KR102004495B1 - 콜린에스테라제 저해성 물질 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법은 혈액으로부터 콜린에스테라제 저해성 물질을 검출할 수 있고, 그 물질의 농도를 정량적으로 검출할 수 있으며, 보다 낮은 농도의 혈액 및 기질이 사용되더라도 정성적, 정량적 분석의 정확도가 높은 효과가 있다. 또한 콜린에스테라제 저해성 물질의 정성적, 정량적 분석의 정확도가 높음에도, 그 분석 시간이 약 10 분 이내로 매우 신속히 수행될 수 있는 효과가 있다.

Description

콜린에스테라제 저해성 물질 검출 방법{Kit for detection of cholinesterase inhibiting substance}
본 발명은 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법에 관한 것이다.
농약은 농업 생산성의 향상과 농산물의 품질 향상을 가져왔으나, 농약의 오남용으로 인한 식품과 자연환경의 오염은 우리의 건강에 심각한 위협이 되고 있다. 특히 카바메이트(carbamate)계 또는 유기인(organophosphate)계 농약은 인체 내의 콜리에스테라제 효소를 비가역적으로 불활성화시키는 것으로 알려져 있어 인체에 심각한 위험을 초례한다.
콜린에스테라제는 신경전달자인 아세틸콜린(acetylcholine, ACh)을 콜린(acholine)과 아세트산(acetic acid)로 분해하는 데에 관여하는 효소이며, 아세틸콜린은 중추신경계, 말초신경계, 신경근육부위 등에 존재한다. 상기 농약에는 콜린에스테라제 저해성 물질이 존재하며, 이는 콜린에스테라제의 활성 사이트에 결합하여 비가역적으로 불활성화시킨다. 따라서 불활성화된 콜린에스테라제는 신경계 시스템에 축적되고, 무스카린(muscarinic) 수용체 및 니코틴(nicotinic) 수용체 등의 과잉 흥분을 유발하여 신경계 시스템이 무력화된다.
콜린에스테라제 저해성 물질인 카바메이트(carbamate)계 화합물, 유기인(organophosphate)계 화합물 등은 전술한 바와 같이 농약, 살충제로 사용되고 있으며, 농촌에서는 파라티온(parathion), 말라티온(malathion), 클로르피로포스(chlorpyrifos), 디클로르보스(dichlorvos)로 알려져 있다. 이는 주로 해충 구제 목적으로 사용되고 있지만, 매년 아시아 지역의 농촌에서 500,000 명이 유기인 계열 농약에 의해 사망하고 있으며, 그 중 200,000 명은 치사량 이하의 노출에 의해 사망하는 것으로 보고되고 있다.
유기인계 농약은 콜린에스테라제 효소의 활성 사이트에 위치해 있는 세린 히드록실(serine hydroxyl) 그룹을 인산화하여 불활성화시킨다. 이러한 반응은 비가역적으로서, 인산화되어 불활성된 콜린에스테라제 효소는 더 이상 아세틸콜린을 분해할 수 없게 된다. 따라서 신경 시스템에 아세틸콜린이 비정상적으로 축적되고, 신경계 시스템은 정상적으로 작동하지 않게 된다.
구체적으로, 유기인계 화합물의 화학구조는 인 원자 주변에 4 개의 그룹이 존재하고, 보통 산소 원자와 탄화수소기를 포함하며, S, F, C, N도 발견되고 있다. 유기인계 화합물은 도 1에서와 같이 aging 단계를 거치게 되며 R 그룹 중의 하나가 인산기 분자를 해리시키면서 유기인계 화합물과 콜린에스테라제 효소(acetylcholineesterase, AChE)의 결합이 비가역적으로 진행된다. 경우에 따라 유기인계 화합물의 aging 단계는 2 분에서 72 시간 동안 진행되기도 한다. 이러한 콜린에스테라제 효소와 유기인계 화합물의 결합은 비가역적으로 진행되므로, 인체 내에 아세틸콜린을 분해할 수 있는 콜린에스테라제 효소가 감소됨에 따라 신경 시스템에 아세틸콜린이 비정상적으로 축적되어 신경계 시스템이 정상적으로 작동하지 않게 된다.
카바메이트계 농약은 카르밤산에서 유래하고, 유기인계 화합물과 유사한 독성 작용 과정을 가지고 있으며, 다만 효소와의 결합이 비가역적이 아니므로 중독되더라도 빠르게 회복되는 특성을 보여주고 있다.
하지만 카바메이트계 농약의 중독과 유기인계 농약의 중독은 아직까지 의학적으로 구별이 어려움에 따라, 이들 물질을 포함하는 콜린에스테라제 저해성 물질에 의한 중독을 빠르게 검출할 수 있는 시스템이 개발되어야 한다.
이에, 농약의 위해성에 대한 새로운 인식과 더불어 콜린에스테라제 저해성 물질을 포함하는 농약의 중독에 대해 효율적이고 효과적으로 분석하기 위한 방법의 필요성이 대두되었다.
농약에 대한 노출은 대표적으로 직업적 노출과 비직업적 노출로 나누어 볼 수 있으나, 직업적 노출이 절대량에서 압도적으로 높다. 직업별로는 농업인이 가장 높으며, 농약 제조업 노동자, 정원, 골프장 방제사 및 농약 원료 작업자의 순서로 노출이 높다. 비직업적인 노출군으로는 항공방제지역 거주인, 농약이 오염된 식수음용 인구 집단 및 농약 잔류식품 섭취군 등의 순으로 노출량이 높다.
피부적인 접촉, 흡입 및 섭취를 통해 중독되는 카바메이트 및 유기인은 노출량과 노출 정도에 따라 중간형 증후군(intermediate syndrome), 근위부 근력 약화(proximal muscle weakness), 호흡 근력 약화(respiratory muscle weakness), 안면 근육 약화(facial muscle weakness), 지연 신경병(delayed neuropathy)을 나타낸다.
기존의 농약 분석법으로는 기체 크로마토그래피(gas chromatography, GC)와 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)가 주로 이용되어 왔다. 기체 크로마토그래피와 고성능 액체 크로마토그래피는 감도가 매우 높고 정확하며 다수성분을 동시에 분석할 수 있는 장점은 있으나, 분석하기에 앞서 복잡한 전처리 과정이 수반되므로, 장시간이 소요되며 전문적인 인력과 고가의 장비가 필요하다는 단점이 있다.
이러한 농약 분석 방법은 실험실 수준에서는 사용 가능하나, 농약을 사용하는 직업에 종사하는 등의 수많은 사람들에게 적용하기에는 실질적으로 그 적용이 어려운 한계가 있다.
따라서 보다 효율적이고 간단하며 경제적인 콜린에스테라제 저해성 물질을 검출할 수 있는 농약 검출 방법에 관한 개발이 필요하며, 나아가 농약의 중독 유무뿐만 아니라, 콜린에스테라제 저해성 물질의 정량적 분석까지도 정밀하게 할 수 있는 농약 검출 방법의 개발이 필요하다.
한국공개특허공보 제10-2005-0074178호
본 발명의 목적은 혈액으로부터 콜린에스테라제 저해성 물질을 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 그 물질의 농도를 정량적으로 검출할 수 있는 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 보다 낮은 농도의 혈액 및 기질이 사용되더라도 콜린에스테라제 저해성 물질의 정성적, 정량적 분석의 정확도가 높은 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 콜린에스테라제 저해성 물질의 정성적, 정량적 분석의 정확도가 높음에도, 그 분석 시간이 약 10 분 이내로 매우 신속히 수행될 수 있는 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법은, a) 검체, 아세틸콜린 수용액을 포함하는 기질 및 물을 포함하는 혈장현탁액을 혼합하고 반응시켜 검출 혼합액을 제조하는 단계 및 b) 상기 혈장현탁액과 비교하여 상기 검출 혼합액의 색 변화를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 검체로 혈액의 혈장을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 검출 혼합액의 검체:기질:혈장현탁액의 중량비는 1:0.1~5:0.1~5일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 아세틸콜린 수용액의 아세틸콜린의 농도는 40 내지 200 mM일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 혈장현탁액은 pH 완중체 및 pH 조절제 중에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 혈장현탁액은 0.5 내지 3 mM 농도의 인산2수소칼륨 및 150 내지 900 mM 농도의 염화나트륨을 포함하는 수용액일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법은, 상기 a) 단계 이전에, 혈액을 원심분리하여 혈장인 검체를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 반응은 1 내지 10 분 동안 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 반응 시 검출 혼합액의 pH가 6.0 이상일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 b) 단계에서 색 변화의 측정은 검출 혼합액의 흡광도를 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 콜린에스테라제 저해성 물질은 유기인계 농약 및 카바메이트계 농약 등에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 농약으로부터 유래하는 물질일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법은, 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 키트를 이용하여 콜린에스테라제 저해성 물질을 검출하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 키트는, 혈액 수용 공간, 혈장현탁액 저장 공간, 기질 저장 공간 및 검출 공간으로 내부가 구획되는 본체를 포함하며, 상기 a) 단계는, a1) 혈액을 상기 혈액 수용 공간에 투입하는 단계, a2) 검출 키트를 원심분리기로 회전시켜 상기 혈액을 혈장 및 혈구로 원심분리 하는 단계 및 a3) 상기 혈액 수용 공간에 수용된 혈장과, 상기 혈장현탁액 저장 공간에 수용된 혈장현탁액과, 상기 기질 저장 공간에 수용된 기질을 상기 검출 공간으로 유입시켜 혼합시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 혈액 수용 공간은 상기 검출 공간의 측면에 이격 배치되며, 상기 혈장현탁액 저장 공간 및 상기 기질 저장 공간은 상기 검출 공간의 상면에 이격 배치되며, 상기 혈액 수용 공간 및 상기 검출 공간은 서로 대향하는 면에 각각 개구부가 형성되되, 상기 a2) 단계에서 상기 각각의 개구부가 혈장 유입로로 연결되어 혈장이 상기 혈장 유입로를 통해 유입되도록 할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 a2) 단계에서 혈액 수용 공간에 수용된 혈액이 원심분리에 의해 혈장 및 혈구로 각각 상하로 층분리되며, 상기 혈장이 상기 혈액 수용 공간의 개구부를 통해 상기 검출 공간으로 유입될 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 본체는, 상기 본체의 외면에 형성되는 혈액 주입구; 및 일단부가 상기 혈액 주입구와 연결되고 타단부가 상기 혈장 유입로와 연결되는 혈액 유입관; 및 상기 혈액 주입구와 상기 혈장 유입로를 개폐하는 혈액 개폐로드;를 더 포함하며, 상기 a2) 단계의 원심분리는 상기 혈액 개폐로드를 상기 혈액 유입관의 내부로 삽입시켜 상기 혈장 유입로를 폐쇄한 상태에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 혈장현탁액 저장 공간의 하면에 혈장현탁액 배출구가 형성되고, 상기 검출 공간의 상면에 혈장현탁액 유입구가 형성되어, 상기 혈장현탁액 배출구 및 상기 혈장현탁액 유입구가 연결되며, 상기 기질 저장 공간의 하면에 기질 배출구가 형성되고, 상기 검출 공간의 상면에 기질 유입구가 형성되어, 상기 기질 배출구 및 상기 기질 유입구가 연결될 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 본체는, 상기 본체의 외부와 통하여 상기 혈장현탁액 저장 공간과 연결되는 혈장현탁액 주입부; 상기 혈장현탁액 배출구 및 상기 혈장현탁액 유입구가 연결되는 혈장현탁액 유입로; 및 상기 혈장현탁액 주입부와 상기 혈장현탁액 유입로를 개폐하는 혈장현탁액 개폐로드;를 더 포함하며, 상기 a2) 단계의 원심분리는 상기 혈장현탁액 개폐로드를 상기 혈장현탁액 저장 공간의 내부로 삽입시켜 상기 혈장현탁액 유입로를 폐쇄한 상태에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 본체는, 상기 본체의 외부와 통하여 상기 기질 저장 공간과 연결되는 기질 주입부; 상기 기질 배출구 및 상기 기질 유입구가 연결되는 기질 유입로; 및 상기 기질 주입부와 상기 기질 유입로를 개폐하는 기질 개폐로드;를 더 포함하며, 상기 a2) 단계의 원심분리는 상기 기질 개폐로드를 상기 기질 저장 공간의 내부로 삽입시켜 상기 기질 유입로를 폐쇄한 상태에서 수행될 수 있다.
본 발명의 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법은 혈액으로부터 콜린에스테라제 저해성 물질을 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 그 물질의 농도를 정량적으로 검출할 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명의 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법은 보다 낮은 농도의 혈액 및 기질이 사용되더라도 콜린에스테라제 저해성 물질의 정성적, 정량적 분석의 정확도가 높은 효과가 있다.
또한 본 발명의 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법은 콜린에스테라제 저해성 물질의 정성적, 정량적 분석의 정확도가 높음에도, 그 분석 시간이 약 10 분 이내로 매우 신속히 수행될 수 있는 효과가 있다.
본 발명에서 명시적으로 언급되지 않은 효과라 하더라도, 본 발명의 기술적 특징에 의해 기대되는 명세서에서 기재된 효과 및 그 내재적인 효과는 본 발명의 명세서에 기재된 것과 같이 취급된다.
도 1은 유기인계 화합물이 콜린에스테라제 효소를 저해하는 화학 반응 메커니즘을 나타낸 모식도이다.
도 2는 콜린에스테라제 효소의 역할 및 유기인계 화합물이 상기 역할을 저해하는 메커니즘을 나타낸 모식도이다.
도 3 내지 도 6은 실시예 1의 검체 함량에 따른 처리군 검출 혼합액(OPMA treatment)과 대조군 검출 혼합액(Nomal)의 시간 경과에 따른 pH 변화를 2 회 반복 측정한 결과(상측)와, 상기 측정값을 이용하여 시간 경과에 따른 처리군/대조군 비(처리군 검출 혼합액 pH/대조군 검출 혼합액 pH)를 계산 및 보정한 결과(하측)를 나타낸 것이다.
도 7 내지 도 10은 실시예 2의 기질 농도에 따른 처리군 검출 혼합액(OPMA treatment)과 대조군 검출 혼합액(Nomal)의 시간 경과에 따른 pH 변화를 2 회 반복 측정한 결과(상측)와, 상기 측정값을 이용하여 시간 경과에 따른 처리군/대조군 비(처리군 검출 혼합액 pH/대조군 검출 혼합액 pH)를 계산 및 보정한 결과(하측)를 나타낸 것이다.
도 11은 실시예 3의 혈장현탁액의 농도에 따른 처리군 검출 혼합액의 시간 경과에 따른 pH 변화를 2 회 반복 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 검출 키트가 원심 분리기에 장착된 것을 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 예에서 사용되는 검출 키트의 사시도이다.
도 14는 본 발명의 일 예에서 사용되는 검출 키트의 분해도이다.
도 15는 본 발명의 일 예에서 사용되는 검출 키트의 각 공간이 명확하게 표시되도록 각 측면을 절개하여 나타낸 절개 사시도이다.
도 16은 본 발명의 일 예에서 사용되는 검출 키트를 상부에서 바라본 측면도이다.
도 17은 본 발명의 일 예에서 사용되는 검출 키트를 도 16의 A에 해당하는 면으로 절단하여 나타낸 절단도이다.
도 18은 본 발명의 일 예에서 사용되는 검출 키트를 도 16의 B에 해당하는 면으로 절단하여 나타낸 절단도이다.
도 19는 도 18을 바탕으로 혈장현탁액 개폐로드와 기질 개폐로드가 개폐되는 구조를 나타낸 도면이다.
도 20은 도 18을 바탕으로 혈액 수용 공간에 수용된 혈액이 원심분리되어 혈장층과 혈구층으로 분리되어 존재하는 것을 나타낸 도면이다.
이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 콜린에스테라제 저해성 물질 검출 방법을 상세히 설명한다.
본 발명에 기재되어 있는 도면은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
또한 본 발명에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명에서 사용되는 용어의 단수 형태는 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
또한 본 발명에서 특별한 언급 없이 불분명하게 사용된 %의 단위는 중량%를 의미한다.
본 발명은 혈액으로부터 콜린에스테라제 저해성 물질을 포함하는 농약을 검출할 수 있는 분석 방법에 관한 것으로, 본 발명의 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법은, a) 검체, 아세틸콜린 수용액을 포함하는 기질, 물을 포함하는 혈장현탁액을 혼합하고 반응시켜 검출 혼합액을 제조하는 단계 및 b) 상기 혈장현탁액과 비교하여 상기 검출 혼합액의 색 변화를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 검체로 혈액의 혈장을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 검출 속도가 빠르고, 보다 낮은 농도의 혈액 및 기질이 사용되더라도, 혈액으로부터 콜린에스테라제 저해성 물질을 정밀하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 그 물질의 농도를 정밀하게 정량적으로 검출할 수 있도록, 혈액으로부터 분리된 혈장을 기질과 반응시키는 것을 발명의 특징으로 한다.
구체적으로, 기질인 아세틸콜린(acetylcholine, ACh)은 중추신경계, 말초신경계, 신경근육부위 및 혈액 내의 적혈구에 존재하고, 아세틸콜린과 유사한 부틸린콜린은 혈장과 비교하여 적혈구에 더 높은 농도로 존재하며, 아세틸콜린 및 부틸린콜린의 농도에 따라, 반응 시간, pH, 반응 시간에 따라 검출되는 콜린에스테라제 저해성 물질의 정량적(함량) 신호에 대한 변화, 기질에 대한 민감도 등의 기질 반응성 및 이를 검출할 수 있는 신호의 정도가 달라진다.
따라서 본 발명은, 검체로 혈액을 이용하여 편이성을 높이되, 부틸린콜린이 더 높은 농도로 존재하는 혈구로부터 분리된 혈장을 기질과 반응시킴으로써, 혈구 내에 존재하는 아세틸콜린과 유사한 부틸린콜린을 배제하여 혈장 내에 존재하는 콜린에스테라제 저해성 물질과 기질인 아세틸콜린이 효율적으로 반응할 수 있도록 유도한다. 이에 따라 기질 반응성 및 이를 검출할 수 있는 신호에 대한 정밀도를 극대화할 수 있다. 또한 콜린에스테라제 저해성 물질의 정성적, 정량적 분석을 정밀하게 할 수 있으면서, 그 분석 시간이 약 10 분 이내로 매우 신속히 수행될 수 있는 효과가 있다. 혈구의 분리 없이 혈액을 기질과 반응하도록 할 경우, 혈구 내에 존재하는 기질도 함께 반응하므로, 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 정확성이 저하되고, 그 물질의 정량적 분석에 대한 정확도는 더욱 신뢰할 수 없는 문제가 발생한다.
검체인 혈장에는 기본적으로 콜린에스테라제가 존재하므로, 검체와 기질을 혼합할 경우, 혈장의 콜린에스테라제와 기질의 아세틸콜린이 반응하여 아세트산과 티오콜린이 생성되고, 따라서 검출 혼합액의 pH는 감소한다. 그러나 검체인 혈장 내에 콜린에스테라제 저해 물질이 존재하거나, 이의 농도가 증가할수록 상기 반응은 저해되어 반응 생성물인 아세트산과 티오콜린의 농도를 상대적으로 감소하므로, 상대적으로 pH의 감소는 저하된다. 따라서 검체 내 콜린에스테라제 저해 물질이 없는 경우(pH)를 기본 값으로 하여, 이의 비교하는 등의 정량적 분석을 통해 검체 내에 존재할 수 있는 콜린에스테라제 저해 물질의 유무 및 이의 농도를 정량적으로 역으로 분석할 수 있다. pH의 변화는 pH미터 또는 pH 지시약을 통해 측정 가능하다. 검출 혼합액의 이에 대한 모식도는 도 2에 도시되어 있다.
즉, 상기 a) 단계의 반응은 검체 내에 함유된 콜린에스테라제 저해성 물질과 기질의 아세틸콜린의 반응을 의미한다.
상기 검출 혼합액의 검체:기질:혈장현탁액의 중량비는 검체 내에 함유된 콜린에스테라제 저해성 물질과 기질의 아세틸콜린의 반응할 수 있을 정도라면 무방하며, 예컨대 1:0.1~5:0.1~5, 바람직하게는 1:0.5~2:0.5~2일 수 있다. 바람직한 일 예에 있어서, 상기 검체는 0.1 ㎖ 이상으로 사용되는 것이 10 분 이하의 반응에서 충분한 정성 분석 및 정량 분석이 가능한 측면에서 좋고, 그 상한 값은 크게 제한되지 않는다.
본 발명에서 시간 경과에 따른 pH 감소율 편차는 정량 분석의 정밀도의 향상 측면에서 낮은 것이 좋으므로, 후술하는 기질의 아세틸콜린 농도, 혈장현탁액의 조성비 등을 만족하는 것이 바람직하다.
특히 기질인 아세틸콜린 수용액의 아세틸콜린 농도는 콜린에스테라제 저해 물질의 정성 분석 및 정량 분석의 정밀도 및 신뢰성 확보에 중요한 인자이다.
상기 아세틸콜린 수용액의 아세틸콜린의 농도는 40 내지 200 mM, 바람직하게는 82.5 내지 165 mM일 수 있다. 이를 만족할 경우, 10 분 이내의 빠른 분석이 가능하면서도, 정성 분석은 물론, pH의 급격한 변화에 따른 안정성 저하 없이 정량 분석의 정밀도를 향상시킬 수 있다. 아세틸콜린 농도가 40 mM 미만일 경우, 반응이 진행되는지에 대한 관찰이 어려워 분석 자체가 불가능할 수 있으며, 아세틸콜린 농도가 200 mM 초과일 경우, 반응 초기에 반응이 불안정적으로 진행되어 콜린에스테라제 저해 물질의 정량 분석이 불가하고, 정성 분석의 신뢰성을 확보할 수 없다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 혈장현탁액은 pH 완중체 및 pH 조절제 중에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있다. pH 완충제의 예로는 KH2PO4 등의 인산화물이 바람직하지만, 이 외에도 적절한 pH 완충을 위한 공지된 완충제, 예를 들어 MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, 바이신, TAPS, CHES, CAPSO 및 CAPS 등을 요구되는 pH에 맞춰 적절히 선택할 수 있다. pH 조절제의 예로는 염산, 질산, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 암모니아를 포함하는 알칼리제; 및 아세트산, 인산, 시트르산, 탄산, 중탄산, 옥살산, 염산을 포함하는 산제 등에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있다.
상기 혈장현탁액이 pH 완중체를 포함할 경우, 혈장현탁액의 물을 용매로 하여 0.5 내지 3 mM 농도로 포함될 수 있으며, pH 조절제가 포함될 경우, 혈장현탁액의 물을 용매로 하여 150 내지 900 mM 농도로 포함될 수 있다. 이를 만족할 경우, 10 분 이내의 빠른 분석이 가능하면서도, 반응에 따른 pH의 급격한 변화를 억제하여 정량 분석에 대한 신뢰성을 향상시킬 수 있다.
바람직한 일 예에 있어서, 상기 혈장현탁액은 0.5 내지 3 mM 농도의 인산2수소칼륨 및 150 내지 900 mM 농도의 염화나트륨을 포함하는 수용액일 수 있다. 이를 만족할 경우, 혈장현탁액이 상기 a) 단계의 반응에 영향을 주어, 콜린에스테라제 저해 물질의 정성 분석 및 정량 분석의 정밀도 및 신뢰성을 감소시키는 부작용을 방지할 수 있다.
상기 반응 시 검출 혼합액의 pH가 6.0 이상인 것이 바람직할 수 있다. pH가 10 분 이하에서 급격히 저하될 경우, 시간 경과에 따른 pH 감소율 편차 또한 함께 증가하여 정량 분석의 정밀도가 저하될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법은, 상기 a) 단계 이전에, 혈액으로부터 혈장을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 구체적으로, 혈액을 원심분리하여 혈장인 검체를 수득하는 단계일 수 있다.
본 발명에서 “혈액”은 검체로 사용되는 혈장을 분리하기 위한 전 검체에 해당할 수 있으며, 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 시 사용되는 실제 반응을 위한 물질은 전술한 바와 같이 혈액으로부터 혈구와 분리된 혈장이 사용된다.
상기 반응 시 반응시간은 콜린에스테라제 저해성 물질의 정성 분석 및 정량 분석이 가능할 정도라면 크게 제한되지 않으나, 높은 검출 효율성을 위한 측면에서, 1 내지 10 분 동안 수행되는 것이 예시될 수 있다. 콜린에스테라제 저해성 물질을 분석하는 데에 걸리는 시간, 즉, 분석 시간은 특히 분석 기술분야에서 매우 중요하며, 본 발명에서는 10 분 내외로 콜린에스테라제 저해성 물질의 실시간 검출이 가능한 효과가 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 콜린에스테라제 저해성 물질은 유기인계 농약 및 카바메이트계 농약 등에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 농약으로부터 유래하는 물질일 수 있다. 본 발명에서 “콜린에스테라제 저해성 물질”은 유기인계 농약의 유기인계 화합물 또는 카바메이트계 농약의 카바메이트계 화합물 등일 수 있으나, 이 외에도 콜린에스테라제 효소를 저해하여 콜린에스테라제 효소의 능력을 저하시키거나 불활성화시키는 물질이라면 검출 가능하므로 제한되지 않는다.
구체적인 일 예로, 상기 유기인계 농약의 유기인계 화합물은 도 1의 예처럼 인(P)을 중심으로 각종 원자 또는 원자단으로 구성되어 있으며, 인 원자에 4 개의 산소 원자가 결합된 정 인산형의 기본형이 있으며, 결합된 산소(O)와 황(S)의 위치 및 수에 따라 분류된다. 또한 상기 카바메이트계 농약의 카바메이트계 화합물은 -O-CO-NH2를 골격으로 하는 화합물을 의미한다.
상기 유기인계 농약 또는 카바메이트계 농약은 농약 성분들 중, 혈장현탁액과 반응하여 검출 혼합액의 pH 변화에 따라 pH 지시약에 의해 색이 변화하므로, 검출 혼합액의 광투과율이 변한다. 구체적으로, 기질과 콜린에스테라제 저해성 물질이 반응함에 따라 반응 생성물의 농도가 달라지고, 반응 생성물에 의해 pH가 변화된다. 따라서 혈장현탁액의 PH 지시약에 의해 광투과율이 변화하며, 이는 육안으로도 식별이 가능하지만, 흡광도 측정을 통해 콜린에스테라제 저해성 물질의 유무는 물론 이의 농도, 함량 또한 정량적으로 분석할 수 있다.
따라서 본 발명은 검출 혼합액의 흡광도 측정을 통해, 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 농도를 정량적으로 정밀하게 분석할 수 있다. 이는 혈구 내에 존재하는 아세틸콜린 및 부틸린콜린을 배제한 혈장을 검체로 사용하는 특징과 함께 흡광도 측정을 통해, 콜린에스테라제 저해성 물질과 기질의 반응에 따른 변화를 보다 효율적으로 감지할 수 있다.
하지만 본 발명은 pH미터 등의 검출 혼합액의 pH의 직접적인 측정을 통해서도 정량적 분석이 가능하므로, pH 변화를 직접 또는 간접적으로 감지할 수 있는 방법이라면 다양한 방법이 사용될 수 있다.
상기 혈장현탁액은 pH 지시약을 더 포함할 수 있으며, pH 지시약은 검출 혼합액의 pH의 변화에 의해 검출 혼합액의 광투과율을 변화시키는 물질이라면 제한되지 않으며, BTB용액(bromothymol blue)이 예시될 수 있다. 이때 pH 지시약의 사용 함량은 pH 지시약의 기능이 발휘될 수 있을 정도라면 무방하며, 예컨대 검출 혼합액 전체 중량에 대하여 0.001~1 중량%로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법은, 보다 바람직한 일 양태로서, 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 키트를 이용하여 콜린에스테라제 저해성 물질을 검출하는 것일 수 있다.
상기 검출 키트는 혈액이 혈장으로 분리되고 혈장의 현탁 및 pH를 조절하는 혈장현탁액이 기질과 함께 투입되도록 효율적인 구조를 가짐으로서, 반응에 따른 pH의 급격한 변화를 방지하여 정량 분석에 대한 신뢰성이 향상되는 효과가 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 키트는, 혈액 수용 공간, 혈장현탁액 저장 공간, 기질 저장 공간 및 검출 공간으로 내부가 구획되는 본체를 포함하며, 상기 a) 단계는, a1) 혈액을 상기 혈액 수용 공간에 투입하는 단계, a2) 검출 키트를 원심분리기로 회전시켜 상기 혈액을 혈장 및 혈구로 원심분리 하는 단계 및 a3) 상기 혈액 수용 공간에 수용된 혈장과, 상기 혈장현탁액 저장 공간에 수용된 혈장현탁액과, 상기 기질 저장 공간에 수용된 기질을 상기 검출 공간으로 유입시켜 혼합시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 혈액 수용 공간은 상기 검출 공간의 측면에 이격 배치되며, 상기 혈장현탁액 저장 공간 및 상기 기질 저장 공간은 상기 검출 공간의 상면에 이격 배치되며, 상기 혈액 수용 공간 및 상기 검출 공간은 서로 대향하는 면에 각각 개구부가 형성되되, 상기 a2) 단계에서 상기 각각의 개구부가 혈장 유입로로 연결되어 혈장이 상기 혈장 유입로를 통해 유입되도록 할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 a2) 단계에서 혈액 수용 공간에 수용된 혈액이 원심분리에 의해 혈장 및 혈구로 각각 상하로 층분리되며, 상기 혈장이 상기 혈액 수용 공간의 개구부를 통해 상기 검출 공간으로 유입될 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 본체는, 상기 본체의 외면에 형성되는 혈액 주입구; 및 일단부가 상기 혈액 주입구와 연결되고 타단부가 상기 혈장 유입로와 연결되는 혈액 유입관; 및 상기 혈액 주입구와 상기 혈장 유입로를 개폐하는 혈액 개폐로드;를 더 포함하며, 상기 a2) 단계의 원심분리는 상기 혈액 개폐로드를 상기 혈액 유입관의 내부로 삽입시켜 상기 혈장 유입로를 폐쇄한 상태에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 혈장현탁액 저장 공간의 하면에 혈장현탁액 배출구가 형성되고, 상기 검출 공간의 상면에 혈장현탁액 유입구가 형성되어, 상기 혈장현탁액 배출구 및 상기 혈장현탁액 유입구가 연결되며, 상기 기질 저장 공간의 하면에 기질 배출구가 형성되고, 상기 검출 공간의 상면에 기질 유입구가 형성되어, 상기 기질 배출구 및 상기 기질 유입구가 연결될 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 본체는, 상기 본체의 외부와 통하여 상기 혈장현탁액 저장 공간과 연결되는 혈장현탁액 주입부; 상기 혈장현탁액 배출구 및 상기 혈장현탁액 유입구가 연결되는 혈장현탁액 유입로; 및 상기 혈장현탁액 주입부와 상기 혈장현탁액 유입로를 개폐하는 혈장현탁액 개폐로드;를 더 포함하며, 상기 a2) 단계의 원심분리는 상기 혈장현탁액 개폐로드를 상기 혈장현탁액 저장 공간의 내부로 삽입시켜 상기 혈장현탁액 유입로를 폐쇄한 상태에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 본체는, 상기 본체의 외부와 통하여 상기 기질 저장 공간과 연결되는 기질 주입부; 상기 기질 배출구 및 상기 기질 유입구가 연결되는 기질 유입로; 및 상기 기질 주입부와 상기 기질 유입로를 개폐하는 기질 개폐로드;를 더 포함하며, 상기 a2) 단계의 원심분리는 상기 기질 개폐로드를 상기 기질 저장 공간의 내부로 삽입시켜 상기 기질 유입로를 폐쇄한 상태에서 수행될 수 있다.
이하, 상기 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 키트의 구조를 구체적으로 설명한다.
콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 키트는, 혈액 수용 공간(110), 혈장현탁액 저장 공간(120), 기질 저장 공간(130) 및 검출 공간(140)으로 내부가 구획되는 본체(100)를 포함하며, 상기 혈액 수용 공간(110)은 상기 검출 공간(140)의 측면에 이격 배치되며, 상기 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 상기 기질 저장 공간(130)은 상기 검출 공간(140)의 상면에 이격 배치되며, 상기 혈액 수용 공간(110) 및 상기 검출 공간(140)은 서로 대향하는 면에 각각 개구부가 형성되되, 상기 각각의 개구부가 혈장 유입로(115)로 연결되며, 상기 검출 공간(140)은 상기 혈액 수용 공간(110), 상기 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 상기 기질 저장 공간(130)으로부터 각각 혈장, 혈장현탁액 및 기질이 유입된다. 이때 상기 혈장은 상기 혈액 수용 공간(110) 내에서 원심분리되어 형성될 수 있다.
상기 본체(100)에 구획되는 혈액 수용 공간(110), 혈장현탁액 저장 공간(120), 기질 저장 공간(130) 및 검출 공간(140)들의 각 위치는 상술한 바와 같이, 혈액 수용 공간(110)이 검출 공간(140)의 측면에 이격 배치되고, 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 기질 저장 공간(130)이 검출 공간(140)의 상면에 이격 배치되면 무방하다. 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 기질 저장 공간(130)과, 혈액 수용 공간(110)과의 위치 관계는 제한되지 않으며, 예컨대 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 기질 저장 공간(130)이 혈액 수용 공간(110)의 측면에 이격하거나 근접하여 위치할 수 있으며, 혈액 수용 공간(110)의 상부에 이격하거나 근접하여 위치할 수도 있다. 이의 일 예는 도 15에 구체적으로 도시되어 있으며, 도 15는 본체(100)의 각 구획이 잘 표시되도록 각 측면을 절개하여 나타낸 사시도이다. 도 15에서는 혈장현탁액 저장 공간(120)이 좌측으로, 기질 저장 공간(130)이 우측으로 위치하여 혈액 수용 공간(110)의 측면부에 위치하는 것으로 도시되어 있으나, 이들 위치는 검출 공간(140)의 상부에 위치하면 무방하다.
본 발명의 검출 키트는 검체로 혈액이 혈액 수용 공간(110)에 수용되고, 수용된 혈액은 검출 키트 내에서 혈구와 혈장으로 분리되며, 분리된 혈장만 검출 공간(140)으로 유입되도록 하는 구조를 가진다. 이러한 구조를 가지는 이유는 전술한 바와 같이 검출 속도를 높이고, 기질 반응성 및 이를 검출할 수 있는 신호에 대한 정밀도를 극대화하여 정성적, 정량적 분석의 정밀도를 극대화하기 위함이다.
상기 혈액은 검출 키트 본체(100)의 혈액 수용 공간(110) 내에서 원심분리에 의해 혈구와 혈장으로 분리되므로, 상기 본체(100)는 원심 분리기(200)에 탈부착되는 구조를 갖는다. 상기 본체(100)의 외장은 탈부착될 수 있는 구조라면 제한되지 않으므로, 공지된 다양한 탈부착 구조가 적용되어도 무방하나, 바람직하게는 도 12 및 도 20에 도시된 화살표와 같이, 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 기질 저장 공간(130)이 위치한 지점에서 검출 공간(140)이 위치한 지점으로의 방향으로 구심력이 작용하도록, 즉, 상기 방향의 반대 방향으로 원심력이 작용하도록 원심 분리기(200)에 탈부착 되는 구조를 가지는 것이 바람직하다. 이러한 구조를 가질 경우, 본체(100) 내부 공간과 연결되어 본체(100) 외부로 유체가 배출되는 부분을 가지는 본체(100) 외부 방향이 원심력 방향과 반대 방향으로 위치되므로, 본체(100) 내부에 수용된 유체가 바깥으로 유출되거나, 상대적으로 구조 안정성이 떨어지는 상부 본체(100b)로 힘이 가해지지 않아, 보다 안정적으로 원심분리를 수행할 수 있다.
상기 본체(100)는 일체로 제작될 수 있고, 상부 본체(100b)와 하부 본체(100a)로 구분되어 제작될 수도 있다. 본체(100)가 상부 본체(100b)와 하부 본체(100a)를 포함할 경우, 본체(100)의 길이 방향으로 검출 공간(140)의 상부, 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 기질 저장 공간(130)의 중간부 또는 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 기질 저장 공간(130)의 상부에서 선택되는 한 부분을 기준으로 하여 상부 본체(100b)와 하부 본체(100a)로 구분될 수 있다. 예컨대 도 14에서와 같이, 혈액 수용 공간(110), 혈장현탁액 저장 공간(120), 기질 저장 공간(130) 및 검출 공간(140)을 포함하는 하부 본체(100a)와, 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 기질 저장 공간(130)의 상부에 형성되는 상부 본체(100b)가 결합하여 본체(100)를 이룰 수 있다. 이렇게 본체(100)는 길이 방향으로 상부 본체(100b)와 하부 본체(100a)로 구성될 수 있으며, 원심분리 시 상부 본체(100b)에서 하부 본체(100a)의 방향으로 원심력이 작용하도록 원심 분리기(200)에 탈부착되는 구조를 가지는 것이 바람직하다.
혈액 수용 공간(110)에서 분리된 혈장과 혈구는 본체(100)를 똑바로 세울 경우, 구체적으로, 본체(100)의 길이방향으로 혈액 수용 공간(110) 및 검출 공간(140)의 하면이 중력 방향을 향하도록 세울 경우, 도 20에 도시된 바와 같이, 혈장은 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 기질 저장 공간(130)의 상부 방향 또는 상부 본체(100b) 방향으로 위치할 수 있다. 이때 혈장이 검출 공간(140)으로 유입될 수 있도록 혈액 수용 공간(110)과 검출 공간(140)이 연결되도록 하는 혈장 유입로(115)가 형성되어 있다.
따라서 상기 혈장 유입로(115)는, 도 15 및 도 17에 도시된 바와 같이 본체(100)의 길이 방향을 기준으로 본체(100)의 하면, 즉, 혈액 수용 공간(110) 및 검출 공간(140)의 하면과 상면 사이에 위치하되, 상기 하면으로부터 이격되어 형성된다. 이에 따라 도 20에 도시된 바와 같이, 혈장 유입로(115)의 하부에 위치한 혈구는 혈장 유입로(115)를 통과하지 못하고, 혈장 유입로(115)와 연결된 개구부와 접하고 혈구의 상부에 위치한 혈장만 혈장 유입로(115)를 통하여 검출 공간(140)으로 유입될 수 있게 된다. 즉, 상기 혈액 수용 공간(110)에 수용된 혈액은 원심분리에 의해 혈장 및 혈구로 각각 상하로 층분리되며, 상기 혈액 수용 공간(110)의 개구부는 상기 층분리된 혈장과 접촉하도록 형성되어 상기 개구부와 연결된 혈장 유입로(115)를 통해 혈장만 검출 공간(140)으로 유입될 수 있다.
통상적으로, 혈액은 혈액 전체 부피에 대하여 혈장 52~57 부피% 및 혈구 43~48 부피%를 포함한다. 따라서 본체(100)의 길이 방향을 기준으로, 혈장 유입로(115)와 연결된 혈액 수용 공간(110)의 개구부는 혈액 수용 공간(110) 전체 부피의 52 부피%에 대응하는 위치 이상으로 이격하여 형성되는 것이 혈구가 상기 개구부와 접하지 않을 확률이 높은 측면에서 좋다. 하지만 수용되는 혈액의 함량에 따라 상기 확률은 달라지므로, 적절히 조절될 수 있는 사항이다. 참고적으로, 본 명세서의 도면에는 혈장 유입로(115)의 위치와, 본체 및 각 공간과의 비는 고려되지 않은 상태로 도시되었다.
상기 혈장 유입로(115)가 혈액 수용 공간(110)에서 검출 공간(140)으로 연결되어 이루는 각은 상경사, 하경사 또는 무경사 모두 가능하다. 바람직하게는, 혈액 수용 공간(110)에서 검출 공간(140)으로 연결되어 이루는 혈장 유입로(115)의 각이 하경사를 이루도록 형성될 경우, 원심분리 시에는 혈장 유입로(115)가 후술하는 개폐 구조에 의해 닫힌 상태에서 수행되므로 혈액이 검출 공간(140)으로 유입되지 않으며, 혈액이 혈구 및 혈장으로 분리된 후에 닫힌 혈장 유입로(115)를 열어 중력에 의해 자동적으로 검출 공간(140)으로 혈장만 유입될 수 있다.
상기 혈장 유입로(115)는 유체의 흐름이 제어되도록 개폐 구조를 가질 수 있으며, 원심분리 시 검출 공간(140)으로 유입되지 않도록 닫히고, 원심 분리 후 혈장만이 검출 공간(140)으로 유입될 수 있도록 열리는 구조를 가질 수 있으며, 이는 수동 또는 자동 모두 가능하다.
상기 본체(100)는, 상기 본체(100)의 외면에 형성되어 혈장 유입로(115)와 연결되어 혈액 수용 공간(110)으로 혈액을 유입시키는 혈액 주입구(111)를 더 포함할 수 있다. 혈액 주입구(111)는 후술하는 혈장 유입로(115)의 개폐 구조에도 포함되어, 혈액의 유입 역할과 함께 혈장 유입로(115)의 개폐가 가능하도록 하는 역할을 동시에 갖는다.
구체적으로, 상기 혈장 유입로(115)의 개폐 구조로서, 도 14 및 도 17에 도시된 바와 같이, 상기 본체(100)는, 본체(100)의 외면에 형성되는 혈액 주입구(111); 일단부가 상기 혈액 주입구(111)와 연결되고 타단부가 상기 혈장 유입로(115)와 연결되는 혈액 유입관(112); 및 상기 혈액 유입관(112)의 내부로 삽입되어 상기 혈액 주입구(111)와 상기 혈장 유입로(115)를 개폐하는 혈액 개폐로드(113);를 더 포함할 수 있다. 따라서 혈액 개폐로드(113)가 혈액 주입구(111)를 통하여 혈액 유입관(112)에 삽입되어 혈장 유입로(115)를 막을 수 있음에 따라, 혈액 수용 공간(110)에서 혈장 유입로(115)를 통해 검출 공간(140)으로 유체의 유입을 차단할 수 있다. 상기 유체 유입의 차단을 보다 확실하게 하기 위해, 혈액 유입관(112)은 혈장 유입로(115)를 관통하여 연장 형성될 수 있으므로, 즉, 혈액 유입관(112)이 혈장 유입로(115)를 관통하여 혈액 유입관(112)의 타단부가 혈장 유입로(115)를 연통하여 연장 형성될 수 있으므로, 혈액 개폐로드(113)가 혈장 유입로(115)를 관통하여 이에 삽입됨으로써, 혈액 수용 공간(110)에서 혈장 유입로(115)를 통해 검출 공간(140)으로 유체의 유입을 보다 확실하게 차단할 수 있다.
상기 혈액 유입관(112)의 위치는 크게 제한되지 않으며, 예컨대 도 17에 도시된 바와 같이, 혈액 수용 공간(110)과 검출 공간(140)의 사이에 형성되어 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 기질 저장 공간(130)의 상부에 해당하는 본체(100) 상면에 형성된 혈액 주입구(111)와 연결되어 형성될 수 있다.
상술한 바와 같이, 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 기질 저장 공간(130)이 검출 공간(140)의 상부에 위치하는데, 이는 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 기질 저장 공간(130)의 유입구과 배출구를 효율적으로 개폐하기 위한 것이다.
도 18에 도시된 바와 같이, 상기 혈장현탁액 저장 공간(120)의 하면에 혈장현탁액 배출구가 형성되고, 상기 검출 공간(140)의 상면에 혈장현탁액 유입구가 형성되어, 상기 혈장현탁액 배출구 및 상기 혈장현탁액 유입구가 연결될 수 있다. 또한 상기 기질 저장 공간(130)의 하면에 기질 배출구가 형성되고, 상기 검출 공간(140)의 상면에 기질 유입구가 형성되어, 상기 기질 배출구 및 상기 기질 유입구가 연결될 수 있다.
상기 본체(100)는, 상기 본체(100)의 외부와 통하여 상기 혈장현탁액 저장 공간(120)과 연결되는 혈장현탁액 주입부(121); 상기 혈장현탁액 배출구 및 상기 혈장현탁액 유입구가 연결되는 혈장현탁액 유입로(122); 및 상기 혈장현탁액 저장 공간(120)의 내부로 삽입되어 상기 혈장현탁액 주입부(121)와 상기 혈장현탁액 유입로(122)를 개폐하는 혈장현탁액 개폐로드(123);를 더 포함할 수 있다. 따라서 도 19에 도시된 바와 같이, 혈장현탁액 개폐로드(123)가 본체(100) 외부와 연결된 혈장현탁액 주입부(121)를 통하여 혈장현탁액 저장 공간(120)의 내부로 삽입되어 혈장현탁액 주입부(121)의 주입구를 개폐하는 역할을 한다. 또한 상기 혈장현탁액 개폐로드(123)는 혈장현탁액 저장 공간(120)의 내부에서 더 삽입되어 혈장현탁액 유입로(122)로 삽입됨으로써, 혈장현탁액 유입로(122)를 개폐하는 역할도 한다.
또한 상기 본체(100)는, 상기 본체(100)의 외부와 통하여 상기 기질 저장 공간(130)과 연결되는 기질 주입부(131); 상기 기질 배출구 및 상기 기질 유입구가 연결되는 기질 유입로(132); 및 상기 기질 저장 공간(130)의 내부로 삽입되어 상기 기질 주입부(131)와 상기 기질 유입로(132)를 개폐하는 기질 개폐로드(133);를 더 포함할 수 있다. 따라서 도 19에 도시된 바와 같이, 기질 개폐로드(133)가 본체(100) 외부와 연결된 기질 주입부(131)를 통하여 기질 저장 공간(130)의 내부로 삽입되어 기질 주입부(131)의 주입구를 개폐하는 역할을 한다. 또한 상기 기질 개폐로드(133)는 기질 저장 공간(130)의 내부에서 더 삽입되어 기질 유입로(132)로 삽입됨으로써, 기질 유입로(132)를 개폐하는 역할도 한다.
본 발명의 검출 키트는 각 유체가 수용된 상태에서 원심분리가 진행될 수 있으므로, 각 공간의 개폐 구성은 중요한 요소다. 구체적으로, 혈장 유입로(115)를 개폐하는 혈액 개폐로드(111)를 포함하는 개폐 구성과, 혈장현탁액 저장 공간(120)에 삽입되는 혈장현탁액 개폐로드(121)를 포함하는 개폐 구성과, 기질 저장 공간(130)에 삽입되는 기질 개폐로드(131)를 포함하는 개폐 구성은 검출 키트 자체가 원심 분리기에 장착되어 강한 원심력이 가해지므로, 각 공간에 수용된 유체가 다른 공간으로 유입되지 않아야 한다.
전술한 바와 같이, 본체(100)는 상부 본체(100b)와 하부 본체(100a)로 구분될 수 있다. 구체적인 일 예로, 하부 본체(100a) 내부에는 혈액 수용 공간(110), 혈장현탁액 저장 공간(120), 기질 저장 공간(130) 및 검출 공간(140)이 구획되어 있을 수 있으며, 상부 본체(100b)에는 혈액 주입구(111), 혈장현탁액 주입부(121), 기질 주입부(131)가 형성될 수 있다. 또한 도 14에 도시된 바와 같이, 상부 본체(100b)에 형성된 끼움돌기가 하부 본체(100b)의 혈액 수용 공간(110), 혈장현탁액 저장 공간(120) 및 기질 저장 공간(130)에 끼워질 수 있도록 형성될 수 있다.
상기 검출 공간(140)은 혈액 수용 공간(110)으로부터 혈장이 유입될 수 있고, 혈장현탁액 저장 공간(120)으로부터 혈장현탁액이 유입될 수 있으며, 기질 저장부로부터 기질이 유입될 수 있다. 따라서 검출 공간(140)에는 혈장, 기질 및 혈장현탁액을 포함하는 혼합액이 수용될 수 있으며, 여기서 기질과 혈장 내의 반응 물질들이 반응하게 된다. 검출 공간(140) 내에서 반응이 진행됨에 따라 혼합물의 pH, 광투과율 등의 변화가 생기며, 이를 감지함으로써, 콜린에스테라제 저해성 물질의 정석적, 정량적 분석이 가능하다. 즉, 콜린에스테라제 저해성 물질이 검체인 혈액, 구체적으로 혈장 내에 존재함에 따라, 콜린에스테라제 저해성 물질 외의 물질, 환경 또는 상태의 변화를 감지할 수 있다.
상기 검출 키트는, 혈구에 존재하는 아세틸콜린 및 부틸린콜린을 배제한 상태에서, 혈장 내에 존재할 수 있는 콜린에스테라제 효소에 기질인 아세틸콜린을 인위적으로 반응시켜, 보다 정밀하게 정성 분석 및 정량 분석이 가능하도록 전술한 구조를 갖는다.
구체적으로, 도 2 에서와 같이, 콜린에스테라제 저해성 물질이 검체인 혈액 내에 존재할 경우, 콜린에스테라제 저해성 물질이 콜린에스테라제 효소에 비가역적으로 결합하게 되므로, 아세틸콜린을 분해하는 콜린에스테라제 효소가 불활성화되어 이의 농도가 감소하고, 아세틸콜린의 농도는 증가하며, 아세틸콜린의 분해산물인 아세트산 및 티오콜린의 농도는 감소한다. 이에 따라, 비정상적으로 증가하는 아세틸콜린의 농도, 비정상적으로 감소하는 아세트산의 농도, 비정상적으로 감소하는 티오콜린의 농도 또는 이들에 의해 변화하는 pH 등의 환경 등을 감지 및 (콜린에스테라제 저해성 물질이 없는 경우와 비교하여)분석할 수 있으므로, 콜린에스테라제 저해성 물질의 농도까지도 정밀하게 측정할 수 있다. 따라서 콜린에스테라제 저해성 물질을 정밀하게 검출할 수 있고, 특히 그 물질의 농도를 정량적으로 검출할 수 있으며, 보다 낮은 농도의 혈액 및 기질이 사용되더라도 정성적, 정량적 검출을 보다 정밀하게 할 수 있는 효과가 있다. 또한 빠른 기질 반응을 유도하고, 검출 키트로서 신속하고 편이성이 우수한 효과가 있다.
이에 따라, 상기 본체(100)는, 상기 검출 공간(140)의 내부에 유입된 혈장, 기질 및 혈장현탁액을 포함하는 혼합액의 흡광도를 측정하는 장치가 구비될 수 있다. 또한 검출 키트를 흡광도를 측정하는 장치를 이용하여 검출 키트 외부에서 흡광도를 측정할 수도 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명하나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
검체 함량에 따른 pH 변화 측정
검체(혈액으로부터 원심분리된 혈장)에 혈장현탁액(1 mM KH2PO4 및 300 mM NaCl을 포함하는 수용액, pH 8.0)과 기질(165 mM 아세틸콜린 수용액)을 1:1:1 중량비로 혼합하고, 여기에 유기인계 농약 화합물(Organophosphorous Pesticides Mix A, OPMA, dichlorvos, micap, disufoton, methyl parathion, ronnel, dusban, gluthion, tokuthion)을 200 ng/㎖ 농도가 되도록 더 혼합하여 처리군 검출 혼합액을 제조하였다. 이때 검체의 함량이 0.1, 0.2, 0.5 및 1 ㎖가 되도록 각각 처리군 검출 혼합액을 제조하였다.
또한 유기인계 농약 화합물을 사용하지 않은 것을 제외하고 상기 처리군 검출 혼합액과 동일한 방법으로 대조군 검출 혼합액을 각각 제조하였다.
각각의 검체 함량에 따른 처리군 검출 혼합액(OPMA treatment)과 대조군 검출 혼합액(Nomal)의 시간 경과에 따른 pH 변화를 2 회 반복 측정하여 도 3 내지 도 6의 상측에 도시하였다. 또한 상기 측정값을 이용하여 시간 경과에 따른 처리군/대조군 비(처리군 검출 혼합액 pH/대조군 검출 혼합액 pH)를 계산 및 보정하여 도 3 내지 도 6의 하측에 도시하였다. 처리군/대조군 비의 값이 시간에 따라 증가한다는 것은 곧 유기인계 화합물의 유무를 알 수 있는 것은 물론, 그 변화로부터 정량 분석도 가능함을 의미한다.
그 결과, 0.1 및 0.2 ㎖의 검체가 사용된 경우는 10 분까지 반응이 진행되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 10 분 이내 측정이 가능한 최소 사용 검체 함량은 적어도 0.1 ㎖ 이상인 것을 알 수 있다.
기질 농도에 따른 pH 변화 측정
0.1 ㎖의 검체(혈액으로부터 원심분리된 혈장)에 혈장현탁액(1 mM KH2PO4 및 300 mM NaCl을 포함하는 수용액, pH 8.0)과 기질을 1:1:1 중량비로 혼합하고, 여기에 유기인계 농약 화합물(Organophosphorous Pesticides Mix A, OPMA, dichlorvos, micap, disufoton, methyl parathion, ronnel, dusban, gluthion, tokuthion)을 200 ng/㎖ 농도가 되도록 더 혼합하여 처리군 검출 혼합액을 제조하였다. 이때 기질로 아세틸콜린 수용액이 사용되었으며, 아세틸콜린의 농도를 82.5 mM(0.1xACh), 165 mM(1xACh), 330 mM(2xACh), 825 mM(5xACh)가 되도록 각각 처리군 검출 혼합액을 제조하였다.
또한 유기인계 농약 화합물을 사용하지 않은 것을 제외하고 상기 처리군 검출 혼합액과 동일한 방법으로 대조군 검출 혼합액을 각각 제조하였다.
각각의 기질 농도에 따른 처리군 검출 혼합액(OPMA treatment)과 대조군 검출 혼합액(Nomal)의 시간 경과에 따른 pH 변화를 2 회 반복 측정하여 도 7 내지 도 10의 상측에 도시하였다. 또한 상기 측정값을 이용하여 시간 경과에 따른 처리군/대조군 비(처리군 검출 혼합액 pH/대조군 검출 혼합액 pH)를 계산 및 보정하여 도 7 내지 도 10의 하측에 도시하였다. 처리군/대조군 비의 값이 시간에 따라 증가한다는 것은 곧 유기인계 화합물의 유무를 알 수 있는 것은 물론, 그 변화로부터 정량 분석도 가능함을 의미한다.
그 결과, 아세틸콜린 농도가 82.5 mM(0.1xACh)인 경우는 처리군/대조군 비가 반응 6 분 이후부터 변화하지 않았다. 반면 아세틸콜린 농도가 165 mM(1xACh)인 경우는 처리군/대조군 비가 반응 이후 꾸준히 증가되었다. 아세틸콜린 농도가 330 mM(2xACh) 및 825 mM(5xACh)인 경우는 반응 2 분 전까지는 처리군/대조군 비의 값이 오히려 감소하였으며, 반응 2 분 이후부터 증가하였다. 또한 반응 직후 pH가 급격히 감소하여 불안정적인 반응을 보였다.
이론적으로, 유기인계 농약 화합물이 기질과 효소와의 반응을 저해하여, 산성물질인 반응 생성물을 감소시키므로, 처리군/대조군 비는 증가하여야 한다. 즉, 처리군/대조군 비가 감소한다는 것은 상기 반응이 정상적으로 진행되지 않거나, 다른 부반응이 진행되는 것 등에 기인하여, 유기인계 농약 화합물의 정량 분석 및 정성 분석이 실질적으로 불가능함을 의미한다.
따라서 기질로 사용되는 아세틸콜린 수용액의 아세틸콜린 농도는 82.5 내지 165 mM인 것이 바람직함을 알 수 있다.
혈장현탁액 농도에 따른 pH 변화 측정
0.1 ㎖의 검체(혈액으로부터 원심분리된 혈장)에 혈장현탁액과 기질(165 mM 아세틸콜린 수용액)을 1:1:1 중량비로 혼합하고, 여기에 유기인계 농약 화합물(Organophosphorous Pesticides Mix A, OPMA, dichlorvos, micap, disufoton, methyl parathion, ronnel, dusban, gluthion, tokuthion)을 200 ng/㎖ 농도가 되도록 더 혼합하여 처리군 검출 혼합액을 제조하였다. 이때 혈장현탁액으로 H2PO4 및 NaCl을 포함하는 수용액이 사용되었으며, H2PO4 및 NaCl의 농도가 각각 1 mM, 300 mM(1x Sample Dilution Buffer); 10 mM, 3,000 mM(10x Sample Dilution Buffer);가 되도록 각각 처리군 검출 혼합액을 제조하였다.
각각의 혈장현탁액의 농도에 따른 처리군 검출 혼합액의 시간 경과에 따른 pH 변화를 2 회 반복 측정하여 도 10에 도시하였다. 도 10에서 pH(a)는 기질 첨가 전 pH의 산도에 해당하며, pH(b)는 기질 첨가 후 pH의 산도에 해당한다.
그 결과, 1 mM H2PO4, 300 mM NaCl 혈장현탁액의 경우(1x Sample Dilution Buffer)는 pH의 감소가 관찰되지 않은 반면, 10 mM H2PO4, 3,000 mM NaCl 혈장 현탁액의 경우(10x Sample Dilution Buffer)는 기질 첨가 5 분 후 pH 5.8에서 pH 5.6으로 감소하였다. 즉, 110 mM H2PO4, 3,000 mM NaCl 혈장현탁액의 경우(10x Sample Dilution Buffer)는 혈장현탁액이 기질 반응에 영향을 준 반면, 1 mM H2PO4, 300 mM NaCl 혈장현탁액의 경우(1x Sample Dilution Buffer)는 기질 반응에 영향을 주지 않음을 알 수 있다.
따라서 혈장현탁액인 H2PO4 및 NaCl을 포함하는 수용액의 H2PO4 및 NaCl의 농도는 각각 0.5 내지 3 mM 및 150 내지 900 mM인 것이 바람직함을 알 수 있다.
100 : 본체, 100a : 하부 본체
100b : 상부 본체, 110 : 혈액 수용 공간
111 : 혈액 주입구, 112 : 혈액 유입관
113 : 혈액 개폐로드, 115 : 혈장 유입로
120 : 혈장현탁액 저장 공간, 121 : 혈장현탁액 주입부
122 : 혈장현탁액 유입로, 123 : 혈장현탁액 개폐로드
130 : 기질 저장 공간, 131 : 기질 주입부
132 : 기질 유입로, 133 : 기질 개폐로드
140 : 검출 공간, 200 : 원심 분리기
210 : 중심축, 220 : 검출 키트 고정부
230 : 검출 키트 고정핀, 510 : 혈구
520 : 혈장

Claims (15)

  1. a) 검체; 아세틸콜린 수용액을 포함하는 기질; 및 물을 포함하는 혈장현탁액;을 혼합하고 반응시켜 검출 혼합액을 제조하는 단계 및
    b) 상기 혈장현탁액과 비교하여 상기 검출 혼합액의 색 변화를 측정하는 단계를 포함하는 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법으로서,
    상기 검출 방법은, 상기 검체로 혈액의 혈장이 사용되며, 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 키트를 이용하여 콜린에스테라제 저해성 물질을 검출하며,
    상기 검출 키트는, 혈액 수용 공간, 혈장현탁액 저장 공간, 기질 저장 공간 및 검출 공간으로 내부가 구획되는 본체를 포함하며,
    상기 a) 단계는,
    a1) 혈액을 상기 혈액 수용 공간에 투입하는 단계
    a2) 검출 키트를 원심분리기로 회전시켜 상기 혈액을 혈장 및 혈구로 원심분리 하는 단계 및
    a3) 상기 혈액 수용 공간에 수용된 혈장과, 상기 혈장현탁액 저장 공간에 수용된 혈장현탁액과, 상기 기질 저장 공간에 수용된 기질을 상기 검출 공간으로 유입시켜 혼합시키는 단계를 포함하는 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 검출 혼합액의 검체:기질:혈장현탁액의 중량비는 1:0.1~5:0.1~5인 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 아세틸콜린 수용액의 아세틸콜린의 농도는 40 내지 200 mM인 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 혈장현탁액은 pH 완중체 및 pH 조절제 중에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 혈장현탁액은 0.5 내지 3 mM 농도의 인산2수소칼륨 및 150 내지 900 mM 농도의 염화나트륨을 포함하는 수용액인 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계 이전에, 혈액을 원심분리하여 혈장인 검체를 수득하는 단계를 더 포함하는 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 반응은 1 내지 10 분 동안 수행되는 것인 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 반응 시 검출 혼합액의 pH가 6.0 이상인 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 b) 단계에서 색 변화의 측정은 검출 혼합액의 흡광도를 측정하는 것인 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계의 혈장현탁액은 pH 지시약을 더 포함하며,
    상기 b) 단계에서 색 변화의 측정은 육안으로 측정하는 것인 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 콜린에스테라제 저해성 물질은 유기인계 농약 및 카바메이트계 농약 중에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 농약으로부터 유래하는 물질인 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서,
    상기 혈액 수용 공간은 상기 검출 공간의 측면에 이격 배치되며,
    상기 혈장현탁액 저장 공간 및 상기 기질 저장 공간은 상기 검출 공간의 상면에 이격 배치되며,
    상기 혈액 수용 공간 및 상기 검출 공간은 서로 대향하는 면에 각각 개구부가 형성되되, 상기 a2) 단계에서 상기 각각의 개구부가 혈장 유입로로 연결되어 혈장이 상기 혈장 유입로를 통해 유입되도록 하는 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 a2) 단계에서 혈액 수용 공간에 수용된 혈액이 원심분리에 의해 혈장 및 혈구로 각각 상하로 층분리되며,
    상기 혈장이 상기 혈액 수용 공간의 개구부를 통해 상기 검출 공간으로 유입되는 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 본체는,
    상기 본체의 외면에 형성되는 혈액 주입구; 및
    일단부가 상기 혈액 주입구와 연결되고 타단부가 상기 혈장 유입로와 연결되는 혈액 유입관; 및
    상기 혈액 주입구와 상기 혈장 유입로를 개폐하는 혈액 개폐로드;
    를 더 포함하며,
    상기 a2) 단계의 원심분리는 상기 혈액 개폐로드를 상기 혈액 유입관의 내부로 삽입시켜 상기 혈장 유입로를 폐쇄한 상태에서 수행되는 혈액 내 콜린에스테라제 저해성 물질의 검출 방법.
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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서인범, ‘유기인계 및 카바마이트계 약물 진단용 현장진단검사키트 개발’(연구결과보고서, 2008.12.17.)

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