，最後一次加入100 μg/well的TPCK培養液，置入培養箱，待測藥物稀釋完成後再給藥；3.給藥條件分為D+V、D、V、對照組(Mock)和空白組(Blank)給藥，於37℃、5%二氧化碳培養箱(incubator)培養48小時；4.兩天後以顯微鏡觀察細胞凋亡情形；接著進行MTT檢測，分別在D+V、D、V、對照組(Mock)和空白組(Blank)中加入MTT試劑20 μl(5 mg/ml)，等待5小時；5.吸去培養液，在D+V、D、V、對照組(Mock)和空白組(Blank)中加入25 μl甘胺酸(glycine)緩衝液以及100 μl二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide,DMSO)。

6.進行讀盤，測量波長540 nm吸光值。

三、給藥條件

1. D+V：同時給予50 μl不同濃度待測藥物和50 μl流感病毒(0.01 MOI)；2. D：給予50 μl不同濃度待側藥物和50 μl TPCK培養液；3. V：給予50 μl流感病毒(0.01 MOI)和50 μl TPCK培養液；4. Mock：含MDCK細胞和100 μl TPCK培養液；5. Blank：不含MDCK細胞和TPCK培養液。

四、流感病毒(H1N1/H3N2)感染量

施於0.01 MOI(病毒感染量multiplicity of infection)的流感病毒株。

五、待測藥物濃度

1.萃取物：100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml三種濃度；2.純化物：75 μg/ml、25 μg/ml、12.5 μg/ml三種濃度。

六、陽性對照組

抗病毒藥物Ribavirin。

七、MTT檢測結果讀取

1.細胞存活率： 2.0~25%細胞存活率(cell survival)紀錄為+/-；25~50%細胞存活率紀錄為+；50~75%細胞存活率紀錄為++；75~100%細胞存活率紀錄為+++；>100%細胞存活率紀錄為++++。

其中，待測藥物對於病毒造成細胞凋亡現象有回復作用者，+++以上為有效藥物，且有效藥物必須有兩次或以上的相同結果。

在一具體實施例中，取正己烷萃取物(SAOF-H)、二氯甲烷萃取物(SAOF-D)和正丁醇萃取物(SAOF-B)三種萃取物，進行抗流感病毒之活性篩選，實驗結果請參閱表1及表2。

如上表1及表2所示，正丁醇萃取物在高劑量(100 μg/ml)及低劑量(25 μg/ml)同時給予待側藥物與H1N1或H3N2流感病毒時，均可使MDCK細胞存活率達75%，二氯甲烷萃取物在低劑量(25 μg/ml)下也可達75%存活。此外，由於二氯甲烷萃取物及正丁醇萃取物皆取自甲醇萃取物，因此技藝人士可理解甲醇萃取物也理應具有抗流感病毒之功效。

實施例3. 純化與分離

將地榆萃取物依抗流感病毒活性進一步選出二氯甲烷萃取物(SAOF-D)和正丁醇萃取物(SAOF-B)進行純化與分離活性成分，分離流程如圖2及圖3所示。

取二氯甲烷萃取物(SAOF-D)以矽膠管柱層析法，正己烷：二氯甲烷=1：1為移動相，梯度沖提的方式極性漸增至甲醇，分成五個分層(SAOF-D-1~5)，取其中有大量大量結晶析出之SAOF-D-3，由矽膠管柱層析法分離，以二氯甲烷為移動相，梯度沖提方式極性漸增至甲醇，分得五個部分(SAOF-D-3-1~5)。取其中SAOF-D-3-3由矽膠管柱層析法分離，移動相為正己烷：乙酸乙酯=9：1漸增極性至乙酸乙酯，續分為八個部分 (SAOF-D-3-3-1~8)。取其中SAOF-D-3-3-4經由低壓逆向性層柱以甲醇/水為移動相分離，得六個部分(SAOF-D-3-3-4-1~6)，取其中SAOF-D-3-3-4-4經製備型高壓液相層析柱以甲醇/水反覆分離純化，得到化合物SAOF-K09：甲基麥考酚酸酯(methyl mycophenolate,7 mg)。

實施例4. 式(I)化合物之鑑定

由本發明地榆萃取物進一步純化及分離之活性成分SAOF-K09具有極佳之抗流感病毒功效，經鑑定為具下列式(I)化合物： 化學名稱甲基麥考酚酸脂(methyl mycophenolate)，係為白色晶體，化學式：C₁₈H₂₂O₆。經鑑定其物化數據為：

1. Mol.Wt.：334.3637

2. R_f：0.3(EtOAc：Hexane=1：3)

3. mp：102-103℃

4. UV(MeOH)：304(3.65),248(3.95),223(4.23)

5. IR(KBr)cm^-1：3425,2993,2955,2918,1732,1622

6. ¹H-NMR(DMSO-d ₆ ,300 MHz),δ(ppm)：1.72(3H,s,CH ₃C),2.07(3H,s,CH₃Ar),2.17(2H,t,J=7.7 Hz,CH ₂C),2.34(2H,t,J=7.8 Hz,CH ₂CO),3.28(2H,d,J=6.9 Hz,CH ₂Ar),3.50(3H,s,CH₃OCO),3.68(3H,s,CH ₃OAr),5.12(1H,t,J=6.3 Hz,CHC),5.23(2H,s,CH ₂O),9.34(1H,s,OH)

7. ¹³C-NMR(DMSO-d ₆ ,75 MHz),δ(ppm)：10.80,15.63,22.20,32.06,33.91,50.88,60.47,68.52,106.88, 115.94,122.25,123.02,133.27,145.72,152.76,162.71,170.23,172.89

實施例5. 式(I)化合物之水解化合物(AnWen2150)

由本發明地榆萃取物進一步純化及分離具有極佳之抗流感病毒功效之活性成分SAOF-K09(式(I)化合物，6 mg)為起始物置於5-mL試管中，加入1 ml 0.1 N NaOH_(aq)振搖1小時候，加入1.5 ml 0.1 N HCl_(aq)酸化後，以乙酸乙酯5 ml萃取3次，合併萃取液後，以無水硫酸鈉5 g除水、過濾、濃縮後結晶得水解化合物(AnWen2150,4.2 mg)，鑑定為麥考酚酸(Mycophenolic acid)，其物化數據為：

1. Mol.Wt.：320.3371

2. R_f：0.1(EtOAc：Hexane=1：3)

3. mp：139-141℃

4. UV(MeOH)：304(3.85),251(3.97),225(4.50)

5. IR(KBr)cm^-1：3450,2997,2959,2923,1735,1627

6. ¹H-NMR(DMSO-d ₆ ,300 MHz),δ(ppm)：1.72(3H,s,CH ₃C),2.07(3H,s,CH₃Ar),2.15(2H,t,J=8.1 Hz,CH ₂C),2.24(2H,t,J=8.1 Hz,CH ₂CO),3.26(2H,d,J=6.9 Hz,CH ₂Ar),3.68(3H,s,CH ₃OAr),5.12(1H,t,J=6.9 Hz,C=CHC),5.23(2H,s,CH ₂O),9.33(1H,s,OH)

7. ¹³C-NMR(DMSO-d ₆ ,75 MHz),δ(ppm)：10.80,15.63,22.19,31.96,33.87,60.47,68.52,106.88,115.94,122.25,123.02,133.27,145.72,152.76,162.71,170.21,172.83.

實施例6. 式(I)化合物之製備

式(I)化合物SAOF-K09亦可依下述方法製備：

於冰浴中之麥考酚酸(mycophenolic acid)3.2 g(10 mmol)溶於30 ml之二氯甲烷(dichloromethane)溶液中，加入草醯氯(oxalyl chloride)1.5 ml(17.5 mmol)及二甲基甲醯胺(dimethylformamide) 2滴，在室溫下攪拌該混和液3小時。真空下蒸發該該混和液而得11a化合物。將11a化合物溶於甲醇中在室溫下攪拌該混和液10分鐘，真空下蒸發該該混和液而得粗產物11b化合物(即式(I)化合物)，該粗產物自己烷(hexane)及二氯甲烷(dichloromethane)(2：1)再結晶而得純化合物(2.3 g,67.3%)。製備反應流程如下：

實施例7. 純化物之抗病毒活性試驗

如表3所示，由二氯甲烷萃取物及正丁醇萃取物所分離之純化物在抗H1N1流感病毒活性試驗中，SAOF-K09(式(I)化合物)在低濃度(3.125 μg/ml)下具有較佳的抗流感病毒活性，並且對細胞無藥物毒性。

又如表4所示，SAOF-K09在低濃度(3.125 μg/ml)下具有較佳的抗流感病毒活性，並且對細胞無藥物毒性。

實施例8. 純化物之最小抑制濃度及藥物毒性實驗

根據前述抗流感病毒(H1N1/H3N2)活性測試結果，SAOF-K09具有抗流感病毒活性，並進行最小抑制濃度及藥物毒性試驗。其中，最小抑制濃度及藥物毒性試驗之實驗細節係同於抗病毒之活性試驗，而待測藥物濃度分別為100、75、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195、0.098 μg/ml。

如表5所示，SAOF-K09對於抗H1N1/H3N2流感病毒活性的最小抑制濃度皆在0.098 μg/ml，且在75 μg/ml以上具有細胞毒性。

根據表5的結果證實，SAOF-K09具有抗流感病毒之功效。

實施例9. 對抗藥性病毒之最小抑制濃度

依前述方法檢測即式(I)化合物及下列化合物針對流感病毒之抗藥變種的最小抑制濃度(MIC)： 式(I)化合物； AnWen2150：式(I)化合物之水解物(Mycophenolic acid)。

受測流感病毒株包括：

(1)H1N1 T.R.-H1N1克流感(Tamiflu)抗性病毒株：A型流感病毒株(H1N1)經變種，此一病毒株經定序後近似於Influenza A/Taiwan/937/2009

(2)H3N2-A型流感病毒株(H3N2)：經定序後近似於株Influenza A/New York/469/2004

(3)WSN-Influenza A/WSN/33(H1N1)：經定序後近似於Influenza A/Hong Kong/470/97

(4)Influenza B-B型流感病毒株

(5)H1N1-A型流感病毒株(H1N1)

根據表8的結果證實，式(I)化合物具有對抗具抗藥性之流感病毒株最佳功效。

雖然本發明以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習本發明技術者，當可在不脫離本發明之精神和範圍內，作些許之更動與潤飾，則應屬本發明申請專利範圍所界定之保護範圍。

圖1係為本發明地榆萃取物之萃取流程圖。

圖2係為根據本發明所得二氯甲烷萃取物純化分離活性化合物之流程圖。

圖3係為根據本發明所得正丁醇萃取物純化分離活性化合物之流程圖。

Claims (4)

1. 一種式(I)化合物、其水解物或藥物可接受之鹽類用於製備對抗具抗藥性之流感病毒之藥物的用途：
2. 如請求項1之用途，其中該水解物為麥考酚酸(Mycophenolic acid)。
3. 如請求項1或2之用途，其中該流感病毒為H1N1或H3N2之具抗藥性之變種病毒株。
4. 如請求項3之用途，其中該具抗藥性之變種病毒株為對克流感(Tamiflu)具抗藥性之變種病毒株。