KR101603129B1 - 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치, 검출키트 및 검출방법 - Google Patents

콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치, 검출키트 및 검출방법 Download PDF

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Abstract

용기내 저부에 기저층을 고정하고, 이 기저층 상에 콜린에스테라제를 함유하는 반응층을 고정해서 검출장치로 하고, 이 검출장치에 시료를 첨가하여 발색반응에 의해 시료 중의 콜린에스테라제 저해성 물질의 존재를 목시 판정한다. 또한, 유기인계 농약의 검출에 있어서는 컬럼 상에서 시료와 산화제를 접촉시켜서 옥손체로의 변환을 행한다.

Description

콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치, 검출키트 및 검출방법{APPARATUS, KIT AND METHOD FOR DETECTION OF CHOLINESTERASE-INHIBITING SUBSTANCE}
본 발명은 콜린에스테라제 저해성 물질 검사장치, 검출키트 및 검출방법에 관한 것이다.
종래부터, 농작물이나 음료수 등에 잔류하는 농약 성분이 인체에 악영향을 미치는 것이 알려져 있다.
그리고, 특히 콜린에스테라제 저해성 물질을 함유하는 유기인계 농약이나 카바메이트계 농약은 신경장애를 일으키기 때문에 큰 문제가 되고 있다.
이러한 상황으로부터, 안심 안전한 음식물, 음료수 등의 공급을 위해서 잔류 농약의 검출기술의 개발이 소망되고, 지금까지 각종 농약 검출장치 및 검출방법이 제안되어 있다.
종래 행해져 온 농약 검출방법의 대부분은 가스 크로마토그래프(GC), 가스 크로마토그래프 질량 분석계(GC/MS), 액체 크로마토그래프(LC), 액체 크로마토그래프 질량 분석계(LC/MS)와 같은 분석 기기를 사용하는 것이었다.
이러한 분석방법은 고감도로 동정, 정량이 가능하다고 하는 이점을 가진 한편, 대형 장치가 필요하고 또한 손기술도 번잡하고 검사에 시간이 걸리기 때문에 많은 검체의 분석이나 현장에서의 검사가 불가능하다고 하는 결점을 갖고 있다.
이와 같이, 기기분석에는 수고와 시간이 걸리기 때문에 유기인계 농약이나 카바메이트계 농약에 있어서는, 예를 들면 특허문헌 1과 같이 농약 중에 포함되는 콜린에스테라제 저해성 물질이 콜린에스테라제를 불활성화시켜서 가수분해 활성을 저하시키는 작용을 이용하여 가수분해에 의한 기질의 분해량을 측정하는 것에 의한 농약의 검출방법이 제안되어 있다.
그러나, 특허문헌 1의 방법에 있어서는 가수분해 생성물의 발색반응이 약하여 흡광도 측정에 의해 기질의 분해량을 측정하기 때문에 간편하게 목시 판정할 수 없어 검출의 신속성에 문제가 있다.
또한, 특허문헌 1의 방법과 같은 원리를 이용하여 시료 중의 유기인계 농약 및 카바메이트계 농약의 존재를 간편하게 목시 판정할 수 있는 검출키트로서, 예를 들면 Neogen Corp.의 AT-10/AT-25(Agri-Screen Ticket 10/25) 등도 판매되고 있다.
특허문헌 1: 일본 특허공개 평09-107992호
그러나, 상기와 같은 검출키트는 검출감도가 반드시 충분하지 않고, 예를 들면 카르바릴 7.0ppm, 클로로피리포스 0.7ppm, 클로로피리포스메틸 1.0ppm, 다이아지논 2.0ppm 정도가 검출 한계이었다.
그리고, 콜린에스테라제 저해성이 있는 유기인계, 카바메이트계 농약의 잔류 농약 분석에 있어서는 일본에서는 2006년 5월 29일부터 식품 위생법의 일부가 개정되어 식품 중의 잔류 농약 농도의 기준치가 변경됨으로써 이들 검출키트의 거의는 새로운 기준치에 대해서는 감도 부족이이서 간편성을 유지하면서도 새로운 검출 감도의 향상이 소망되고 있었다.
본 발명은 이상한 바와 같은 사정을 감안한 것으로, 저비용이고 목시에 의한 판정이 가능하며 고감도인 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출장치, 검출키트 및 검출방법을 제공하는 것을 과제로 하고 있다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서, 제 1 실시형태로는 용기내 저부의 기저층 상에 콜린에스테라제를 함유하는 반응층이 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치를 제공한다. 또한, 제 2 실시형태로는 반응층에는 공극이 형성되어 있는 검출장치를, 제 3 실시형태로는 상기 제 1 또는 2 실시형태에 있어서 기저층 및 반응층이 친수성 광경화성 수지로 이루어진 검출장치를 제공한다.
또한, 제 4 실시형태로는 상기 제 1 실시형태 내지 제 3 실시형태 중 어느 하나에 기재된 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치와, 시린지와, 시린지의 선단부에 부착가능함과 아울러 컬럼 입자가 내부에 충전되어 있는 컬럼칩과, 콜린에스테라제와의 반응에 의해 발색이 일어나는 기질을 포함하는 콜린에스테라제 저해성 물질 검출키트를 제공하고, 제 5 실시형태로는 상기 제 4 실시형태에 있어서 콜린에스테라제와의 반응에 의해 발색이 일어나는 기질은 아세트산 인독실인 콜린에스테라제 저해성 물질 검출키트를 제공한다.
또한, 제 6 실시형태로는 시료 중의 콜린에스테라제 저해성 물질의 존재를 판정하는 방법으로서, 1) 시료를 상기 제 1 실시형태 내지 제 3 실시형태 중 어느 하나에 기재된 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치 내에 첨가하고, 2) 콜린에스테라제와의 반응에 의해 발색이 일어나는 기질을 첨가하고, 3) 발색이 일어나지 않았을 경우에 시료 중에 콜린에스테라제 저해성 물질이 존재한다고 판정하는 콜린에스테라제 저해성 물질 검출방법을 제공하고, 제 7 실시형태로는 상기 제 6 실시형태에 있어서 시료를 컬럼에 의해 포착하여 산화 처리를 행한 후에 상기 제 1 실시형태 내지 제 3 실시형태 중 어느 하나에 기재된 검출장치 내에 첨가하는 콜린에스테라제 저해성 물질 검출방법을, 제 8 실시형태로는 시료 중의 유기인계 농약의 존재를 판정하는 방법으로서, 1) 시료를 컬럼에 의해 포착하여 산화 처리를 행하고, 2) 상기 시료를 상기 제 1 실시형태 내지 제 3 실시형태 중 어느 하나에 기재된 검출장치 내에 첨가하고, 3) 콜린에스테라제와의 반응에 의해 발색이 일어나는 기질을 첨가하고, 4) 발색이 일어나지 않았을 경우에 시료 중에 콜린에스테라제 저해성 물질이 존재한다고 판정하는 유기인계 농약의 검출방법을, 제 9 실시형태로는 상기 제 6 실시형태 내지 제 8 실시형태 중 어느 하나에 있어서 콜린에스테라제와의 반응에 의해 발색이 일어나는 기질은 아세트산 인독실인 검출방법을 제공한다.
본 발명의 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치에 의하면 기저층의 존재에 의해 반응층에 사용하는 액량이 소량이어도 좋아서 콜린에스테라제의 사용량을 억제할 수 있기 때문에 비용을 삭감할 수 있다.
또한, 반응층은 공극을 갖고 있음으로써 용액 시료가 효율적으로 침투하기 때문에 콜린에스테라제 저해반응의 유무를 신속하게 고감도로 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출키트에 의하면 본 발명의 검출방법을 용이하게 실시하는 것이 가능하고, 본 발명의 검출방법에 의하면 분석 전에 유기인계 농약을 컬럼 상에서 옥손체로 변화시키기 때문에 반응의 효율화가 도모되어 고농도의 산화제의 사용이 가능해지기 때문에 검출 감도를 향상시킬 수 있다. 그리고, 검사 결과를 용기 내의 반응층의 발색을 목시로 확인함으로써 간편하게 콜린에스테라제 저해성 물질의 존재를 판정 가능하게 하기 때문에, 잔류 농약의 검사를 출하 현장이나 판매 현장 등에서 용이하게 행하는 것이 가능해져서 음식물이나 음료수 등의 안전성에 크게 공헌할 수 있다.
도 1은 본 발명의 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치의 모식 구성도이다.
도 2는 샘플의 농축 및 유기인계 농약의 산화에 사용하는 시린지 및 컬럼칩을 나타내는 모식도이다.
도 3은 콜린에스테라제 저해성 물질 검출방법을 나타내는 공정도이다.
본 발명에 의해 검출이 가능한 물질은 콜린에스테라제 저해성 물질이며, 유기인계 농약, 카바메이트계 농약, 불소, 비소 등 중 1종 또는 2종 이상이다.
또한, 여기에서 말하는 「검출」이란 시료 중에 특정 물질이 존재하는지의 여부를 결정하는 것을 말한다.
본 발명의 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치의 구체예에 대해서 도 1을 사용해서 설명한다.
이 검출장치(1)는 용기(2)내 저부의 기저층(3) 상에 콜린에스테라제(4)를 함유하는 반응층(5)이 적층상태로 고정되어 있고, 이 장치 내에 분석 시료를 첨가함으로써 반응층(5)에 있어서의 콜린에스테라제 저해 반응의 유무를 목시 판정 가능하게 하는 것이다.
기저층(3) 및 반응층(5)은 고정시에 효소 활성에 데미지를 주지 않는 재료가 바람직하고, 예를 들면 친수성 광경화성 수지에 의해 형성할 수 있다. 그리고, 구체적으로는, 우선 용기(2)에 친수성 광경화성 수지를 첨가한 후 광경화를 행함으로써 기저층(3)을 형성하고, 또한 콜린에스테라제(4)를 함유하는 친수성 광경화성 수지를 기저층(3)의 상부에 중층한 후 광경화를 행함으로써 반응층(5)을 형성할 수 있다.
기저층(3)은 반응층(5)과 용기(2)의 결합을 물리적으로 안정시키는 기반으로서 사용할 수 있음과 아울어 반응층(5)을 박층으로 하는 것을 가능하게 하고, 이것에 의해 반응층(5)에 함유시키는 콜린에스테라제(4)의 양을 경감할 수 있는 구조로 되어 있다. 또한, 기저층(3)과 반응층(5)에 사용하는 친수성 광경화성 수지는 동일한 것으로 할 수 있다.
그리고, 반응층(5)에는 콜린에스테라제(4)가 함유되어 있다. 여기에서, 콜린에스테라제(4)로서는 아세틸콜린에 특이적으로 반응하는 아세틸콜린에스테라제와 콜린에스테르에 일반적으로 반응하는 부틸콜린에스테라제 모두 사용하는 것이 가능하지만, 본 발명에 있어서는 특히 부틸콜린에스테라제를 사용하는 것을 바람직한 형태로 하고 있다.
그리고, 부틸콜린에스테라제를 사용했을 경우, 발색 기질로서 콜린에스테라제에 의한 반응에 의한 발색성이 강하고 지용성 생성물을 생성하는 것을 사용하는 것이 가능하고, 예를 들면 아세트산 인독실, 5-브로모-6-클로로-3-인독실 부티레이트, 5-브로모-6-클로로-3-인독실 카프릴레이트, 5-브로모-4-클로로-3-인독실 팔미테이트 등을 사용할 수 있고, 발색성 등을 고려하면 아세트산 인독실이 바람직하다.
예를 들면, 아세트산 인독실을 사용했을 경우에는 부틸콜린에스테라제에 의한 가수분해에 의해 인디고가 생성된다. 인디고는 670nm 부근에 최대 흡수파장을 갖고 청색으로 발색하고, 지용성이기 때문에 시료액 중으로는 확산하지 않고 수지내에 체류한다. 따라서, 부틸콜린에스테라제 및 아세트산 인독실을 사용했을 경우, 확산에 의한 발색 정도의 저하에 의한 감도 감소를 회피하는 것이 가능하고, 또한 색채적으로 미세한 변화를 목시로 확인하는 것이 가능하다.
한편, 아세틸콜린에스테라제를 사용할 경우, 발색 기질에 5,5'-디티올비스-2-니트로벤조산(DTNB)을 사용할 수 있지만, 생성되는 5-티오-2-니트로벤조산(TNB)은 수용성이기 때문에 수지 내로부터 샘플 용액 중으로 확산해버린다. 또한, TNB는 412nm 부근에 최대 흡수파장을 갖고 황색으로 발색하기 때문에, 용액 중에서는 미세한 색의 변화를 목시로 확인하는 것은 어렵다. 따라서, 본 발명에 있어서는 부틸콜린에스테라제가 바람직하게 사용된다.
또한, 반응층(5)은 폭기처리나 교반 등에 의해 다수의 공극을 갖는 구조로 하는 것이 바람직하다. 이 공극은 반응층의 표면으로부터 반응층 내의 콜린에스테라제로 통하는 것으로, 이것에 의해 반응층 표면뿐만 아니라 내부로까지 시료 용액이 침투하는 것이 가능해지기 때문에 콜린에스테라제(4)와 시료 용액의 접촉성이 향상된다. 공극의 크기는 시료 용액의 점성에 따라서 형성할 수 있지만, 바람직하게는 100㎛∼1000㎛, 더욱 바람직하게는 500㎛ 정도로 할 수 있다. 이것에 의해, 시료 중에 콜린에스테라제 저해성 물질이 존재할 경우에는 확실하게 콜린에스테라제 저해 반응이 일어나게 된다.
또한, 본 발명의 검출장치(1)의 용기(2)는 밀폐가 가능하고, 내충격성이나 내약품성이 우수한 것이 바람직하고, 예를 들면 수지제의 마이크로튜브, 더욱 구체적으로는 Eppendorf사의 「Safe-Lock tube」등의 시판품을 사용할 수 있다. 용액의 교반 용이성과 저부에 고정하는 수지의 물리적 안정성을 고려하면, 사용하는 사이즈는 1.5mL의 것이 바람직하고, 또한 고정하는 수지의 용량은 용기 내에서 액을 교반하는 것을 고려하면, 기저부에서는 100μL, 반응부에서는 30μL 정도가 바람직하다.
그리고, 본 발명의 검출키트는 본 발명의 상기 검출장치와, 시린지와, 컬럼칩과, 발색 기질을 포함하는 것이다.
도 2(a)는 시린지와 컬럼칩을 접속한 상태를 나타내는 외관 모식도이며, 도 2(b)는 컬럼칩의 확대 모식도이다.
도 2(a)에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 검출키트는 시린지(6)의 선단부에 컬럼칩(7)을 부착해서 사용한다.
시린지(6)는 １회용의 것을 사용할 수 있고, 사용 편이성을 고려하면 용량은 10ml 정도의 것이 바람직하다.
또한, 컬럼칩(7)은 그 선단 내부에 컬럼 입자(8)가 충전되어 있는 것을 사용한다. 샘플링의 조작성이나 시료 농축을 행하는 것도 고려하면, 가능한 한 미량의 액량을 취급하는 것이 바람직하고, 시판되어 있는 마이크로피펫용 칩을 사용할 수 있다. 사용하는 용액량을 고려하면, 사용하는 사이즈는 100μL 정도의 것이 바람직하다.
이러한 컬럼칩(7)을 시린지(6)의 선단에 부착해서 사용함으로써 대량의 액체를 사용하는 것이 가능해져서 컬럼(8)에 시료를 농축하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 검출키트에 있어서는 미리 시린지(6)에 컬럼칩(7)을 접속한 것을 키트의 구성품으로 할 수도 있다.
또한, 이 키트에 포함되는 발색 기질은, 상술한 바와 같이, 콜린에스테라제에 의한 반응에 의한 발색성이 강하고 지용성 생성물을 생성하는 것을 사용할 수 있고, 예를 들면 아세트산 인독실을 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명의 검출장치의 반응층 중의 부틸콜린에스테라제의 가수분해에 의해 지용성인 인디고가 생성되어 수지 내에서 청색으로 발색하기 때문에, 이것을 목시에 의해 확인하는 것이 가능하다.
다음에, 본 발명의 검출방법의 공정에 대해서 도 3을 사용해서 설명한다.
본 발명의 검출방법에 있어서는 음료수 등을 샘플 시료로 할 수 있고, 또한 농작물 등의 잔류 농약을 검사할 경우에는, 예를 들면 농작물을 물과 함께 자루 등에 넣고 밀폐해서 강하게 흔든 것을 샘플 시료로 할 수 있다.
그리고, 시린지(6)에 의해 이 시료를 채취하고, 시료를 컬럼에 유지시킨 후,
1) 시료 전처리, 2) 본 발명의 검출장치로의 시료의 첨가(콜린에스테라제 저해반응), 3) 발색 기질의 첨가의 공정을 행함으로써 시료 중의 콜린에스테라제 저해성 물질의 존재 유무를 목시 판정할 수 있다.
시료 전처리는 시료 중에 유기인계 농약이 포함된 경우에는 검출 감도의 향상을 도모하기 위해서 행한다.
구체적으로는, 산화제(9)를 시린지(6)에 의해 흡인시켜 컬럼 중에 유지되어 있는 시료와 접촉시킴으로써 유기인계 농약을 옥손체로 변화시킨다. 산화제는, 예를 들면 N-브로모숙신산 이미드(NBS), 브롬수, 차아염소산, 과산화수소 등을 사용할 수 있고, 시약의 안정성이나 활성화 효율을 고려하면 NBS를 바람직하게 사용할 수 있다.
이 전처리에 의해 100-1000배 정도 콜린에스테라제 저해 능력이 증강되어 검출 감도를 향상시킬 수 있다.
옥손체로의 변화는 시료 중에 산화제를 첨가해서 행할 수도 있지만, 이 경우 미반응 산화제도 포함하여 콜린에스테라제와 반응하게 되기 때문에, 산화제 유래의 원인에 의한 콜린에스테라제의 실활을 고려하면 저농도의 산화제밖에 사용할 수 없다.
그래서, 본 발명에 있어서는 시료(유기인계 농약)가 유지된 컬럼에 산화제(9)를 통과시키는 형태로 함으로써, 고농도의 산화제(9)로 처리한 후 미반응 산화제(9)를 폐기하는 것을 가능하게 하고 있다. 이것에 의해, 옥손체로의 변환이 충분히 행해지게 되어 고감도의 검출을 가능하게 하고 있다.
다음에, 상기 처리를 거친 시료를 컬럼으로부터 용출시켜서 용출액(10)을 얻는다. 또한, 시료의 용출은 공지의 방법으로 행할 수 있다. 그리고, 이 용출액(10)을 본 발명의 검출장치(1)에 첨가한다. 시료 중에, 콜린에스테라제 저해성 물질이 포함되어 있을 경우에는 검출장치(1)의 반응층(5)에 있어서 콜린에스테라제 저해 반응이 일어난다.
이어서, 발색 기질을 검출장치에 첨가한다. 여기에서, 저해 반응을 검출하는 방법으로서는 콜린에스테라제와 반응하는 기질을 가하고, 이 반응에 의한 생성물을 검출하는 발색제를 첨가하는 형태로 하는 것도 가능하다.
그리고, 시료 중에 콜린에스테라제 저해성 물질이 포함되어 있을 경우에는 콜린에스테라제에 의한 발색 기질의 가수분해가 일어나지 않기 때문에 반응층(5)은 무색 투명한 채로 있다.
한편, 시료 중에 콜린에스테라제 저해성 물질이 포함되어 있지 않을 경우에는 발색 기질의 가수분해에 의한 발색이 반응층(5)에서 일어나게 된다. 발색 기질로서 아세트산 인독실을 사용했을 경우에는 청색 발색이 목시로 확인된다.
이상과 같이, 본 발명에 의하면 고감도이고 또한 간편하게 시료 중의 콜린에스테라제 저해성 물질의 존재 유무를 판정할 수 있고, 특히 시료 중의 유기인계 농약에 대해서는 상기와 같이 시료 전처리를 행함으로써 고감도로 콜린에스테라제 저해성 물질을 검출하는 것이 가능하게 된다.
실시예
<실시예 1> 유기인계 농약의 검출
도 3에 나타내는 공정에 따라서 유기인계 농약의 검출을 행했다.
우선, 샘플 시료가 되는 유기인계 농약인 다이아지논 표준액을 0.1ppb의 농도로 희석한 수용액 10mL를 준비하고, 도 2에 나타낸 컬럼칩을 선단에 접속한 시린지를 사용해서 흡인했다.
흡인한 용액을 비이커 내에서 배출, 흡인을 3회 반복함으로써 컬럼에 샘플 중의 다이아지논을 흡착시킨 후, 마찬가지로 1% NBS 용액을 1mL 흡인, 배출해서 옥손체로 변화시킨 후 컬럼으로부터 다이아지논을 용출시켰다.
이 용출액을 도 1에 나타낸 검출장치 중에 첨가해서 콜린에스테라제 저해 반응을 일으켰다. 5분 후, 발색 기질이 되는 아세트산 인독실 용액을 장치 내에 첨가하고, 5분간 발색반응을 행했다. 그 결과, 다이아지논에 의해 콜린에스테라제의 효소활성이 저해되어 발색은 일어나지 않고, 다이아지논은 0.1ppb의 농도로 검출이 가능했다.
또한, 샘플 시료에 다이아지논이 포함되지 않은 경우에는 청색의 발색이 확인되었으므로, 본 발명의 방법에 의해 유기인계 농약을 확실하게 검출할 수 있는 것을 나타내었다.
<비교예 1> 산화 처리의 효과
실시예 1의 산화 처리(NBS 용액의 흡인 처리)의 효과를 확인하기 위해서 비교 실험을 행했다. 실시예 1과 마찬가지로 컬럼에 샘플 중의 다이아지논을 흡착시킨 후, 산화 처리(NBS 용액의 흡인 처리)를 행하지 않고 컬럼으로부터 다이아지논을 용출시켰다. 이 용출액을 검출장치 중에 첨가하고, 아세트산 인독실 용액을 장치 내에 첨가했다.
그 결과, 다이아지논의 검출치는 5ppm(5000ppb)으로 저하했으므로, 산화 처리의 유효성이 나타내졌다.
<실시예 2> 카바메이트계 농약의 검출
검출방법은 도 3에 나타내는 공정을 따르지만, 카바메이트계 농약이 검출 대상이기 때문에 실시예 1에서 행한 NBS 용액의 흡인, 배출 조작은 행하지 않았다.
샘플로서 카바메이트계 농약인 카르바릴(NAC) 표준액을 10ppb의 농도로 희석한 수용액 10mL를 준비하고, 도 2에 나타내는 컬럼칩을 선단에 접속한 시린지로 흡인했다.
흡인한 용액을 비이커 내에서 배출, 흡인을 3회 반복함으로써 컬럼에 샘플 중의 NAC를 흡착시킨 후 컬럼으로부터 NAC를 용출시키고, 장치 중에 넣어 5분간 효소 저해반응을 일으켰다.
5분 후, 발색 기질이 되는 아세트산 인독실 용액을 장치 내에 첨가하고, 5분간 발색반응을 행했다. 그 결과, NAC에 의해 콜린에스테라제의 효소활성이 저해되어 발색이 일어나지 않고, NAC는 10ppb의 농도로 검출이 가능했다.
<실시예 3>
기타 농약 물질에 대해서도 실시예 1 및 실시예 2의 방법과 마찬가지로 시험한 바 이하의 결과가 얻어졌다.
농약명 검출치(ppb) 농약명 검출치(ppb)
EPN 40 터부포스 10
아진포스에틸 1 파라티온 0.8
아진포스메틸 8 피리다펜티온 1
이속사티온 0.2 피리미포스메틸 20
에티온 10 페나미포스 4
에토프로포스 100 페니트로티온 40
에트림포스 10 펜술포티온 100
퀴날포스 0.1 부타미포스 100
쿠마포스 2 프로파포스 1
클로르피리포스 0.2 브로모포스에틸 10
클로르피리포스메틸 1 포살론 6
클로르펜빈포스 40 포레이트 80
살리티온 100 모노크로토포스 100
시아노펜포스 100 티오디카르브* 20
디클로펜티온 100 피리미카르브* 8
디메틸빈포스(E) 100
디메틸빈포스(Z) 100
술프로포스 20
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 장치 및 방법은 종래 방법보다 검출 감도가 우수한 것이 확인되었다. 또한, 상기 실시예 1, 2 및 표 1에 나타내는 검출치는 발색 기질, 컬럼 등에 의해 변화될 수 있는 것이며, 본 발명의 장치 및 방법에 의한 검출 한계를 나타내는 것이 아니다. 또한, 표 1에 있어서의 *은 카바메이트계 농약인 것을 나타내고 있다.
(산업상의 이용 가능성)
저비용이고, 목시에 의한 판정이 가능하고, 고감도인 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출장치, 검출키트 및 검출방법을 제공한다.
1: 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치 2: 용기
3: 기저층 4: 콜린에스테라제
5: 반응층 6: 시린지
7: 컬럼칩 8: 컬럼
9: 산화제 10: 용출액

Claims (10)

  1. 용기내 저부에 친수성 광경화성 수지로 이루어진 기저층이 고정되고, 상기 기저층 상에 콜린에스테라제를 함유하는 친수성 광경화성 수지로 이루어진 반응층이 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 반응층에는 공극이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 용기는 수지제 마이크로튜브인 것을 특징으로 하는 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 콜리에스테라제 저해성 물질 검출장치와, 시린지와, 상기 시린지의 선단부에 부착가능함과 아울러 컬럼 입자가 내부에 충전되어 있는 컬럼칩과, 콜린에스테라제와의 반응에 의해 발색이 일어나는 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 콜린에스테라제 저해성 물질 검출키트.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 콜린에스테라제와의 반응에 의해 발색이 일어나는 기질은 아세트산 인독실인 것을 특징으로 하는 콜린에스테라제 저해성 물질 검출키트.
  6. 시료 중의 콜린에스테라제 저해성 물질의 존재를 판정하는 방법으로서:
    1) 시료를 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치 내에 첨가하고;
    2) 콜린에스테라제와의 반응에 의해 발색이 일어나는 기질을 첨가하고;
    3) 발색이 일어나지 않았을 경우에 시료 중에 콜린에스테라제 저해성 물질이 존재한다고 판정하는 것을 특징으로 하는 콜린에스테라제 저해성 물질 검출방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    시료를 컬럼에 의해 포착하여 농축하고, 산화제를 흡인, 배출하여 산화 처리를 행한 후에 산화제를 제거하고, 상기 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치 내에 첨가하는 것을 특징으로 하는 콜린에스테라제 저해성 물질 검출방법.
  8. 시료 중의 유기인계 농약의 존재를 판정하는 방법으로서:
    1) 시료를 컬럼에 의해 포착하여 농축하고, 산화제를 흡인, 배출하여 산화 처리를 행한 후에 산화제를 제거하고;
    2) 상기 시료를 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 콜린에스테라제 저해성 물질 검출장치 내에 첨가하고;
    3) 콜린에스테라제와의 반응에 의해 발색이 일어나는 기질을 첨가하고;
    4) 발색이 일어나지 않았을 경우에 시료 중에 콜린에스테라제 저해성 물질이 존재한다고 판정하는 것을 특징으로 하는 유기인계 농약의 검출방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 콜린에스테라제와의 반응에 의해 발색이 일어나는 기질은 아세트산 인독실인 것을 특징으로 하는 콜린에스테라제 저해성 물질 검출방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 콜린에스테라제와의 반응에 의해 발색이 일어나는 기질은 아세트산 인독실인 것을 특징으로 하는 유기인계 농약의 검출방법.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2491708B (en) 2011-06-07 2014-01-29 Bp Childrens Prod Hk Co Ltd Child Safety Seat
KR101723097B1 (ko) 2015-02-17 2017-04-19 대한민국 신경작용제 노출 진단 방법 및 이에 사용되는 멀티 챔버 킷
JP2016187318A (ja) * 2015-03-30 2016-11-04 株式会社サタケ 残留農薬測定方法
CN105606800B (zh) * 2016-01-27 2017-06-20 广州聚佰生物科技有限公司 一种广谱农药检测金标试纸及方法
KR101996221B1 (ko) * 2017-07-14 2019-07-04 주식회사 넥스바이오 콜린에스테라제 저해성 물질 검출 키트
KR20210125206A (ko) * 2020-04-08 2021-10-18 건국대학교 산학협력단 세포외소포체를 포함한 살충제 검출용 조성물 및 이의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003004720A (ja) * 2001-06-19 2003-01-08 Kanto Chem Co Inc 検体中に含まれるコリンエステラーゼ阻害物質を検出する方法及びそれに用いるテストキット

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4324858A (en) * 1980-06-16 1982-04-13 Midwest Research Institute Stabilization of cholinesterase, detector kit using stabilized cholinesterase, and methods of making and using the same
JPH01157386A (ja) * 1987-12-11 1989-06-20 Daicel Chem Ind Ltd マイクロカプセル化酵素
JP2927221B2 (ja) * 1995-10-16 1999-07-28 株式会社島津製作所 農薬検出装置
AU4660800A (en) * 1999-04-26 2000-11-10 U.S. Army Medical Research And Materiel Command Immobilized enzymes as biosensors for chemical toxins
CN1321194C (zh) * 2002-12-30 2007-06-13 高希武 农药残毒检测试剂盒、其制备方法
CN1687756A (zh) * 2004-12-27 2005-10-26 南京农业大学 一种农药残留快速检测试剂盒及其用法
KR20060104704A (ko) * 2005-03-31 2006-10-09 주식회사 소일테크 아세틸콜린에스터라제 또는 그 변이체와 감광물질이부착되어 있는 잔류 농약 검출용 스트립
JP2006333704A (ja) * 2005-05-31 2006-12-14 Satake Corp 残留農薬検査方法およびその装置
SG178773A1 (en) * 2006-11-13 2012-03-29 Ateris Technologies Llc Pesticide biomarker

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003004720A (ja) * 2001-06-19 2003-01-08 Kanto Chem Co Inc 検体中に含まれるコリンエステラーゼ阻害物質を検出する方法及びそれに用いるテストキット

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sensors and Actuators B. 38-39:426-431(1997.03)*

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