TWI503543B - 膽鹼酯酶阻害性物質檢測裝置、檢測套組及檢測方法 - Google Patents

Description

膽鹼酯酶阻害性物質檢測裝置、檢測套組及檢測方法

本發明是有關膽鹼酯酶阻害性物質檢測裝置、檢測套組及檢測方法。

一直以來，已知殘留在農作物或飲料水等中之農藥成分對人體有不良影響。

因此，尤其是含有膽鹼酯酶阻害性物質之有機磷系農藥或胺基甲酸鹽(或酯)(cabamate)系農藥因為會引發神經病變(neuropathy)而造成嚴重問題。

由於如此之狀況，為了供給安心安全之食物、飲料水等，而期望能開發出殘留農藥之檢測技術，到目前為止，已提出有各種各樣農藥檢測裝置及檢測方法。

以往所進行之大部分的農藥檢測方法，係使用如氣體層析分析(GC)、氣體層析質量分析儀(GC/MS)、液體層析分析(LC)、液體層析質量分析儀(LC/MS)的分析機器。

如此之分析方法，係具有可以高感度同定、定量的優點，但由於需有大型裝置，同時因手法繁瑣而使檢測費時，而有無法進行多檢體分析，或無法當場檢測之缺點。

如此，由於機器分析會有費工夫及費時的情形，故在有機磷系農藥或胺基甲酸鹽(或酯)(cabamate)系農藥中，例如，如在專利文獻1中，提案一種農業之檢測方法，係利用農藥中所含有之膽鹼酯酶阻害性物質令使膽鹼酯酶不活化而降低水解活性之作用，而測量因水解所致之基質分解量藉此進行檢測者。

然而，在專利文獻1之方法中，由於水解生成物之發色反應微弱，而藉由吸光度測定來測定基質之分解量，因此無法簡單地以目視判定，因而有無法快速檢測之問題。

同時，利用與專利文獻1之方法相同之原理，可以簡單地以目視判定試料中之有機磷系農藥及胺基甲酸鹽(酯)系農藥之存在之檢測套組，例如已有NEOGEN公司AT-10/AT-25(AgriScreen ticket 10/25)等之販售。

專利文獻1：日本特開平09-107992號

然而，如上述之檢測套組，檢測感度不一定充足，檢測界限係例如：加保利(Carbaryl)為7.0ppm、陶斯松(chlorpyrifos)為0.7ppm、甲基陶斯松(Chlorpyrifos-methyl)為1.0ppm、大利松(diazinon)為2.0ppm。

此外，日本國內自2006年5月29日起修正部分的食品衛生法，在有膽鹼酯酶阻害性物質之有機磷系、胺基甲酸鹽(酯)系農藥之殘留農藥分析中，由於已改變食品中之殘留農藥濃度之基準值，對於新的基準值此等檢測試劑套組幾乎是感度不足，故仍期望維持簡便性之同時也能更提高檢測感度者。

本發明是有鑑於如上述之事實而作的發明，其課題是提供以低成本即可藉由目視而進行判定之高感度之膽鹼酯酶阻害性物質之檢測裝置、檢測套組及檢測方法。

本發明為了解決上述課題而提供以下裝置：第1是膽鹼酯酶阻害性物質檢測裝置，其特徵為在容器內底部的基底層之上，固定有含有膽鹼酯酶之反應層。進一步，第2是在前述檢測裝置之反應層中形成空隙，第3是前述之第1或2之檢測裝置，其中之基底層及反應層是由親水性光硬化性樹脂所構成。

又，第4是一種膽鹼酯酶阻害性物質檢測套組，其係含有前述第1至3項中任一項之檢測裝置、注射筒、可安裝在注射筒之前端部並具有管柱粒子充填於內部之管尖(column tip)、以及藉由與膽鹼酯酶反應而產生發色之基質。第5是第4之膽鹼酯酶阻害性物質檢測套組，其中，藉由與膽鹼酯酶之反應而產生發色之基質係乙酸吲哚酯。

進一步，第6是一種膽鹼酯酶阻害性物質檢測方法，係判定試料中是否存在有膽鹼酯酶阻害性物質之方法，其是1)在前述第1至3項中任一項的檢測裝置內添加試料，2)添加藉由與膽鹼酯酶之反應而產生發色之基質，3)如不產生發色，則判定在試料中存在有膽鹼酯酶阻害性物質；第7是前述第6之檢測方法，其係經由管柱捕集試料，並進行氧化處理後，予以添加至前述之第1至3項中任一項的檢測裝置內；第8是一種有機磷系農藥之檢測方法，其係判定試料中是否存在有有機磷系農藥之方法，其為1)經由管柱捕集試料，並進行氧化處理，2)將此試料加入前述第1至3項中任一項的檢測裝置內，3)添加藉由與膽鹼酯酶之反應而產生發色之基質，4)如不產生發色，則判定在試料中存在有膽鹼酯酶阻害性物質；第9是前述第6至8項中任一項的檢測方法，其中，藉由與膽鹼酯酶之反應而產生發色之基質係乙酸吲哚酯。

如依本發明之膽鹼酯酶阻害性物質檢測裝置，藉由基底層之存在，在反應層使用之液量可以是少量，由於可以抑制膽鹼酯酶之使用量，故可以削減成本。

再者，由於反應層具有空隙而使溶液試料可有效率地滲入，故可快速且高感度地檢測是否存在有膽鹼酯酶阻害反應。

又，如依本發明之膽鹼酯酶阻害性物質之檢測套組，可輕易地實施本發明之檢測方法，如依本發明之檢測方法，在分析前，由於將有機磷系之農藥在管柱上變化成含氧體(oxon form)，以求反應之效率化，而因為可以使用高濃度之氧化劑，故可以提高檢測感度。因此，由於使檢測結果，可以用目視確認在容器內之反應層的發色，而變成簡便地判定膽鹼酯酶阻害性物質之存在，故在出貨現場或販賣現場等可以容易地進行殘留農藥之檢測，可對食物、或飲料水等之安全性有很大之貢獻。

藉由本發明而可檢測之物質，係膽鹼酯酶阻害性物質，其包含：有機磷系農藥、胺基甲酸鹽系農藥、氟、砷等之1種或2種以上。

同時，在此所謂之「檢測」，係指決定試料中是否有特定物質的存在。

有關本發明之膽鹼酯酶阻害性物質檢測裝置的具體例，係使用第1圖來進行說明。

此檢測裝置1係在容器2內底部之基底層3之上，使含有膽鹼酯酶4之反應層5以積層狀態固定，並在此裝置內添加分析試料，即可用目視判定反應層5中是否有膽鹼酯酶阻害反應的裝置。

基底層3及反應層5係以在固定時不會損害酵素活性之材料來形成為佳，例如，可以藉由親水性光硬化性樹脂來形成。因此，具體上，首先，可在容器2內添加親水性光硬化性樹脂後，藉由實施光硬化形成基底層3，進一步，將含有膽鹼酯酶4之親水性光硬化性樹脂重疊在基底層3之上部後，藉由進行光硬化而形成反應層5。

基底層3係做為使反應層5與容器2之結合物理性地安定化之基盤而使用，同時，可以使反應層5作成薄層，藉此，變成可以減輕在反應層5中所含之膽鹼酯酶4之量的結構。同時，在基底層3與反應層5中使用的親水性光硬化性樹脂可設為相同物質。

因此，反應層5中係含有膽鹼酯酶4。在此，作為膽鹼酯酶4者，係可以使用對乙醯膽鹼會進行特異性反應的乙醯膽鹼酯酶、與對膽鹼酯會進行一般反應的丁醯膽鹼酯酶中之任一種膽鹼酯酶，而在本發明中，尤其以使用丁醯膽鹼酯酶者為較佳態樣。

因此，在使用丁醯膽鹼酯酶時，作為發色基質者可以使用藉由與膽鹼酯酶反應而產生發色性強之脂溶性產物，例如，可以使用乙酸吲哚酯、丁酸5-溴-6-氯-3-吲哚酯(5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl butyrate)、辛酸-5-溴-6-氯-3-吲哚酯(5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl caprylate)、棕櫚酸-5-溴-4-氯-3-吲哚酯等，若考慮發色性等，則以乙酸吲哚酯為佳。

例如在使用乙酸吲哚酯時，藉由丁醯膽鹼酯酶所致之水解而生成靛藍(indigo)，靛藍在670nm附近具有最大吸收波長而發出藍色，由於是脂溶性而不會在試料液中擴散，而是留在樹脂內。因此，在使用丁醯膽鹼酯酶及乙酸吲哚酯時，除了可以避免因擴散使發色程度降低而減少感度的情形，更可以目視確認色彩之微細變化。

另一方面，在使用乙醯膽鹼酯酶時，雖可以使用5,5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸(5,5’-Dithiobis-2-nitrobenzoic acid；DTNB)為發色基質，但由於生成之5-硫基-2-硝基苯酸(TNB)為水溶性，故會由樹脂內向試樣溶液中擴散。進一步，TNB在412nm附近因為具有最大吸收波長而會發出黃色，故在溶液中很難以目視確認微細之顏色變化。因此，在本發明中，以使用丁醯膽鹼酯酶為宜。

再者，反應層5係藉由以曝氣處理或攪拌等作成有多量之空隙結構者為佳。此空隙，係從反應層之表面穿過反應層內之膽鹼酯酶者，藉此，試料溶液不僅滲入反應層之表面亦可滲入至內部，故可以提高膽鹼酯酶4與試料溶液之接觸性。空隙之大小，可對應試料溶液之黏性而形成，而以100μm至1000μm為宜，更佳可以是500μm左右。藉此，當在試料中存在膽鹼酯酶阻害性物質時，確實會引起膽鹼酯酶阻害反應。

再者，本發明之檢測裝置1之容器2可為密閉性，而以具優異之耐衝擊性或耐藥品性者為佳，例如，可使用樹脂製之微量離心管(microtube)，更具體而言，可以使用EPPENDORF公司製「Safe-Lock tube」等之市售品。如考量溶液之攪拌容易度與固定於底部之樹脂的物理安定性時，所使用之尺寸以1.5mL者為佳，又，固定之樹脂容量在考量攪拌容器內之液體時，以基底部100μL，反應部30μL左右者為佳。

因此，本發明之檢測套組，係含有本發明之前述檢測裝置、注射筒、管尖(column tip)、與發色基質者。

第2圖(a)是表示注射筒與管尖接連狀態之外觀模式圖，第2圖(b)是管尖之擴大模式圖。

如第2圖(a)所示，本發明之檢測套組係在注射筒6之前端部安裝管尖7而予以使用。

注射筒6可使用拋棄式者，若考慮使用便利性，用量是以10ml左右者為佳。

又，管尖係使用在其前端內部充填有管柱粒子8者。又考量試樣之操作性及試料濃縮的可行性時，以可儘可能處理微量之液量者為佳，可以使用市售之微滴管用管尖。如考量使用之溶液量時，所使用尺寸是以100μL左右者為佳。

藉由將如此之管尖安裝在注射筒6前端後予以使用，即可使用大量之液體，而可在管柱8進行試料的濃縮。另外，在本發明之檢測套組中，亦可作成管尖7預先接在注射筒6之套組的結構品。

再者，在此套組中所含之發色基質，如上述，可以使用藉由膽鹼酯酶所致之反應而產生發色性強的脂溶性產物，例如，可適用乙酸吲哚酯。在本發明之檢測裝置的反應層中，藉由丁醯膽鹼酯酶之水解而生成脂溶性之靛藍，由於在樹脂內是發出藍色，故此可藉由目視而予以確認。

其次，有關本發明之檢測方法的步驟，使用第3圖來說明。

在本發明之檢測方法中，可以將飲料水等作為試樣試料，此外，在檢測農作物等之殘留農藥時，例如，可同時將農作物與水放入袋等之內，密閉後經過強烈搖振者而當作試樣試料。

然後，藉由注射筒6採取此試料，使此試料保存在管柱後，藉由實施：1)試料之前處理、2)在本發明檢測裝置中添加試料(膽鹼酯酶阻害反應)、3)添加發色基質之步驟，可藉由目視而判定在試料中有無膽鹼酯酶阻害性物質的存在。

試料之前處理，係試料中含有有機磷系農藥時，為了謀求提高檢測感度而實施者。

具體上，藉由注射筒6吸取氧化劑9，並使其與管柱中所持有之試料接觸，藉此而使有機磷系農藥變化成含氧體。氧化劑例如可以使用：N-溴化琥珀醯亞胺(NBS)、溴水、次氯酸、過氧化氫等。若考量試藥之安定性或活性化效率，以NBS為適用。

依前述之處理，係增強100至1000倍左右之膽鹼酯酶阻害能力，而可提高檢測感度。

轉換成含氧體者，雖然可在試料中加入氧化劑而進行，但此情形下，因為也含有未反應之氧化劑而會變成與膽鹼酯酶反應，因此如考量到源自氧化劑之因素而使膽鹼酯酶失活，就只能使用低濃度之氧化劑。

而在本發明中，由於在保持有試料(有機磷系農藥)之管柱中使氧化劑9通過之形態，故以高濃度之氧化劑9處理後，可將未反應之氧化劑9廢棄。藉此，即能充分進行含氧體的轉換，而可以高感度檢測。

其次，將經過前述處理之試料自管柱洗提而可得到洗提液10。試料之洗提可用習知方法來進行。因此，將此洗提液10添入本發明之檢測裝置1中，當試料中含有膽鹼酯酶阻害性物質時，檢測裝置1之反應層5中，會引起膽鹼酯酶阻害反應。

接著，將發色基質添加到檢測裝置內。在此，作為檢測阻害反應之方法，亦可作成以下形態：加入與膽鹼酯酶反應之基質，再添加用以檢測出藉由此反應所致之產物之發色劑之形態。

因此，試料中含有膽鹼酯酶阻害性物質時，由於不會發生因膽鹼酯酶使所造成之發色基質之水解，故反應層5維持原有的無色透明的形態。

另一方面，試料中不含有膽鹼酯酶阻害性物質時，藉由發色基質之水解而造成之發色係在反應層5中產生。在使用乙酸吲哚酯作為發色基質時，可以用目視確認藍色之發色。

如上所述，若依本發明，就可以高感度並且簡便地判定試料中的膽鹼酯酶阻害性物質有無存在，尤其針對試料中之有機磷系農藥，如前所述，在進行試料之前處理時，即可以高感度地檢測出膽鹼酯酶阻害性物質。

實施例 ＜實施例1＞有機磷系農藥之檢測

依照第3圖所示步驟，進行有機磷系農藥之檢測。

首先，準備稀釋成0.1ppb濃度的作為試樣試料之大利松(diazinon)有機磷系農藥標準液的水溶液10mL，使用如第2圖所示在前端連接有管尖的注射筒予以吸取。

將已吸取之溶液排放在燒杯內，藉由重複3次吸取而在管柱中吸附試樣中之大利松後，同樣吸取1mL之1% NBS溶液，予以排出並轉換成含氧體後，由管柱中洗提大利松。

將此洗提液添加到第1圖中所示之檢測裝置中使膽鹼酯酶阻害反應產生。5分鐘後，在裝置內添加成為發色基質之乙酸吲哚酯溶液並進行5分鐘之發色反應。其結果，經由大利松而阻害膽鹼酯酶之酵素活性，而不產生發色，即可檢測出0.1ppb濃度的大利松。

同時，由於在試樣試料中不含大利松時，可以確認藍色之發色，故依照本發明之方法，顯示可以確實檢測出有機磷系農藥。

＜比較例1＞氧化處理的效果

為了調查實施例1之氧化處理(NBS溶液之吸取處理)的效果而進行比較實驗。與實施例1同樣，將試樣中的大利松吸附至管柱中後，不進行氧化處理(NBS溶液之吸取處理)而由管柱中洗提大利松。將此洗提液添加到檢測裝置中，並在裝置內添加乙酸吲哚酯溶液。

結果，由於大利松之檢測值是低至5ppm(5000ppb)，故顯示氧化處理之有效性。

＜實施例2＞胺基甲酸鹽(或酯)系農藥之檢測

檢測方法係依第3圖所示之步驟，由於以胺基甲酸鹽(或酯)系農藥為檢測對象，故不進行實施例1所進行的NBS溶液之吸取、排放操作。

作為試樣者，準備稀釋成10ppb濃度的加保利(NAC；Carbaryl)胺基甲酸鹽(或酯)系農藥標準液之水溶液10mL，以如第2圖所示之在前端連接有管尖的注射筒予以吸取。

將已吸取之溶液排放到燒杯內，藉由重複3次吸取而在管柱中吸附試樣中之NAC後，由管柱中洗提NAC。放入裝置中5分鐘使產生酵素阻害反應。

5分鐘後，在裝置內添加成為發色基質之乙酸吲哚酯溶液，進行5分鐘之發色反應。其結果，經由NAC而阻害膽鹼酯酶之酵素活性，而不產生發色，即可檢測出10ppb濃度的NAC。

＜實施例3＞

關於其他之農藥物質，以與實施例1及實施例2之方法進行相同之實驗時，可得到以下之結果。

如表1所示，本發明之裝置及方法，係確認比以往之方法有更優異之檢測感度。同時，在上述實施例1、2及表1中所示檢測值可依據發色基質、管柱等而變化者，並非顯示藉由本發明之裝置及方法所得之檢測限制。又，在表1中付有＊記號者是表示胺基甲酸鹽(或酯)系農藥。

[產業上之可利用性]

本發明係提供一種以低成本即可由目視判定之高感度之膽鹼酯酶阻害性物質之檢測裝置、檢測套組及檢測方法。

1．．．膽鹼酯酶阻害性物質檢測裝置

2．．．容器

3．．．基底層

4．．．膽鹼酯酶

5．．．反應層

6．．．注射筒

7．．．管尖

8．．．管柱粒子

9．．．氧化劑

10．．．洗提液

第1圖係表示本發明之膽鹼酯酶阻害性物質檢測裝置之模式結構圖。

第2圖(a)及(b)係表示在試樣之濃縮及有機磷系農藥之氧化中使用的注射筒及管尖模式圖。

第3圖係表示膽鹼酯酶阻害性物質檢測方法之步驟圖。

1．．．膽鹼酯酶阻害性物質檢測裝置

2．．．容器

3．．．基底層

4．．．膽鹼酯酶

5．．．反應層

Claims (8)

1. 一種膽鹼酯酶阻害性物質檢測裝置，其特徵為在容器內底部之基底層之上，固定有含有膽鹼酯酶之反應層，其中，前述基底層係將親水性光硬化性樹脂添加於前述容器內後藉由進行光硬化而形成者，前述反應層係將含有膽鹼酯酶之親水性光硬化性樹脂重疊在前述基底層之上部後藉由進行光硬化而形成者。
2. 如申請專利範圍第1項之膽鹼酯酶阻害性物質檢測裝置，其中，在反應層中形成空隙。
3. 一種膽鹼酯酶阻害性物質檢測套組，其特徵係含有：如申請專利範圍第1或2項之檢測裝置、注射筒、可安裝在注射筒之前端部並具有管柱粒子充填於內部之管尖、以及藉由與膽鹼酯酶反應而產生發色之基質。
4. 如申請專利範圍第3項之膽鹼酯酶阻害性物質檢測套組，其中，藉由與膽鹼酯酶反應而產生發色之基質係乙酸吲哚酯。
5. 一種膽鹼酯酶阻害性物質檢測方法，係判定試料中是否存在有膽鹼酯酶阻害性物質之方法，其特徵是：1)在申請專利範圍第1或2項之檢測裝置內添加試料；2)添加藉由與膽鹼酯酶之反應而產生發色之基質；3)如不產生發色，則判定在試料中存在有膽鹼酯酶阻害性物質。
6. 如申請專利範圍第5項之膽鹼酯酶阻害性物質檢測方法，其係經由管柱捕集試料並進行氧化處理後，予以添 加至申請專利範圍第1或2項的檢測裝置內。
7. 一種有機磷系農藥之檢測方法，其係判定試料中是否存在有有機磷系農藥之方法，其特徵是：1)經由管柱捕集試料並進行氧化處理；2)將此試料添加至申請專利範圍第1或2項的檢測裝置內；3)添加藉由與膽鹼酯酶之反應而產生發色之基質；4)如不產生發色，則判定在試料中存在有膽鹼酯酶阻害性物質。
8. 如申請專利範圍第5至7項中任一項的檢測方法，其中，藉由與膽鹼酯酶之反應而產生發色之基質係乙酸吲哚酯。