KR20210047982A - 개선된 민감성을 지닌 보툴리눔 독소 검정 - Google Patents

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Abstract

리포터-함유 부분 및 보툴리눔 독소 절단 부위를 갖는 하이브리드 단백질을 생산하는 트랜스펙션된 세포가 상승된 온도에서 및/또는 감소된 소듐 농도를 갖는 배지에서 보툴리눔 독소와 접촉하는 방법 및 조성물이 제공된다. 그러한 배지 및 보툴리눔 독소를 포함하는 키트가 또한 기재된다.

Description

개선된 민감성을 지닌 보툴리눔 독소 검정{BOTULINUM TOXIN ASSAY WITH IMPROVED SENSITIVITY}
본 출원은 2013년 8월 9일 출원된 미국 가특허 출원 61/864,436호의 우선권의 이익을 주장한다. 상기 및 본원에 기재된 모든 다른 외부 자료는 그 전문이 참조로서 포함된다. 포함된 참고문헌에서의 용어의 정의 또는 이용이 본원에서 제공된 용어의 정의와 불일치하거나 반대되는 경우, 본원에 제공된 용어의 정의를 이용하고 참고문헌에서의 용어의 정의는 이용하지 않는다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 보툴리눔 독소에 관한 프로테아제 검정이다.
보툴리눔 신경독 (BoNT)은 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)에 의해 생성되며, 그 중 가장 강력한 독소로 알려져 있다. 이러한 독소는 종종 심각한 피해나 심지어 피해자의 사망을 발생시키는, 식중독의 널리 알려진 원인이다. 7개의 구조적으로 관련된 보툴리눔 신경독 또는 혈청형 (BoNT/A-G)이 존재하며, 이들 각각은 중쇄 (~100 KD) 및 경쇄 (~50KD)로 구성된다. 중쇄는 수용체-매개된 세포내이입을 통해 표적 세포로의 독소 진입을 매개한다. 일단 내재화되면, 경쇄는 엔도솜 소포 루멘으로부터 세포질로 전위되고, 소포-표적 막 융합을 매개하는 단백질 ("기질 단백질")을 절단하는 아연-의존성 프로테아제로서 작용한다.
이러한 BoNT 기질 단백질은 형질막 단백질 신탁신(syntaxin), 표면막(peripheral membrane) 단백질 SNAP-25, 및 소포막 단백질 시냅토브레빈(synaptobrevin)(Syb)을 포함한다. 이러한 단백질은 총괄적으로 SNARE (가용성 N-에틸말레이미드-민감성 인자 부착 단백질 수용체) 단백질로서 언급된다. SNARE 단백질의 절단은 형질막과의 소포 융합을 차단하고 신경근 이음부에서의 신경전달물질 방출을 폐지한다. SNARE 단백질 중에서, 신탁신 및 SNAP-25는 일반적으로 표적 막 상에 존재하며, 따라서 t-SNARE로서 언급되는 한편, 시냅토브레빈은 시냅스 내의 시냅스 소포와만 배타적으로 발견되며 v-SNARE라 불린다. 더불어, 이러한 3개의 단백질은 소포막과 형질막 사이의 융합을 매개하는 최소한의 장치로 생각되는 복합체를 형성한다. 단일하지만 상이한 부위에서, BoNT/A, E, 및 C는 SNAP-25를 절단하고, BoNT/B, D, F, 및 G는 시냅토브레빈 (Syb)을 절단한다. BoNT/C는 또한 SNAP-25 외에 신탁신을 절단한다.
식중독의 원인, 및 생물테러 무기로서의 이들의 위협으로 인해, BoNT를 민감하고 신속하게 검출할 필요가 있다. 현재, 독소를 검출하는 가장 민감한 방법은 마우스에서 독성 검정을 수행하는 것이다. 그러한, 이러한 방법은 상당한 비용을 수반하고 동물 시험에 관한 규정이 적용된다.
결과적으로, BoNT 특성화를 위한 동물-기반 방법의 대안을 개발하는 것에 관심이 증가하고 있다. 매력적인 대안은 세포-기반 검정의 이용이며, 이러한 검정은 통상적인 시험관내 검정에 일반적으로 부재하는 수용체-기반 내재화 및 BoNT 분자의 후속 절단을 유지한다. 그러한 세포-기반 검정은 BoNT에 반응성인 작제물을 발현시키는 세포를 활용하고, 일부 예에서 포스터(Foerster) 공명 에너지 전이 (FRET)를 이용하며, 다른 예에서, BoNT의 검출 및 특성화에 유용한 형광성을 제공하는 비-FRET 방법을 활용한다. 예들은 미국특허출원 2004/0,191,887호 (Chapman), 미국특허출원 2006/0,134,722호 (Chapman), 미국특허출원 7,208,285호 (Steward), 미국특허출원 7,183,066호 (Fernandez-Salas), 및 미국특허출원 2011/0,033,866호 (Atapattu)호에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 그러나, 일부 출원의 경우, 그러한 세포-기반 방법의 민감성이 부족할 수 있다. 예를 들어, 미국특허출원 2006/0,134,722호 (Chapman)는 BoNT를 검출하는 세포 기반 FRET 검정의 EC50 값이 ≥10 pM 범위라고 기재한다.
국제특허출원 WO 2014/060373호 (Eisele)는 뉴런 세포로의 분화를 위해 프라이밍된(primed) 특정 종양 세포가 독소에 노출되기 전 수 일 내지 수 주 동안 낮은 오스몰농도의 분화 배지에서 분화되도록 함에 의한 보툴리눔 독소로의 중독에 대한 세포의 민감성의 향상을 보고하였다. 민감성은 처리된 세포의 용해 이후에 SNAP-25에 대해 유도된 웨스턴 블롯 방법에 의해 결정되었다. 정량적인 방법으로서 웨스턴 블롯팅의 유용성은 논쟁의 여지가 있지만, 보고된 차이의 통계적 유의성을 입증하는 데이터는 제공되지 않았다.
비록 BoNT의 검출에 FRET 검정을 적용함에 있어서 일부 성공이 입증되었으나, BoNT에 대한 FRET 검정의 민감성은 많은 목적을 위해 여전히 바람직하지 않았다. 40 나노그램만큼 적은 양의 BoNT가 대부분의 사람에게 치사량이고, BoNT를 함유할 것으로 의심되는 샘플은 종종 시험 공정에 적용되기 전이다. 따라서, 낮은 농도의 BoNT를 검출하는 방법을 갖는 것이 매우 요망된다.
보툴리눔 독소에 대한 세포-기반 검정에서 증가된 민감성을 제공하는 방법 및 조성물을 제공하고자 한다.
발명의 개요
보툴리눔 독소에 대한 세포-기반 검정에서 증가된 민감성을 제공하는 방법 및 조성물이 기재된다. 보툴리눔 독소에 반응성인 리포팅 작제물을 발현시키는 세포가 제공된다. 통상적인 온도 및 배지 조성에 비해 보툴리눔 독소에 대한 트랜스펙션된 세포 반응의 증가된 민감성을 제공하는 온도 및 배지 조성이 확인되었다.
본 발명의 개념의 한 구체예는 하이브리드 단백질을 발현시키는 트랜스펙션된 세포를 제공함에 의해 보툴리눔 독소 (예를 들어, BoNT/A)의 세포-기반 검출의 민감성을 증가시키는 방법이고, 여기서 하이브리드 단백질은 리포터-함유 부분 (예를 들어, 하이브리드 단백질의 말단에 또는 말단 가까이에) 및 절단 부위를 포함하고, 절단 부위는 하이브리드 단백질의 나머지로부터 리포터-함유 부분 (예를 들어, 형광단을 함유하는 부분)을 방출시키기 위해 보툴리눔 독소에 의해 절단된다. 적합한 세포는, 뉴런, 신경내분비 종양, 하이브리드, 및 줄기 세포를 포함한다. 이러한 공정에서 트랜스펙션된 세포는 보툴리눔 독소로의 노출 동안 38℃ 내지 41℃ 또는 38.5℃ 내지 39.5℃의 온도에 노출되어, 37℃에서의 보툴리눔 독소에 대한 세포의 민감성에 비해 보툴리눔 독소에 대한 세포의 민감성에서의 적어도 2배 증가를 발생시킨다. 일부 구체예에서, 민감성 향상은 BoNT/A에 선택적이다. 대안적으로, 일부 구체예에서, 트랜스펙션된 세포는 보툴리눔 독소로의 노출 이전에 사전-독소 온도 (예를 들어, 38℃ 내지 41℃ 또는 38.5℃ 내지 39.5℃)에 노출된다. 일부 구체예에서, 하이브리드 단백질은 리포터-함유 부분의 형광단에 추가하여 제 2 형광단을 포함하고, 상기 제 2 형광단은 리포터-함유 부분의 것과 상이한 하이브리드 단백질의 말단에 위치할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 그러한 형광단은 포스터 공명 에너지를 통한 현저하지 않은 (즉 ≤5%) 에너지 전이가 형광단들 사이에 발생하도록 배열된다.
본 발명의 개념의 또 다른 구체예는 하이브리드 단백질을 발현하는 트랜스펙션된 세포를, 65mM 초과의 소듐 농도를 갖는 제 1 배지에 제공함에 의해 보툴리눔 독소의 세포-기반 검출의 민감성을 증가시키는 방법이고, 여기서 하이브리드 단백질은 리포터-함유 부분 (예를 들어, 하이브리드 단백질의 말단에 또는 말단 가까이에) 및 절단 부위를 포함하고, 절단 부위는 하이브리드 단백질의 나머지로부터 리포터-함유 부분 (예를 들어, 형광단을 함유하는 부분)을 방출시키기 위해 보툴리눔 독소에 의해 절단된다. 그 후 세포는 50 mM 미만 (예를 들어, 45 mM 미만)의 소듐 농도를 갖는 제 2 배지로 옮겨지고, 제 2 배지에서 보툴리눔 독소와 접촉한다. 일부 구체예에서, 트랜스펙션된 세포는 제 2 배지로의 운반시에 보툴리눔 독소에 노출된다 (즉, 제 2 배지에서의 예비-인큐베이션 없음). 그 후, 하이브리드 단백질의 리포터-함유 부분으로부터 신호를 획득한다. 그러한 방법에서, 보툴리눔 독소에 대한 트랜스펙션된 세포의 민감성은, 세포가 제 1 배지 (즉, 적어도 65 mM의 소듐 농도를 갖는 배지)에 유지되어 보툴리눔 독소에 노출되는 방법에 비해 10배 이상 증가될 수 있다. 제 2 배지에서의 소듐 농도는, 예를 들어 소듐 클로라이드 및/또는 소듐 바이카르보네이트의 농도를 감소시킴에 의해, 신경기본 배지의 소듐 함량에서의 감소에 의해 감소될 수 있다. 일부 구체예에서, 제 1 배지, 제 2 배지, 또는 둘 모두는 생리학적 삼투 강도를 지닐 수 있다. 다른 구체예에서, 제 1 배지, 제 2 배지, 또는 둘 모두는 생리학적 삼투 강도 미만의 삼투 강도, 예를 들어 250 mOsm 이하를 지닐 수 있다.
본 발명의 개념의 여전히 또 다른 구체예는 보툴리눔 독소에 대한 세포-기반 검정의 민감성을 개선시키기 위한 키트이며, 여기서 키트는 상기 기재된 민감성 향상 배지에 둘 이상의 상이 농도로 공급되는 보툴리눔 독소를 함유하는 표준 세트를 포함한다. 그러한 키트는 상기 배지에 0이 아닌 농도의 보툴리눔 독소를 함유하는 둘 이상의 제조물을 포함할 수 있고, 일부 구체예에서 블랭크(blank) 또는 제로(즉, 배지만) 제조물을 포함할 수 있다. 그러한 키트는 샘플 중 보툴리눔 독소를 정량하기에 유용한 용량/반응 곡선을 작도 및/또는 검증하는데 (예를 들어, 검량선의 작도 또는 메모리에 저장된 검량선에 비해 검정 성능의 입증에) 이용될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1a, 1b, 및 1c는 다양한 온도에서 보툴리눔 독소 및 이의 단편에 대한 트랜스펙션된 세포의 반응을 도시한다. 도 1a는 다양한 온도에서 보툴리눔 홀로톡신에 대한 트랜스펙션된 세포의 반응을 도시한다. 도 1b는 다양한 온도에서 보툴리눔 홀로톡신 또는 보툴리눔 독소의 경쇄에 대한 트랜스펙션된 세포의 반응을 도시한다. 도 1c는 다양한 온도에서 보툴리눔 독소의 중쇄의 존재하에 보툴리눔 홀로톡신에 대한 트랜스펙션된 세포의 반응을 도시한다.
도 2는 다양한 사전-독소 노출 (즉, 배양) 온도 및 독소 노출 (즉, 검정) 온도에서 보툴리눔 독소에 대한 트랜스펙션된 세포의 반응을 도시한다.
도 3A 및 3B는 다양한 온도에서 보툴리눔 독소에 대한 트랜스펙션된 세포의 반응에 대한 배지 이온 강도의 효과를 도시한다. 도 3A는 270mM의 이온 강도를 갖는 배지에서 트랜스펙션된 세포의 반응을 도시한다. 도 3B는 250mM의 이온 강도를 갖는 배지에서 보툴리눔 독소에 대한 트랜스펙션된 세포의 반응을 도시한다.
도 4A 및 4B는 보툴리눔 독소에 대한 그리고 보툴리눔 독소의 부재하에 트랜스펙션된 세포의 반응에 대한 상승된 온도의 효과를 도시한다. 도 4A는 41℃ 이하의 온도에서 보툴리눔 독소에 대한 트랜스펙션된 세포의 반응을 도시한다. 도 4B는 보툴리눔 독소의 부재하에 41℃ 이하의 온도에서 트랜스펙션된 세포의 반응의 명시야(brightfield) 및 형광 현미경사진을 도시한다.
도 5는 BoNT/E 독소에 대한 세포-기반 검정에 대한 증가된 온도의 효과를 도시한다.
도 6a 내지 6c는 보툴리눔 독소에 대한 세포-기반 검정에 대한 감소된 소듐 농도를 지닌 배지의 효과를 도시한다. 도 6a는 다양한 농도의 NaCl이 첨가된 독점 배지의 사용의 효과를 도시한다. 도 6b는 다양한 농도의 NaCl을 함유한 맞춤 배양 배지에 노출된 트랜스펙션된 세포의 현미경사진을 도시한다.
도 7은 다양한 소듐 농도를 지닌 배지에서 그리고 독소로의 노출 후 상이한 시점에 보툴리눔 독소에 대한 트랜스펙션된 세포의 반응을 도시한다.
도 8a, 8b, 및 8c는 정상 소듐 농도를 복구하기 전 상이한 길이의 시간 동안 감소된 소듐 함량을 갖는 배지에서 보툴리눔 독소에 대한 트랜스펙션된 세포의 노출 결과를 도시한다. 도 8a는 트랜스펙션된 세포가 보툴리눔 독소로의 노출 전에 통상적인 배지에서 배양되는 경우의 효과를 도시한다. 도 8b는 트랜스펙션된 세포가 보툴리눔 독소로의 노출 전에 낮은 소듐 함량 배지에서 배양되는 경우의 효과를 도시한다.
도 9A 및 9B는 보툴리눔 독소에 대한 세포-기반 검정에 이용된 배지에서 소듐 바이카르보네이트 농도를 감소시킨 효과를 도시한다. 도 8a는 다양한 농도의 소듐 바이카르보네이트를 지닌 배지에서 용량/반응 곡선을 도시한다. 도 8b는 배지 중 소듐 바이카르보네이트 농도의 함수로서 상기 용량/반응 곡선으로부터 계산된 EC50에 대한 효과를 도시한다. 도 8c는 낮은 소듐 함량 배지에서 보툴리눔 독소에 대한 세포-기반 검정의 수행 전에 통상적인 배지 또는 감소된 소듐 함량을 갖는 배지와의 예비-인큐베이션의 효과를 도시한다.
도 10은 보툴리눔 독소에 대한 세포-기반 검정에 이용된 맞춤 배지에서, 그리고 그러한 배지 중 소듐 및 포타슘 농도의 감소에 있어서, 소듐을 포타슘으로 대체시킨 효과를 도시한다.
도 11은 보툴리눔 독소에 대한 세포-기반 검정에 이용된 낮은 소듐 함량 배지의 오스몰농도를 증가시킨 효과를 도시한다.
도 12A 및 12B는 감소된 소듐 함량을 갖는 배지에서 트랜스펙션된 세포에 대한 보툴리눔 독소 단편 및 무손상 보툴리눔 홀로톡신의 효과를 도시한다. 도 12A는 홀로톡신으로의 노출 전에 트랜스펙션된 세포에 재조합 보툴리눔 독소 중쇄를 첨가시킨 효과를 도시한다. 도 12B는 트랜스펙션된 세포에 재조합 보툴리눔 독소 경쇄를 첨가시킨 효과 및 트랜스펙션된 세포에 무손상 보툴리눔 홀로톡신을 첨가시킨 효과를 도시한다.
상세한 설명
본 발명의 주제는 세포-기반 보툴리눔 독소 검정에 이용된 세포 배양 배지의 소듐 이온 농도 및/또는 세포-기반 보툴리눔 검정이 수행되는 온도가 향상된 민감성을 지닌 보툴리눔 검정을 제공하기 위해 이용되는 방법을 제공한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 세포 배양 배지 중 소듐 이온 농도에서의 감소가 이온 및 보툴리눔-독소 특이적인 방식으로 보툴리눔 독소의 민감성을 향상시킨다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 용량/반응 곡선에 의해 정의된 대로, 상기 검정의 민감성이 급격하게 향상되는 좁은 온도 범위를 확인하였다.
본 발명의 주제는 보툴리눔 독소 (BoNT)의 존재를 검출하기 위한 세포-기반 방법의 민감성을 개선시키는 방법을 제공한다. 이러한 프로테아제에 의해 절단가능한 검출성 작제물을 발현시키는 트랜스펙션된 세포를 이용한 보툴리눔 독소에 대한 다양한 검정이 개발되어 왔다. 세포-기반 검정에서, 세포 표면 수용체에 의한 보툴리눔 독소의 중쇄의 특이적 결합에 이어 보툴리눔 독소의 경쇄에 의한 보툴리눔 독소-특이적 절단 부위를 포함하는 작제물의 특이적 절단 및 작제물로부터 지표 모이어티 (예를 들어, 형광 단백질)의 후속 방출은 높은 수준의 특이성을 제공한다. 그러나, 종래의 방법은 이러한 검정의 중요한 응용에 필요한 민감성, 예를 들어 환경 시험이 결여되었다. 이는 생화학무기와 같은 보툴리눔 독소의 잠재적인 사용을 고려할 때 특히 중요하다.
문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 본원에 개시된 모든 범위는 이들의 종말점을 포함하는 것으로 해석되어야 하고, 개방형 범위는 단지 상업적 실제 값을 포함하도록 해석되어야 한다. 유사하게, 모든 수치 리스트는 문맥에서 달리 지시하지 않는 한 중간 값을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
세포-기반 검정은 생리학적 이온 농도, 오스몰농도 (즉, 250-270 mOsm), 및 생리학적 수준에서 유지되는 온도를 이용하는 엄격하게 제어된 환경을 필요로 한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 배양 배지의 소듐 이온 농도를 감소시키는 것이 일부 세포-기반 BoNTM 검정의 민감성에서 급격한 증가를 제공함을 발견하였다. 이러한 효과는 포타슘 이온으로는 나타나지 않고, 세포 배양 배지의 오스몰농도에서의 변화의 결과가 아니며, 특정 유형의 보툴리눔 독소로는 관찰되지 않는다. 본 발명자들은 또한 검정이 수행되는 온도를 최대 4℃만큼 상승시키는 것이 검정의 과정을 통해 세포 생존력에 영향을 주지 않으며, 그러한 검정의 민감성에서 급격한 증가를 발생시킴을 발견하였다. 유사하게, 세포 배지의 오스몰농도를 감소시키는 것이 또한 민감성의 증가를 발생시켰다. 이러한 방법은 특수 장비의 필요없이 채용될 수 있고, 실현된 증가된 민감성은 이러한 고도로 특이적인 보툴리눔 독소 검정에 대한 응용 범위를 확대시킨다.
본 발명의 개념의 방법은 트랜스펙션된 세포를 제공하며, 이는 다시 작제물 또는 융합 단백질을 생성시킨다. 하이브리드 단백질을 발현시키는 트랜스펙션된 세포에 관해, 세포는 안정하게 트랜스펙션되는 것이 일반적으로 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 일시적인 트랜스펙션이 또한 고려된다. 또한 추가로 트랜스펙션된 세포가 뉴런 세포인 것이 전형적으로 바람직하다. 그러나, 다수의 다른 비-뉴런 세포 (포유동물 세포, 곤충 세포, 효모, 박테리아, 및 인공 세포 포함)가 또한 본원에서 고려된다. 가장 전형적으로, 세포는 따라서 적절한 조절 엘리먼트 하에 하이브리드 단백질(들)을 항시적으로 발현시킬 것이다. 대안적인 양태에서, 발현은 또한 유도성일 수 있다.
본 발명을 위한 숙주 세포로서 세포주의 많은 선택이 적합하다. 바람직하게는, 세포는 개개의 보툴리눔 독소 (BoNT)가 이의 독성 활성을 나타내는 타입의 세포이다. 다시 말해, 세포는 바람직하게는 적합한 세포 표면 수용체를 나타내거나, 그렇지 않으면 독소가 세포에 충분히 효율적으로 전위되는 것을 가능하게 하고, 독소가 적합한 기질 폴리펩티드를 절단하는 것을 허용한다. 특수한 예는 일차 배양된 뉴런 (예컨대, 피질 뉴런, 해마 뉴런, 척수 운동 뉴런 등); PC12 세포 또는 PC12 세포로부터 유래된 세포주; 일차 배양된 크롬친화 세포; 배양된 신경모세포종 세포주 (예컨대 뮤린 콜린성 Neuro2A 세포주), 인간 아드레날린성 SK-N-SH 세포주, NS-26 세포주, 및 줄기 세포 (예컨대, 문헌[Foster and Stringer (1999), Genetic Regulatory Elements Introduced Into Neural Stem and Progenitor Cell Populations, Brain Pathology 9: 547-567]을 참조하라)를 포함한다. 유사하게, 신경내분비 및 신경내분비-유래 세포주를 이용할 수 있다. 그러나, 비-뉴런 세포 타입에 대해 유도된 재조합 또는 돌연변이된 BoNT의 경우, 그 숙주 세포는 상응하는 특이성을 지닌 세포주로부터 선택될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명의 개념의 작제물 또는 융합 단백질은 리포터-함유 부분 및 절단 부위를 포함할 수 있다. 절단 부위는 보툴리눔 독소 경쇄와 관련된 프로테아제 활성에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 그러한 트랜스펙션된 세포는 안정한 형질전환 또는 일시적인 형질전환을 나타낼 수 있다. 절단 부위의 절단은 작제물의 나머지로부터 리포터-함유 부분의 적어도 일부를 방출시킨다. 리포터 영역은 관찰가능한 형광성을 제공하는 형관단과 같은, 관찰가능한 리포팅 그룹 또는 태그를 포함할 수 있다. 적합한 형광단은 형광 염료를 포함하고, 형광 단백질, 예컨대 그린 형광 단백질 (GFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 옐로우 형광 단백질 (YFP), 시트린(Citrine), 비너스(Venus), YPet, mStrawberry, 및/또는 mCherry 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하이브리드 단백질은 다수의 형광단, 예를 들어 제 2 형광단을 포함할 수 있다. 그러한 제 2 형광단은 리포터 영역 내에 또는 원위 위치에 위치할 수 있다. 예를 들어, 리포터 영역의 형광단 (즉, 제 1 형광단)은 하이브리드 단백질의 한 말단에 인접하게 위치할 수 있고, 한편 제 2 형광단은 하이브리드 단백질의 다른 말단에 인접하게 위치할 수 있다. 대안적으로, 제 1 형광단 및 제 2 형광단 둘 모두는 리포터 영역 내에 있을 수 있다. 검출의 특성에 따라서, 제 1 형광단 및 제 2 형광단은 동일한 형광단 종일 수 있거나, 상이한 형광단 종일 수 있다. 예를 들어, FRET 검출을 이용한 검정 시스템에서, 제 1 형광단 및 제 2 형광단은 상이한 형광단 종일 수 있다.
본 발명의 개념의 바람직한 구체예에서, 리포터 영역은 호모-FRET가 상이한 정도로 발생하지 않도록 (즉, 5% 미만의 포스터 공명 에너지 전이) 배열될 수 있는 동일한 종의 하나 이상의 형광단을 포함한다. 다른 구체예에서, 작제물은 FRET가 현저한 정도로 발생하지 않도록 (즉, 5% 미만의 포스터 공명 에너지 전이) 배열될 수 있는 상이한 종의 형광단을 포함할 수 있다. 이는, 예를 들어, 형광단을 작제물의 상이한 말단에 또는 상이한 말단 가까이에 배치시킴에 의해 달성될 수 있다. 그러한 구체예에서, 제 1 형광단의 방출 스펙트럼은 현저한 포스터 공명 에너지 전이 없이 (즉, 5% 미만) 제 2 형광단의 여기 (excitation) 스펙트럼과 중복될 수 있으나, 제 1 형광단의 형광 방출은 켄칭을 통해 현저하게 감소하지 않고 (즉, 5% 미만) 제 2 형광단의 형광 방출은 그러한 에너지 전이를 통해 현저하게 (즉, 5% 초과) 증가하지 않는다. 본 발명의 개념의 다른 구체예에서, 작제물은 제 2 형광단의 여기 스펙트럼과 중복되는 방출 스펙트럼을 갖는 제 1 형광단을 포함할 수 있고, 작제물 내의 형광단의 위치는 형광단들 사이에 유의성 (즉, >5% 포스터 공명 에너지 전이)이 발생하도록 배열되었다. 예를 들어 각각의 형광 종, FRET, 및 형광 이방성으로부터의 직접 여기 및 방출을 포함하는, 본 발명의 개념의 작제물로부터의 형광성은 작제물의 배치에 적합한 임의의 수단에 의해 검출될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 각각의 형광단 종으로부터의 직접 여기 및 방출 검출을 위해 구성된 통상적인 마이크로웰 플레이트 형광계가 이용될 수 있다.
추가적인 보조인자 또는 기질을 필요로 하지 않고 형광을 발하는 그린 형광 단백질 및 이의 돌연변이가 본 발명의 개념의 작제물에 사용하기에 특히 적합하다. 예를 들어, 옐로우 형광 단백질 (YFP)은 애쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria)로부터 유래된 그린 형광 단백질의 돌연변이이고, 514nm에서의 여기 피크 및 527nm에서의 방출 피크를 갖는다. YFP 외에, 또한 관련 시트린, 비너스, 및 YPet 단백질이 리포터-함유 부분에 이용될 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 돌연변이는 감소된 클로라이드 민감성, 더 빠른 성숙화, 및 GFP에 비해 증가된 밝기 (흡광 계수 및 양자 수율의 생성물)를 갖는다. 물론, 본원에서 언급된 임의의 형광 단백질은 특수한 특징 (예컨대, 스펙트럼)을 포함하도록 변형되거나 특정 크기로 트렁케이션될 수 있다. 리포터-함유 부분은 형광 단백질 이외의 리포터를 포함하도록 또한 고려된다 (예컨대, 인광 화합물, 발광 화합물, 발색단, 효소 등).
본 발명의 개념의 일부 구체예에서, 검출 신호는 기준선 신호를 제공하기 위해, 보툴리눔 독소 (BoNT)로의 트랜스펙션된 세포의 노출 이전에 특성화된다. 이러한 기준선 신호는 보툴리눔 독소로의 트랜스펙션된 세포의 노출 이후 획득된 검정 신호와 비교하기 위한 기준이 될 수 있고, 상이한 시험 부위들 간의 세포 수, 밀도, 및/또는 형상에서의 차이를 적어도 부분적으로 교정하기 위해 그러한 검정 신호를 표준화하는 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 노출후 신호 및 기준선 신호 간의 비의 이용은 마이크로웰 플레이트의 상이한 웰에서 수행된 검정들 간의 형광 세기를 표준화하는 역할을 하여, 유사 측정들 간의 편차를 감소시킬 수 있다. 민감성은 전형적으로 S자형인 용량/반응 곡선을 생성하기 위해 다양한 농도의 보툴리눔 독소를 이용한 일련의 검정들을 준비함에 의해 평가될 수 있다. 민감성은 용량 반응 곡선의 소정 부분에 상관하는 반응을 발생시키는 보툴리눔 독소의 농도를 결정함에 의해 정량될 수 있다. 예를 들어, 용량/반응 곡선의 중간값 또는 반-최대 값 (전형적으로 EC50으로서 보고됨)에 상관하는 보툴리눔 농도가 그러한 검정에서 민감성을 비교하기 위한 기준으로서 이용될 수 있다.
세포-기반 검정을 이용하여 보툴리눔 독소에 대한 민감성을 측정하는 다수의 상이한 방법이 이용될 수 있다. 한 구체예에서, FRET 쌍을 형성하지 않는 제 1 형광 단백질 및 제 2 형광 단백질의 방출 비 (즉, FRET을 통한 약 5% 미만의 에너지 전이를 나타냄)가 트랜스펙션된 세포를 보툴리눔 독소에 노출시킨 후 측정될 수 있다. 그러한 구체예에서, 하이브리드를 보툴리눔 독소에 노출시키기 전, 작제물은 기준선 신호를 나타내고, 제 1 형광 단백질 방출 및 제 2 형광 방출은 별도로 측정된다. 보툴리눔 독소로의 노출 후, 제 1 형광 단백질을 포함하는 리포터-함유 부분은 보툴리눔 독소에 의해 절단되고, 절단된 리포터-함유 부분은 후속하여 단백질분해에 의해 분해된다. 그러한 예에서 제 1 형광 단백질의 방출 세기는 감소하는 한편, 제 2 형광 단백질의 방출 세기는 본질적으로 동일하게 유지된다. 따라서 이러한 제 2 형광 단백질로부터 측정된 방출은 세포 수, 밀도, 분포 등의 함수이므로, 보툴리눔 독소의 농도의 함수는 아니다. 이와 같이, 제 2 형광 단백질로부터의 방출을 이용하여, 예를 들어 방출 비를 이용하여, 리포터 영역의 형광단 (이 경우 제 1 형광 단백질)으로부터 측정된 방출을 표준화할 수 있다. 그러한 방출 비는 형광단이 FRET를 수행하도록 배열된 작제물에서 데이터 표준화에 유효하지 않은데, 그 이유는 둘 모두의 형광단으로부터의 방출이 그러한 작제물의 절단시에 변화될 것이기 때문임이 이해되어야 한다. 방출 비 (제 1 형광 단백질 방출/제 2 형광 단백질 방출)는 작제물이 보툴리눔 독소와 상호작용할 때 감소한다. 그러한 구체예에서 적합한 작제물의 예는 CFP 및 YFP가 FRET 쌍을 형성하지 않도록 구성된, 리포터 영역의 외부에 시안 형광 단백질 (CFP)을 포함하고 리포터 영역은 옐로우 형광 단백질 (YFP)을 포함하는 것이다. 보툴리눔 독소로의 노출 후 YFP 분해 정도에 관한 데이터 (즉, 직접적으로, 별도로 여기된 YFP 방출 및 CFP 방출)는 그러한 작제물을 발현시키는 세포로부터 수집될 수 있다. 개개 세포에서의 세포 밀도 및 리포터 발현을 제어하기 위해 그러한 방출은 배경 공제될 수 있고 YFP 방출은 CFP 방출로 나누어질 수 있다.
리포터 영역의 형광단으로부터의 보툴리눔 독소 반응성 방출 또는 방출 비는 샘플 중 보툴리눔 독소를 정량하는데 유용한 용량 반응 곡선을 생성하고/거나 보툴리눔 독소에 대한 검정의 민감성을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 그러한 민감성은 종종 용량/반응 곡선의 특징적인 부분에 상응하는 BoNT의 농도로서 표시된다. 예를 들어, 그러한 곡선의 중간점에 상응하는 BoNT 농도는 EC50으로서 언급된다.
본 발명의 개념의 한 구체예에서, 트랜스펙션된 세포는 세포 배양 및 그러한 검정이 보통 수행되는 온도 (즉, 37.0℃)에 비해 상승된 온도에서 보툴리눔 독소에 노출된다. 그러한 온도는 일반적으로 세포 생존에 최적이 아닌 것으로 고려되고, 이의 이용은 살아 있는 세포의 사용에 의존하는 검정에서 직관에 어긋나는 것임이 이해되어야 한다. 바람직한 구체예에서, 트랜스펙션된 세포가 보툴리눔 독소에 노출되는 온도는 민감성이 37.0℃에서 수행된 검정에 비해 적어도 2배 (즉, 2배만큼) 증가하도록 한다 (즉, 상승된 온도에서 수행된 검정의 EC50은 37.0℃에서 수행된 검정의 EC50의 절반 미만이다). 놀랍게도, 본 발명자들은 그러한 민감성 향상이 비교적 좁은 범위의 온도 내에서 발생함을 발견하였다. 본 발명의 개념의 일부 구체예에서, 트랜스펙션된 세포는 38.0℃ 내지 41.0℃에서 보툴리눔 독소에 노출된다. 본 발명의 개념의 다른 구체예에서, 트랜스펙션된 세포는 38.5℃ 내지 39.5℃의 온도에서 보툴리눔 독소에 노출된다.
대안적으로, 본 발명의 개념의 트랜스펙션된 세포는 보툴리눔 독소로의 노출 전에 37.0℃ 초과, 예를 들어 38.0℃ 내지 41.0℃ 또는 38.5℃ 내지 39.5℃의 온도에서 유지될 수 있다. 그러한 구체예에서, 보툴리눔 독소로의 트랜스펙션된 세포의 노출은 37.0℃에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 일부 구체예에서 트랜스펙션된 세포는 보툴리눔 독소로의 노출 전 및 노출 동안에 37.0℃ 초과 (예를 들어, 38.0℃ 내지 41.0℃ 또는 38.5℃ 내지 39.5℃)의 온도에 노출될 수 있다. 또한 다른 구체예에서, 트랜스펙션된 세포의 온도는 검정의 수행 동안 경사를 이룰 수 있다. 예를 들어, 트랜스펙션된 세포의 온도는 보툴리눔 독소의 도입 시점에 37.0℃에서 출발하고, 그 후 검정 진행에 따라 증가할 수 있다 (예를 들어, 41.0℃로). 대안적으로, 일부 구체예에서 트랜스펙션된 세포의 온도는 보툴리눔 독소의 도입 시점에 상승된 온도 (예를 들어, 41.0℃)에서 출발하고, 검정의 경과 동안 37.0℃로 감소할 수 있다.
본 발명의 개념의 구체예에서, 보툴리눔 독소의 존재를 검출하는 세포-기반 검정은 조건 (예컨대, 온도, 오스몰농도, 세포외 이온 농도 등)의 변화에 의해 보툴리눔 독소에 대한 민감성에서의 적어도 2배의 증가를 지닐 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 보툴리눔 독소에 대한 민감성은 트랜스펙션된 세포가 37.0℃ 보다 높은 온도에서, 38℃ 내지 41℃의 범위 내, 또는 38.5℃ 내지 39.5℃의 범위 내에서 보툴리눔 독소에 노출될 때 37.0℃에서의 보툴리눔 독소에 대한 민감성에 비해 적어도 3배 증가한다. 또 다른 구체예에서, 민감성은 트랜스펙션된 세포가 37.0℃ 보다 높은 온도에서, 38℃ 내지 41℃의 범위 내, 또는 38.5℃ 내지 39.5℃의 범위 내에서 보툴리눔 독소에 노출될 때 37.0℃에서의 보툴리눔 독소에 대한 민감성에 비해 적어도 5배 증가한다. 또한 다른 구체예에서, 민감성은 트랜스펙션된 세포가 37.0℃ 보다 높은 온도에서, 38℃ 내지 41℃의 범위 내, 또는 38.5℃ 내지 39.5℃의 범위 내에서 보툴리눔 독소에 노출될 때 37.0℃에서의 보툴리눔 독소에 대한 민감성에 비해 적어도 10배 증가한다.
또한, 트랜스펙션된 세포가 BoNT에 노출되는 세포 배지의 감소된 오스몰농도가 또한 BoNT에 대한 민감성을 향상시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 이론에 구속되길 원치 않으며, 본 발명자들은 감소된 세포외 오스몰농도가 세포 활성 (예컨대, 뉴런 여기성)의 조절을 발생시킬 수 있다고 여긴다. 특히, 뉴런 세포에서, 감소된 오스몰농도는 시냅스 전달 및 뉴런 여기성을 향상시키는데, 이는 세포내이입률을 증가시킨다. 따라서, 트랜스펙션된 세포가 보툴리눔 독소에 노출되는 세포 배지의 오스몰농도에서의 감소, 예를 들어 220 milliOsm 내지 260 milliOsm 범위로의 감소는 보툴리눔 독소에 대한 민감성에서의 증가를 부여할 수 있다고 고려된다. 그러한 조건은 세포 생존력에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로, 상기 변형은 직관에 어긋난 것임이 이해되어야 한다. 더욱이, 세포 배지의 감소된 오스몰농도는, 예를 들어 상승적인 양상으로, 37.0℃ 보다 높은 온도에서 비롯된 보툴리눔 독소에 대한 증가된 민감성을 향상시킬 수 있는 것으로 또한 고려된다.
또 다른 구체예에서, 보툴리눔 독소에 대한 증가된 민감성은 특수한 세포외 이온, 예를 들어 유리 (즉, 복합체화되지 않거나 비-킬레이트화된) 칼슘의 농도를 감소시킴에 의해 달성될 수 있다. 세포외 칼슘 농도가 정상 생리학적 수준 아래로 떨어지면, 트랜스펙션된 세포는 점점 더 여기성이 될 수 있다. 감소된 오스몰농도와 유사하게, 증가된 세포 여기성은 세포내이입률을 향상시키므로, 이용된 보툴리눔 독소의 내재화를 향상시킬 수 있다. 따라서, 생리학적 수준 이하로 (1.0 - 1.5 mM) 칼슘 농도를 감소시키는 것은 보툴리눔 독소에 대한 민감성에서의 유사한 증가를 제공할 수 있는 것으로 또한 고려된다. 유사하게, 세포 배지로의 칼슘 킬레이터 (예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌글리콜테트라아세트산 (EGTA), 1,2-비스-(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 테트라(아세톡시메틸) 에스테르 (BAPTA/AM), 및 다른 유기산)의 첨가는 보툴리눔 독소에 대한 민감성에서의 유사한 증가를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 개념의 다른 구체예에서, 검정의 수행 동안 사용된 세포 배양 배지의 소듐 이온 농도가 감소할 때 보툴리눔 독소에 대한 세포-기반 검정의 민감성에서의 증가는 증가하였다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 제형에서 생략된 소듐 염, 예를 들어 NaCl 및/또는 NaHCO3로 제조될 수 있다. 그러한 세포 배양 배지는 약 70 mM, 약 50 mM, 약 40 mM, 약 30 mM, 약 25 mM, 또는 약 20 mM 미만의 최종 소듐 이온 농도를 지닐 수 있다. 본 발명의 개념의 바람직한 구체예에서, 세포-기반 보툴리눔 독소 검정을 수행하는데 이용된 세포 배양 배지는 약 20 mM 이하이다.
세포-기반 검정의 수행에서, 상기 기재된 보툴리눔-민감성 작제물을 발현시키는 세포는 보툴리눔 독소로의 노출 전에 낮은 소듐 이온 함량 배양 배지를 이용하여 예비-인큐베이션된 다음, 보툴리눔 독소 (예를 들어, 첨가된 샘플로부터의)를 함유하는 낮은 소듐 이온 함량 배양 배지와 접촉할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 세포는 보툴리눔 독소와 접촉하기 전 낮은 소듐 이온 함량 배양 배지로의 간단 (즉, 수 분) 교환 또는 세척 외에 세포의 노출 전에 낮은 소듐 이온 함량 배양 배지에 노출되지 않는다.
본 발명의 개념의 일부 구체예에서, 세포 배양 배지의 소듐 이온은 세포 배양 배지의 생리학적 오스몰농도를 유지하는 한편, 소듐 이온 농도에서의 감소에 의해 실현된 민감성 향상을 여전히 제공하기 위해 소듐 이온 효과를 나타내지 않는 다른 이온 (예를 들어, 포타슘 이온) 또는 다른 오스몰농도 변형제 (예를 들어, 트리에틸아민 N-옥시드)로 대체될 수 있다.
상승된 온도, 감소된 배지 오스몰농도, 특수한 이온 (예를 들어, 소듐 이온)의 감소된 세포외 농도, 및 추가적인 단백질은 조합될 수 있고, 그러한 조합은 상승적인 효과를 발휘할 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 놀랍게도 본 발명자들은 보툴리눔 독소로의 트랜스펙션된 세포의 노출 동안 상승된 온도 및 감소된 오스몰농도를 갖는 배지의 이용이 세포-기반 검정의 민감성에서의 개선에 상승적인 효과를 지님을 발견하였다.
상이한 기질 상세 및 특수한 절단 부위를 갖는, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, 및 제안된 BoNT/H를 포함하는, 보툴리눔 독소 (BoNT)의 다수의 혈청형이 동정되었다. 본 발명의 개념의 일부 구체예에서, 민감성 향상 방법은 BoNT의 특수한 종에 선택적일 수 있다. 예를 들어, 낮은 소듐 함량 세포 배양 배지의 이용은 BoNT/A에 대한 세포-기반 검정에 향상된 민감성을 발생시킬 수 있지만, 세포-기반 검정 BoNT/E의 민감성에는 거의 효과가 없다. 본 발명의 개념의 일부 구체예에서, 하나 이상의 BoNT 종에 대한 민감성의 이러한 선택적인 향상은 동일한 작제물을 발현시키는 동일한 세포주가 다수의 BoNT 종을 특성화하는데 이용될 때 발생한다.
본 발명의 개념의 작제물은 그러한 하나 이상의 BoNT에 반응성 (즉, 기질로서 작용함)일 수 있다고 고려된다. 유사하게, 변경된 특이성 및 아직 동정되지 않은 BoNT 혈청형 및/또는 아이소형을 지닌 재조합 또는 변형된 BoNT에 대해 기질로서 작용할 수 있는 단백질을 함유하는 하이브리드 리포터/절단 부위를 발현시키는 트랜스펙션된 세포는 본 발명의 개념의 방법에 반응성일 것으로 고려된다. 파상풍 신경독 (TeNT)에 반응성인 유사한 리포터 및 상이한 절단 부위 부분을 갖는 단백질을 발현시키는 트랜스펙션된 세포는 본 발명의 개념의 방법이 적용될 때 개개의 TeNT에 대한 민감성에서의 유사한 증가를 나타낼 수 있을 것으로 또한 고려된다.
바람직한 구체예에서, 37.0℃보다 유의하게 높은 온도 및 낮은(즉, 약 70 mM보다 낮음) 소듐 이온 농도를 갖는 세포 배양 배지는 보툴리눔 신경독 타입 A(BoNT/A)에 대한 BOCELL™ 모델 세포주의 민감성을 향상시킨다. 이러한 세포주는 미국 가특허 출원 61/492237호(2011년 6월 1일에 출원됨)에 기재되어 있으며, 본원에 포함된다. 본원에 논의된 모든 다른 외부 자료는 이들의 전체내용이 참조로서 유사하게 포함된다.
BoNT는 절단 부위를 인지하며, 하이브리드 단백질을 리포터-함유 부분 및 하이브리드 단백질의 나머지로 절단시킨다. 본 발명의 절단 부위 서열은 유리하게는 (a) SNARE 단백질, 모티프, 또는 뮤테인(또는 이들의 절단가능한 부분)을 포함할 수 있다. SNARE 단백질은 SNAP-25, 시냅토브레빈(VAMP), 및 신탁신을 포함하는 것이 이해된다. 단백질의 "뮤테인"은, 예를 들어, 천연 단백질과 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성을 갖는 조성물을 포함하여 상응하는 천연 단백질과 적어도 30%의 동일성을 갖는 것으로 본원에서 해석되어야 한다. 동일성의 변화는 첨가, 결실 및 치환 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 고려되는 뮤테인은 단편, 트렁케이트 및 융합 단백질을 포함한다.
이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 높은 온도에서 보툴리눔 독소에 대해 관찰된 증가된 민감성이 보툴리눔 독소의 증가된 특이적 결합 및 세포내이입의 결과일 수 있는 것으로 생각한다. 세포-기반 검정에서, BoNT는 수용체-매개 세포내이입을 통해 세포질로 내재화되어야 한다. 따라서, 더 많은 BoNT가 내재화되도록 하고, 하이브리드 단백질/작제물의 절단 부위와 상호작용하도록 하는 어떤 것이든지 트랜스펙션된 세포가 BoNT에 더 민감화되도록 하는 것이 가능하다. 다양한 온도에서 보툴리눔 독소로 획득된 용량/반응 곡선을 도시하는 도 1a에 제시된 바와 같이, 온도에서의 비교적 작은 변화가 놀랍게도 보툴리눔 독소 검정(EC50에 의해 결정됨)의 민감성에 대해 큰 영향을 발생시킨다. 도 1b는 무손상 보툴리눔 독소(즉, 홀로톡신) 및 세포의 리포팅 작제물을 절단할 수 있는 프로테아제 활성을 갖지만, 수용체-결합 활성은 갖지 않는 보툴리눔 독소 경쇄를 이용하여 수행된 유사한 연구의 결과를 제시한다. 세포가 경쇄에 노출되는 경우 통상적인 온도 및 상승된 온도에서 인지된 작제물의 방출 비에서의 변화의 결핍은 온도 효과가 전반적으로 향상된 세포내이입의 결과가 아니라, 수용체-매개 과정의 결과임을 나타낸다. 이는 리포팅 작제물을 절단하는 능력이 결핍되어 있으나, 독소-특이적 수용체 부위를 차지할 수 있는 보툴리눔 독소 중쇄의 존재 또는 부재하에 보툴리눔 독소에 노출된 트랜스펙션된 세포에 대한 다양한 온도의 효과를 제시하는 도 1c에 제시된 데이터에 의해 뒷받침된다. 도 1c는 보툴리눔 독소 중쇄가 홀로톡신의 효과를 방지하는데 효과적이나, 상승된 온도에서 덜 효과적임을 제시하는데, 이는 세포-기반 검정 민감성의 온도 효과가 수용체-매개 과정일 수 있음을 나타낸다.
트랜스펙션된 세포 표면 상에서의 보툴리눔 독소 수용체 단백질의 증가된 발현은 보툴리눔 독소의 향상된 세포내이입을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 A, D 및 E는 세포 표면 상에서 발현된 시냅스 소포 단백질(SV2)과의 상호작용을 통해 세포질로 내재화된다. 따라서, 트랜스펙션된 세포에서의 SV2 단백질의 공동 발현이 보툴리눔 독소에 대한 민감성에서 유사한 증가를 나타낼 수 있을 것으로 또한 생각된다.
더 높은 온도에서의 열 충격 단백질 70(HSP70) 및 열 충격 단백질 90(HSP90)을 포함하는 내인성 스트레스 반응 단백질의 증가된 활성은 보툴리눔 독소에 대한 향상된 민감성을 잠재적으로 유도할 수 있다. HSP70 및 HSP90 둘 모두는 생리학적 온도 범위(35.0 내지 37.0℃)보다 높은 온도에서 활성화되고, 세포의 단백질분해 활성을 향상시킨다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, HSP70 또는 HSP90의 증가된 활성이 하이브리드 단백질의 리포터-함유 부분의 파괴를 촉진할 수 있는 것으로 생각된다.
또한 추가로, 기준선 FRET 신호가 증대될 수 있는 높은 온도에서의 하이브리드 단백질의 형태 변화가 보툴리눔 독소에 대한 향상된 민감성을 유도할 수 있다. 단백질의 적절한 폴딩을 돕는 HSP70 기능, 및 HSP70의 증가된 활성이 하이브리드 단백질의 형태 변화를 유도할 수 있다. 따라서, 트랜스펙션된 세포에 대한 HSP70 활성제(예를 들어, YM1 (2-((Z)-((E)-3-에틸-5-(3-메틸벤조[d]티아졸-2(3H)-일리덴)-4-옥소티아졸리딘-2-일리덴)메틸)-1-메틸피리딘-1-윰 클로라이드, 2-[3-에틸-5-(3-메틸-3H-벤조티아졸-2-일리덴)-4-옥소-티아졸리딘-2-일리덴메틸]-1-메틸-피리디늄 클로라이드))의 처리가 보툴리눔 독소에 대한 민감성에서 유사한 증가를 나타낼 수 있는 것으로 또한 생각된다.
세포-기반 검정에서 BoNT에 대한 추가의 향상된 민감성을 제공하기 위해 상기 기재된 다양한 조건이 조합될 수 있을 것으로 추가로 생각된다. 예를 들어, 추가의 민감성 향상을 제공하기 위해 배지 내에서의 감소된 삼투 강도 및 감소된 소듐 농도가 조합될 수 있다. 상기 조합은 상승적 효과를 발생시킬 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명의 개념의 또 다른 구체예는 상기 기재된 바와 같은 민감성 향상 배지 및 다양한 농도의 하나 이상의 보툴리눔 독소를 포함하는 제조물을 포함하는 키트이다. 예를 들어, 상기 키트는 민감성 향상 배지를 포함하는 한 세트의 제조물을 포함할 수 있으며, 상기 세트의 각각의 일원은 추가로 다양한 농도의 보툴리눔 독소를 포함한다. 상기 민감성 향상 배지는 상기 기재된 바와 같을 수 있고, 예를 들어, 50mM 소듐 이하의 소듐을 함유하는 배지일 수 있다. 상기 민감성 향상 배지는 생리학적 삼투 강도 또는 생리학적 미만의 삼투 강도를 가질 수 있다.
상기 키트에서, 제조물은 이들이 용량/반응 곡선으로 사용하기에 적합한 일련의 보툴리눔 독소 농도를 나타내도록 제조될 수 있다. 이러한 용량/반응 곡선은 차례로 특징적인 반응을 발생시키기 위해 세포 기반 보툴리눔 독소 검정을 교정하기 위해 이용될 수 있다. 대안적으로, 상기 키트는 용량/반응 곡선을 생성시키는데 적합하지 않을 수 있으나, 세포 기반 보툴리눔 검정이 컴퓨터 메모리에 저장되는 완전 용량/반응 또는 교정 곡선의 결과와 일치하는 결과를 발생시키는지 확인하기 위해 이용될 수 있는 제한된 수의 상기 제조물(예를 들어, 1, 2, 또는 3개의 제조물)을 함유할 수 있다. 임의로, 상기 키트는 희석제, 대조군, 블랭크 샘플, 및/또는 제로 표준(zero standard)으로 사용하기 위한 보툴리눔 독소를 포함하지 않는 제조물을 포함할 수 있다. 대안적인 구체예에서, 상기 키트는 배지 공급물(예를 들어, 보툴리눔 독소가 없는 민감성 향상 배지) 및 보툴리눔 독소 스톡의 공급물을 포함할 수 있다. 상기 민감성 향상 배지의 공급물은 벌크 공급물로서, 또는 바람직하게는 특성 규명된 부피를 함유하는 개별적 용기 내의 일련의 분취량으로 제공될 수 있다. 상기 구체예에서, 다양한 안정화 조건(예를 들어, 다양한 온도, 완충액 조건, 안정화 시약 등)을 수용하기 위해 성분은 개별 성분으로 제공될 수 있음이 인지되어야 한다. 상기 구체예에서, 상기 기재된 바와 같이 이용될 수 있는 완전한 제조물을 발생시키기 위해 불완전한 제조물로의 보툴리눔 독소 쇼크의 추가를 위해 사용자에게 설명서가 공급된다.
실시예
온도 효과 . 보툴리눔 독소를 검출하기 위한 세포-기반 검정(BOCELL™ 검정)을 10-15 M 내지 10-9 M 범위의 농도의 보툴리눔 독소/A 홀로톡신을 이용하여 35.0℃, 37.0℃, 및 39.0℃(시도 1 및 2), 및 37℃, 39℃, 및 41℃(시도 3)에서 수행하였다. 트랜스펙션된 세포를 보툴리눔 독소에 노출시키면서 3개의 온도 중 하나에 노출시켰다. 각각의 농도에서 방출 비(YFP/CFP)를 특성 규명하고, 이들을 보툴리눔 독소/A 농도의 함수로서 작도함으로써 용량/반응 곡선을 생성시켰다. 도 1a에 제시된 바와 같이, 37℃로부터 39.0℃ 또는 41℃로 검정에서 사용된 온도를 증가시킴으로써 보툴리눔 독소에 대한 민감성(EC50 값으로 측정됨)은 5배 초과로 향상된다.
도 1b에 도시된 연구에서, 트랜스펙션된 세포를 보툴리눔 독소/A 홀로톡신 또는 보툴리눔 독소/A 경쇄로 처리하고, 37.0℃ 또는 39.0℃에서 인큐베이션하였다. 보툴리눔 독소/A 경쇄는 세포에 의해 발현된 검출 작제물을 절단하는 능력을 보유하나, 무손상 홀로톡신에 의해 이용된 특이적 세포 표면 수용체에 결합하는 능력은 결핍되어 있다. 이들 연구에서, 보툴리눔 독소/A 경쇄는 높은 농도에서도 리포팅 작제물의 부분을 함유하는 절단 부위를 절단하지 않는다. 이는 무손상 BoNT/A가 37.0℃ 및 39.0℃ 둘 모두에서 세포 내에서 수용체-매개 독소 흡수 과정 및 활성화를 겪고, 향상된 민감성이 수용체-매개 과정임을 나타낸다.
이의 확인은 도 1c에 제시된 연구에서 발견된다. 트랜스펙션된 세포를 보툴리눔 독소/A 홀로톡신의 첨가 전에 보툴리눔 독소/A 중쇄 또는 동등한 비히클로 전처리하였다. 보툴리눔 독소/A 중쇄는 독성(즉, 단백질분해 활성)이 결핍되어 있고, 세포에 의해 발현된 검출 작제물을 절단할 수 없으나, 홀로톡신에 의해 결합된 특이적 수용체를 차지하기 위해 결합할 수 있다. 37.0℃ 및 39.0℃ 둘 모두에서의 수용체 결합 도메인, 보툴리눔 독소/A 홀로톡신 흡수 및 리포터 절단 도메인을 포함하는 중쇄와 트랜스펙션된 세포의 예비 인큐베이션은 상승된 온도에서 리포터 절단을 위한 BoNT/A 홀로톡신의 수용체-매개 세포내이입을 위한 필요조건을 나타낸다.
상승된 온도를 이용한 세포의 전처리의 효과가 도 2에 제시되어 있다. BoNT를 검출하기 위한 세포-기반 검정(BoCell™ 검정)을 10-15 M 내지 10-9 M 범위의 농도의 보툴리눔 독소/A 홀로톡신을 이용하여 35.0℃, 37.0℃, 및 39.0℃에서 수행하였다. 트랜스펙션된 세포를 보툴리눔 독소에 노출시키기 전에 상기 3개의 온도 중 하나에 노출시키고, 그 후 노출 동안 3개의 온도 중에서 동일하거나 상이한 온도에 노출시켰다. 감소된 EC50 값으로 특성규명된 보툴리눔 독소에 대한 민감성은 39.0℃에서 보툴리눔 독소에 노출된 트랜스펙션된 세포에서 향상되었다. 39.0℃에서의 보툴리눔 독소에 대한 민감성은 37.0℃에서의 보툴리눔 독소에 대한 민감성보다 적어도 3배 더 컸고, 35.0℃에서의 보툴리눔 독소에 대한 민감성에 비해 적어도 10배 더 컸다.
감소된 오스몰농도와 조합된 상승된 온도의 효과는 도 3A 및 3B에 제시되어 있다. 보툴리눔 독소를 검출하기 위한 세포-기반 검정(BOCELL™ 검정)을 35.0℃, 37.0℃, 및 39.0℃에서 수행하였고, 여기서 트랜스펙션된 세포를 약 270 mOsm의 오스몰농도(즉, 정상 오스몰농도)를 갖는 세포 배지 중 보툴리눔 독소에 노출시켰다. 이전 관찰과 일치하고, 도 3A에 제시된 바와 같이, 39.0℃에서의 보툴리눔 독소에 대해 관찰된 민감성은 37.0℃에서의 민감성에 비해 약 2배까지 증가된다. 250 mOSm 미만의 오스몰농도를 갖는 달리 동일한 세포 배양 배지를 이용하여 유사한 연구를 수행하였다. 결과는 도 3B에 제시되어 있다. 39.0℃에서의 보툴리눔 독소에 대한 민감성은 37.0℃에서의 보툴리눔 독소에 대한 민감성에 비해 약 7배까지 증가된다. 놀랍게도, 감소된 오스몰농도는 37℃에서 비교적 적은 효과 및 35℃에서 실제로 감소된 민감도를 가졌고, 이는 감소된 오스몰농도와 상승된 온도 사이의 상승적 상호작용을 나타낸다.
도 4A에 제시된 바와 같이, 상승된 온도의 민감성 향상 효과가 협소한 범위의 온도 내에서 발생한다. 상승된 온도에서 수행된 세포-기반 검정으로부터의 형광 데이터는 더 낮은 온도와 비교하는 경우, 41.0℃에서 작제물의 형광 단백질로부터의 신호의 손실을 나타내며, 이는 불량한 세포 건강을 나타낼 수 있다. 명시야 및 형광 현미경검사 하에서의 트랜스펙션된 세포의 이미지는 도 4B에 제시된 바와 같이 41.0℃에서 불량한 세포 건강을 입증한다. 트랜스펙션된 세포는 41.0℃(명시야)에서 불량한 형태 및 41.0℃에서의 작제물의 리포터 단백질(YFP)의 전체적 감소 및 확산을 나타낸다.
온도 효과의 선택성은 도 5에 제시되어 있다. 상기 제시된 온도 연구는 BoNT/A 및 BoNT/A에 의해 절단될 수 있는 작제물을 발현하는 형질전환된 세포를 이용한 것으로부터의 결과를 도시한다. BoNT/A 및 BoNT/E 둘 모두는 SNAP-25 내의 부위를 절단하며, SNAP-25를 포함하는 리포팅 작제물 또는 이들 절단 부위를 포함하는 SNAP-25의 부분이 BoNT/A 및 BoNT/E의 검출에서 잠재적으로 사용될 수 있다. 도 5는 상기 기재된 BOCELL™ 세포를 이용한 BoNT/E 세포-기반 검정의 결과를 제시한다. 놀랍게도, 동일한 세포 및 세포 배양 배지를 이용함에도 불구하고, BoNT/A 검정 민감성의 향상에 효과적인 것으로 밝혀진 범위 내의 상승된 온도(즉, 39℃)의 이용은 BoNT/E에 대한 민감성에서의 감소를 발생시켰다(상승된 EC50 값으로 제시된다). 이는 온도 효과가 특정 BoNT에 대해 선택적일 수 있음을 나타낸다.
소듐 이온 효과 . 감소된 소듐 클로라이드(NaCl) 농도의 효과를 나타내는 연구의 결과가 도 6a에 제시된다. 첨가된 NaCl을 함유하지 않은 맞춤 기본 세포 배양 배지를 제조하였다. 다양한 농도의 NaCl을 첨가함으로써 상기 맞춤 기본 배지의 변형을 제조하고, 보툴리눔 독소/A에 대한 세포-기반 검정을 BOCELL 세포를 이용하여 수행하였다. 표시된 농도의 BoNT/A를 함유하는 배지의 적용 전에 3시간 동안 세포를 인큐베이션하였다. 세포에 의해 발현된 작제물의 형광단(즉, YFP 및 CFP)의 형광을 세포와 BoNT/A를 접촉시킨지 48시간 후에 특성규명하였다. NaCl의 가장 높은 농도(48 mM)는 통상적인 기본 세포 배양 배지의 NaCl 함량이다. 제시된 바와 같이, NaCl 농도의 감소는 민감성의 급격한 향상(감소된 EC50 값에 의해 표시됨)을 발생시키며, 최종적으로 첨가되는 NaCl의 부재하에서 민감성에서 거의 50배 증가를 발생시킨다.
BoNT/A의 부재하에서의 세포 형태에 대한 감소된 NaCl 농도의 효과(명시야) 및 48시간 후의 BoNT/A의 부재 및 존재하에서의 형질전환된 세포 내에서의 작제물(YFP)의 분포가 도 6b에 제시된다. 세포 배양 배지에서의 다양한 NaCl 농도에서의 작제물의 형태 또는 분포에서 변화의 증거가 없다.
세포 배양 배지의 다양한 NaCl 함량의 영향이 도 7에 제시된다. 첨가되는 NaCl을 함유하지 않은 맞춤 기본 세포 배양 배지를 제조하였다. 다양한 농도의 NaCl을 첨가함으로써 상기 맞춤 기본 배지의 변형을 제조하고, 보툴리눔 독소/A에 대한 세포-기반 검정을 BOCELL 세포를 이용하여 수행하였다. 48.3 mM NaCl을 함유하는 기본 배지는 통상적인 기본 배지의 NaCl 농도이다. 세포를 48, 72, 및 96시간 동안 표시된 농도에서 BoNT/A를 함유하는 배지를 이용하여 인큐베이션시켰다. 세포에 의해 발현된 작제물의 형광단(즉, YFP 및 CFP)의 형광을 세포와 BoNT/A를 접촉시킨지 48시간 후에 특성규명하였다. NaCl의 가장 높은 농도(48 mM)는 기본 세포 배양 배지의 통상적인 NaCl 함량이다. 제시된 바와 같이, NaCl의 농도는 세포-기반 검정의 시간에 대해 적은 영향을 갖는다.
도 8a, 8b, 및 8c는 세포 기반 BoNT 검정의 민감성에 대한 낮은 소듐 함량 배지의 도입 시간의 효과 연구의 통상적인 결과를 제시한다. 도 8a는 4시간 또는 24시간 동안의 낮은 소듐 함량 기본 배지 중 BoNT/A의 농도에 대한 노출(즉, 예비-인큐베이션) 전 통상적인 소듐 함량을 갖는 기본 배지에서 인큐베이션된 적절한 리포팅 작제물을 갖는 세포의 결과를 제시한다. 이들 기간 후, 세포를 해당 농도의 BoNT/A를 함유한 통상적인 소듐 함량을 갖는 기본 배지로 옮겼으며, BoNT/A에 노출되어 소비된 전체 시간이 48시간이 되도록 하였다. 세포를 또한 대조군 조건을 제공하기 위해 전체 48시간 동안 낮은 소듐 함량 기본 배지 중 BoNT/A에 노출시켰다. 도 8b는 예비-인큐베이션 동안 낮은 소듐 함량 기본 배지를 이용하여 수행된 유사한 연구에 대한 통상적인 결과를 제시한다. 세포의 예비-인큐베이션에 이용된 배지가 세포에 대해 식별가능한 효과를 갖지 않은 것이 인지되어야 하며, 이는 낮은 소듐 함량 배지를 이용한 세포의 예비-컨디셔닝이 필요하지 않은 것을 나타낸다.
예비-인큐베이션의 효과를 또한 도 8c에 제시된 연구에서 시험하였고, 이는 통상적인 결과를 나타낸다. 세포를 보충된 통상적인 소듐 함량 배지(배지 A) 또는 낮은 소듐 함량 맞춤 배지(배지 B)로 예비-인큐베이션시켰다. 이후, 세포를 BoNT와의 접촉 전에 보충되지 않은 통상적인 소듐 함량 배지(배지 C) 또는 낮은 소듐 함량 맞춤 배지로 간단히 세척하였다. 제시된 바와 같이, 낮은 소듐 함량 배지에서의 예비-인큐베이션은 향상된 BoNT 민감성을 발생시키는데 필요하지 않다.
반대이온 효과 . 본 발명의 개념의 세포-기반 BoNT 검정에서 사용된 세포 배양 배지의 소듐 함량은 NaCl이 아닌 소듐 염의 농도를 조정함으로써 조작될 수 있다. 도 9A에 제시된 바와 같이, 기본 배지의 소듐 바이카르보네이트(NaHCO3) 함량에서의 감소가 또한 세포-기반 BoNT 검정의 민감성 증가에 효과적이다. 도 9B에 제시된 바와 같이, NaCl을 이용하는 것과 같이, 민감성에서의 큰 개선이 소듐 함량에서의 비교적 작은 변화에 걸쳐 관찰된다.
이온 강도 및 오스몰농도 효과. 세포-기반 BoNT 검정에서 사용된 배지로부터의 소듐의 제거의 효과는 이온 강도에서의 변화로 인한 것이 아니다. 도 10은 일련의 맞춤 배지가 통상적인(즉, 70%) 및 감소된(즉, 25%) 소듐 함량을 갖고, 소듐이 동일 농도의 포타슘에 의해 대체된 연구로부터의 통상적인 결과를 제시한다. 세포-기반 BoNT 검정에서의 민감성의 향상이 소듐 농도의 감소에 대해 명백한 한편, 소듐이 포타슘으로 대체되고, 농도가 이후 감소되는 경우 유사한 향상이 관찰되지 않는다. 이와 같이, 효과는 이온 강도에 독립적이고, 이온-특이적 및/또는 이온-선택적인 것으로 관찰될 수 있다.
도 11은 이온 강도를 증가시키기 위해 낮은 소듐 함량 배지를 비이온성 물질로 보충하는 것의 결과를 제시한다. 세포 기반 BoNT 검정을 48 mM NaCl(70% Neurobasal, 전체 [Na+] = 53 mM), 0 mM NaCl(70% 맞춤 0　mM NaCl, 전체 [Na+] = 19 mM)을 함유하는 배양 배지, 및 수크로스 또는 트리메틸아민 N-옥시드(TMAO)가 보충된 0 mM NaCl 배지 중에서 수행하였다. 수크로스 및 TMAO 둘 모두가 오스몰농도를 조정하는데 통상적으로 사용된다. 오스몰농도를 48 mM NaCl의 당량으로 조정함에도 불구하고 배양 배지에서의 소듐의 감소에 의해 생성된 민감성 향상이 남아 있다. 따라서, 세포-기반 BoNT 검정에서 이용된 배양 배지 중 소듐 함량의 감소의 효과는 오스몰농도와 독립적이다.
낮은 소듐 함량 배지의 기계적 연구. 낮은 소듐 함량 배양 배지의 사용을 통해 세포-기반 BoNT 검정의 민감성의 향상과 관련될 수 있는 다양한 메커니즘이 존재한다. 도 12A는 낮은 소듐 함량 배양 배지에서의 세포에 의한 BoNT의 세포 표면 수용체-매개 흡수를 차단하는 것에 관한 연구에서 획득된 통상적인 결과를 제시한다. 상기 세포를 무손상 BoNT/A 홀로톡신에 대한 세포의 노출 전에 BoNT/A의 재조합 중쇄 단편(HcR/A, 1 μM)으로 처리하였다. BoNT/A의 상기 중쇄 단편은 홀로톡신과 동일한 세포 표면 수용체에 결합하나, 단백질분해 활성이 결핍되어 있으며, 검출 작제물을 절단할 수 없다. 제시된 바와 같이, 이들 수용체 부위를 차단하는 것은 일단 낮은 소듐 함량 배양 배지 중에서 적용되나, 높은 홀로톡신 농도에 적용되는 경우 BoNT/A 홀로톡신의 독성 효과를 효과적으로 차단한다.
BoNT/A의 재조합 경쇄 단편(Lc/A)은 BoNT/A 홀로톡신의 단백질분해 활성을 보유하나, 홀로톡신의 내재화를 위해 이용된 세포 표면 수용체에 결합하는 능력이 결핍되어 있다. 도 12B는 낮은 소듐 함량 배양 배지에서의 세포에 의한 BoNT/A 경쇄의 내재화에 대한 연구에 대한 통상적인 결과를 제시한다. 제시된 바와 같이, Lc/A는 이들 세포에 대해 최소 영향을 가지며, 이는 낮은 소듐 함량 배지로 관찰된 민감성 향상에서 비특이적 세포내이입이 주요 요인이 아님을 나타낸다.
이미 기재된 변형 외에도 더 많은 변형이 본 발명의 개념으로부터 벗어남이 없이 가능함이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 주제는 첨부된 청구항의 사상을 제외하고는 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 청구항 둘 모두의 해석에서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 배타적이지 않은 방식으로 요소, 성분, 또는 단계를 언급하는 것으로 해석되어야 하며, 이는 언급된 요소, 성분, 또는 단계가 명백히 언급되지 않은 다른 요소, 성분, 또는 단계와 함께 존재하거나, 이용되거나, 조합될 수 있는 것을 나타낸다. 명세서의 청구항이 첫번째 및 두번째 단계를 언급하는 경우, 문맥은 첫번째 및 두번째 단계가 임의의 순서로 실시될 수 있는 것을 의미하고, 청구항이 둘 모두의 요소가 제공되어야 하거나 두 요소가 상기 순서로 존재하는 것을 필요로 하지 않는 것을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 명세서의 청구항이 A, B, C..... 및 N으로 구성된 군으로부터 선택된 어떤 것 중 적어도 하나를 나타내는 경우, 본문은 A + N, 또는 B + N 등이 아니라 상기 군으로부터의 단지 하나의 요소를 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다. 유사하게, 본 발명의 주제는 개시된 요소의 모든 가능한 조합을 포함하는 것으로 간주된다. 따라서, 한 구체예가 요소 A, B, 및 C를 포함하고, 두번째 구체예가 요소 B 및 D를 포함하는 경우, 본 발명의 주제는 또한 명백히 개시되지 않은 경우에도 불구하고 A, B, C, 또는 D의 다른 나머지 조합을 포함하는 것으로 간주된다.

Claims (14)

  1. 보툴리눔(botulinum) 신경독에 대한 세포-기반 검정의 민감성을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은
    (i) 적어도 39.0℃의 온도 및 부-생리학적 오스몰농도를 갖는 배지에서, 보툴리눔 신경독에 의해 절단가능한 리포팅 펩티드를 포함하는 트랜스펙션된(transfected) 세포를 제공하는 단계;
    (ii) 상기 세포를 보툴리눔 신경독에 접촉시키는 단계; 및
    (iii) 상기 리포팅 펩티드로부터 유래된 절단 산물을 측정하는 단계를 포함함으로써, 생리학적 온도 및 생리학적 오스몰농도에서 수행되는 세포-기반 검정에 비해 보툴리눔 신경독에 대한 EC50에서 상승적 감소(synergistic decrease)를 제공하는 것인 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 리포팅 펩티드는
    신호를 방출하는 리포터-함유 부분을 포함하는 말단; 및
    상기 리포팅 펩티드의 나머지로부터 상기 리포터-함유 부분의 절단을 생산하는 방식으로 보툴리눔 신경독과 상호작용하는 절단 부위를 포함하고, 여기서 측정은 상기 신호에서의 변화를 모니터링함으로써 수행되는 것인 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 배지는 250 mOsm 이상의 오스몰농도를 갖는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 생리학적 온도 및 생리학적 오스몰농도에서 수행되는 세포-기반 검정에 비해 보툴리눔 신경독에 대한 EC50가 적어도 3배 감소하는 것인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 보툴리눔 신경독은 재조합 독소인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 재조합 독소는 비-뉴런 세포로 유도되는 것인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 트랜스펙션된 세포는 비-뉴런 세포인 방법.
  8. 보툴리눔 신경독에 반응성인 세포에 의한 보툴리눔 신경독의 흡수를 선택적으로 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은
    보툴리눔 신경독을 수득하는 단계;
    보툴리눔 신경독에 반응성인 세포를 보툴리눔 신경독에 접촉시키는 단계; 및
    37.0℃ 초과 41.0℃ 이하의 상승된 온도에 보툴리눔 신경독에 반응성인 세포를 노출시키는 단계를 포함하고,
    상승된 온도에서 보툴리눔 신경독에 반응성인 세포에 의한 보툴리눔 신경독의 흡수는 37.0℃에서 보툴리눔 신경독에 반응성인 세포에 의한 보툴리눔 신경독의 흡수에 비해 증가되고, 증가된 흡수는 제 2 보툴리눔 신경독 혈청형에 비해 제 1 보툴리눔 신경독에 대해 선택적인 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 제 1 보툴리눔 신경독 혈청형은 혈청형 A이고, 제 2 보툴리눔 신경독 혈청형은 혈청형 E인 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 상승된 온도는 39℃인 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 상승된 온도는 41℃인 방법.
  12. 제 8항에 있어서, 보툴리눔 신경독에 반응성인 세포는 보툴리눔 신경독에 의해 절단가능한 리포팅 작제물(construct)를 포함하는 방법.
  13. 제 8항에 있어서, 보툴리눔 신경독에 반응성인 세포를 상기 상승된 온도에 노출시키는 단계는 보툴리눔 신경독에 반응성인 세포를 보툴리눔 신경독에 노출한 후에 일어나는 것인 방법.
  14. 제 8항에 있어서, 보툴리눔 신경독에 반응성인 세포를 상기 상승된 온도에 노출시키는 단계는 보툴리눔 신경독에 반응성인 세포를 보툴리눔 신경독에 노출함과 동시에 일어나는 것인 방법.
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