TWI583794B - 具有改良靈敏度之肉毒桿菌毒素檢測方法 - Google Patents

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Description

具有改良靈敏度之肉毒桿菌毒素檢測方法
本申請案主張於西元2013年8月9日申請之61/864,436號美國臨時申請案之優先權，其及本文所討論之其他外來材料透過引用其全文併入本文。在一併入文獻中之一技術用語之使用或定義與本文所提供之技術用語定義不一致或相反時，適用本文所提供之技術用語定義，而不適用文獻中之技術用語定義。
本發明的領域係關於肉毒桿菌毒素的蛋白酶檢測方法。
肉毒桿菌神經毒素(Botulinum neurotoxins,BoNTs)係由肉毒桿菌(Clostridium botulinum)製造，且係已知毒素中最強有力的。這些毒素係公認的食物中毒之源頭，時常導致受害者嚴重的傷害甚至死亡。有七種結構相關的肉毒桿菌神經毒素或血清型(serotypes)(BoNT/A-G)，每一種係由一重鏈(heavy chain,~100KD)和一輕鏈(light chain,~50KD)構成。該重鏈介導毒素藉由受體媒介胞吞作用(receptor-mediated endocytosis)進入一標的細胞(target cell)。一旦內化(internalized)，該輕鏈會自胞內體囊泡內腔(endosomal vesicle lumen)易位(translocated)進入胞質液(cytosol)中，而作為一鋅依賴性蛋白酶(zinc-dependent protease)以切割介導囊泡標的膜融合之蛋白質(受質蛋白質，substrate proteins)。
這些肉毒桿菌神經毒素受質蛋白質包含細胞膜蛋白質(plasma membrane protein)突觸融合蛋白(syntaxin)、膜周邊蛋白(peripheral membrane protein)可溶性NSF固著蛋白-25(SNAP-25，以下稱為SNAP-25)及一囊泡膜蛋白(vesicle membrane protein)突觸囊泡蛋白(synaptobrevin,Syb)。這些蛋白統稱為可溶性N-乙基馬來醯亞胺敏感性因 子附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleirnide-sensitive factor attachment protein receptor，以下簡稱為SNARE)蛋白質。切割SNARE蛋白質會阻礙囊泡與細胞膜的融合而破壞神經肌肉接合處神經傳導物質之釋放。在SNARE蛋白質中，突觸融合蛋白及SNAP-25通常駐留在標的膜，因此被稱為t-SNAREs，而突觸囊泡蛋白(Syb)只存在於突觸內之突觸囊泡，因此被稱為v-SNARE。此三種蛋白質合起來形成一複合物，被認為是介導囊泡膜和細胞膜間融合之最小機構。A型、E型及C型肉毒桿菌神經毒素切割SNAP-25，B型、D型、F型及G型肉毒桿菌神經毒素切割突觸囊泡蛋白(Syb)，且在單一但不同的位置上切割。C型肉毒桿菌神經毒素除了SNAP-25以外亦切割突觸融合蛋白。
由於其作為食物中毒之一來源及作為生物恐怖武器之威 脅，有必要靈敏地且迅速地檢測肉毒桿菌神經毒素。目前，檢測毒素最靈敏之方法係為在小鼠上進行之毒性檢測方法。然而，前述之方法需要可觀的費用且受到動物試驗相關法規之管制。
因此，對於發展用於肉毒桿菌神經毒素特性分析的基於動物 之方法的替代方法有與日俱增的興趣。一種引人注意的替代方法係為基於細胞之檢測方法的使用，其維持了基於受體之內化作用(internalization)及隨後的肉毒桿菌神經毒素之切割，且通常在習知之離體(in vitro)檢測方法中不存在。前述基於細胞之檢測方法係利用表現對於肉毒桿菌神經毒素敏感之構成物(constructs)之細胞，在一些情況下，利用佛斯特共振能量轉移(Förster resonance energy transfer,FRET)，而在其他的情況下利用非佛斯特共振能量轉移(non-FRET)之方法，以提供對於肉毒桿菌神經毒素之檢測及特性分析有用之螢光。實例可參考美國專利申請2004/0,191,887號(Chapman)、美國專利申請2006/0,134,722號(Chapman)、美國專利7,208,285號(Steward)、美國專利7,183,066號(Fernandez-Salas)及美國專利申請2011/0,033,866號(Atapattu)，其通過引用全文的方式併入本文中。然而，對於一些申請案，該些基於細胞之方法可能缺乏靈敏度。例如，美國專利申請2006/0,134,722號(Chapman)公開了檢測肉毒桿菌神經毒素的基於細胞之佛斯特共振能量轉移檢測方法，其半效應濃度(EC50)係在 10pM之範圍。
國際專利申請WO 2014/060373號(Eisele)公開了增加細 胞對於肉毒桿菌毒素中毒的靈敏度，其係藉由在暴露於該毒素前讓已準備分化成神經細胞的某些腫瘤細胞在一低滲透壓之分化培養基中分化數天至數週。靈敏度之測定係藉由分解該經處理之細胞後，針對SNAP-25進行西方墨點法(Western blot method)。然而，利用西方墨點法做為一定量方法係被認為有爭議的，且並未提供對於該公開的差異之能顯示其統計上差異之數據。
雖然利用佛斯特共振能量轉移檢測方法去檢測肉毒桿菌神 經毒素已獲得一些成功，但佛斯特共振能量轉移檢測方法對於肉毒桿菌神經毒素的靈敏性在很多用途上仍令人不甚滿意。少如40毫微克之肉毒桿菌神經毒素對大多數人來說係一致死劑量(lethal dose)，而被懷疑含有肉毒桿菌神經毒素之樣本通常係該檢測程序之首要應用。因此，強烈希望有檢測低濃度肉毒桿菌神經毒素之方法。
本發明公開之方法及組合物提供基於細胞之檢測方法對肉毒桿菌毒素之增進的靈敏度。提供之細胞表現一報導構成物(reporting construct)，且該報導構成物對肉毒桿菌毒素敏感。相對於習知溫度及培養基組合物，本發明之溫度及培養基組合物經確認可提供該轉染細胞(transfected cell)對於肉毒桿菌毒素反應之增進的靈敏度。
本發明概念之一實施例係一種增加一肉毒桿菌毒素(例如：A型肉毒桿菌神經毒素)之基於細胞之偵測之靈敏度之方法，其係藉由提供可表現一雜交蛋白質之一轉染細胞，其中該雜交蛋白質(hybrid protein)包括一含有報導蛋白部分(reporter-containing portion)(例如，位於或接近該雜交蛋白質之一端)及一切割位置(cleavage site)，其中一肉毒桿菌毒素會切割該切割位置以自該雜交蛋白質其餘部分釋放該含有報導蛋白部分(例如，一含有一螢光團(fluorophore)部分)。適合之細胞包括神經細胞(neuronal cells)、神經內分泌腫瘤細胞(neuroendocrine tumor cells)、雜交 細胞(hybrid cells)及幹細胞(stem cells)。在此過程中，在暴露至該肉毒桿菌毒素期間，轉染細胞暴露至一為38℃至41℃或38.5℃至39.5℃之溫度，造成該細胞對肉毒桿菌毒素之靈敏度相對於該細胞在37℃時對肉毒桿菌毒素之靈敏度增加至少兩倍。在一些實施例中，該靈敏度之增進係選擇性對於A型肉毒桿菌神經毒素(BoNT/A)。另外，在一些實施例中，在暴露於肉毒桿菌毒素前將該轉染細胞暴露至一毒素前溫度(例如，38℃至41℃或38.5℃至39.5℃)。在一些實施例中，該雜交蛋白質除了該含有報導蛋白部分之一螢光團還包括一第二螢光團，且該第二螢光團在該雜交蛋白質上可位於與該含有報導蛋白部分之一端不相同之一端。在較佳實施例中，該些螢光團被設置成使得該些螢光團之間無顯著(即5%)之能量移轉經由佛斯特共振能量發生。
本發明概念之另一實施例係一種增加一肉毒桿菌毒素之基 於細胞之偵測之靈敏度之方法，其係藉由在一具有一大於65mM之鈉濃度之第一培養基中，提供表現一雜交蛋白質之轉染細胞，其中該雜交蛋白質包含一含有報導蛋白部分(例如，位於或接近該雜交蛋白質之一端)及一切割位置，其中一肉毒桿菌毒素會切割該切割位置以自該雜交蛋白質其餘部分釋放該含有報導蛋白部分(例如，一含有一螢光團部分)。接著，將該細胞移轉至一具有一小於50mM之鈉濃度之第二培養基(例如，小於45mM)，並在該第二培養基中與一肉毒桿菌毒素接觸。在一些實施例中，該轉染細胞在移轉至該第二培養基中後立即暴露至該肉毒桿菌毒素，即不在該第二培養基中預培養(pre-incubation)。此後，可自該雜交蛋白質之該含有報導蛋白部分獲取一信號(signal)。相對於將細胞維持在該第一培養基中(即一具有一至少為65mM鈉濃度之培養基)並在該第一培養基中暴露至肉毒桿菌毒素之方法，在這種方法中，該轉染細胞對於肉毒桿菌毒素之靈敏度可至少增加10倍或更多。該第二培養基中之該鈉濃度可藉由降低一神經基礎(neurobasal)培養基之鈉含量而降低，例如藉由降低氯化鈉及/或碳酸氫鈉之濃度。在一些實施例中，該第一培養基、該第二培養基或兩者皆可具有生理滲透強度(physiological osmotic strength)之性質。在其他實施例中，該第一培養基、該第二培養基或兩者皆可具有一滲透強度，其 小於生理滲透強度，例如為250mOsm或更小。
本發明概念的又一實施例係一種用於增進一肉毒桿菌毒素 之基於細胞之偵測之靈敏度之套組(kit)，其中該套組包含一組標準品，其在如上所述靈敏度增加的培養基中含有兩種或更多種不同濃度之肉毒桿菌毒素。這樣的套組可以包括兩種或更多種配製(preparation)，在該培養基中含有非零濃度(non-zero concentrations)之肉毒桿菌毒素，而在一些實施例中可以包括一空白(blank)或零(即僅有培養基)之配製。這樣的套組可用以製作及/或驗證劑量-反應曲線(dose/response curves)，有助於定量一樣品中之肉毒桿菌毒素(例如，相對於儲存在記憶體中的一校準曲線，一校準曲線之製作或檢測方法性能之驗證)。
圖1A、1B及1C顯示在不同溫度下轉染細胞對肉毒桿菌毒素及其片段之反應。圖1A顯示在不同溫度下轉染細胞對肉毒桿菌全毒素(botulinum holotoxin)之反應。圖1B顯示在不同溫度下轉染細胞對肉毒桿菌全毒素或肉毒桿菌毒素輕鏈之反應。圖1C顯示在不同溫度下轉染細胞在肉毒桿菌毒素重鏈存在時對肉毒桿菌全毒素之反應。
圖2顯示在不同的毒素暴露前(即培養)溫度及不同的毒素暴露(即檢測)溫度下轉染細胞對肉毒桿菌毒素之反應。
圖3A及3B顯示培養基離子強度對於在不同溫度下轉染細胞對肉毒桿菌毒素之反應的影響。圖3A顯示在一具有270mM離子強度之培養基中轉染細胞之反應。圖3B顯示在一具有250mM離子強度之培養基中轉染細胞對肉毒桿菌毒素之反應。
圖4A及4B顯示升高之溫度對於轉染細胞對肉毒桿菌毒素之反應及在沒有肉毒桿菌毒素時轉染細胞之反應的影響。圖4A顯示溫度高達41℃時轉染細胞對肉毒桿菌毒素之反應。圖4B顯示在沒有肉毒桿菌毒素時轉染細胞對高達41℃溫度之反應的亮視野顯微照片及螢光顯微照片。
圖5顯示增加溫度對於E型肉毒桿菌毒素之一基於細胞之檢測方法之 影響。
圖6A至6B顯示具有降低的鈉濃度之培養基對於肉毒桿菌毒素之一基於細胞之檢測方法之影響。圖6A顯示使用商業培養基並增添不同濃度之氯化鈉的影響。圖6B顯示轉染細胞暴露至含有不同氯化鈉濃度之訂製培養基之顯微照片。
圖7顯示在具有不同鈉濃度之培養基中及其後在不同時間點暴露於毒素之轉染細胞對肉毒桿菌毒素之反應。
圖8A、8B及8C顯示在恢復正常鈉濃度前，在一具有降低的鈉含量之培養基中不同時間長度下轉染細胞暴露於肉毒桿菌毒素之結果。圖8A顯示當轉染細胞在暴露於肉毒桿菌毒素前培養於習知培養基中之結果。圖8B顯示當轉染細胞在暴露於肉毒桿菌毒素前培養於低鈉含量培養基中之結果。圖8C顯示在一低鈉含量培養基中實施一肉毒桿菌毒素之基於細胞之檢測方法前，以習知培養基或具有降低鈉含量之培養基之其中之一進行預培養之影響。
圖9A及9B顯示降低用於肉毒桿菌毒素之基於細胞之檢測方法之培養基中碳酸氫鈉的結果。圖9A顯示具有不同濃度碳酸氫鈉之培養基中的劑量-反應曲線。圖9B顯示自前述劑量-反應曲線計算而來之EC50s做為該培養基中碳酸氫鈉濃度之一函數的結果。
圖10顯示以鉀取代用於肉毒桿菌毒素之基於細胞之檢測方法的訂製培養基中之鈉的影響，及降低那些培養基中之鈉和鉀濃度的影響。
圖11顯示增加用於肉毒桿菌毒素之基於細胞之檢測方法的低鈉含量培養基之滲透壓的影響。
圖12A及12B顯示在具有降低鈉含量的培養基中，肉毒桿菌毒素片段及完整肉毒桿菌全毒素對轉染細胞之影響。圖12A顯示在暴露於全毒素前，添加重組肉毒桿菌毒素重鏈於該轉染細胞之影響。圖12B顯示添加重組肉毒桿菌毒素輕鏈於該轉染細胞之結果，及添加完整肉毒桿菌全毒素於該轉染細胞之結果。
本發明標的提供了一些方法，在其中用於一基於細胞的肉毒 桿菌毒素檢測方法之細胞培養基的鈉離子濃度及/或實施該基於細胞的肉毒桿菌毒素檢測方法時的溫度可用以提供具有增強靈敏度肉毒桿菌分析方法。令人驚訝地，發明人發現降低細胞培養基中鈉離子濃度會以一種離子及肉毒桿菌毒素特定的方式增強對肉毒桿菌毒素之靈敏度。發明人還藉由劑量-反應曲線確定了一個狹窄的溫度範圍，在此溫度範圍中，該檢測方法之靈敏度顯著地提高。
本發明標的提供了一些方法，用於增加偵測一肉毒桿菌毒素(肉毒桿菌神經毒素，BoNT)存在的基於細胞之方法靈敏度。現已發展了各式各樣利用表現可被這些蛋白酶(proteases)切割之偵測構成物的轉染細胞之用於肉毒桿菌毒素的檢測方法。在基於細胞之檢測方法中，一肉毒桿菌毒素的一重鏈與細胞表面受體之專一性結合(specific binding)，其次是藉由該肉毒桿菌毒素之輕鏈對一含有一肉毒桿菌毒素專一性切割位置的構成物之專一性切割，隨後自該構成物釋放一指標部分(indicator moiety，例如一螢光蛋白)，以提供一高水準之專一性。然而，習知技術方法缺乏靈敏性，其對於這些檢測方法之重要應用係必需的，例如環境的檢測，這對於考慮到以肉毒桿菌毒素做為生化武器之淺在用途而言係十分重要的。
除非上下文相反，本文所述之所有範圍應被解釋為包括其端點，且開放式的範圍應當被解釋為僅包括商業實用價值。同樣地，除非上下文相反，所有列出的值應被視為包含中間值。
基於細胞之檢測方法需要一嚴格控制的環境，其使用之生理離子濃度、滲透壓(即250-270mOsm)及溫度皆保持在生理標準。令人意外地，發明人發現降低培養基中鈉離子濃度提供了一些基於細胞之肉毒桿菌毒素檢測方法之顯著增加的靈敏度。這樣的效果並未見於鉀離子濃度，亦非為改變細胞培養基滲透壓之結果，且在特定種類之肉毒桿菌毒素並未觀察到這樣的效果。發明人亦發現在實施該檢測方法時將溫度提高4℃會導致該檢測方法靈敏度顯著地增加，且在檢測的過程中不會影響細胞的生存能力(viability)。同樣地，降低該細胞培養基之滲透壓亦造成靈敏度之增加。這些方法可被採用而不需要專業設備，且所實現之靈敏度增加擴大了 這些高度專一性之肉毒桿菌毒素檢測方法應用的範圍。
本發明概念之方法提供了一轉染細胞，其逐個地產生一構成 物或融合蛋白質(fusion protein)。關於表現該雜交蛋白質的轉染細胞，通常穩定轉染的細胞係較佳的。然而，也是可考慮短暫轉染(transient transfection)。該轉染細胞更典型且更佳的係為一神經細胞。然而，這裡也可考慮許多其他非神經細胞，包含哺乳動物細胞(mammalian cells)、昆蟲細胞(insect cells)、酵母菌(yeast)、細菌(bacteria)及人工細胞(artificial cells)。最典型地，在適當的調控因子下，該細胞會組成性地表現該雜交蛋白質。另一方面，該表現亦可被引發。
作為本發明適合的寄主細胞(host cell)有很多可選擇之細 胞株。較佳地，該細胞係一種個別的肉毒桿菌毒素(肉毒桿菌神經毒素，BoNT)在其中可展現其毒性活性之類型。換句話說，該細胞較佳地表現適合之細胞表面受體，或以其他方式允許該毒素被充分且有效地易位至細胞內，且允許該毒素切割適合的受質多肽(polypeptide)。具體之例子包含初代培養(primary cultured)之神經元(例如皮質神經元(cortical neurons)、海馬迴神經元(hippocampal neurons)、脊髓運動神經元(spinal cord motor neurons)等)、PC12細胞或源自PC12細胞之細胞株、初代培養之嗜鉻細胞(chromaffin cells)、培養的神經母細胞瘤(neuroblastoma)細胞株，如鼠膽鹼性Neuro2A細胞株(murine cholinergic Neuro2A cell line)、人類腎上腺素性SK-N-SH細胞株(human adrenergic SK-N-SH cell lines)、NS-26細胞株及幹細胞(請參照文獻如：引入神經幹細胞群及前驅細胞群之基因調節因子，Foster and Stringer(1999),Genetic Regulatory Elements Introduced Into Neural Stem and Progenitor Cell Populations,Brain Pathology 9：547-567)。同樣地，也可使用神經內分泌細胞株及源自神經內分泌之細胞株。然而應當理解的是，在被導向非神經細胞類型之重組或突變肉毒桿菌毒素的實例中，該寄主細胞可自具有對應的專一性之細胞株中選擇。
本發明概念之構成物或融合蛋白可包括一含有報導蛋白部 分及一切割位置。該切割位置可作為與一肉毒桿菌毒素輕鏈相關聯的蛋白酶活性之一受質。該些轉染細胞可展現穩定的轉化(transformation)或短暫 的轉化。切割該切割位置可自該構成物之一其餘部分釋放至少一部份之含有報導蛋白部分。該報導蛋白區域可包含一可見的報導蛋白群組或標籤，如一螢光團，其提供一可見的螢光。適台的螢光團包含螢光染料(fluorescent dyes)且可包含螢光蛋白，如綠色螢光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)、青色螢光蛋白(Cyan Fluorescent Protein,CFP)、黃色螢光蛋白(Yellow Fluorescent Protein,YFP)、Citrine、Venus、YPet、mStrawberry及/或mCherry蛋白。在一些實施例中，該雜交蛋白質可包括多種螢光團，例如一第二螢光團。該一第二螢光團可位於該報導蛋白區域內或位於一遠端位置。舉例來說，該報導蛋白區域之該螢光團(即該第一螢光團)可位於最接近該雜交蛋白質之一端，而該第二螢光團可位於最接近該雜交蛋白質之另外一端。或者，該第一螢光團及該第二螢光團皆可位於該報導蛋白區域內。根據偵測的性質，該第一螢光團及該第二螢光團可為相同之螢光團種類或可為不同之螢光團種類。例如，在一利用佛斯特共振能量轉移(FRET)偵測之檢測系統中，該第一螢光團及該第二螢光團可為不同螢光團種類。
在本發明概念之一較佳實施例中，該報導蛋白區域包含一或 多個同種類之螢光團，其可被設置以使同佛斯特共振能量轉移(homo-FRET)不會發生至一顯著程度(即小於5%的佛斯特共振能量轉移)。在其他實施例中，該構成物可包括不同種類之螢光團，其可被設置以使佛斯特共振能量轉移(FRET)不會發生至一顯著程度(即小於5%的佛斯特共振能量轉移)。這可例如藉由將該些螢光團設置於或接近該構成物之不同端而實現。在該些實施例中，一第一螢光團之發射光譜(emission spectra)可與一第二螢光團之激發光譜(excitation spectra)重疊，且無顯著的佛斯特共振能量轉移(即小於5%)，然而該第一螢光團之螢光發射並未透過消光(quenching)顯著地降低(即小於5%)，且該第二螢光團之螢光發射並未透過該能量轉移顯著地增加(即大於5%)。在本發明概念其他實施例中，該構成物可包括一第一螢光團，其具有可與一第二螢光團之激發光譜重疊之一發射光譜，且該構成物中之螢光團的位置可被設置以使該些螢光團之間具有顯著的(即大於5%)佛斯特共振能量轉移。本發明概念之一構成物的螢光可藉由任何適合該構成物構形之方式來偵測，包含例如自 各螢光種類之直接激發及發射、佛斯特共振能量轉移及螢光非均向性(fluorescence anisotropy)。在一較佳實施例，可使用一習知之微孔板螢光計(microwell plate fluorometer)，其係配置用於自各螢光團種類偵測直接激發及發射。
綠色螢光蛋白及其突變可發出螢光且不需額外的輔因子(cofactors)或受質，特別適合與本發明概念之構成物使用。例如黃色螢光蛋白(YFP)，係綠色螢光蛋白之一突變，係源自維多利亞多管發光水母(Aequorea victoria)且在514nm具有一激發峰(excitation peak)及在527nm具有一發射峰(emission peak)。除了黃色螢光蛋白，亦可考慮將相關的Citrine、Venus及Ypet蛋白質用於含有報導蛋白部分。這些突變相對於綠色螢光蛋白，具有降低的氯靈敏度、更快的成熟及增加的亮度(消光係數(extinction coefficient)與量子產率(quantum yield)的積)。當然，任何本發明所提及之螢光蛋白可被修飾，以包含特定的特性(例如，光譜)或者被截短為一特定大小。該含有報導蛋白部分亦可考慮包含除了螢光蛋白以外的報導蛋白，例如為一磷光發光性化合物(phosphorescent compound)、一發光化合物(luminescent compound)、一發色團(chromophore)、一酵素(enzyme)等等。
在本發明概念之一些實施例中，將該轉染細胞暴露至該肉毒桿菌毒素(肉毒桿菌神經毒素，BoNT)前記錄該偵測信號以提供一基線信號。此基線信號可當作用於與一自後續該轉染細胞暴露至肉毒桿菌毒素所獲取之檢測信號比較之一基礎，也可用於標準化(normalize)該檢測信號，以至少部分修正不同測試位置間細胞數量、密度及/或形狀之差異。例如，一暴露後信號與該基線信號間之一比率可用於標準化實施於一微孔板之不同孔(well)之檢測方法間的螢光強度(fluorescence intensity)，從而減少類似測量值之間的偏差。靈敏度可藉由製備一系列利用不同濃度之肉毒桿菌毒素之檢測所產生的一劑量-反應曲線進行評估，且該曲線為典型的S形曲線。靈敏度之定量可藉由測定產生一反應之肉毒桿菌毒素的濃度進行，其與該劑量-反應曲線之一限定部分相關聯。例如與該劑量-反應曲線之中點或半最大值(通常以EC50描述)相關聯之一肉毒桿菌濃度可作為 用於在該些檢測中比較靈敏度之一基礎。
許多不同的方法可用來測量使用一基於細胞之檢測方法對 於肉毒桿菌毒素之靈敏度。在一實施例中，不形成一佛斯特共振能量轉移對(FRET pair)之一第一螢光蛋白與一第二螢光蛋白(即顯示約少於5%透過佛斯特共振能量轉移之能量轉移)之一發射比率可在暴露該轉染細胞至肉毒桿菌毒素後進行測量。在該實施例中，暴露該雜交蛋白質至肉毒桿菌毒素前，該構成物顯示一基線信號，且該第一螢光蛋白發射及該第二螢光蛋白發射分開進行測量。暴露至肉毒桿菌毒素後，該肉毒桿菌毒素會切割該包含該第一螢光蛋白之含有報導蛋白部分，且被切割之含有報導蛋白部分隨後會經由蛋白質水解作用(proteolysis)被降解。在該例子中，該第一螢光蛋白之該發射強度會降低，而該第二螢光蛋白之一發射強度實質上維持一樣。自該第二螢光蛋白所測得之該發射係細胞數量、密度、分布等等之一函數，但非該肉毒桿菌毒素之濃度的一函數。因此，該第二螢光蛋白之發射可用於標準化自該報導蛋白區域之一螢光團(此例中為該第一螢光蛋白)所測得之發射，例如藉由使用一發射比率。應當理解的係，在該螢光團係被設置為進行佛斯特共振能量轉移之構成物中，該一發射比率對數據之標準化係無效的，因為自該構成物之斷裂上的兩個螢光團之發射會改變。當該構成物與肉毒桿菌毒素交互作用時，該發射比率(第一螢光蛋白發射/第二螢光蛋白發射)會降低。在該一實施例中，一適合的構成物之例子係在該報導蛋白區域之外包含青色螢光蛋白(CFP)且在該報導蛋白區域中包含黃色螢光蛋白(YFP)，配置成該青色螢光蛋白及黃色螢光蛋白不形成一佛斯特共振能量轉移對。在暴露至一肉毒桿菌毒素後之黃色螢光蛋白降解(即直接地且個別地激發的黃色螢光蛋白發射及青色螢光蛋白發射)之程度的相關數據可自一表現該一構成物之一細胞進行收集。這些發射可進行背景濾除，且該黃色螢光蛋白發射除以該青色螢光蛋白發射，以對照細胞密度及個別細胞中報導蛋白之表現。
一報導蛋白區域之一螢光團的肉毒桿菌毒素反應發射或一 發射比率可用於產生一劑量-反應曲線，其有助於定量一樣品中之肉毒桿菌毒素及/或測定一肉毒桿菌毒素測定方法之靈敏度。這樣的靈敏度經常 表示為相當於該劑量-反應曲線之一特有部分的一肉毒桿菌毒素濃度。例如，相當於該曲線中點之一肉毒桿菌毒素濃度稱為一半效應濃度(EC50)。
在本發明概念之一實施例中，在一相對於細胞培養及通常實 施該檢測方法之溫度(即37.0℃)提高之溫度下暴露該轉染細胞至該肉毒桿菌毒素。應當理解的是，通常認為這樣的溫度非最理想於細胞生存，且在依賴利用存活細胞之檢測方法中使用這樣的溫度悖於常理。在一較佳實施例中，相對於一實施於37.0℃之檢測方法，在該溫度將轉染細胞暴露至肉毒桿菌毒素使得該靈敏度增加至少兩倍(即以2的倍數)，即在提高的溫度下實施該檢測方法之EC50係小於在37.0℃下實施該檢測方法之EC50的一半。令人意外地，本案發明人發現該一靈敏度增強發生於一相對狹窄之溫度範圍內。在本發明概念之一些實施例中，將該轉染細胞暴露至該肉毒桿菌毒素於38.0℃至41.0℃。在本發明概念之其他實施例中，將該轉染細胞暴露至該肉毒桿菌毒素於38.5℃及39.5℃間之一溫度。
另外，將本發明概念之轉染細胞暴露至肉毒桿菌毒素前，可培養於高於37.0℃之溫度，例如38.0℃至41.0℃或38.5℃及39.5℃。在該些實施例中，暴露該轉染細胞至肉毒桿菌毒素可於37.0℃進行。另外，在一些實施例中，轉染細胞在暴露至肉毒桿菌毒素前或期間皆可暴露於高於37.0℃之溫度(例如38.0℃至41.0℃或38.5℃及39.5℃)。在其他實施例中，在實施該檢測方法期間，該轉染細胞之溫度可上升或下降。例如，在導入該肉毒桿菌毒素時，該轉染細胞之溫度可開始於37.0℃，然後在進行該檢測方法時增加(例如增加至41.0℃)。另外，在一些實施例中，在導入該肉毒桿菌毒素時，該轉染細胞之溫度可開始於一提高之溫度(例如41.0℃)，然後在該檢測方法之過程中降低至37.0℃。
在本發明實施例中，隨著條件(例如，溫度、滲透壓、細胞外離子濃度等等)之改變，一偵測肉毒桿菌毒素存在之基於細胞之檢測方法對於肉毒桿菌毒素之靈敏度可增加至少兩倍。在一較佳實施例中，當該轉染細胞在一高於37.0℃之溫度下、在38℃至41℃之範圍中、或在38.5℃至39.5℃之範圍中暴露至肉毒桿菌毒素，相較於在37.0℃時對肉毒桿菌毒素之靈敏度增加至少3倍。在另一實施例中，當該轉染細胞在一高於 37.0℃之溫度下、在38℃至41℃之範圍中、或在38.5℃至39.5℃之範圍中暴露至肉毒桿菌毒素，相較於在37.0℃時對肉毒桿菌毒素之靈敏度增加至少5倍。在其它實施例中，當該轉染細胞在一高於37.0℃之溫度下、在38℃至41℃之範圍中、或在38.5℃至39.5℃之範圍中暴露至肉毒桿菌毒素，相較於在37.0℃時對肉毒桿菌毒素之靈敏度增加至少10倍。
降低該轉染細胞暴露於肉毒桿菌毒素時所在之一細胞培養 基之滲透壓也被認為可增進對肉毒桿菌毒素之靈敏度。不希望受理論的約束，本案發明人相信，降低細胞外的滲透壓可導致細胞活性(例如，神經元興奮性)之調節。特別是在神經元細胞，降低滲透壓增強了突觸傳導及神經元興奮性，其增加了胞吞作用之速率。因此，可以預期的是，降低該轉染細胞暴露於肉毒桿菌毒素時所在之一細胞培養基之滲透壓，例如至一介於220 milliOsm及260 milliOsm間之範圍，可賦予對肉毒桿菌毒素靈敏度之增加。應當理解的是，這樣的改變係悖於常理的，因為這樣的條件對細胞生存力會有不利影響。此外，也可預期該細胞培養基之滲透壓降低可增強由一高於37.0℃之溫度造成的對肉毒桿菌毒素靈敏度之增加，例如以一協同方式(synergistic fashion)。
在另一實施例中，增加對肉毒桿菌毒素之靈敏度可藉由降低 特定細胞外離子之濃度而達成，例如游離(即未配合(uncomplexed)或非螯合(non-chelated))鈣。當細胞外鈣濃度降低至正常生理程度之下，該轉染細胞會逐步地更加興奮。與降低滲透壓相同，增加細胞興奮性可提高胞吞作用之速率，且以此方式促進一所施加之肉毒桿菌毒素之內化作用。因此可預期的是，降低鈣濃度至生理程度之下(1.0-1.5mM)可賦予一相似的對肉毒桿菌毒素靈敏度之增加。同樣地，添加鈣螯合劑(chelators)，例如乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(ethyleneglycoltetraacetic acid,EGTA)、1,2-雙(2-胺基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四(乙醯氧基甲基)酯(1,2-bis-(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetra(acetoxymethyl)ester,BAPTA/AM)及其他有機酸，至該細胞培養基可賦予相似的對肉毒桿菌毒素靈敏度之增加。
在本發明概念另一實施例中，一肉毒桿菌毒素之基於細胞的 檢測方法之靈敏度增加，當降低在實施該檢測方法期間利用之該細胞培養基的鈉離子濃度時會增加。例如，製備細胞培養基可自配方中省略鈉鹽類，如氯化鈉及/或碳酸氫鈉。該細胞培養基可具有少於約70mM、約50mM、約40mM、約30mM、約25mM、或約20mM之最終鈉離子濃度。 在本發明概念一較佳實施例中，用以實施一基於細胞之肉毒桿菌毒素檢測方法之該細胞培養基係少於或等於約20mM。
在實施一基於細胞之檢測方法中，表現一如上所述之肉毒桿 菌敏感之構成物的細胞在暴露至該肉毒桿菌毒素前可預培養(pre-incubated)於一低鈉離子含量之培養基中，然後與一含有肉毒桿菌毒素(例如，自一添加之樣本)的低鈉離子含量之培養基接觸。在本發明一較佳實施例中，在與肉毒桿菌毒素接觸前將細胞以一短暫交換(即幾分鐘)或沖洗暴露於低鈉離子含量之培養基，而在此之前細胞不暴露於低鈉離子含量之培養基。
在本發明概念之一些實施例中，細胞培養基中之鈉離子可由 其他不會展現鈉離子效力之離子(例如鉀離子)或由其他滲透壓調節劑(例如氧化三乙胺(triethylamine N-oxide))代替，以維持該細胞培養基之生理滲透壓，而仍能提供藉由降低鈉離子濃度而實現之靈敏度增進。
應當理解的是，可以組合升高之溫度、降低之培養基滲透 壓、降低之細胞外特定離子(例如為鈉離子)濃度及添加之蛋白質，且該組合可表現出協同效應。例如，本案發明人意外地發現在暴露該轉染細胞至肉毒桿菌毒素期間提高溫度及使用降低滲透壓之培養基，在增進一基於細胞之檢測方法的靈敏度上具有一協同效應。
一些肉毒桿菌毒素(肉毒桿菌神經毒素，BoNT)血清型具 有不同之受質專一性，且已確認其專一的切割位置，包含A型肉毒桿菌毒素(BoNT/A)、B型肉毒桿菌毒素(BoNT/B)、C型肉毒桿菌毒素(BoNT/C)、D型肉毒桿菌毒素(BoNT/D)、E型肉毒桿菌毒素(BoNT/E)、F型肉毒桿菌毒素(BoNT/F)、G型肉毒桿菌毒素(BoNT/G)及一建議的H型肉毒桿菌毒素(BoNT/H)。在本發明概念之一些實施例中，一靈敏度增進方法對 於一特定種類之肉毒桿菌毒素可為有選擇性的。例如，使用一低鈉含量細胞培養基可導致一基於細胞之檢測方法對於A型肉毒桿菌毒素之一靈敏度增加，但對於一基於細胞之檢測方法對於E型肉毒桿菌毒素之靈敏度影響不大。在本發明概念之一些實施例中，當相同之細胞株表現用於辨別多種肉毒桿菌毒素種類之相同的構成物，會發生這種對於一或多種肉毒桿菌毒素種類選擇性的靈敏度增進。
可以預期的是，本發明概念之一構成物對該一或多種肉毒桿 菌毒素可係敏感的(即作為一受質)。同樣可以預期的是，轉染細胞表現帶有雜交報導蛋白/切割位置之蛋白質可作為具有改變的專一性之重組或修飾的肉毒桿菌毒素及肉毒桿菌毒素血清型及/或尚未確認之異型體(isoforms)之一受質，且對於本發明之方法將會有反應。亦可預期的是，轉染細胞表現具有相似報導蛋白及對破傷風神經毒素(Tetanus neurotoxins,TeNTs)敏感之不同切割位置部分的蛋白質，當應用本發明概念之方法，可顯示對相應的破傷風神經毒素之靈敏度相似之增加。
在一較佳實施例，顯著地高於37.0℃之溫度及具有低鈉離子濃度(即小於約70mM)之細胞培養基增加了BOCELLTM模式細胞株對A型肉毒桿菌神經毒素(BoNT/A)之靈敏度。61/492237號美國臨時專利申請案(申請於西元2011年6月1日)描述了該一細胞株，且併入本文。本文討論之全部其他外來之材料藉由引用其全文同樣地併入本文。
肉毒桿菌毒素可辨識該切割位置且切割該雜交蛋白質成含有報導蛋白部分及該雜交蛋白質之其餘部分。本發明之該切割位置序列有益地可包含一SNARE蛋白質、模體(motif)或突變蛋白質(mutein)或這些中之一可切割之部分。SNARE蛋白質應理解為包含可溶性NSF固著蛋白(SNAP-25)、突觸囊泡蛋白(synaptobrevin，一種囊泡相關膜蛋白，VAMP)及突觸融合蛋白(syntaxin)。一蛋白質之突變蛋白質在此應解釋為具有與一對應之天然蛋白質至少30%相同，例如包含具有與該天然蛋白質至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%相同之組成。相同中的變異可包括任一或更多的添加(additions)、缺失(deletions)及置換(substitutions)。預期的突變蛋白質 包括片段(fragments)、斷片(truncates)及融合蛋白質(fusion proteins)。
不希望受到理論約束，發明人相信在較高溫度下觀察到之對 肉毒桿菌毒素增加之靈敏度可能係增加肉毒桿菌毒素之專一性結合與胞吞作用之結果。在一基於細胞之檢測方法，肉毒桿菌神經毒素必須通過受體媒介胞吞作用內化至細胞質。任何引起更多肉毒桿菌神經毒素被內化及與雜交蛋白質/構成物之該切割位置交互作用之事物，有可能因此導致該轉染細胞對肉毒桿菌神經毒素更加敏感。如圖1A所示，其描述了在不同溫度下得到的肉毒桿菌毒素之劑量-反應曲線，相對來說微小的溫度變化對一肉毒桿菌毒素檢測方法之靈敏度產生了驚人效果(以EC50判斷)。圖1B顯示使用完整肉毒桿菌毒素(即全毒素)及該肉毒桿菌毒素輕鏈進行相似研究之結果，其中肉毒桿菌毒素輕鏈具有蛋白酶活性，可以切割該細胞之報導構成物但不具有與受體結合之活性。當該細胞暴露於該輕鏈，在習知之溫度及提高的溫度下該構成物之發射比率缺乏變化，表示溫度之影響並非廣泛地增進胞吞作用之結果，而是受體媒介過程(receptor-mediated process)的結果，此被圖1C所示之數據支持，圖1C顯示不同溫度對於在肉毒桿菌毒素重鏈存在或不存在時暴露至肉毒桿菌毒素之轉染細胞之影響，其中肉毒桿菌毒素重鏈缺乏切割該報導構成物之能力，但可佔據毒素專一性受體之位置。圖1C顯示該肉毒桿菌毒素重鏈有效地阻斷該全毒素之作用但在提高之溫度下影響較小，此表示基於細胞的檢測方法靈敏度之溫度影響可能係一受體媒介過程。
增加肉毒桿菌毒素受體蛋白在轉染細胞表面之表現可導致 增進的肉毒桿菌毒素胞吞作用。例如，A型、D型及E型肉毒桿菌毒素透過與表現在細胞表面之突觸囊泡蛋白質(synaptic vesicle proteins,SV2)內化至細胞質。因此，在轉染細胞上SV2蛋白質之共同表現(co-expression)可推斷對肉毒桿菌毒素之靈敏度類似的增加亦係可預期的。
在較高溫度下內生性壓力反應蛋白質之增加的活性可能會 導致對肉毒桿菌毒素靈敏度之增強，其中該內生性壓力反應蛋白質包括熱休克蛋白70(Heat Shock Protein 70,HSP70)及熱休克蛋白90(Heat Shock Protein 90,HSP90)。熱休克蛋白70及熱休克蛋白90皆係於在高於生理溫 度範圍(35.0-37.0℃之間)之溫度下活化，且會增進細胞之蛋白質水解活性。不希望受到理論約束，熱休克蛋白70及熱休克蛋白90之活性增加可促進該雜交蛋白質之該含有報導蛋白部分的分解係可預期的。
更進一步地，在較高溫度下該雜交蛋白質之一構型變化(藉 此可增加該佛斯特共振能量轉移信號之基線)可導致對肉毒桿菌毒素之增加的靈敏度。熱休克蛋白70用於幫助蛋白質之正確折疊，且熱休克蛋白70增加的活性可導致該雜交蛋白質之一構型變化。因此，亦可考慮以熱休克蛋白70活化劑(例如為YM1氯化(2-((Z)-((E)-3-乙基-5-(3-甲基苯並[d]噻唑-2(3H)-亞基)-4-氧噻唑烷基-2-亞基)甲基)-1-甲基聯吡啶-1-鎓(YM1(2-((Z)-((E)-3-ethyl-5-(3-methylbenzo[d]thiazol-2(3H)-ylidene)-4-oxothiazolidin-2-ylidene)methyl)-1-methylpyridin-1-ium chloride)、氯化2-[3-乙基-5-(3-甲基-3H-苯並噻唑-2-亞基)-4-氧噻唑烷基-2-亞基甲基]-1-甲基吡啶(2-[3-Ethyl-5-(3-methyl-3H-benzothiazol-2-ylidene)-4-oxo-thiazolidin-2-ylid enemethyl]-1-methyl-pyridinium chloride))處理該轉染細胞可推斷出對肉毒桿菌毒素之靈敏度類似的增加。
可進一步考慮結合上述各種條件以提供該基於細胞的檢測 方法對肉毒桿菌毒素更加增進之靈敏度。例如，可結合降低滲透強度及降低培養基中鈉濃度以提供進一步的靈敏度增強。可預期這些結合可產生協同作用。
本發明概念之另一實施例為一包含製劑之套組(kit)，該製 劑包括如上所述之靈敏度增進培養基及不同濃度之一或多種肉毒桿菌毒素。例如，該一套組可包括一組包含一靈敏度增進培養基之製劑，其中該組之每一製劑額外地包含一不同濃度之肉毒桿菌毒素。該靈敏度增進培養基可為如上所述，例如為含有少於或等於50mM鈉濃度之培養基。該靈敏度增進培養基可具有生理滲透強度或少於生理滲透強度。
在該一套組中，可製備該製劑以使其表現適於作為一劑量- 反應曲線使用之一系列肉毒桿菌毒素濃度。該一劑量-反應曲線可依次用於校準一基於細胞的肉毒桿菌毒素檢測方法以產生一特有的反應。另外，該一套組可含有不多數量之該製劑(例如為1、2或3個製劑)，其可能不 適於產生一劑量-反應曲線，但可用於驗證一可產生與儲存於電腦記憶體中之一完整劑量-反應曲線之結果或校準曲線之結果一致的結果的基於細胞之肉毒桿菌檢測方法。較佳地，該一套組可包括一未包含肉毒桿菌毒素之製劑，用作為一稀釋劑、對照組、空白樣品及/或零標準品。在另一實施例，該一套組可包括一培養基之供給(例如為一不具有肉毒桿菌毒素之靈敏度增進培養基)及一肉毒桿菌毒素原料之供給。該一靈敏度增進培養基之供給可為一批量供給，或較佳的為一系列以容納特定體積之個別容器之分裝。應當理解的是，為了適應不同的穩定條件(例如不同之溫度、緩衝液條件、穩定劑等等)，在該一實施例中之成分可以獨立的成分提供。在該一實施例中，提供說明書給使用者，用於添加該肉毒桿菌毒素原料至該不完整之製劑為了產生可以如上使用之完整製劑。
實驗例
溫度效應 。用於偵測肉毒桿菌毒素之基於細胞的檢測方法 (BOCELLTM檢測方法)於35.0℃、37.0℃及39.0℃(試驗1及試驗2)與37℃、39℃及41℃(試驗3)實施，且使用濃度範圍於10-15M至10-9M之間的A型肉毒桿菌毒素全毒素。當暴露於肉毒桿菌毒素時，該轉染細胞暴露於三個溫度的其中之一。藉由描繪各濃度之發射比率(黃色螢光蛋白/青色螢光蛋白)及將其以A型肉毒桿菌毒素濃度之一函數繪圖以產生劑量-反應曲線。如圖1A所示，藉由自37℃增加使用於該檢測方法之溫度至39.0℃或41℃，對肉毒桿菌毒素之靈敏度(以EC50值估量)增加五倍以上。
在描繪於圖1B之研究中，該轉染細胞以A型肉毒桿菌毒素 全毒素或A型肉毒桿菌毒素輕鏈處理，且培養在37.0℃或39.0℃。A型肉毒桿菌毒素輕鏈保有切割該些細胞所表現之偵測構成物之能力，但缺乏與完整全毒素利用之專一性細胞表面受體結合之能力。在這些研究中，A型肉毒桿菌毒素輕鏈即使在高濃度下亦不切割該報導構成物之切割位置含有部分。這表示完整A型肉毒桿菌神經毒素在37.0℃與39.0℃下皆經歷受體媒介毒素攝入過程及在該細胞內之活化作用，且該增強之靈敏度係一受體媒介過程。
以上所述可以圖1C所示之研究確認。轉染細胞在加入A型 肉毒桿菌毒素全毒素前以A型肉毒桿菌毒素重鏈或相同之媒液進行預處理。A型肉毒桿菌毒素重鏈缺乏毒性(即蛋白水解活性)且無法切割該細胞所表現之偵測構成物，但可結合至與該全毒素結合之專一性受體的位置。將該轉染細胞與該重鏈預培養，其中該重鏈包含受體結合區域，在37.0℃及39.0℃下A型肉毒桿菌毒素全毒素之攝入及報導蛋白之切割，說明在升高的溫度下用於報導蛋白切割之A型肉毒桿菌毒素全毒素的受體媒介胞吞作用之要求。
圖2顯示利用升高之溫度預處理細胞之效果。偵測肉毒桿菌 神經毒素之基於細胞的檢測方法(BoCellTM檢測方法)實施於35.0℃、37.0℃及39.0℃，且使用濃度範圍於10-15M至10-9M之間的A型肉毒桿菌毒素全毒素。暴露於肉毒桿菌毒素前，該轉染細胞暴露於三個溫度的其中之一，然後在暴露於肉毒桿菌毒素時，暴露於該相同溫度或三個溫度中一不同的溫度。轉染細胞在39.0℃時暴露於肉毒桿菌毒素，其對肉毒桿菌毒素之靈敏度會增加，且記述為一減少的EC50值。39.0℃時對肉毒桿菌毒素之靈敏度大於37.0℃時對肉毒桿菌毒素之靈敏度至少3倍，且與35.0℃時對肉毒桿菌毒素之靈敏度相較至少大於10倍。
圖3A及3B顯示升高之溫度結合降低之滲透壓的效果。偵 測肉毒桿菌毒素之基於細胞的檢測方法(BOCELLTM檢測方法)實施於35.0℃、37.0℃及39.0℃，其中該轉染細胞在一具有接近270mOsm(即正常滲透壓)之一滲透壓的一細胞培養基中暴露至肉毒桿菌毒素。與先前的觀察一致且如圖3A所示，在39.0℃時之觀察到的對肉毒桿菌毒素之靈敏度較在37.0℃時之靈敏度增加至近乎2倍。利用一具有一小於250mOSm之滲透壓但其它方面相同的細胞培養基實施相似之研究，其結果顯示於圖3B。39.0℃時之對肉毒桿菌毒素之靈敏度較37.0℃時之對肉毒桿菌毒素靈敏度增加至近乎7倍。令人意外地，降低之滲透壓在37℃時具有相對小的影響，且實際上降低了35℃時的靈敏度，表示降低之滲透壓與升高之溫度之間的一協同交互作用。
如圖4A所示，升高之溫度的靈敏度增加效果在一狹窄的溫 度範圍內發生。當與較低溫度比較時，在一升高之溫度下實施的基於細胞的檢測方法之螢光數據顯示在41.0℃時該構成物之一螢光蛋白的一信號損失，其可表示不佳的細胞健康狀況。如圖4B所示，轉染細胞在亮視野顯微鏡術及螢光顯微鏡術下之影像確認了41.0℃時不佳的細胞健康狀況。該轉染細胞在41.0℃時顯示不佳的形態(亮視野)與全面的減少及在41.0℃時該構成物之報導蛋白(黃色螢光蛋白)之擴散(diffusion)。
圖5顯示溫度效應的選擇性。以上所示之溫度研究描述了使 用A型肉毒桿菌神經毒素及表現一可被A型肉毒桿菌神經毒素切割之構成物的轉化細胞(transformed cells)之結果。A型肉毒桿菌神經毒素及E型肉毒桿菌神經毒素皆切割位於SNAP-25內之位置，而一包含SNAP-25或含有這些切割位置之部分SNAP-25的報導構成物可能可用於偵測A型肉毒桿菌神經毒素及E型肉毒桿菌神經毒素其中之一。圖5顯示利用上述BOCELLTM細胞之E型肉毒桿菌神經毒素之基於細胞的檢測方法的結果。 令人意外的，儘管利用相同的細胞及相同的細胞培養基，使用發現對於增加A型肉毒桿菌神經毒素檢測方法靈敏度有效之範圍內之提高的溫度(即39℃)導致對E型肉毒桿菌神經毒素之靈敏度下降(顯示為一升高的EC50值)。這顯示溫度效應可對特定的肉毒桿菌神經毒素有選擇性。
鈉離子效應。 如圖6A所示，研究結果顯示降低氯化鈉(NaCl)濃度之影響。製備一不含添加之氯化鈉的訂製基礎細胞培養基。藉由添加不同濃度之氯化鈉製備該訂製基礎培養基之變化，且使用BOCELL細胞以實施A型肉毒桿菌毒素之基於細胞的檢測方法。細胞在施加含有所示濃度之A型肉毒桿菌神經毒素的培養基前培養3小時。在細胞與A型肉毒桿菌神經毒素接觸後48小時記錄該細胞表現之該構成物的該螢光團(即黃色螢光蛋白及青色螢光蛋白)之螢光。氯化鈉之最高濃度(48mM)代表習知基礎細胞培養基之NaCl含量。如圖所示，氯化鈉濃度之降低產生一靈敏度的顯著增加(以降低之EC50值表示)，在缺乏添加之氯化鈉時，最終導致一接近50倍之靈敏度增加。
圖6B顯示在無A型肉毒桿菌神經毒素時降低的氯化鈉濃度對細胞形態(亮視野)之影響，及在無A型肉毒桿菌神經毒素與A型肉毒 桿菌神經毒素出現48小時後，該轉化細胞內該構成物(黃色螢光蛋白)之分布。沒有證據顯示在細胞培養基中不同的氯化鈉濃度下細胞形態或該構成物分布之改變。
圖7顯示改變細胞培養基之氯化鈉含量的影響。製備一不含 添加之氯化鈉的訂製基礎細胞培養基。藉由添加不同濃度之氯化鈉製備該訂製基礎培養基之變化，且使用BOCELL細胞以實施A型肉毒桿菌毒素之基於細胞的檢測方法。基礎培養基含有48.3mM氯化鈉，其代表該習知基礎培養基之氯化鈉濃度。細胞與含有所示濃度之A型肉毒桿菌神經毒素的培養基培養48、72及96小時。在細胞與A型肉毒桿菌神經毒素接觸後48小時記錄該細胞表現之該構成物的該螢光團(即黃色螢光蛋白及青色螢光蛋白)之螢光。氯化鈉之最高濃度(48mM)代表該基礎細胞培養基之習知NaCl含量。如圖所示，氯化鈉濃度對該基於細胞之檢測方法的時間選擇具有很小的影響。
圖8A、8B及8C顯示導入低鈉含量培養基之時間選擇對基 於細胞之肉毒桿菌神經毒素檢測方法之靈敏度的影響之典型研究結果。圖8A顯示帶有適當報導構成物之細胞在暴露至低鈉含量基礎培養基中一濃度之A型肉毒桿菌神經毒素4小時或24小時前，培養在一具有習知鈉含量之基礎培養基中(即預培養)之結果。在這些時間過後，將該些細胞移轉至一具有習知鈉含量且含有一對應濃度之A型肉毒桿菌神經毒素的基礎培養基，使得暴露至A型肉毒桿菌神經毒素的總時間為48小時。亦將細胞暴露至在低鈉含量基礎培養基中之A型肉毒桿菌神經毒素整整48小時以提供一對照條件。圖8B顯示使用該低鈉含量基礎培養基進行預培養而實施相似研究之典型結果。應當理解的是，用於細胞預培養之培養基對於細胞沒有可識別的影響，表示使用低鈉含量培養基進行細胞預培養係不必要的。
預培養的影響亦於如圖8C所示之研究中被檢驗，且圖8C 顯示了典型之結果。將細胞以一補充習知鈉含量培養基(培養基A)或一低鈉含量訂製培養基(培養基B)進行預培養。接著，在與肉毒桿菌神經毒素接觸前，以一非補充習知鈉含量培養基(培養基C)或該低鈉含量訂製培養基其中之一短暫地沖洗細胞。如圖所示，在低鈉含量培養基中預培 養對於產生該增加的肉毒桿菌神經毒素靈敏度係不必要的。
相對離子(Counterion)效應 。用於本發明概念之一基於細 胞之肉毒桿菌神經毒素檢測方法之該細胞培養基的鈉含量可藉由調整其他非氯化鈉之鈉鹽類的濃度來控制。如圖9A所示，降低一基礎培養基之碳酸氫鈉(NaHCO3)含量亦對增加一基於細胞之肉毒桿菌神經毒素檢測方法的靈敏度有效。如圖9B所示，如同用氯化鈉，對於相對小之鈉含量變化而觀察到靈敏度的巨大增進。
離子強度及滲透壓效應 。自用於一基於細胞之肉毒桿菌神經 毒素檢測方法的培養基移除鈉之影響並非係由於離子強度之改變。圖10顯示研究的典型結果，其中一系列訂製培養基具有習知的(即70%)及降低的(即25%)鈉含量且以相同濃度之鉀取代鈉。雖然一基於細胞之肉毒桿菌神經毒素檢測方法之靈敏度增加係明顯透過鈉濃度之降低，而當以鉀取代鈉且隨後濃度降低並未觀察到一相似之增加。因此，該效應與離子強度無關且可視為離子專一性(ion-specific)及/或離子選擇性(ion-selective)。
圖11顯示補充非離子物質於低鈉含量培養基以增加離子強 度之結果。基於細胞之肉毒桿菌神經毒素檢測方法在一含有48mM氯化鈉(70%神經基礎培養基(Neurobasal)，總[Na+]=53mM)之培養基中、一含有0mM氯化鈉(70%訂製0mM氯化鈉，總[Na+]=19mM)之培養基中及一含有0mM氯化鈉且補充蔗糖(sucrose)或氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide,TMAO)其中之一之培養基中實施。蔗糖及氧化三甲胺皆通常用於調整滲透壓。儘管調整該滲透壓至相當於48mM氯化鈉，藉由降低培養基中之鈉產生之靈敏度增進仍會保持。因此，降低利用於基於細胞之肉毒桿菌神經毒素檢測方法的培養基中之鈉含量的效果與滲透壓無關。
低鈉含量培養基之機轉研究 。藉由使用低鈉含量培養基增加 基於細胞之肉毒桿菌神經毒素檢測方法的靈敏度可牽涉各種機轉。圖12A顯示針對在低鈉含量培養基中阻斷細胞表面受體媒介之細胞肉毒桿菌神經毒素攝入之研究所得之典型結果。在暴露該些細胞至該完整的A型肉毒桿菌神經毒素全毒素前，以一重組的A型肉毒桿菌神經毒素重鏈片段(HcR/A,1μM)處理該些細胞。該些A型肉毒桿菌神經毒素重鏈片段結合至與全毒 素相同之細胞表面受體，但缺乏蛋白質水解活性且無法切割該偵測構成物。如圖所示，阻斷這些受體位置可有效地阻斷該A型肉毒桿菌神經毒素全毒素之毒性作用，當應用於具有所有但高的全毒素濃度之低鈉含量培養基。
該重組的A型肉毒桿菌神經毒素輕鏈片段(Lc/A)保留了 該A型肉毒桿菌神經毒素全毒素之蛋白質水解活性，但缺乏結合至用於全毒素內化作用之該細胞表面受體之能力。圖12B顯示在低鈉含量培養基中細胞之A型肉毒桿菌神經毒素輕鏈的內化作用之研究典型結果。如圖所示，重組的A型肉毒桿菌神經毒素輕鏈片段對於這些細胞具有極微之影響，表示非專一性胞吞作用並非為在低鈉含量培養基觀察到的靈敏度增加之主要因素。
對本領域技術人員來說，除了已經描述的之外有更多修改是可能的且不偏離本發明概念係顯而易見的。因此，本發明標的並不被限制，除了在所附之申請專利範圍之精神中。此外，在解釋說明書及申請專利範圍兩者時，所有技術用語應以與上下文一致之最廣的可能方法解釋。特別是“包含”及“包括”這兩個詞應解釋為係指要素、組件或一非排他性方法之步驟，表示該提及之要素、組件或步驟可存在或被利用，或是與其他未被明確提及之要素、組件或步驟結合。其中，該說明書之申請專利範圍提及一第一步驟及一第二步驟，該文應解釋為是指該第一步驟及第二步驟可以以任何順序來實施，而非該申請專利範圍需要兩個要素都應存在或為按該順序之兩個要素。其中，該說明書之申請專利範圍提及某物的至少其中之一係選自由A、B、C...及N所組成之群組，該文應解釋為僅需要該群組中之一要素，而非A加N、或B加N等等。同樣地，本發明標的被認為包括所揭露之要素的所有可能組合。因此，若一實施例包含要素A、B及C，而一第二實施例包含要素B及D，則本發明標的亦被認為包括A、B、C及D之其他剩餘組合，即使未明確地揭露。

Claims (21)

  1. 一種增加一肉毒桿菌毒素之基於細胞的偵測之靈敏度的方法，包括：(i)提供一轉染細胞，其可產生一構成物，包括：(a)一第一端，包括一含有報導蛋白部分，其中該含有報導蛋白部分顯示一信號；及(b)一切割位置，與該肉毒桿菌毒素發生一交互作用，該交互作用係指自該構成物之一其餘部分產生該含有報導蛋白部分之一斷裂，其中該肉毒桿菌毒素係一肉毒桿菌血清型A神經毒素全毒素；(ii)在一自38℃至41℃之毒素暴露溫度下，將該轉染細胞暴露至該肉毒桿菌毒素，其中在該毒素暴露溫度下，該轉染細胞對該肉毒桿菌毒素之反應的靈敏度較該轉染細胞在37℃對該肉毒桿菌毒素之靈敏度增加至少兩倍；及(iii)自該含有報導蛋白部分獲取該信號。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該轉染細胞係選自由一神經細胞、一神經內分泌腫瘤細胞、一雜交細胞及一幹細胞所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該含有報導蛋白部分包括一第一螢光團。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該構成物更包括一第二螢光團。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該第二螢光團位於接近該構成物之一第二端。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該第一螢光團及該第二螢光團顯示小於5%佛斯特共振能量轉移。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該溫度係介於38.5℃與39.5℃之間。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，包括在暴露至該肉毒桿菌毒素前將該轉染細胞暴露至一毒素前溫度之額外的步驟。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該細胞之該毒素前溫度係介於38.0℃與41.0℃之間。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該細胞之該毒素前溫度係介 於38.5℃與39.5℃之間。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中相較於在37℃下該轉染細胞對該肉毒桿菌毒素之靈敏度，該轉染細胞在該毒素暴露溫度下對該肉毒桿菌毒素之反應的靈敏度增加至少五倍。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該轉染細胞之反應的靈敏度增加係選擇性對於A型肉毒桿菌毒素(BoNT/A)。
  13. 一種增加一肉毒桿菌毒素之基於細胞的偵測之靈敏度的方法，包括：(i)在一具有一大於48mM之鈉濃度的第一培養基中提供一轉染細胞，其可產生一構成物，包括：(a)一端，包括一含有報導蛋白部分，其中該含有報導蛋白部分顯示一信號；及(b)一切割位置，與該肉毒桿菌毒素發生一交互作用，該交互作用係指自該構成物之一其餘部分產生該含有報導蛋白部分之一斷裂；(ii)將該轉染細胞移轉至一第二培養基，其具有相對於該第一培養基而言一較低之鈉濃度，其中該第二培養基具有一小於48mM之鈉濃度；(iii)將該轉染細胞與該肉毒桿菌毒素接觸，其中該肉毒桿菌毒素係一肉毒桿菌血清型A神經毒素全毒素；及(iv)自該含有報導蛋白部分獲取該信號，其中相較於當該轉染細胞在該第一培養基就與該肉毒桿菌毒素接觸的該轉染細胞對該肉毒桿菌毒素之靈敏度，在移轉至該第二培養基之後的該轉染細胞對該肉毒桿菌毒素之反應的靈敏度係增加的。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該第二培養基具有一小於45mM之鈉濃度。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中對於該肉毒桿菌毒素之靈敏度相對於其中該轉染細胞係在該第一培養基之一基於細胞的偵測方法增加至少10倍。
  16. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該轉染細胞在該第二培養基中與該肉毒桿菌毒素接觸且不在該第二培養基中預培養。
  17. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該第二培養基中之該鈉濃度 之降低係藉由降低一神經基礎培養基之氯化鈉含量。
  18. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該第二培養基中之該鈉濃度之降低係藉由降低一神經基礎培養基之碳酸氫鈉含量。
  19. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該第二培養基具有一生理滲透強度。
  20. 一種用於增進一肉毒桿菌毒素之基於細胞的偵測之靈敏度的套組，包括：一第一培養基，包括一濃度為小於或等於48mM之鈉；及一第二培養基，包括一非零濃度之一肉毒桿菌毒素及一濃度為小於或等於該第一培養基之該濃度之鈉。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之套組，其中該第一培養基及該第二培養基具有一生理滲透強度。
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