KR20150003794A - 펩티드 생성물의 방출 시험을 위한 불순물의 정량 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 펩티드 생성물 내에 존재하는 불순물의 정량적인 결정에 관한 것으로, 불순물은 다른 불순물들 또는 주 생성물로부터 분리될 수 없다. 본 방법은 특히 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 사용하거나 사용하지 않는 고 해상도 질량분석(mass spectrometry, MS) 검출의 사용을 포함한다. 본 방법은 펩티드 및 단백질, 특히 약학적 펩티드 및 단백질의 품질의 조사에 사용할 수 있다.

Description

펩티드 생성물의 방출 시험을 위한 불순물의 정량{quantification of impurities for release TESTING of peptide products}
본 발명은 펩티드 생성물 내에 존재하는 불순물의 정량적인 결정을 위한 방법에 관한 것으로, 불순물은 주 생성물 및 선택적으로는 다른 불순물들로부터 분리될 수 없다. 본 방법은 특히 고 성능 액체 크로마토그래프(high performance liquid chromatography, HPLC)를 사용하거나 하지 않는 고 해상 질량 분석(mass spectrometry, MS) 검출의 사용을 포함한다. 본 방법은 펩티드 및 단백질, 특히 약학적 펩티드 및 단백질, 및 이의 제형의 품질의 조사에 사용될 수 있다.
잘 알려진 재조합 DNA 및 화학적 고체상 합성 공정을 사용하여, 몇몇 단백질 및 펩티드가 약학적 용도를 위해 합성되어왔다. 이러한 단백질 및 펩티드의 생성은, 그러나, 종종 다수의 원하지 않는 합성 부산물들을 야기한다. 이는 고체상 합성으로 생성되는 경우, 특히 그렇다. 합성 단계의 증가를 야기하는 펩티드/단백질의 길이의 증가로, 이러한 부산물들은 조생성물의 50 내지 70%로 존재할 수 있다.
따라서, 합성의 중요한 부분은 합성 부산물들로부터의 주생성물의 정제이다. 이러한 정제는 주로 크로마토그래피 절차에 의해 수행된다. 약학적 생성물에서 유효 성분으로 사용하기 위해, 정제된 최종 펩티드 생성물은, 또한, 대개 크로마토그래피 절차를 사용하여 수행되는 순도에 대한 분석이 필요하다. 종종, 원하는 펩티드 생성물과 원치 않는 합성 부산물의 분자 구조의 차이가 전체 구조와 비교하여 매우 작기 때문에, 이러한 생성물들의 크로마토그래피 성질은 동일하거나 거의 동일할 수 있다. 이는 종종 크로마토그래피 분리 절차에서 다른 불순물들 및 주 생성물 그 자체와 이러한 불순물들의 공동 용출을 야기한다.
선택적인 분석 방법의 개발은 약학적 화합물로 사용되는 펩티드 생성물 조성물의 방출 시험을 위한 주요 양태 중 하나이다. 그러나 전술된 이유들로 인해, 심지어 많은 노력들도 모든 관련 불순물들의 크로마토그래피 방법에 의한 분리를 초래할 수는 없다. 따라서, 펩티드 생성물 내 불순물의 양, 특히 원하는 주 생성물로부터 크로마토그래피 방법에 의해 정량적으로 분리될 수 없는 불순물들의 양을 결정하기 위한 신규한 방법이 제공되어야 할 필요성이 존재한다.
본 발명은 펩티드 생성물 조성물 내에서 주 생성물로부터 크로마토그래피로 분리될 수 없거나 조성물의 다른 불순물들 또는 성분들과 공동 용출되는 불순물들의 정량적인 결정을 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 44개 아미노산 길이인 길이를 가지는 GLP-1 아고니스트인 펩티드 릭시세나티드(Lixisenatide)(AVE0010)에 대하여 예시적으로 보여준다. 릭시세나티드의 아미노산 서열은 서열번호 1(H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2)에 나타나 있다.
릭시세나티드는 화학적 고체상 합성 공정에 의해 생성된다. 크로마토그래피 정제 절차에 의해, 대부분의 불순물들은 원하는 주 생성물로부터 분리될 수 있다.
하지만, 그럼에도 불구하고, 2종의 불순물인 Di-Ser(33)-AVE0010 및 Di-Ala(35)-AVE0010은 크로마토그래피 방법에 의해 분리될 수 없다. 이러한 불순물들의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Di-Ser(33)-AVE0010(서열번호 2)
H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
Di-Ala(35)-AVE0010(서열번호 3)
H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
특히, 당뇨병 환자의 치료에서 릭시세나티드가 약학적 조성물로서 사용되기 때문에, 위의 불순물들의 존재 및 양은 배치 방출을 가능하게 하기 위해서 결정되어야 한다. 본 발명자는 현재 사전 크로마토그래피를 사용하거나 하지 않는 고 해상 질량 분석 기법을 사용하여 위의 불순물들의 정량적인 결정이 달성될 수 있다는 것을 밝혔다.
본 발명의 주제는 다음의 단계를 포함하는 펩티드 생성물 조성물 내에 존재하는 불순물의 정량적인 결정을 위한 방법이다:
(a) 펩티드 생성물 및 미지의 양의 적어도 1종의 불순물을 포함하는 펩티드 생성물 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 불순물은 조성물의 다른 성분 또는 펩티드 생성물로부터 크로마토그래피 절차에 의해 분리될 수 없는 것인, 단계,
(b) 첨가된 상기 불순물이 없는 펩티드 생성물 조성물의 적어도 하나의 시료 및 선택적으로 공지된 양의 상기 불순물이 첨가된 펩티드 생성물 조성물의 적어도 하나의 추가의 시료를 제공하는 단계,
(c) 단계 (b)로부터의 상기 적어도 하나의 시료 내 상기 불순물을 질량 분석(mass spectrometry)에 의해 정량적으로 결정하는 단계, 및
(d) (c)의 결과에 기반하여 펩티드 생성물 조성물 내 상기 불순물의 양을 계산하는 단계.
본 발명의 추가의 주제는 다음의 단계를 포함하는 펩티드 생성물 조성물 내에 존재하는 불순물의 정량적인 결정을 위한 방법이다:
(a) 펩티드 생성물 및 미지의 양의 적어도 1종의 불순물을 포함하는 펩티드 생성물 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 불순물은 조성물의 다른 성분 또는 펩티드 생성물로부터 크로마토그래피 절차에 의해 분리될 수 없는 것인, 단계,
(b) 펩티드 생성물 조성물의 적어도 3개의 시료를 제공하는 단계로서, 제1 시료는 첨가된 상기 불순물 없이 펩티드 생성물 조성물을 포함하고, 적어도 2개의 추가의 시료는 각각 상이한 공지된 양의 상기 불순물이 첨가된 펩티드 생성물 조성물을 포함하는 것인, 단계
(c) 단계 (b)로부터의 상기 적어도 3개의 시료 내 상기 불순물을 질량 분석에 의해 정량적으로 결정하는 단계, 및
(d) (c)의 결과에 기반하여 펩티드 생성물 조성물 내 상기 불순물의 양을 계산하는 단계.
본 발명의 추가의 주제는 다음을 포함하는 릭시세나티드(AVE0010) 생성물 조성물 내 불순물들의 양을 결정하기 위한 시약 키트이다:
(i) Di-Ser(33)-AVE0010의 적어도 1개의 스톡(stock) 제제 및/또는
(ii) Di-Ala(35)-AVE0010의 적어도 하나의 스톡 제제.
또한, 본 발명의 추가의 주제는 상기 조성물 내, Di-Ser(33)-펩티드, 예컨대, Di-Ser(33)-AVE0010 및/또는 Di-Ala(35)-펩티드, 예컨대, Di-Ala(35)-AVE0010의 양을 정량적으로 결정하는 단계를 포함하는, 아미노산 서열 S-S-G-A를 포함하는 엑센딘(exendin) 펩티드 생성물을 포함하는 조성물, 바람직하게는 릭시세나티드(AVE0010)생성물을 포함하는 조성물의 품질 제어를 위한 방법이다.
본 발명은 펩티드 생성물 조성물 내에 존재하는 불순물의 결정에 관한 것이다."펩티드 생성물”이라는 용어는 적어도 5 또는 적어도 10개의 아미노산 및 최대 50 또는 심지어 최대 100개 이상의 아미노산의 길이를 가지는 펩티드 및 단백질을 포함한다. 펩티드 생성물은 유전적으로 암호화된 아미노산 빌딩 블록으로 이루어질 수 있거나 비유전적으로 암호화된 아미노산 빌딩 블록, 예컨대 비자연적으로 발생하는 아미노산인 D-아미노산, 또한 화학적으로 변형된 아미노산을 포함할 수 있거나, 예컨대, 이황화 다리에 의해 연결된 몇몇 펩티드 사슬로 이루어질 수 있다. 펩티드 생성물은 N- 및/또는 C-말단 및/또는 측쇄에서 변형, 예컨대, 아실화, 아미드화, 또는 친지질기와 같은 펩티드가 아닌 측쇄기의 첨가를 더 함유할 수 있다. 펩티드 생성물은 선형이거나 원형일 수 있다. 바람직하게, 펩티드 생성물은 5 내지 100개 아미노산의 길이를 가진다.
펩티드 생성물의 합성은 재조합 DNA 공정 및/또는 화학적 합성 공정을 포함할 수 있다. 바람직하게, 펩티드 생성물은, 특히, 당해 분야에 잘 알려진 고체상 합성 절차, 예컨대, 담체, 예컨대, 합성 수지에 연결된 펩티드 사슬의 단계적 신장을 포함하는 절차에 의해 화학적으로 합성된다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 펩티드 생성물은 엑센딘 펩티드, 예컨대, 엑센딘-4, 리라글루티드(Liraglutide) 또는 릭시세나티드(AVE0010)이다. 펩티드 생성물의 추가의 예는 인슐린 및 인슐린 유사체 또는 DPP-4 저해제이다. 더욱 바람직하게, 펩티드 생성물은 엑센딘 펩티드, 예컨대, 아미노산 서열 S-S-G-A를 포함하는 엑센딘 펩티드, 가장 바람직하게는 릭시세나티드(AVE0010)이다.
본 발명의 방법은 합성 후, 예컨대, 고체상 절차에 의한 합성 후에, 또는 저장 후 분해 산물로서, 펩티드 생성물 내에 존재하는 불순물의 정량적인 결정을 포함한다. 불순물은 대개 펩티드 불순물, 예컨대, 원하는 주 펩티드 생성물과 적어도 하나의 아미노산 빌딩 블록 및/또는 화학적 변형에서 구분되는 펩티드이다. 예를 들어, 불순물은 원하는 펩티드 생성물로부터 적어도 하나의 이량체 아미노산 빌딩 블록, 즉, Di-세린 또는 Di-알라닌 빌딩 블록에 의해 구분되는 펩티드일 수 있다. 엑센딘 펩티드, 예컨대, 아미노산 서열 S-S-G-A를 포함하는 엑센딘 펩티드의 경우, 불순물은, 예컨대, Di-Ser(33)-엑센딘 펩티드, Di-Ala(35)-엑센딘 펩티드 또는 이의 조합일 수 있다. 릭시세나티드의 경우, 불순물은, 예컨대, Di-Ser(33)-AVE0010, Di-Ala(35)-AVE0010 또는 이의 조합일 수 있다.
본 발명의 방법은 펩티드 생성물 조성물 내 적어도 1종의 불순물의 정량적인 결정을 포함한다. 펩티드 생성물 조성물은 적어도 1종의 펩티드 생성물 및 적어도 1종의 결정될 불순물을 포함한다. 또한, 조성물은 다른 성분들, 예컨대, 다른 불순물들을 포함하는 펩티드 또는 비 펩티드 성분을 포함할 수 있다. 펩티드 생성물 조성물은, 예컨대, 약학적 제형 또는 약학적 제형의 제조를 위해 의도된 조성물, 예컨대 합성된 펩티드 생성물의 배치일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 펩티드 생성물은 미지의 양의 적어도 1종의 불순물을 포함하고, 불순물은 펩티드 생성물로부터 크로마토그래피 절차에 의해 정량적으로 분리될 수 없거나, 펩티드 생성물 시료 내에 존재하는 다른 불순물들 또는 성분들과 공동 용출된다. 일부 경우에서, 펩티드 생성물 조성물은 미지의 양의 1종의 불순물을 포함한다. 다른 경우에서, 펩티드 생성물 조성물은 미지의 양의 적어도 2, 예컨대, 2, 3, 4, 또는 심지어 5종 이상의 불순물들을 포함하되, 불순물들은 펩티드 생성물로부터 크로마토그래피 절차에 의해 정량적으로 분리될 수 없거나 펩티드 생성물 시료 내에 존재하는 다른 다른 불순물들 또는 성분들과 공동 용출된다. 바람직하게, 적어도 1종의 불순물은 펩티드 생성물로부터 정량적으로 분리될 수 없다.
“크로마토그래피 절차”라는 용어는, 예컨대, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및, 특히, 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC), 및 보다 구체적으로 역상 HPLC, 또는 몇몇 절차들의 조합을 포함하는 펩티드 생성물의 정제에 적합한 크로마토그래피 절차를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 결정되는 불순물은 펩티드 생성물 또는 조성물의 다른 성분들로부터 정량적으로 분리될 수 없다. 이는, 불순물이 크로마토그래피 분리 절차 후, 특히, 전술된 바와 같은 크로마토그래피 분리 절차 후, 광학적 방법, 예컨대, UV- 또는 형광 검출에 의한 정량이 불가능한 방식으로 원하는 펩티드 생성물 또는 다른 불순물들 또는 성분들과 공동 용출되거나 실질적으로 공동 용출된다는 것을 의미한다. 이는, 불순물이 원하는 펩티드 생성물 또는 불순물들을 포함하는 다른 성분들로부터 합리적인 노력에 의해 분리될 수 없고, 펩티드 생성물 조성물의 주어진 배치 내 불순물의 정량적인 양이 본 발명의 방법에 의해 정량적으로 결정되어야 한다는 것을 의미한다.
본 발명의 방법의 단계(a)는 미지의 양의 적어도 1종의 불순물을 포함하는 펩티드 생성물 조성물을 제공하는 단계를 포함하되, 불순물은 펩티드 생성물 또는 조성물의 다른 성분으로부터 전술된 크로마토그래피 절차에 의해 분리될 수 없다. 펩티드 생성물은, 예컨대, 인간 또는 수의학에서 약제로서 사용하기 위한, 예컨대, 약학적 적용에서 사용하기 위한 생성물일 수 있다.
본 발명의 방법의 단계(b)는 첨가된 불순물이 없는 펩티드 생성물 조성물의 적어도 하나의 시료 및 선택적으로 공지된 양의 첨가된 불순물을 가지는 펩티드 생성물 조성물의 적어도 하나의 추가의 시료를 제공하는 단계를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 단계(b)는 펩티드 생성물 조성물의 적어도 3개의 시료를 제공하는 단계를 포함하되, 제1 시료는 첨가된 불순물 없이 펩티드 생성물 조성물을 포함하고, 적어도 2개의 추가의 시료는 펩티드 생성물 조성물을 포함하고, 이들 시료 각각은 추가적으로 상이한 공지된 양의 첨가된 불순물을 포함한다.
적어도 하나의 시료는 첨가된 불순물 없이 펩티드 생성물 조성물을 포함하는 시료, 즉, 결정될 불순물의 미지의 양을 포함하는 미주입(un-spiked) 시료이다. 이러한 시료에 추가하여, 미지의 양의 불순물을 가지고 추가적으로 결정될 불순물의 상이한 공지된 양이 추가된 펩티드 생성물 조성물을 포함하는 주입된(spiked) 시료인 적어도 하나, 예컨대, 적어도 2, 3 또는 4개의 추가의 시료들이 제공될 수 있다. 이러한 주입된 시료들은 불순물을 불순물의 스톡 제제, 바람직하게는 상이한 농도의 불순물을 포함하는 적어도 2종의 스톡 제제로부터의 미주입 펩티드 생성물 조성물 시료에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 스톡 제제는 임의의 적합한 형태, 예컨대 건조 또는 액체 형태의 제제로 존재할 수 있다. 바람직하게, 스톡 제제는 스톡 용액이다.
시험된 시료는 미지의 양의 결정될 불순물 및 선택적으로 첨가된 불순물과 함께 펩티드 생성물을 포함한다. 이러한 화합물들은 질량 분석에 의한 분석을 가능하게 하는 농도로 존재한다. 펩티드 생성물의 농도는 상당히 다양하다. 농도는, 예컨대, 0.001 내지 50 mg/ml, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/ml 그리고 더욱 바람직하게는 0.02 내지 5.0 mg/ml의 범위, 예를 들어, 약 1.0 mg/ml일 수 있다. 주입된 시료에서, 첨가된 불순물의 양은 바람직하게는 시료 내 펩티드 생성물의 농도에 기반하여 0.1% 내지 5%, 바람직하게는 0.1 내지 2%의 범위일 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 적어도 1종의 불순물이 주입된 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2, 3, 또는 심지어 4개 이상의 펩티드 생성물 시료와 함께 미주입 펩티드 생성물 시료만 시험하는 단계를 포함한다. 상이한 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 오직 미주입 펩티드 생성물 시료만을 시험하는 단계를 포함한다. 미주입 시료 내에 존재하는 불순물의 미지의 양은 주입된 시료의 참조 측정 및/또는 미주입 시료 내 불순물의 측정된 값을 참조, 예컨대 표준 또는 교정 곡선과 비교함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 방법의 단계(c)는 단계(b)로부터의 상기 적어도 하나의 시료 내 상기 불순물을 고해상 질량 분석에 의해 정량적으로 결정하는 단계를 포함한다. 질량 분석에 추가하여, 결정은, 예컨대, 펩티드 생성물 또는 조성물의 다른 성분들로부터 다른 불순물들을 분리하기 위한 사전의 크로마토그래피 절차를 포함할 수 있다. 바람직하게, 질량 분석은 HPLC와 조합된다. 각각의 시료는 측정의 정확도를 증가시키기 위해 몇몇 개별적인 결정을 거칠 수 있다.
질량 분석은 하전된 입자들의 질량 대 전하비의 측정을 기반으로 한다. 통상적인 질량 분석 절차에서는, 시료를 질량 분석 기기에 로딩하고 휘발시킨다. 시료 성분들이 이온화되고, 얻어진 이온들이 질량 분석기에서 전자기장에 의해 분리된다. 얻어진 이온들이 검출되고 신호가 질량 스펙트럼으로 가공된다. 펩티드 생성물의 이온화를 위해, 전기분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 및 매트릭스 지원 레이저 탈착/이온화(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)가 사용될 수 있다. 얻어진 이온들은 Orbitrap 또는 푸리에 변환(Fourier Transform(FT))-이온 사이클로트론 공명(Ion Cyclotron Resonance, ICR) 검출 시스템과 같은 고도로 민감한 방법에 의해 검출될 수 있다.
단계(c)에 따르면, 결정될 불순물과 연관된 적어도 하나의 피크가 질량 분석에 의해 분석된다. 이러한 피크는 디콘볼루션(deconvolution)되거나 디콘볼루션되지 않은 질량 스펙트럼으로부터 도출될 수 있다. 바람직하게, 방법은 결정될 불순물과 연관된 하나 또는 몇몇 단일동위원소 피크의 결정을 포함한다. 불순물 Di-Ser(33)-AVE0010의 경우, 디콘볼루션되지 않은 질량 스펙트럼의 예컨대, 1237.1529 Da 또는 디콘볼루션된 질량 스펙트럼의 4944.5822 Da에서의 4배로 하전된 피크가 이용될 수 있다. 불순물 Di-Ala(35)-AVE0010의 경우, 디콘볼루션되지 않은 질량 스펙트럼의 예컨대, 1233.1550 Da 또는 디콘볼루션된 질량 스펙트럼의 4928.5908 Da에서의 4배로 하전된 피크가 분석될 수 있다.
분석될 적어도 하나의 피크는 불순물의 질량 스펙트럼에서 고 해상 설정 및 전술된 고도로 민감한 검출을 사용하여 식별될 수 있다.
단계(d)는 질량 분석 결과에 기반하여 펩티드 생성물 조성물 내 불순물의 양을 계산하는 단계를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 계산은 회귀 분석, 특히 선형 회귀 분석을 포함하는 방법에 의해 수행된다. 회귀 분석은 적어도 2개의 주입된 시료, 즉, 미지의 양의 불순물과 함께 펩티드 생성물을 포함하고 2개의 상이한 공지된 양으로 불순물들이 첨가된 시료에서의 불순물의 측정된 값으로부터 (또는 표준 또는 교정 측정에서 생성된 이러한 시료의 참조 값으로부터) 곡선, 예컨대, 직선을 생성하는 단계를 포함한다. 이러한 곡선, 예컨대 직선 내로, 미주입 시료 내 불순물의 측정된 값을 삽입함으로써 그 시료 내 존재하는 불순물의 미지의 양의 정량적인 결정이 가능하게 된다.
바람직하게, 계산은 선형 직선 방정식에 따라 수행된다:
y = ax + b
여기서 y는 시료(주입되거나 미주입 시료) 내 불순물의 결정된 피크 면적에 해당하고, x는 주입된 시료 내 첨가된 불순물의 공지된 양에 해당하고, a는 직선 기울기이고, b는 y축과의 절편으로 첨가된 불순물이 없는 시료(x=0) 내 불순물의 측정 신호에 해당한다. 미주입 시료 내 불순물의 정량적인 양(Xt)은 다음과 같은 수득된 회귀 파라미터를 사용하여 얻어질 수 있다.
xt = b ● a-1
본 발명은 또한 Di-Ser(33)-AVE0010 및/또는 Di-Ala(35)-AVE0010의 적어도 하나의 스톡 제제 및 선택적으로 용매, 완충액 등과 같은 추가적인 시약들을 포함하는 릭시세나티드 생성물 내 불순물의 양을 결정하기 위한 시약 키트를 포함한다. 시약 키트는 상기 릭시세나티드 생성물 내 Di-Ser(33)-AVE0010 및/또는 Di-Ala(35)-AVE0010의 양의 정량적인 결정을 위한 릭시세나티드 생성물의 품질 제어를 위한 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게, 정량적인 결정은 질량 분석법, 예컨대 전술된 질량 분석법에 따라 수행된다.
본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명된다.
도면의 범례는 다음과 같다.
도 1은 릭시세나티드(Lixisenatide)(AVE0010), Di-Ser(33)-AVE0010 및 Di-Ala(35)-AVE0010의 피크의 공동 용출을 HPLC 크로마토그램에 나타낸 것이다.
도 2는 4배로 하전된 분자 이온 AVE0010 및 불순물 Di-Ser(33)-AVE0010 및 Di-Ala(35)-AVE0010의 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 미주입(un-spiked) 및 (1%의 각 불순물) 주입(spiked) AVE0010 제제의 질량 스펙트럼의 비교를 나타낸 것이다.
도 4는 m/z400에서 각각 60,000 및 100,000의 해상도 설정에서의 Di-Ser(33)-AVE0010의 질량 범위의 확대도 및 중첩되는 종들의 이론적으로 계산된 패턴을 나타낸 것이다.
도 5는 중첩되는 종들의 이론적으로 계산된 패턴으로 디콘볼루션(deconvolution)된 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 Di-Ser(33)-AVE0010의 정량을 위해 사용된 불순물 피크에 대한 확대도를 나타낸 것이다.
도 7은 디콘볼루션되지 않은 질량 스펙트럼으로 시험 시료 내 Di-Ala(35)-AVE0010 및 Di-Ser(33)-AV0010의 4배로 하전된 동위원소의 추출된 단일 이온 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 8은 디콘볼루션되지 않은 질량 스펙트럼으로 시험 시료 내 Di-Ala(35)-AVE0010 및 Di-Ser(33)-AV0010의 추출된 단일 이온 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 9는 시험 시료 내 불순물 Di-Ala(35)-AVE0010의 농도의 계산을 위한 일 예시이다.
실시예
HPLC/MS에 의한 Di-Ser(33)-릭시세나티드 및 Di-Ala(35)-릭시세나티드의 정량화를 위한 분석적 절차
1. 물질 및 방법
1.1 참조 물질
릭시세나티드(Lixisenatide)(AVE0010) 참조 물질; 고체상 합성에 의해 생성된 후 정제됨.
Di-Ser(33)-AVE0010 참조 물질; 33번 위치의 보호된 아미노산 세린의 이중 커플링 단계를 가지는 고체상 합성 공정에 의해 생성된 후 정제됨.
Di-Ala(35)-AVE0010 참조 물질; 35번 위치의 보호된 아미노산 알라닌의 이중 커플링 단계를 가지는 고체상 합성 공정에 의해 생성된 후 정제됨.
(미지의 양의 불순물 DiSer(33)-AVE0010 및 DiAla(35)-AVE0010을 함유하는) 릭시세나티드의 미주입(unspiked) 시료의 제제는 1.0 mg 릭시세나티드/ml의 농도로 제조되었다.
불순물들 각각에 대한 4개의 주입(spiked)된 시료 제제를 0.2 중량%, 0.4 중량%, 0.6 중량% 및 0.8 중량%의 불순물 Di-Ser(33)-AVE0010 또는 Di-Ala(35)-AVE0010를 ml 당 1.0 mg 릭시세나티드를 가지는 시료 제제 내에 각각 혼합하여 제조하였다.
1.2 분석 조건
바이너리 HPLC 펌프, 오토샘플러, 컬럼 오븐 및 (m/z 400에서) 100.000의 해상도 설정을 가지는 고 해상 질량 분석기, 예컨대, LTQ-Orbitrap(ThermoFisher)로 이루어진 구배 고 성능 액체 크로마토그래피 시스템 또는 등가물을 사용하였다.
크로마토그래피는 150 mm의 길이 및 2.0 mm의 내부 직경을 가지는 C18 역상 분석 HPLC 컬럼(Jupiter C18 3μm 300A)으로 수행하였다.
이동상 A는 850 부피부의 물, 150 부피부의 아세토니트릴 및 1 부피부의 트리플루오로아세트 산으로 이루어졌다. 이동상 B는 250 부피부의 물, 750 부피부의 아세토니트릴 및 1 부피부의 트리플루오로아세트 산으로 이루어졌다. 구배는 다음과 같이 설정되었다:
Figure pct00001
질량 분석기는 양성 전자분무 이온화 모드로 작동하였고, 결정될 분석물로부터의 이온 신호를 측정하기 위한 방식으로 스캔되었다.
시험 조건은 다음과 같았다:
유속: 0.25 mL/분
주사 부피: 10 μL
오토샘플러 온도: 오토샘플러 온도를 +10℃±2℃로 설정함
컬럼 온도: 오븐 온도를 +25℃±2℃로 설정함
이온화 모드: ESI 양성
측정/검출: ITMS: 모드: 양성
질량 범위: 700.0 내지 2000.0
FTMS: 모드: 양성
질량 범위(SIM) 1232.0 내지 1239.0
해상: 100,000
우회 밸브: 폐기 0 내지 1.5 분
주사 1.5 2.25.5 분
PDA 총 스캔(UV), 선택적
절차는 문헌(Ph. Eur 7.0 (2011)(2.2.43 Mass Spectrometry) 및 USP 34 (2011)(〈736〉Mass Spectrometry)에 기술된 방법을 기반으로 하였다.
1.3 통합
결정은 4배로 하전된 이온 [M+4H+]4+의 디콘볼루션(deconvolution)된 질량 스펙트럼 또는 디콘볼루션되지 않은 질량 스펙트럼 중 하나로부터 수행되었다.
패턴의 단일 동위원소 피크의 정확한 질량의 선택 후:
a) 디콘볼루션되지 않은 질량 스펙트럼의 4배로 하전된 피크를 사용함:
● DiSer(33)-AVE0010: 예컨대, 1237.1529 Da
● DiAla(35)-AVE0010: 예컨대, 1233.1550 Da,
또는 b) 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 사용함:
● DiSer(33)-AVE0010: 예컨대, 4944.5822 Da
● DiAla(35)-A VE0010: 예컨대, 4928.5908 Da,
추출 이온 크로마토그램을 수행하였다. 관심있는 동위원소만 추출하였다. 추출된 이온 크로마토그램으로부터의 피크를 통합하였다.
2. 결과
도 1은 릭시세나티드(AVE0010), 및 불순물 Di-Ser(33)-AVE0010 및 Di-Ala(35)-AVE0010의 피크의 공동 용출을 HPLC 크로마토그램에 나타낸 것이다. 크로마토그래피 피크에서의 이러한 중첩으로 인해, Di-Ala(35)-AVE0010 및 Di-Ser(33)-AVE0010은 원하는 펩티드 생성물 AVE0010으로부터 크로마토그래피 절차에 의해 정량적으로 분리될 수 없는 불순물들이 된다.
방법 개발을 위해, 질량 분석의 일부 특정한 특징들이 고려되어야 한다. 릭시세나티드의 질량 스펙트럼은 게다가 통상적으로 용액 내 흔한 양성자, 예컨대, 나트륨 또는 칼륨과 클러스터를 이루는 다중으로 양성자화된 종들을 보여준다. 도 2는 AVE0010의 4배로 하전된 이온의 스펙트럼 섹션을 나타낸 것으로, 이온은 불순물들의 질량 스펙트럼과 중첩됨으로써 분석을 어렵게 한다.
도 3에서, 1%의 2종의 불순물이 주입된 AVE0010 시료는 아직 소량의 불순물들을 함유하는 미주입 시료와 비교된다. 삽도(inset)의 확대도에서, 기저의 클러스터들과의 분자 패턴의 중첩이 존재할 수 있음을 볼 수 있다. Di-Ser(33)-AVE0010의 경우에, 릭시세나티드에 대한 질량 증가는 87 Da이다. 반면에, 릭시세나티드는 4개의 나트륨 이온과 클러스터를 이뤄서, 88 Da의 질량 이동을 야기할 수 있다. 이러한 2가지 패턴은 중첩되고, 질량 분광학적으로 분리되어야 하는데, 그렇지 않으면 Di-Ser-AV0010 불순물은 구체적으로 정량될 수 없다.
도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 중첩된 피크는 60.000의 해상도 설정으로는 분리되지 않았지만, 오직 100.000의 해상도 설정으로 분리되었다. 도 4의 하부에, 릭시세나티드의 나트륨 클러스터와 중첩된 Di-Ser-AVE0010의 이론적인 스펙트럼이 나타나있다. 이러한 고해상은 바람직하게는 푸리에 변환(Fourier transform) 질량 분석기(FT-ICR 또는 본원에 사용된 바와 같은 FT-Orbitrap 질량 분석기 중 하나)에 의해 이행된다.
스펙트럼의 디콘볼루션 및 중심화(centroiding) 후, 이러한 2개의 종들은 질량 분광학적으로 분리될 수 있다(도 5 참조).
도 6에서, 완전한 크로마토그래피 피크의 모든 측정된 개별 질량 스펙트럼들이 첨가된다. Di-Ser(33)-AVE0010의 측정을 위해 사용된 질량 피크는 확대도로 나타나 있다. 피크는 AVE0010의 나트륨 클러스터에 해당하는 피크로부터 충분히 떨어져서 정확한 측정을 가능하게 한다. 좁은 질량 창 내에 모든 분석물 피크들이 포함되는 데, 이는 임의의 간섭 피크로부터 잘 분리된, 기기의 질량 안정성을 보여준다. 따라서, 본 방법은 릭시세나티드 펩티드 생성물 내에서 Di-Ser(33)-AVE0010 및 Di-Ala(35)-AVE0010의 양을 구체적으로 결정하기에 적합하다.
시험 시료 내 Di-Ala(35)-AVE0010 및 Di-Ser(33)-AV0010의 4배로 하전된 동위원소의 추출 이온 크로마토그램은 디콘볼루션되지 않은 질량 스펙트럼으로 도 7에 그리고 디콘볼루션된 질량 스펙트럼으로 도 8에 나타나 있다.
Di-Ser(33)-AVE0010 및 Di-Ala(35)-AVE0010의 양은 선형 회귀 분석에 의해 계산될 수 있다. 주입 및 미주입된 시험 용액의 각각의 주사를 사용하여서, 다음 식에 따라서 회귀 곡선이 확립될 수 있다.
y = ax+b
a = 기울기
y = 시험 용액의 피크 면적(미주입 및 주입된 시험 용액)
x = 시험 용액 내 Di-Ser(33)-AVE0010 또는 Di-Ala(35)-AVE0010의 첨가된 양(미주입 및 주입 시험 용액).
b = 절편
시험 시료 내 Di-Ser(33)-AVE0010 및 Di-Ala(35)-AVE0010의 농도(xt)는 다음과 같이 수득된 회귀 파라미터를 사용하여 계산될 수 있다:
xt = b ● a-1
도 9는 시험 시료 내 불순물 Di-Ala(35)-AVE0010의 농도의 계산을 위한 일 예시이다.
최종 결과는 릭시세나티드의 백분율로 나타낸 모든 개별적인 결정들의 산술 평균으로 결정되었다. 구체적인 경우에서, 시험 시료 내 불순물 Di-Ala(35)-AVE0010의 평균값은 릭시세나티드의 양에 기반하여 0.4260%로 결정되었다
SEQUENCE LISTING <110> Sanofi-Aventis Deutschland GmbH <120> Quantification of Impurities for Release Testing of Peptide Products <130> 52972PWO <160> 3 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> SOURCE <222> 1..44 <223> /mol_type="protein" /note="Lixisenatide-(AVE0010)" /organism="Artificial Sequence" <220> <221> MOD_RES <222> 44 <223> Lysine is modified with an NH2 group. <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 2 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> SOURCE <222> 1..45 <223> /mol_type="protein" /note="Di-Ser(33)-AVE0010" /organism="Artificial Sequence" <220> <221> MOD_RES <222> 45 <223> Lysine is modified with an NH2 group. <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 45 <210> 3 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> SOURCE <222> 1..45 <223> /mol_type="protein" /note="Di-Ala(35)-AVE0010" /organism="Artificial Sequence" <220> <221> MOD_RES <222> 45 <223> Lysine is modified with an NH2 group. <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 45

Claims (17)

  1. (a) 펩티드 생성물 및 미지의 양의 적어도 1종의 불순물을 포함하는 펩티드 생성물 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 불순물은 조성물의 다른 성분 또는 펩티드 생성물로부터 크로마토그래피 절차에 의해 분리될 수 없는 것인, 단계,
    (b) 첨가된 상기 불순물이 없는 펩티드 생성물 조성물의 적어도 하나의 시료 및 선택적으로 공지된 양의 상기 불순물이 첨가된 펩티드 생성물 조성물의 적어도 하나의 추가의 시료를 제공하는 단계,
    (c) 단계 (b)로부터의 상기 시료 내 상기 불순물을 질량 분석(mass spectrometry)에 의해 정량적으로 결정하는 단계, 및
    (d) (c)의 결과에 기반하여 펩티드 생성물 조성물 내 상기 불순물의 양을 계산하는 단계를 포함하는 펩티드 생성물 조성물 내에 존재하는 불순물의 정량적 결정을 위한 방법.
  2. (a) 펩티드 생성물 및 미지의 양의 적어도 1종의 불순물을 포함하는 펩티드 생성물 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 불순물은 조성물의 다른 성분 또는 펩티드 생성물로부터 크로마토그래피 절차에 의해 분리될 수 없는 것인, 단계,
    (b) 펩티드 생성물 조성물의 적어도 3개의 시료를 제공하는 단계로서, 제1 시료는 첨가된 상기 불순물 없이 펩티드 생성물 조성물을 포함하고, 적어도 2개의 추가의 시료는 각각 상이한 공지된 양의 상기 불순물이 첨가된 펩티드 생성물 조성물을 포함하는 것인, 단계,
    (c) 단계 (b)로부터의 상기 시료 내 상기 불순물을 질량 분석에 의해 정량적으로 결정하는 단계, 및
    (d) (c)의 결과에 기반하여 펩티드 생성물 조성물 내 상기 불순물의 양을 계산하는 단계를 포함하는 펩티드 생성물 조성물 내에 존재하는 불순물의 정량적 결정을 위한 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 펩티드 생성물은 5 내지 100개의 아미노산의 길이를 가지는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 생성물은, 특히 고체상 합성 절차에 의해 화학적으로 합성되거나 재조합 DNA 공정에 의해 생성된 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 생성물 조성물은 약학적 제형이거나 약학적 제형의 제조를 위해 의도된 조성물인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 생성물은 엑센딘(exendin) 펩티드, 특히 릭시세나티드(Lixisenatide)(AVE0010)인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 불순물은 펩티드 불순물인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 불순물은 펩티드 생성물 또는 조성물의 다른 성분으로부터 HPLC 절차, 특히 역상 HPLC 절차에 의해 정량적으로 분리될 수 없는 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 생성물은 미지의 양의 적어도 2종의 불순물을 포함하되, 불순물은 펩티드 생성물 또는 조성물의 다른 성분으로부터 크로마토그래피 절차에 의해 정량적으로 분리될 수 없는 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 불순물이 스톡(stock)제제, 바람직하게는 상이한 농도의 불순물을 포함하는 적어도 2종의 스톡 제제로부터의 적어도 1종의 펩티드 생성물 조성물 시료에 첨가되는 것인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 공지된 양의 첨가된 불순물을 가지는 적어도 3 또는 4개의 추가의 시료가 제공되고 질량 분석 결정이 수행되는 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 질량 분석은, 예컨대, 푸리에 변환(Fourier Transform) 질량 분석을 포함하는 고 해상 질량 분석인 것인, 방법.
  13. 재1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 계산은 선형 회귀 분석을 포함하는 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 계산은 다음 식에 따라서 수행되고, 불순물의 임의의 양(Xt)은 하기와 같이 얻어지는 것인, 방법.
    y = ax+b
    (여기서, a = 기울기
    y = 시료 내 불순물의 결정된 피크 면적
    x = 시료 내 첨가된 불순물의 양
    b= 절편)
    xt = b ● a-1
  15. (i) Di-Ser(33)-AVE0010의 적어도 하나의 스톡 제제 및/또는
    (ii) Di-Ala(35)-AVE0010의 적어도 하나의 스톡 제제를 포함하는 릭시세나티드(AVE0010) 생성물 조성물 내 불순물의 양을 결정하기 위한 시약 키트.
  16. 상기 조성물 내, Di-Ser(33)-펩티드, 예컨대, Di-Ser(33)-AVE0010 및/또는 Di-Ala(35)-펩티드, 예컨대, Di-Ala(35)-AVE0010의 양을 정량적으로 결정하는 단계를 포함하는, 아미노산 서열 S-S-G-A를 포함하는 엑센딘 펩티드 생성물을 포함하는 조성물, 바람직하게는 릭시세나티드(AVE0010)생성물을 포함하는 조성물의 품질 제어를 위한 방법.
  17. 제16항에 있어서, 정량적인 결정은 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수행되는 것인, 방법.
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