KR101723097B1 - 신경작용제 노출 진단 방법 및 이에 사용되는 멀티 챔버 킷 - Google Patents

신경작용제 노출 진단 방법 및 이에 사용되는 멀티 챔버 킷 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경작용제 노출 진단 방법에 있어서,신경작용제에 노출되지 않은 건강한 인체에서 채취된 혈액 샘플에서 혈청(serum)을 분리하는 단계;상기 분리된 혈청을 버퍼(buffer)용액과 혼합하여 안정화된 상태인 신경작용제에 노출되지 않은 정상인 Butyrylcholinesterase 활성도를 측정하는 단계;상기 분리된 혈청을 버퍼(buffer)용액과 혼합한 후 안정화된 상태에서 유기인계열(organophosphate) 약물을 첨가하여 신경작용제에 노출된 오염된 상태의Butyrylcholinesterase 활성도를 측정하는 단계; 상기 신경작용제에 노출되지 않은 정상상태와 노출된 오염된 상태의Butyrylcholinesterase 활성도의 측정된 결과를 비교 분석하는 단계 및 신경작용제에 오염 의심 환자에서 채취된 혈청을 버퍼용액과 혼합한 후 Butyrylcholinesterase 활성도를 측정하여 상기 분석 단계 결과에 적용하여 오염여부를 판단하는 단계로 구성될 수 있는 신경작용제 노출 진단 방법 및 이를 진단하는 멀티 챔버 킷에 관한 발명이다.

Description

신경작용제 노출 진단 방법 및 이에 사용되는 멀티 챔버 킷{The Method for screening of nerve agent intoxication and The Multichamber kit used thereof}
본 발명은 신경작용제 노출 진단 방법 및 이에 사용되는 멀티 챔버 킷에 관한 것으로, 구체적으로는 유기인계열(organophosphate) 신경작용제(soman, sarin 등) 노출에 대한 선별검사에 관한 것으로 유기인계 신경작용제의 체내 흡수 후 작용분자인 acetylcholie esterase(AChE)의 활성도를 진단하는 방법 및 단순화한 공정으로 측정하는 멀티 챔버 킷에 관한 것이다.
우리나라의 지정학적 중요성을 뿐만 아니라 북한의 위협은 분단 이후 상존하고 있으며 최근까지 연평도 포격，천안함 폭침 등 현실적인 위협이 되고 있다. 더구나 북한은 세계 세 번째 생/화학무기 보유국으로서 20여 종에 달하는 5천여 톤의 화학 작용제를 전역에 분산 저장하고 있으며 이 가운데 특히 사린과 vx 같은 신경 작용제，화학 작용제 생산에 집중하는 것으로 알려졌다.
일반적으로 대규모의 화학무기 살포의 경우 의심할 수 있는 징후 또는 징조의 포착이 보다 용이할 수도 있으나，국지적으로 또는 소규모 및 특정인 특정구역에 신경작용제가 살포될 경우 현장에서 이를 확인하고 피해확산을 막는데 어려움이 크다. 특히 일부신경작용제의 경우 무색,무취의 물리적 특성을 고려할 경우 이러한 위험성은 더욱 크게 느껴질 수 있다.
비록 생화학전 관련 대처에 대하여 전담 화학부대가 있으나, 특징적인 징후 없이 신경작용제가 살포되는 경우 발생하는 환자에 대한 현장적용 (최소단위 부대 또는 야전)이 가능한 진단 기술은 미비한 수준이다. 특히 정밀장비가 구비되지 않는 야전의 일선부대의 경우 의증환자가 발생하더라도 이에 대하여 증상에 근거한 진단 외에 적용할 수 있는 방법은 거의 없다.
이에 따라 신경 작용제에 대한 노출 여부를 평가할 수 없는 야전 상황에서 의증 환자 발생 시 빠르게 진단 가능한 검사 기술이 필요하다.
지금까지 국내외 기술개발은 신경 작용제에 대한 노출 가능성 또는 현실적 위험성이 커짐에 따라 이의 조기진단을 위한 노력 역시 이어져 왔다. 신경 작용제에 대한 노출진단을 위해 실험실적 기법으로 행해지는 가장 고전적인 방법으로는 Nordgren등이 보고한 형태인 혈중에서 작용 분자에 작용하지 않은 잔여 신경 작용제를 직접 측정 방법이었다.
그러나, Shih 등은 신경작용제의 분해 과정 중에 생기는 분해산물 등을 혈중에서 직접 측정하는 방법을 소개하였으며, Adams 등은 체내 홉수된 신경작용제가 그 목표 분자인 아세틸콜린에스터라제(AChE)에 부착한 후 유리되는 플로라이드(fluoride) 이온의 혈중 농도를 ion-based regeneration 법으로 측정하는 방법 을 소개하기도 하였다.
최근에는 신경 작용제 노출에 대한 확증적 진단을 위하여 적혈구(red blood cell; RBC)에 존재하는 choline esterase activity 를 평가하는 방법이 Subash 등에 의해 보고되기도 하였다.
그러나, 이들 방법들은 뛰어난 민감도 등을 바탕으로 소량의 검체만으로도 신경 작용제 노출 유무를 분석할 수는 있으나 이들 방법은 공통적으로 고가의 장비와 숙련된 전문인력을 필요로 하는 등 실험실적 측면에서는 그 의미를 가질 수 있으나 간단하면서 신속한 진단을 필요로 하는 야전에서 사용하기에는 큰 무리가 된다.
따라서, 현재 일선 현장 (야전 또는 단위부대)에서 적용되고 있는 신경 작용제에 대한 노출 유무를 평가하기 위한 진단기법은 환자가 나타내는 특징적인 증상들에 근거한 임상적 진단 방법이며 이러한 방법으로는 사전 징후 없이 특정 지역 또는 소수 인원에게 살포되는 신경 작용제에 대한 노출 진단은 시간적으로 지체될 수밖에 없다.
신경 작용제에 의한 체내 cholinesterase 억제 정도 및 임상적 중증도 사이의 확립된 상관관계는 신경작용제 노출 환자의 진단에 cholinesterase 억제 정도가 활용될 수 있음을 증명해준다. 특히 이들 상관관계가 급성기에 확인될 경우 환자의 최종 예후와도 상관관계를 가침이 알려져 있는 바，신속한 신경작용제 노출 진단기법의 중요성은 더욱 강조된다.
이에 따라 체내에 존재하는 cholinesterase 의 활성도 변화를 측정함으로써 신경작용제 노출 유무를 평가를 통해 해당 기법이 특별한 장비나 기술 없이 최소한의 숙련과 노력으로 구현이 가능한 장치를 개발의 필요성이 대두되었다.
상기와 같은 문제점을 개선하기 위해 본 발명의 목적은 신경작용제 노출에 따른 생체내 콜린에스테라제(Cholinesterase)의 활성 억제 정도 진단방법에 관한 혈청(serum) Butyrylcholinesterase (BChE)의 활성도를 측정하는 방법을 제공하는 데 있다.
또한 본 발명은 신경작용제 노출 진단을 위해 pH meter 없이 pH 변화 정도를 확인하는 진단 방법을 제공하는 데 있다.
또한 본 발명은 신경작용제 노출 진단을 위해서 간단하고 신속하게 판단가능한 장치를 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 신경작용제 노출 진단 방법에 있어서,
신경작용제에 노출되지 않은 건강한 인체에서 채취된 혈액 샘플에서 혈청(serum)을 분리하는 단계;상기 분리된 혈청을 버퍼(buffer)용액과 혼합하여 안정화된 상태인 신경작용제에 노출되지 않은 정상인 Butyrylcholinesterase 활성도를 측정하는 단계; 상기 분리된 혈청을 버퍼(buffer)용액과 혼합한 후 안정화된 상태에서 유기인계열(organophosphate) 약물을 첨가하여 신경작용제에 노출된 오염된 상태의Butyrylcholinesterase 활성도를 측정하는 단계; 상기 신경작용제에 노출되지 않은 정상상태와 노출된 오염된 상태의Butyrylcholinesterase 활성도의 측정된 결과를 비교 분석하는 단계 및 신경작용제에 오염 의심 환자에서 채취된 혈청을 버퍼용액과 혼합한 후 Butyrylcholinesterase 활성도를 측정하여 상기 분석 단계 결과에 적용하여 오염여부를 판단하는 단계로 구성될 수 있는 신경작용제 노출 진단 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 혈청(serum)을 분리하는 방법에 SST 튜브를 이용할 수 있는 것에 특징이 있는 신경작용제 노출 진단 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 버퍼(buffer)용액은 0.7 내지 1.3 mM KH2PO4와 250 내지 350 mM NaCl 혼합하여 pH 7.5 내지 8.5을 갖고 Acetylcholine(CH3CO-) 0.073 내지 0.093M이 혼합된 특징이 있는 신경작용제 노출 진단 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 Butyrylcholinesterase 활성도를 측정하는 방법은 Bromothymolblue(BTB)용액을 첨가해 색변화를 판단하는 것에 특징이 있는 신경작용제 노출 진단 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 신경작용제 노출여부를 측정하는 장치는 하나 이상의 분리막에 의해 순차적으로 공간을 구분시킨 챔버(Chamber); 혈액에서 분리된 혈청(serum)을 흡입하여 챔버내 일 공간으로 이동시킬 수 있는 주사바늘; 챔버의 분리막를 관통해 챔버의 일면으로 돌출된 개폐 조절기 및 상기 개폐 조절기가 챔버 분리막을 관통하는 통로인 밸브로 구성될 수 있는 수집기(collector)로 구성될 수 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 개폐 조절기에 연결하여 상하로 이동시킬 수 있는 제어기(regulator)를 포함할 수 있는 진단 멀티 챔버 킷을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 챔버의 공간은 순차적으로 수직으로 연결되되, 버퍼용액이 포함된 제1공간, 유기인계열(organophosphate) 약물이 포함된 제2공간 및 BTB 용액이 포함된 제3공간으로 구성될 수 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 주사바늘은 속이 빈 공간이며 챔버의 공간을 수직으로 관통을 하되, 주사바늘 선단은 얇은 막을 관통할 수 있게 날카로운 모양을 갖고 주사바늘 끝단은 챔버의 제1공간 수직높이의 7/10 내지 9/10의 위치에 위치하며 특징이 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 개폐 조절기는 일정한 간격으로 제1홈과 제2홈의 두 개의 홈으로 구성이 될 수 있고,상기 홈의 깊이는 개폐 조절기 지름의 1/3 내지 2/3 이며, 홈의 길이는 밸브의 높이보다 긴 것에 특징이 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 밸브는 제1공간과 제2공간 분리막 사이에 있는 제1밸브와 제2공간과 제3공간 분리막 사이에 있는 제2 밸브로 구성이 되되,상기 밸브와 상기 개폐 조절기는 밀착되게 결합이 되어 공간 사이의 밀폐가 유지가 되나 개폐 조절기가 제어기에 의해 아래로 이동하여 홈이 밸브을 포함하는 상태로 위치하면,상기 홈사이로 챔버의 용액이 이동될 수 있는 것에 특징이 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 제1공간의 버퍼(buffer)용액은 주사바늘를 통해 이동된 혈청(serum)과 혼합되며, 상기 제1공간에서 혼합된 용액이 개폐조절기에 의해 아래로 이동하여 상기 제2챔버에서 유기인계열(organophosphate) 약물과 혼합되고,상기 제2공간에서 혼합된 용액이 개폐조절기에 의해 아래로 이동하여 BTB용액과 반응하면 색변화를 확인할 수 있는 것에 특징이 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 개폐 조절기는 조정기에 입력된 시간에 자동으로 아래로 내려와 제1 밸브에 제1홈이 관통하여 제1홈의 수직길이 사이에 제1 밸브가 위치하게 되면, 제1홈사이로 제1공간의 용액이 제2공간으로 이동이 되고, 연속해서 제어기에 입력된 다음 시간에 개폐 조절기가 자동으로 내려와 제2홈이 제2 밸브를 관통하여 제2홈의 수직길이 사이에 제2 밸브가 위치하게 되면 제2홈 사이로 제2공간 용액이 제3공간으로 이동될 수 있는 것에 특징이 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 주사바늘과 챔버의 공간은 진공상태이며 튜브속 혈청에 주사바늘 선단을 꽂을 때 주사바늘 선단입구가 열리게 되어 압력차이로 혈청이 제1공간으로 이동이 되고, 상기 밸브에 의한 공간 사이의 용액 이동은 상기 개폐 조절기 홈에 의한 공간 사이의 압력차이로 용액이 아래로 빨려 내려가는 것에 특징이 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷을 제공한다.
본 발명인 신경작용제 노출 진단방법은 적혈구(RBC)용혈의 추가 단계없이 혈청(Serum)을 이용한 콜린에스테라제(cholinesterase)의 추출하여 조기에 진단하는 효과가 있다.
또한 본 발명인 신경작용제 노출 진단방법은 흡광도 측정의 별도 장비 필요없이 Bromothymol blue (BTB)용액을 활용하여 pH 변화를 육안으로 확인할 수 있는 특징이 있다.
또한 본 발명인 진단을 위한 멀티 챔버 킷은 한 개의 진단 장비에서 여러개의 격벽공간을 두어 시간간격에 따라 반응용액의 이동이 가능한 간단하고 신속하게 진단가능한 장치를 제공하는 특징이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 신경작용제의 노출 진단방법의 순서도를 나타낸 도면이다.
도 2은 본 발명에 따른 신경작용제가 노출될 경우 어떤 변화가 생길 수 있는지 그 작용기전 상 특징을 간략히 나타낸 도면이다.
도 3는 본 발명에 따른 Organophosphate 전처리 유무에 따른 개인별 pH 변화 정도를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 혈청의 Butyrylcholinesterase(BChE)의 활성도 변화에 따른 BTB 용액 반응 후 색변화를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 신경작용제의 노출 진단장치인 멀티 챔버 킷의 사시도를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 멀티 챔버 킷의 피스톤막대의 이동에 따른 1,2챔버간 용액의 이동를 보여주는 도면이다.
도 7는 본 발명에 따른 멀티 챔버 킷의 피스톤막대의 이동에 따른 2,3챔버간 용액의 이동를 보여주는 도면이다.
도 8은 본 발명에 따른 멀티 챔버 킷으로 SST 튜브에서 혈청을 제1챔버로 이동시키는 것을 보여주는 도면이다.
도 9는 본 발명에 따른 멀티 챔버 킷으로 챔버가 용액의 이동을 보여주는 도면이다.
이하 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 일실시예를 상세히 설명하기로 한다. 우선, 도면들 중, 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 동일한 참조부호를 나타내고 있음에 유의하여야 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 '약', '실질적으로' 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
도 1은 신경작용제의 노출 진단방법의 순서도를 도시화한 것이다. 먼저 신경작용제에 노출되지 않은 건강한 인체에서 채취된 혈액 샘플을 SST 튜브를 이용한 혈청(serum)을 분리하는 단계, 상기 분리된 혈청을 버퍼(buffer)용액과 혼합한 안정화된 상태인 신경작용제에 노출되지 않은 정상인 Butyrylcholinesterase(BChE) 활성도를 측정하는 단계,
상기 분리된 혈청을 버퍼(buffer)용액과 혼합한 후 안정화된 상태에서 유기인계열(organophosphate) 약물을 첨가하여 신경작용제에 노출된 오염된 상태의 Butyrylcholinesterase(BChE) 활성도를 측정하는 단계;
상기 신경작용제에 노출되지 않은 정상상태와 노출된 오염된 상태의 Butyrylcholinesterase(BChE) 활성도의 측정된 결과를 비교 분석하는 단계 및 신경작용제에 오염 의심 환자에서 채취된 혈청을 버퍼용액과 혼합한 후 Butyrylcholinesterase(BChE) 활성도를 측정하여 오염여부를 판단하는 단계로 구성할 수 있다.
도 2는 신경작용제가 노출될 경우 어떤 변화가 생길 수 있는지 그 작용기전상 특징을 간략히 나타낸 도면이다. 도 2를 통해 작용기전의 특징과 특히 Acetylcholine(ACh)의 기질과 반응하는 Acetylcholinesterase(AChE)이외에 Butyrylcholinesterase (BChE)을 임상적으로 사용할 수 있는 지와 그 장점을 살펴본다.
소만(soman), 사린(sarin) 등의 신경작용제의 체내 주요 작용기전은 자율신경계 중 부교감신경계 신경전달물질인 Acetylcholine(ACh)의 분해를 담당하는 Acetylcholineeaterase(AChE)의 비가역적인 억제작용을 한다. 신경작용제가 비가역적으로 Acetylcholinesterase(AChE)를 억제하게 되면 신경절(synapse)사이에 Acetylcholine(ACh)이 축적되게 되고 이로 인해 절후 신경은(post-synaptic nerve) 과도한 흥분상태로 지속되게 된다. 이러한 결과로 부교감신경계 항진증상이 나타나며 최종적으로 경련, 호흡부진 등으로 사망에 이르게 된다.
여기서 신경작용제의 주요 목표 분자(target molecule)로서 이자 체내에서 Acetylcholine(ACh)의 분해에 관여하는 Cholinesterase 효소는 크게 Acetylcholinesterase (AChE)와 Butyrylcholinesterase (BChE)가 존재한다. 이 효소는 주로 간에서 합성 후 혈장으로 분비되는데 Butyrylcholine(BCh)을 1차 기질 (substrate)로 사용하지만 Acetylcholine(ACh)에 대한 친화도(affinity)도 유의한 수준으로 존재한다. 두 물질의 특성은 표1와 같다.
항목 Acetylcholinesterase(AChE) Butyrylcholinesterase (BChE)
효소 기질 Acetylcholine〉Butyrylcholine Butyrylcholine〉Acetylcholine
주요 존재 부위 중추신경과 말초신경의 콜린계 시냅스에 주로 존재 주로 간에서 합성 후 혈장에서 분비
기타 존재부위 비콜린게 신경에도 존재
적혈구, 혈소판, 임파구에서도 발견됨(혈구 분화에 관여)		 소화기와 심장에서도 발견
성인 중추신경계에 존재하는 전체 cholinesterase의 1~10%
추출 특징 혈액에서 분석할 경우 혈구로부터 추출단계 작업이 추가로 필요 혈액에서 분석할 경우 혈장 분리후 바로 분석 가능
기타 Acetylcholinesterase 효소와 구조,기능 등이 유사하나 일부 방향성 분자 구조가 없음
신경 작용제 노출 유무의 진단에서 Acetylcholinesterase(AChE)의 활성도는 임상적으로 그 중요성을 인정받고 있다. 이 효소의 활성도(activity)의 억제 정도는 신경 작용제에 노출된 환자에게서 관찰되는 임상적 증상들의 중증도 정도와 연관되어 있기 때문이다. 따라서 Acetylcholinesterase(AChE)의 활성도 정도를 판단할 수 있으면 신경 작용제에 노출되는지 알 수 있다.
자율신경계 부교감신경에 작용하는 Acetylcholinesterase(AChE)의 활성도를 측정하는 현실적 방법은 존재하지 않는다. 다만, Acetylcholinesterase(AChE)는 혈액 내 적혈구(red bloos cell; RBC) 내에 존재하므로 이를 활용하여 측정할 수 있다.
그러나 RBC 내의 Acetylcholinesterase(AChE)를 측정하고자 한다면 실험방법상 RBC를 용혈 시키는 단계가 추가로 필요하다. 이러한 연유로 별도의 용혈(hemolysis) 단계 반응이 필요 없는 serum Butyrylcholinesterase (BChE)의 활성도를 측정하는 방법을 활용하고자한다.
그러나 이러한 방법상의 편이성이 인정받기 위해서는 AChE 활성도와 BChE 활성도가 임상적으로 서로 상관관계를 가져야 한다. 만약 BChE 활성도가 신경 작용제에 의한 임상 증상의 중증도 또는 AChE 억제 정도와 상관관계가 없다면 해당 분석법의 타당성은 인정받기 어렵게 된다.
알려진 바에 따르면 AChE는 BChE와 달리 Trp279와 Phe330 을 가지고 있어 기능상의 차이점을 가지고는 있으나 도네페질 등의 일부 분자의 반응 특이성에만 관여하고 Acety1choline esterase inhibitor 등의 특이성에는 의미가 없는 것으로 알려져 있다.
또한 Cholinesterase (AchE, BchE) activity 억제정도와 신경학적 증상의 중증도 사이의 연관성은 이들 Cholinesterase (AchE, BchE)의 활성도의 억제 정도가 신경학적 증상의 중증도 사이의 연관성이 있는 것으로 보고되어 있다.
그 외 BChE 활성도 평가를 이용할 경우 기대되는 장점은 혈청(serum)을 이용하므로 cholinesterase의 추출이 용이하고, 적혈구 용혈과정(RBC hemolysis)를 위한 별도의 처치가 필요 없어 방법상 단순하며, AchE와 연관성을 담보하므로 임상적 증상의 중증도 반영이 가능하고, 신경 작용제에 의한 cholinesterase 억제정도를 조기에 진단함으로 의증 환자의 예후 예측 가능하다는 점등이다.
이를 근거로 본 발명은 Butyrylcholinesterase(BChE)의 활성도 측정을 신경 작용제 노출유무를 평가하기 위해 사용할 수 있음을 알 수 있다.
이하 신경작용제 노출 진단을 위한 방법에 대하여 구체적으로 살펴보면,
건강한 인체에서 채취된 혈액을 SST 튜브를 사용하여 혈청을 분리한다. SST 튜브에 채혈된 혈액을 원심분리를 통해 상부에 위치한 투명한 누런색의 액체를 분리하면 된다. 이 혈청에 존재하는 Butyrylcholinesterase(BChE)를 버퍼용액에 있는 Acetylcholine(ACh)과 반응시키면 된다. 이 단계에서 유기인계열 약물에 오염되지 않은 상태의 Butyrylcholinesterase(BChE) 활성도를 측정하면 된다.
여기서 버퍼(buffer)용액은 완충 용액(buffer solution)으로 일반적으로 산이나 염기를 가해도 공통 이온 효과에 의해 그 용액의 수소 이온 농도(pH)가 크게 변하지 않는 용액을 말한다. 본 발명에는 0.7 내지 1.3 mM KH2PO4와 250 내지 350 mM NaCl 혼합하여 pH 7.5 내지 8.5 정도 유지 시키며 Acetylcholine(CH3CO-) 0.073 내지 0.093M가 첨가된 혼합용액을 말한다.
상기 Acetylcholine(ACh)은 자율신경계의 신경전달물질 중 하나로 Butyrylcholinesterase(BChE)와 만나면 아세트산(acetic acid)와 콜린(choline)으로 분해가 된다.
신경작용제에 노출되지 않은 경우는 분리된 혈청에 버퍼(buffer)용액과 혼합한 후 안정화 상태 시간인 10분 내지 15분 후 Butyrylcholinesterase(BChE)의 활성도를 측정하면 된다.
반면에 신경작용제에 노출된 경우에는 분리된 혈청에 버퍼(buffer)용액과 유기인계열(organophosphate) 약물을 혼합한 후 25 내지 35분 지난 후 Butyrylcholinesterase(BChE)의 활성도를 측정하면 된다.
신경작용제인 유기인계열(organophosphate)약물은 상기 Butyrylcholinesterase(BChE)의 활성도에 영향을 미쳐 자율신경계의 신경전달물질인 Acetylcholine(ACh)과 반응을 억제하는 작용이 있어 결과적으로 유기인계열(organophosphate)약물에 오염되지 않은 경우와 오염된 경우 Acetylcholine과 반응 정도에 차이가 있게 된다.
따라서 Butyrylcholinesterase(BChE)의 활성도를 측정하면 유기인계열(organophosphate)약물에 오염 유무를 확인할 수 있다.
Butyrylcholinesterase(BChE)의 활성도를 측정하기 위한 가늠자(indicator)에는 크게 두 가지 방법이 활용되고 있으며 pH method 와 colorimetric method 이있다. 활성도 측정의 용이성, 안정성 등 여러 장점 면에서 colorimetric method 가 선호되고 있으나 실험단계가 복잡하고 활성도 평가에 흡광도를 활용함으로써 별도의 장비가 필요하므로 본 발명에서는 pH method 를 활용하기로 하였다.
pH method가 가능한 이유는 혈청의 신경전달물질(ACh)이 BChE와 반응을 하면 콜린(Choline)과 초산(acetic acid)로 분해가 되며, 따라서 초산에 의한 pH의 변화를 판단하면 되기 때문이다.
도 3는 Organophosphate 전처리 유무에 따른 pH 변화 정도를 나타낸 도면이다. pH 미터기를 이용하여 정확한 pH값을 측정한다.
pH(a)값은 정상상태의 경우 분리된 혈청이 버퍼용액과 혼합되자 마자 초기의 pH값 또는 유기인계열 약물에 오염된 상태의 경우 분리된 혈청이 버퍼용액과 혼합되고 10 내지 15분이 지난후 유기인계열 약물과 혼합된 직후 pH값을 의미한다.
pH(b)값은 정상상태의 경우 버퍼용액과 혼합된 후 10 내지 15분 정도 지난 안정된 상태에서의 pH값 또는 유기인계열 약물에 오염된 상태의 경우 25 내지 35분 정도 지난 안정된 상태에서의 pH값을 의미한다.
도 4는 도 3에서 측정된 pH값을 BTB 용액을 이용해서 색깔 변화를 보여주는 도면이다.
유기인계열 약물에 오염되지 않은 정상상태에서는 초기 pH(a)값이 7.5 내지 8.0값이 나타나 중성과 염기성에 걸친 색깔인 초록색과 푸른색이 혼합된 옅은 남 색으로 보이고 안정된 상태의 pH(b)값은 버퍼용액의 Acetylcholine과 반응하여 acetic acid이 생겨 pH값이 6.0 근처를 보임에 따라 BTB용액이 노란색을 나타내고 있음을 알 수 있다.
반면에 신경작용제인 유기인계열(organophosphate)약물에 오염된 경우 초기 pH(a)값이 8.0에서 버퍼용액으로 안정화 된 후 pH(b)값이 7.0임을 알 수 있다.
유기인계열(organophosphate)약물이 존재하에도 사람마다 혈청의 Butyrylcholinesterase(BChE)의 활성도를 방해하는 정도가 다를 수 있어 미량의 acetic acid가 발생함에 따라 pH값이 1.0 포인트 정도 내려갈 수 있기 때문이다.
따라서 초기 염기성의 남색에서 중성에 가까은 초록색으로 BTB 용액의 색이 변함을 알 수 있다.
상기와 같이 유기인계열(organophosphate)약물에 오염 유무에 따른 혈청의 Butyrylcholinesterase 활성도의 변화를 실험실에서 pH 미터기와 BTB 지시용액 색변화를 비교 분석할 수 있다.
비교 기준을 확정한 후 실제 유기인계열(organophosphate)약물에 오염이 의심된 경우 의심된 환자의 혈청을 분리해서 혈청, 버퍼용액 및 BTB 용액을 혼합해서 BTB 지시용액의 색깔 변화만으로 오염여부를 신속하게 판단할 수 있게 된다.
다만, 신경작용제 노출여부를 측정하는 하기 위해 상기와 같은 방법을 실험실에서 할 수 없는 경우 즉, 야전에서 긴박한 상황에서 신속히 진단하기 위해서는 간단하면서 신속하게 상기와 같은 반응을 할 수 있는 장치를 통해 오염여부를 판단할 필요가 있다.
도 5는 신경작용제의 노출 진단장치인 멀티 챔버 킷의 사시도를 나타낸 도면이다. 자세히 살펴보면 하나 이상의 분리막에 의해 순차적으로 공간을 구분시킨 챔버(Chamber)(110), 혈액에서 분리된 혈청(serum)(310)을 흡입하여 챔버(110)내 일 공간으로 이동시킬 수 있는 주사바늘(120), 챔버의 분리막를 관통해 챔버의 일면으로 돌출된 개폐 조절기(130) 및 상기 개폐 조절기가 챔버 분리막을 관통하는 통로인 밸브(117)(119)로 구성될 수 있는 수집기(collector)(100)로 구성될 수 있다.
여기서 상기 개폐 조절기(130)에 연결하여 상하로 이동시킬 수 있는 제어기(regulator)(200)를 포함할 수 있다. 제어기는 수동으로 개폐 조절기를 이동시킬 수 도 있으며 전자제어장치에 의해서 입력된 시간에 따라 이동시킬 수도 있다.
챔버(110)의 3개의 공간으로 구분할 수 있고 순차적으로 수직으로 연결되며, 버퍼용액(10)이 포함된 제1공간(111), 유기인계열(organophosphate) 약물(20)이 포함된 제2공간(113) 및 BTB 용액(30)이 포함된 제3공간(115)으로 구성될 수 있다.
상기 주사바늘(120)은 속이 빈 공간이며 챔버의 공간을 수직으로 관통을 하되, 주사바늘 선단(121)은 얇은 막을 관통할 수 있게 날카로운 모양을 갖고 주사바늘 끝단(123)은 챔버의 제1공간(111) 수직높이의 7/10 내지 9/10의 위치에 위치한다. 주사바늘을 통해 제1공간으로 이동된 혈청이 다시 주사바늘(120)을 통해서 아래로 빠져나오지 않기 위함이다.
상기 개폐 조절기(130)는 일정한 간격으로 제1홈(131)과 제2홈(133)의 두 개의 홈으로 구성이 될 수 있고, 상기 홈의 깊이는 개폐 조절기 지름의 1/3 내지 2/3 이며, 홈의 길이는 밸브의 높이보다 긴 것에 특징이 있다.
또한 밸브는 제1공간(111)과 제2공간(113) 분리막 사이에 있는 제1밸브(117)와 제2공간(113)과 제3공간(115) 분리막 사이에 있는 제2 밸브(119)로 구성이 되며, 상기 밸브(117)(119)와 상기 개폐 조절기(130)는 밀착되게 결합이 되어 공간 사이의 밀폐가 유지가 되나 개폐 조절기(130)가 제어기(200)에 의해 아래로 이동하여 홈이 밸브을 포함하는 상태로 위치하면, 상기 홈사이로 챔버의 용액이 이동된다.
제1공간(111)의 버퍼(buffer)용액(10)은 주사바늘(120)을 통해 이동된 혈청(serum)(310)과 혼합되며, 상기 제1공간(111)에서 혼합된 용액이 개폐 조절기(130)에 의해 아래로 이동하여 상기 제2공간(113)에서 유기인계열(organophosphate) 약물(20)과 혼합되고,
상기 제2공간(113)에서 혼합된 용액이 개폐조절기(130)에 의해 아래로 이동하여 BTB용액(30)과 반응하면 색변화를 확인할 수 있는 것에 특징이 있다.
도 6은 제1공간(111)의 용액이 제2공간(113)로 이동되는 원리를 보여주고 있다. 상기 개폐 조절기(130)는 제어기(200)에 입력된 시간에 자동으로 아래로 내려와 제1 밸브(117)에 제1홈(131)이 관통하여 제1홈(131)의 수직길이 사이에 제1 밸브(117)가 위치하게 되면, 제1홈(131) 사이로 제1공간(111)의 용액이 제2공간(113)으로 이동이 되고,
또한 도 7은 제2챔버(111)의 용액이 제3챔버(113)로 이동되는 원리를 보여주고 있다. 제2공간으로 이동한 용액은 연속해서 제어기에 입력된 다음 시간에 개폐 조절기(130)이 자동으로 내려와 제2홈(133)이 제2밸브(119)를 관통하여 제2홈의 수직길이 사이에 제2밸브가 위치하게 되면 제2홈 사이로 제2공간 용액이 제3공간(115)으로 이동될 수 있다.
여기서 상기 주사바늘(120)과 챔버(110)의 공간은 진공상태이며 튜브속 혈청에 주사바늘 선단(121)을 꽂을 때 주사바늘 선단입구가 열리게 되어 압력차이로 혈청이 제1공간(111)으로 이동이 되고,
상기 밸브에 의한 공간 사이의 용액 이동은 상기 개폐 조절기 홈에 의한 공간 사이의 압력차이로 용액이 아래로 빨려내려간다.
도 8은 본 발명에 따른 멀티 챔버 킷으로 SST 튜브에서 혈청을 제1챔버로 이동시키는 것을 사진으로 보여주는 도면이며 도 9는 본 발명에 따른 멀티 챔버 킷으로 챔버가 용액의 이동을 사진으로 보여주는 도면이다.
실시예
1.신경작용제에 노출되지 않은 혈청의 Butyrylcholinesterase 활성도를 측정(대조군)
1) 신경작용제에 노출되지 않은 총 50명의 건강한 사람으로부터 혈액을 채혈하여 각각의 SST 튜브를 이용하여 혈청을 분리한다.
2) 1mM KH2PO4와 300mM NaCl 혼합하여 pH 8.0의 특성이 있으며 Choline(CH3CO-) 0.083M의 버퍼용액(buffer)을 준비한다.
3) 각각의 SST 튜브에서 50명의 혈청 30ml씩을 채취해 버퍼용액에 넣어 혼합후 10분 정도 기다린다.
4) 버퍼용액과 혼합된 초기와 혼합 후 10분 지난 후 pH미터를 이용하여 pH값을 측정하여 평균을 내고 색 변화를 본다.
2. 신경작용제에 노출되지 않은 혈청에 유기인계열 (organophosphate) 약물을 첨가하여 Butyrylcholinesterase 활성도를 측정( 실험군 )
1) 50명의 SST 튜브에서 혈청을 분리 후 남은 혈청에서 동일한 30m를 분리한다.
2) 분리된 30m를 혈청을 버퍼용액에 넣어 혼합후 10분 기다린 후 유기인계열(organophosphate) 약물을 첨가 혼합 후 30분 기다린다.
3) 유기인계열(organophosphate) 약물을 혼합한 초기와 혼합 후 30분이 지난 후 pH미터를 이용하여 pH값을 측정하여 평균을 내고 색변화를 본다.
대조군과 실험군에서 측정된 pH값과 색변화는 아래 표2와 같다.
버퍼(buffer)만 있을 경우(대조군) Organophosphate와 반응한경우(실험군)
pH(a) pH(b) pH차이 pH(a) pH(b) pH차이
평균 7.83 5.95 1.88 8.01 6.85 1.11
표준편차 0.04 0.09 0.10 0.05 0.12 0.11
색깔 옅은 남색 노란색 남색 짙은 초록색
pH(a); Inintial pH, pH(b); Post-incubation pH, pH차이 = pH(b) - pH(a)
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.
1: 수집기 10: 버퍼용액
20: 유기인계열(organophosphate)약물 30: BTB용액
15: 혈청, 버퍼, 유기인계열약물 혼합용액
25: 혈청, 버퍼, 유기인 계열약물 및 BTB용액 혼합용액
100: 수집기 110: 챔버
111: 제1공간 113: 제2공간
115: 제3공간 117: 제1밸브
119: 제2밸브 120: 주사바늘 121: 주사바늘 선단 123: 주사바늘 끝단 130: 개폐 조절기 131: 제1홈 133: 제2홈 200: 제어기 300: SST 튜브 310: 혈청

Claims (13)

  1. 삭제
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  5. 신경작용제 노출여부를 측정하는 장치는
    하나 이상의 분리막에 의해 순차적으로 공간을 구분시킨 챔버(Chamber); 혈액에서 분리된 혈청(serum)을 흡입하여 챔버내 일 공간으로 이동시킬 수 있는 주사바늘; 챔버의 분리막를 관통해 챔버의 일면으로 돌출된 개폐 조절기 및 상기 개폐 조절기가 챔버 분리막을 관통하는 통로인 밸브로 구성될 수 있는 수집기(collector)로 구성될 수 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 개폐 조절기에 연결하여 상하로 이동시킬 수 있는 제어기(regulator)를 포함할 수 있는 진단 멀티 챔버 킷.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 챔버의 공간은 순차적으로 수직으로 연결되되,
    버퍼용액이 포함된 제1공간, 유기인계열(organophosphate) 약물이 포함된 제2공간 및 BTB 용액이 포함된 제3공간으로 구성될 수 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 주사바늘은 속이 빈 공간이며 챔버의 공간을 수직으로 관통을 하되, 주사바늘 선단은 얇은 막을 관통할 수 있게 날카로운 모양을 갖고 주사바늘 끝단은 챔버의 제1공간 수직높이의 7/10 내지 9/10의 위치에 위치하는 것에 특징이 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 개폐 조절기는 일정한 간격으로 제1홈과 제2홈의 두 개의 홈으로 구성이 될 수 있고,
    상기 홈의 깊이는 개폐 조절기 지름의 1/3 내지 2/3 이며, 홈의 길이는 밸브의 높이보다 긴 것에 특징이 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 밸브는 제1공간과 제2공간 분리막 사이에 있는 제1밸브와 제2공간과 제3공간 분리막 사이에 있는 제2 밸브로 구성이 되되,
    상기 밸브와 상기 개폐 조절기는 밀착되게 결합이 되어 공간 사이의 밀폐가 유지가 되나 개폐 조절기가 제어기에 의해 아래로 이동하여 홈이 밸브을 포함하는 상태로 위치하면,
    상기 홈사이로 챔버의 용액이 이동될 수 있는 것에 특징이 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 제1공간의 버퍼(buffer)용액은 주사바늘를 통해 이동된 혈청(serum)과 혼합되며,
    상기 제1공간에서 혼합된 용액이 개폐조절기에 의해 아래로 이동하여 상기 제2공간에서 유기인계열(organophosphate) 약물과 혼합되고,
    상기 제2공간에서 혼합된 용액이 개폐조절기에 의해 아래로 이동하여 BTB용액과 반응하면 색변화를 확인할 수 있는 것에 특징이 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 개폐 조절기는 조정기에 입력된 시간에 자동으로 아래로 내려와 제1 밸브에 제1홈이 관통하여 제1홈의 수직길이 사이에 제1 밸브가 위치하게 되면, 제1홈사이로 제1공간의 용액이 제2공간으로 이동이 되고,
    연속해서 제어기에 입력된 다음 시간에 개폐 조절기가 자동으로 내려와 제2홈이 제2 밸브를 관통하여 제2홈의 수직길이 사이에 제2 밸브가 위치하게 되면 제2홈 사이로 제2공간 용액이 제3공간으로 이동될 수 있는 것에 특징이 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷.
  13. 제5항에 있어서,
    상기 주사바늘과 챔버의 공간은 진공상태이며 튜브속 혈청에 주사바늘 선단을 꽂을 때 주사바늘 선단입구가 열리게 되어 압력차이로 혈청이 제1공간으로 이동이 되고,
    상기 밸브에 의한 공간 사이의 용액 이동은 상기 개폐 조절기 홈에 의한 공간 사이의 압력차이로 용액이 아래로 빨려 내려가는 것에 특징이 있는 신경작용제 진단 멀티 챔버 킷.

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