TWI589874B - 用於胜肽產物放行測試的雜質定量 - Google Patents

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Description

用於胜肽產物放行測試的雜質定量
本發明係關於定量測定存在於胜肽產物中的雜質之方法，其中該雜質無法與主要產物及視需要與其他雜質分離。此方法特別是關於在有或無高效液相層析(HPLC)下使用高解析質譜(MS)偵測。此方法可用於探究胜肽和蛋白之品質，特別是醫藥胜肽和蛋白，以及其調配物。
使用熟知的重組DNA和化學固相合成法，已合成數種供醫藥用途之蛋白和胜肽。然而，製造這些蛋白和胜肽常常產生多重不欲的合成副產物。特別是當其係以固相合成來製造時。隨著胜肽/蛋白的長度增加，使得合成步驟增加，這些副產物可能以50至70%的粗產物存在。
因此，合成的一重要部分為從合成副產物純化主要產物。此純化主要係以層析程序來進行。就用作為醫藥產品之活性成份，最終的純化胜肽產物需要就純度加以分析，其主要亦是使用層析程序來進行。因為相較於整體的結構，所欲的胜肽產物和不欲的合成副產物之分子結構的差異通常非常小，這些產物的層析性質可能相同或幾乎相同。此項常常導致這些雜質與其他雜質和主要產物本身在層析分離程序中共溶離。
開發選擇性分析方法為用作醫藥化合物之胜肽產物組成物放行試驗的關鍵方向之一。但由於上述理由，即使盡最大努力可能無法藉由層析法將所有相關雜質分離。因此，需要提供測定胜肽產物中雜質量之新穎方法，特別是無法在定量上以層析法與所欲的主要產物分離之雜質量。
本發明係提供定量測定胜肽產物組成物中的雜質之方法，該雜質係無法以層析從主要產物分離或係與其他雜質或組成物之成份共溶離。此方法係以胜肽利西拉來(Lixisenatide)(AVE0010)，一種具有44個胺基酸長度之GLP-1促效劑作為範例來表示。利西拉來之胺基酸序列係如SEQ ID NO：1所示：
利西拉來係以固相合成法所製造。藉由層析純化程序，可從所欲的主要產物分離出大部份的雜質。
但然而二種雜質，二-絲胺酸(33)-AVE0010和二-丙胺酸(35)-AVE0010無法以層析法分離。這些雜質的胺基酸序列係如下：
二-絲胺酸(33)-AVE0010(SEQ ID NO：2)
二-丙胺酸(35)-AVE0010(SEQ ID NO：3)
因為利西拉來係用作為醫藥產品，特別是用於糖尿病患者之治療，所以必須測定上述雜質的存在和數量，以便於能批次放行。本發明者等目前已發現，在有或無先前的層析下，可使用高解析質譜技術達成上述雜質之定量測定。
本發明的主體為定量測定存在胜肽產物組成物中之雜質之方法，其包括下列步驟：(a)提供一包括胜肽產物及至少一未知量雜質之胜肽產物組成物，其中該雜質無法藉由層析程序與胜肽產物或另外的組成物成份分離，(b)提供至少一無添加該雜質之胜肽產物組成物的樣本及視需要至少另一含已知量之添加該雜質的組成物樣本，(c)以質譜定量測定該至少一來自步驟(b)樣本中的雜質，及(d)以(c)的結果為基準，計算胜肽產物組成物中該雜質的量。
本發明另外的主體為定量測定存在胜肽產物組成物中之雜質之方法，其包括下列步驟：(a)提供一包括胜肽產物及至少一種未知量雜質之胜肽產物組成物，其中該雜質無法藉由層析程序與胜肽產物或另外的組成物成份分離，(b)提供至少三個胜肽產物組成物樣本，其中第一個樣本係包括無添加該雜質之胜肽產物組成物，及其中至少另外二個樣本係包括各帶有不同已知量之添加該雜質的胜肽組成物樣本，(c)以質譜定量測定該至少三個來自步驟(b)樣本中的該雜質，及(d)以(c)的結果為基準，計算胜肽產物組成物中該雜質的量。
本發明另外的主體為用於測定利西拉來(AVE 0010)產物組成物中之雜質量之試劑套組，其包括：(i)至少一二-絲胺酸(33)-AVE0010之儲存製備物及/或(ii)至少一二-丙胺酸(35)-AVE0010之儲存製備物。
又，本發明另一主體為用於控制包括含胺基酸序列S-S-G-A之艾塞那肽(exendin)胜肽產物之組成物，較佳地包括利西拉來(AVE0010)產物之組成物品質的方法，其包括定量測定該組成物中二-絲胺酸(33)-胜肽，例如二-絲胺酸(33)-AVE0010及/或二-丙胺酸(35)-胜肽，例如二-丙胺酸(35)-AVE0010之量。
本發明係關於測定存在胜肽產物組成物中之雜質的方法。術語「胜肽產物」係涵蓋具有至少5個或至少10個胺基酸之長度及至高50個或至高100個胺基酸或甚至更長之胜肽和蛋白。胜肽產物可由一般編碼的胺基酸建構組塊所組成或可包括非一般編碼的胺基酸建構組塊，例如非天然生成的胺基酸、D-胺基酸或化學修飾的胺基酸或可由數條藉由雙硫橋連接的胜肽鏈所組成。胜肽產物可進一步在N-及/或C-端及/或在側鏈含有修飾，例如醯化、醯胺化或加入非胜肽側鏈基團例如親脂性基團。此胜肽產物可為直鏈或環狀。較佳地，此胜肽產物具有5-100個胺基酸之長度。
胜肽產物之合成可包括重組DNA法及/或化學合成法。較佳地，胜肽產物係以化學合成，特別是本項技術中熟知的固相合成程序，例如包括逐步加長與載劑(例如合成樹脂)偶合之胜肽鏈。在一較佳的本發明實施例中，胜肽產物為艾塞那肽，例如艾塞那肽-4(Exendin-4)、利拉魯肽(Liraglutide)或利西拉來(AVE0010)。胜肽產物之另外的實例有胰島素及胰島素類似物或DPP-4抑制劑。更佳地，胜肽產物為艾塞 那肽，例如包括胺基酸序列S-S-G-A之艾塞那肽，最佳地利西拉來(AVE0010)。
本發明之方法包括在胜肽產物合成之後定量測定存在其中之雜質，例如在其以固相合成程序合成之後或在儲存後為一降解產物時。雜質通常為胜肽雜質，例如與所欲的主要胜肽產物有至少一個胺基酸建構組塊或化學修飾不同之胜肽。例如，此雜質可為與所欲產物有至少一個二聚胺基酸建構組塊，亦即二-絲胺酸或二-丙胺酸建構組塊不同之胜肽。就艾塞那肽之情況，例如包括胺基酸序列S-S-G-A之艾塞那肽，雜質可為例如二-絲胺酸(33)-艾塞那肽、二-丙胺酸(35)-艾塞那肽或其組合物。就利西拉來之情況，雜質可為二-絲胺酸(33)-AVE0010、二-丙胺酸(35)-AVE0010或其組合物。
本發明之方法包括定量測定至少一種胜肽產物組成物中之雜質。此胜肽產物組成物包括至少一種胜肽產物和至少一種所欲測定之雜質。另外，此組成物可包括其他的成份，例如胜肽或非胜肽成份(包括其他雜質)。此胜肽產物組成物可例如為醫藥調配物或希望用於製造醫藥調配物之組成物，例如合成的胜肽產物批件。
在本發明方法中，此胜肽產物係包括至少一種未知量之雜質，其無法在定量上以層析程序與胜肽產物分離，或其係與存在胜肽產物樣本中的其他雜質或成份共溶離。在某些案例中，此胜肽產物組成物係包括一未知量之雜質。在其他的案例中，此胜肽產物組成物係包括至少二種，例如2、3、4、5或甚至更多種未知量之雜質，其無法在定量上以層析程序與胜肽產物分離或其係與存在胜肽產物樣本中的其他雜質或成份共溶離。較佳地，此至少一種雜質無法在定量上與胜肽產物分離。
術語「層析程序」包括適用於胜肽產物純化之層析程序，其包括例如離子交換層析、疏水性交互作用層析、親和性層析、大小排除層析及特別是高效液相層析(HPLC)，及更特別是逆相HPLC，或數種程序之組合。
以本發明方法所測定的雜質無法在定量上與胜肽產物或組成物的其他成份分離。其係指，此雜質在層析分離程序之後與所欲的胜肽產物或與其他雜質或成份共溶離或大體上共溶離，特別是在如上述的層析分離程序之後，以不可能藉由光學方法例如UV-或螢光偵測來量化之方式。其係指，此雜質無法藉由合理的努力與所欲的胜肽產物或其他成份(包括雜質)分離，且其在一特定批次的胜肽產物組成物中之量必須以本發明方法定量測定。
本發明方法之步驟(a)包括提供含至少一種未知量雜質的胜肽產物組成物，其中該雜質無法以如上述之層析程序與胜肽產物或另外的組成物成份分離。此胜肽產物可例如為用於醫藥應用之產品，例如用作人類或獸藥之醫藥品。
本發明方法之步驟(b)包括提供至少一種無添加雜質的胜肽產物組成物樣本及視需要含至少一種已知量添加雜質之另外的胜肽產物組成物樣本。在一較佳的實施例中，步驟(b)包括提供至少三個胜肽產物組成物樣本，其中第一個樣本包括無添加雜質之胜肽產物組成物，其中至少二個另外的樣本係包括胜肽產物組成物且這些樣本各額外包括一不同已知量之添加雜質。
至少一樣本為包括無添加雜質之胜肽產物組成物的樣本，亦即所欲測定之包括未知量雜質的未加料樣本。除了此樣本外，可提供至少一個，例如至少二個、三個或四個另外的樣本，其為包括所欲測定之 含未知量雜質及另外含不同已知量添加雜質的胜肽產物組成物的加料樣本。這些加料樣本可藉由將來自雜質儲存製備物，較佳地來自二種包括不同濃度雜質之儲存製備物的雜質加到未加料的胜肽產物組成物樣本中加以製備。儲存製備物可以任何適合的形式存在，例如乾燥或液體形式之製備物。較佳地此儲存製備物為儲存溶液。
試驗樣本係包括含所欲測定之未知量雜質及視需要添加雜質的胜肽產物。這些化合物係以各濃度存在，使其能藉由質譜來分析。此胜肽產物的濃度可具有大程度上的不同。其可例如在0.001-50mg/ml之範圍內，較佳地0.01-10mg/ml及更佳地0.02-5.0mg/ml，例如約1.0mg/ml。在加料樣本中，所添加雜質的量，以樣本中胜肽產物的濃度為基準，較佳地係在0.1%-5%之範圍，較佳地從0.1-2%。
在一較佳的實施例中，本發明之方法係包括將一未加料的胜肽產物樣本與至少一種，較佳地至少二種、三種或四種或甚至更多種添加至少一種雜質之胜肽產物樣本共同試驗。在不同的實施例中，本發明之方法包括僅試驗一種未加料的胜肽產物樣本。存在未加料樣本中的未知量雜質可藉由加料樣本的參照測量值及/或藉由將未加料樣本中的雜質測量值與參照值例如標準或校正曲線做比較來測定。
本發明方法之步驟(c)包括以高解析質譜定量測定該來自步驟(b)之至少一樣本中的該雜質。除了質譜外，測量可包括先前的層析程序，例如為了將其他雜質與胜肽產物或與組成物的其他成份分離。較佳地，質譜係與HPLC結合。各樣本可經數次測量以便於增加測量的準確性。
質譜係以測量帶電粒子之質荷比為基礎。在一典型的質譜程序中，係將樣本載入質譜儀中並揮發。將樣本組份離子化並將生成的離子以 質量分析儀藉由電磁場分離。偵測所生成的離子並處理訊號變成質譜。就胜肽產物之離子化，可使用電噴灑離子化(ESI)和基質輔助雷射脫附/離子化(MALDI)。所生成的離子可藉由高敏感性方法例如軌道阱(Orbitrap)或傅立葉變換離子回旋共振[Fourier Transform(FT)-Ion Cyclotron Resonance(ICR)]偵測系統來偵測。
根據步驟(c)，係以質譜分析至少一與所欲測定之雜質有關的波峰。此波峰可由退卷積或非-退卷積質譜所衍生。較佳地，此方法包括測定一或數個與所欲測定之雜質有關的單同位素波峰。就雜質二-絲胺酸(33)-AVE0010之情況，可使用非-退卷積質譜在例如1237.1529Da，或退卷積質譜在4944.5822Da之四重電荷波峰。就雜質二-丙胺酸(35)-AVE0010之情況，可分析非-退卷積質譜在1233.1550Da，或退卷積質譜在4928.5908Da之四重電荷波峰。
所分析的至少一波峰可於雜質的質譜中使用如上述之高解析設定及高敏感偵測來辨識。
步驟(d)包括以質譜分析結果為基準，計算胜肽產物組成物中雜質的量。在一較佳的實施例中，此計算係以包括迴歸分析，特別是線性迴歸分析之方法來進行。迴歸分析可包括從至少二個加料樣本，亦即包括含未知量雜質和具有添加二種不同已知量雜質之胜肽產物的樣本(或來自以標準或校正測量所產生之此等樣本的參照值)中的雜質測量值產生一曲線，例如直線。於此曲線，例如直線中，插入未加料樣本中的雜質測量值，藉此得以定量測定存在該樣本中的未知量雜質。較佳地，此計算係根據線性直線方程式來進行：y=ax+b 其中，y係相當於樣本(加料或未加料樣本)中雜質之測定波鋒面積，x係相當於加料樣本中之已知的雜質添加量，a為直線斜率而b為與y-軸之截距，其相當於無添加雜質之樣本中雜質的測量訊號(x=0)。如下使用所得到的迴歸參數可得到未添加樣本xt中雜質的量：xt=b．a-1本發明亦包括用於測定包含至少一種二-絲胺酸(33)-AVE0010及/或二-丙胺酸(35)-AVE0010的儲存製備物及視需要另外的試劑例如溶劑、緩衝劑等之利西拉來產物中之雜質量的試劑套組。此試劑套組可用於控制利西拉來產物品質之方法中，供定量測定該利西拉來產物中二-絲胺酸(33)-AVE0010及/或二-丙胺酸(35)-AVE0010的量。較佳地，該定量測定係根據質譜法，例如上述之質譜法來進行。
圖1係顯示HPLC層析圖中利西拉來(AVE0010)、二-絲胺酸(33)-AVE0010和二-丙胺酸(35)-AVE0010之共溶離波峰。
圖2係顯示AVE0010以及雜質二-絲胺酸(33)-AVE0010和二-丙胺酸(35)-AVE0010之四重電荷分子離子的質譜。
圖3係顯示未加料和加料的(各雜質1%)AVE0010製備物之質譜比較。
圖4係顯示於m/z400分別在60,000和100,000之解析度設定下二-絲胺酸(33)-AVE0010之質量範圍的展開圖和重疊種類之理論計算圖式。
圖5係顯示重疊種類之理論計算圖式的去卷積質譜。
圖6係顯示用於定量二-絲胺酸(33)-AVE0010之雜質波峰上的展開圖。
圖7係顯示非-去卷積質譜之試驗樣本中二-丙胺酸(35)-AVE0010和二-絲胺酸(33)-AV0010之四重電荷同位素的萃取單一離子層析圖。
圖8係顯示去卷積質譜之試驗樣本中二-丙胺酸(35)-AVE0010和二-絲胺酸(33)-AV0010之萃取單一離子層析圖。
圖9係顯示用於計算試驗樣本中雜質二-丙胺酸(35)-AVE0010之濃度的實例。
以HPLC/MS定量二-絲胺酸(33)-利西拉來和二-丙胺酸(35)-利西拉來之分析程序
1.材料及方法
1.1參照材料
利西拉來(AVE0010)參照材料；以固相合成所製造，接著純化。
二-絲胺酸(33)-AVE0010參照材料；藉由固相合成法以在位置33經保護的胺基酸絲胺酸之雙偶和步驟所製造，接著純化。
二-丙胺酸(35)-AVE0010參照材料；藉由固相合成法以在位置35經保護的胺基酸丙胺酸之雙偶和步驟所製造，接著純化。
將利西拉來之未加料的樣本製備物(含有未知量雜質二絲胺酸(33)-AVE0010和二-丙胺酸(35)-AVE0010)製備成1.0mg利西拉來/ml濃度。
四個加料樣本製備物，係於含1.0mg利西拉來/ml之樣本製備物中 各自藉由分別併入0.2%、0.4%、0.6%和0.8%重量比之雜質二-絲胺酸(33)-AVE0010或二-丙胺酸(35)-AVE0010所製備。
1.2分析條件
使用由雙HPLC幫浦、自動取樣器、管柱烘箱和高解析質譜儀，例如LTQ-Orbitrap(ThermoFisher)，以100.000之解析度設定(於m/z 400)所組成的梯度高效液相層析系統，或同等物。
層析係以長度150mm和內徑2.0mm之C18逆相分析式HPLC管柱(Jupiter C18 3μm 300A)來進行。
移動相A係由850體積份的水、150體積份的乙腈和1體積份的三氟乙酸所組成。移動相B係由250體積份的水、750體積份的乙腈和1體積份的三氟乙酸所組成。梯度係如下設定：
質譜係以正電噴灑離子化模式操作並以從所欲測定的分析物測量離子訊號之方式掃描。
試驗條件係如下：
流速：0.25mL/min
注射體積：10μL
自動取樣器溫度：自動取樣器之溫度係設定在+10℃±2℃
管柱溫度：烘箱溫度設定在+25℃±2℃
離子化方法：ESI正電
此程序係以Ph.Eur 7.0(2011)(2.2.43 Mass Spectrometry)和USP 34(2011)(‹736›Mass Spectrometry)中所描述的方法為基準。
1.3積分
測定係以來自四重電荷離子[M+4H+]4+之去卷積質譜或非-去卷積質譜來進行。
選擇該模式之單一同位素波峰之精確的質量後：a)使用非-去卷積質譜之四重電荷波峰：．二絲胺酸(33)-AVE0010：例如1237.1529Da．二丙胺酸(35)-AVE0010：例如1233.1550Da，或b)使用去卷積質譜：．二絲胺酸(33)-AVE0010：例如4944.5822Da．二丙胺酸(35)-A VE0010：例如4928.5908Da，進行萃取離子層析。僅萃取有關的同位素。將萃取離子層析圖之波峰積分。
2.結果
圖1係顯示HPLC層析圖中利西拉來(AVE0010)和雜質二-丙胺酸(35)-AVE0010和二-絲胺酸(33)-AVE0010之共溶離波峰。由於層析波峰中的這些重疊，二-丙胺酸(35)-AVE0010和二-絲胺酸(33)-AVE0010構成了無法藉由層析程序在定量上與所欲的胜肽產物AVE0010分離之雜質。
對於方法之開發，必須考量某些特定的質譜性質。利西拉來之質譜顯示，除了多重質子化種類外典型地團簇溶液中普遍存在的陽離子，例如鈉或鉀。圖2係顯示與雜質光譜重疊並因此掩蓋了分析物之AVE0010的四重電荷離子光譜區。
在圖3中係將添加了1%二種雜質之AVE0010樣本與含低量雜質之未加料樣本做比較。在插入的展開圖中可看到，可能有潛藏團簇的分子圖重疊。就二-絲胺酸(33)-AVE0010之情況，相對於利西拉來，質量增加了87Da。另一方面，利西拉來可與4個鈉離子團簇，導致88Da之質量位移。這二個圖重疊且必須以質譜分離，否則無法明確地將第二-絲胺酸AV0010雜質定量。
如圖4中可看到，重疊的波峰在60.000之解析度設定時並未分離，但僅在100.000之解析度設定時分離。在圖4的下面部分，顯示第二-絲胺酸-AVE0010之理論光譜與利西拉來的鈉團簇重疊。此高解析度較佳地係以傅立葉變換質譜，FT-ICR或如本處所使用以FT-Orbitrap質譜來遞送。
在光譜之去卷積和定出質心後，此二類可在質譜上分離，參照圖5。
在圖6中，已加入完整層析波峰之所有測量的個別質譜。用於測量二-絲胺酸(33)-AVE0010之質量波峰係以展開圖表示。其離對應 AVE0010之鈉團簇的波峰夠遠，而得以精確測量。所有的分析物質量波峰皆落在狹窄的質量窗口內，顯示儀器的質量穩定性，完全與任何干擾波峰分離。因此，此方法適合明確地測定利西拉胜肽產物來中二-絲胺酸(33)-AVE0010和二-丙胺酸(35)-AVE0010之量。
試驗樣本中二丙胺酸(35)-AVE0010和二-絲胺酸(33)-AV0010之四重電荷同位素的萃取離子層析圖係如圖7之非-去卷積質譜及圖8之去卷積質譜所示。
二-絲胺酸(33)-AVE0010和二-丙胺酸(35)-AVE0010之量可藉由線性迴歸分析來計算。藉由使用各注射的加料和未加料試驗溶液，根據下列方程式可建立迴歸曲線：y=ax+b
a=斜率
y=試驗溶液之波峰面積(未加料和加料試驗溶液)
x=試驗溶液中添加的二-絲胺酸(33)-AVE0010或二-丙胺酸(35)-AVE0010之量(未加料和加料試驗溶液)。
b=截距
試驗樣本中二-絲胺酸(33)-AVE0010和二-丙胺酸(35)-AVE0010之濃度xt可使用如下所得到的迴歸參數來計算：xt=b．a-1圖9係顯示計算試驗樣本中二-丙胺酸(35)-AVE0010濃度之實例。
最終結果經測定為以利西拉來百分比表示之所有個別測定值的算術平均。在特定的案例中，樣本中雜質二-丙胺酸(35)-AVE0010之平均值，以利西拉來的量為基準，經測定為0.4260%。
<110> 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司
<120> 用於胜肽產物放行測試的雜質定量
<130> 52972PWO
<160> 3
<170> BiSSAP 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<222> 1..44
<223> /mol_類型="蛋白" /note="利西拉來-(AVE0010)" /有機體="人工序列"
<220>
<221> MOD_RES
<222> 44
<223> 離胺酸係經NH2基團修飾。
<400> 1
<210> 2
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<222> 1..45
<223> /mol_類型="蛋白" /note="二-絲胺酸(33)-AVE0010" /有機體="人工序列"
<220>
<221> MOD_RES
<222> 45
<223> 離胺酸係經NH2基團修飾。
<400> 2
<210> 3
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<222> 1..45
<223> /mol_類型="蛋白" /note="二-丙胺酸(35)-AVE0010" /有機體="人工序列"
<220>
<221> MOD_RES
<222> 45
<223> 離胺酸係經NH2基團修飾。
<400> 3

Claims (18)

  1. 一種定量測定存在胜肽產物組成物中之雜質之方法，其包括下列步驟：(a)提供一包括胜肽產物及至少一種未知量雜質之胜肽產物組成物，該胜肽產物為利西拉來(Lixisenatide)(AVE0010)，該雜質為二-絲胺酸(33)-AVE0010和/或二-丙胺酸(35)-AVE0010，其中該雜質無法藉由層析程序與胜肽產物或另外的組成物成份分離，(b)提供至少一無添加該雜質之胜肽產物組成物樣本及至少另一含已知量之添加該雜質的組成物樣本，(c)以質譜定量測定該來自步驟(b)樣本中的該雜質，及(d)以(c)的結果為基準，計算胜肽產物組成物中該雜質的量。
  2. 一種定量測定存在胜肽產物組成物中之雜質之方法，其包括下列步驟：(a)提供一包括胜肽產物及至少一種未知量雜質之胜肽產物組成物，該胜肽產物為利西拉來(Lixisenatide)(AVE0010)，該雜質為二-絲胺酸(33)-AVE0010和/或二-丙胺酸(35)-AVE0010，其中該雜質無法藉由層析程序與胜肽產物或另外的組成物成份分離，(b)提供至少三個胜肽產物組成物樣本，其中第一個樣本係包括無添加該雜質之胜肽產物組成物，及其中至少另外二個樣本係包括各帶有不同已知量之添加該雜質的胜肽組成物樣本，(c)以質譜定量測定該來自步驟(b)樣本中的該雜質，及(d)以(c)的結果為基準，計算胜肽產物組成物中該雜質的量。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該胜肽產物具有5-100個胺 基酸之長度。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該胜肽產物係以化學合成，或以重組DNA方法所製造。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該化學合成是固相合成程序。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該胜肽產物組成物為一醫藥調配物或欲用於製造醫藥調配物之組成物。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該雜質無法藉由HPLC程序，與胜肽產物或另外的組成物成份定量分離。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該HPLC程序是逆相HPLC程序。
  9. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該胜肽產物係包括未知量之至少二種無法藉由層析程序與胜肽產物或另外的組成物成份定量分離之雜質。
  10. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該雜質係添加到至少一種來自儲存製備物之胜肽產物組成物樣本中。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該雜質係添加到至少一種來自自包含不同雜質濃度之至少二種儲存製備物之胜肽產物組成物樣本中。
  12. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中係提供至少3或4個含不同已知量添加雜質之樣本並進行質譜測定。
  13. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該質譜為高解析質譜。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該高解析質譜包括傅立葉轉換質譜(Fourier Transform mass spectrometry)。
  15. 如申請專利範圍第1-或2項之方法，其中該計算係包括一線性迴歸分 析。
  16. 如申請專利範圍第15項中任一項之方法，其中該計算係根據下列方程式來進行：y=ax+b其中a=斜率y=樣本中所測定的雜質波鋒面積x=樣本中添加的雜質量b=截距及未知量的雜質xt係如下所獲得：xt=b‧a-1。
  17. 一種用於測定利西拉來(AVE 0010)產物組成物中的雜質量之試劑套組，其包括：(i)至少一種二-絲胺酸(33)-AVE0010(SEQ ID NO：2)H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2之儲存製備物，及/或(ii)至少一種二-丙胺酸(35)-AVE0010(SEQ ID NO：3)H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2之儲存製備物。
  18. 一種用於控制包括含利西拉來(AVE0010)產物之組成物品質方法，其包括定量測定該組成物中二-絲胺酸(33)-AVE0010及/或二-丙胺酸(35)-AVE0010之量，其中該定量測定係根據如申請專利範圍第1或2項之方法來進行。
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