CN102016063B - 胆碱酯酶抑制性物质检测器件、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种胆碱酯酶抑制性物质检测器件，在容器内底部固定基底层，在此基底层上固定含有胆碱酯酶的反应层作为检测器件，在此检测器件内添加试料，通过发色反应，用目视判定试料中胆碱酯酶抑制性物质的存在。同时，在有机磷类农药检测中，于管柱上使试料与氧化剂接触而变换成为含氧体。

Description

胆碱酯酶抑制性物质检测器件、检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及胆碱酯酶抑制性物质检测器件、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

一直以来，已知残留在农作物或饮用水等中的农药成分对人体有不良影响。

因此，尤其是含有胆碱酯酶抑制性物质的有机磷类农药或胺基甲酸盐(或酯)(cabamate)类农药因为会引发神经病变(neuropathy)而造成严重问题。

由于这些状况，为了供给安心安全的食物、饮用水等，期望能开发出残留农药的检测技术，到目前为止，已提出各种各样的农药检测器件及检测方法。

以往所进行的大部分农药检测方法，是使用如气相色谱(GC)、气相色谱-质谱(GC/MS)、液相色谱(LC)、液相色谱-质谱(LC/MS)的分析仪器。

这些分析方法具有可以高感度定性、定量的优点，但由于需要大型器件，同时因手法繁琐而使检测费时，而有无法进行多样品分析或无法当场检测的缺点。

如此，由于仪器分析会有费工夫及费时的情形，因此，对于有机磷类农药或胺基甲酸盐(或酯)(cabamate)类农药的检测，例如，专利文献1提出一种农业检测方法，是利用农药中含有的胆碱酯酶抑制性物质使胆碱酯酶失活而降低水解活性作用，从而测量因水解所致的底物分解量，从而进行检测。

然而，在专利文献1的方法中，由于水解产物的发色反应微弱，因此无法简单地以目视判定通过吸光度测定来测定的底物分解量，因而有无法快速检测的问题。

同时，利用与专利文献1方法相同的原理，可以简单地以目视判定试料中是否存在有机磷类农药及胺基甲酸盐(酯)类农药的检测试剂盒，例如已有NEOGEN公司AT-10/AT-25(AgriScreen ticket 10/25)等贩售。

专利文献1：日本特开平09-107992号

发明内容

(发明待解决的课题)

然而，如上述检测试剂盒，不一定具有足够的检测限，检测限为例如：加保利(Carbaryl)为7.0ppm、陶斯松(chlorpyrifos)为0.7ppm、甲基陶斯松(Chlorpyrifos-methyl)为1.0ppm、大利松(diazinon)为2.0ppm。

此外，日本国内自2006年5月29日起修正部分食品卫生法，在有胆碱酯酶抑制性物质的有机磷类、胺基甲酸盐(酯)类农药的残留农药分析中，由于已改变食品中残留农药浓度的基准值，对于新的基准值，这些检测试剂盒几乎不具有足够的敏感度，因此仍期望在维持简便性的同时也能更提高检测限。

本发明是有鉴于如上述事实而作的发明，其课题是提供以低成本即可通过目视进行判定的胆碱酯酶抑制性物质的高感度检测器件、检测试剂盒及检测方法。

(解决课题的手段)

本发明为了解决上述课题而提供以下器件：

第1是胆碱酯酶抑制性物质检测器件，其特征是，在容器内底部的基底层上，固定有含有胆碱酯酶的反应层。进一步，第2是在前述检测器件的反应层中形成空隙，第3是前述第1或第2的检测器件，其中，基底层及反应层是由亲水性光硬化性树脂构成的。

又，第4是一种胆碱酯酶抑制性物质检测试剂盒，所述试剂盒含有前述第1至第3任意一项的检测器件、注射筒、可安装在注射筒前端部且内部充填有管柱粒子的管尖(column tip)、以及通过与胆碱酯酶反应而产生发色的底物。第5是第4的胆碱酯酶抑制性物质检测试剂盒，其中，通过与胆碱酯酶反应而产生发色的底物是乙酸吲哚酯。

进一步，第6是一种胆碱酯酶抑制性物质检测方法，所述方法是判定试料中是否存在胆碱酯酶抑制性物质的方法，所述方法为1)在前述1至3任意一项的检测器件内添加试料，2)添加通过与胆碱酯酶反应而产生发色的底物，3)如不产生发色，则判定在试料中存在胆碱酯酶抑制性物质；第7是前述第6的检测方法，经由管柱捕集试料并进行氧化处理后，将所述试料添加至前述之1至3任意一项的检测器件内；第8是一种有机磷类农药的检测方法，所述方法是判定试料中是否存在有机磷类农药之方法，所述方法为1)经由管柱捕集试料，并进行氧化处理，2)将此试料加入前述1至3任意一项的检测器件内，3)添加通过与胆碱酯酶反应而产生发色的底物，4)如不产生发色，则判定在试料中存在胆碱酯酶抑制性物质；第9是前述第6至第8任意一项的检测方法，其中，通过与胆碱酯酶反应而产生发色的底物是乙酸吲哚酯。

(发明效果)

如根据本发明的胆碱酯酶抑制性物质检测器件，由于基底层的存在，在反应层使用的液量可以是少量，由于可以抑制胆碱酯酶的使用量，因此可以削减成本。

再者，由于反应层具有空隙而使溶液试料可有效地渗入，因此可快速且高感度地检测是否存在胆碱酯酶抑制反应。

又，如根据本发明的胆碱酯酶抑制性物质检测试剂盒，可轻易地实施本发明检测方法，如根据本发明的检测方法，在分析前，由于将有机磷类农药在管柱上变化成含氧体(oxon form)，以求反应效率化，而因为可以使用高浓度氧化剂，因此可以提高检测感度。因此，由于可以用目视确认容器内反应层的发色，而使检测结果变成简便地判定胆碱酯酶抑制性物质的存在，故在出货现场或贩卖现场等可以容易地进行残留农药的检测，可对食物或饮用水等的安全性有很大贡献。

附图说明

图1表示本发明胆碱酯酶抑制性物质检测器件的模式结构图。

图2表示在试样浓缩及有机磷类农药氧化中使用的注射筒及管尖的模式图。

图3表示胆碱酯酶抑制性物质检测方法的步骤图。

元件符号说明

1    胆碱酯酶抑制性物质检测器件

2    容器            3    基底层

4    胆碱酯酶        5    反应层

6    注射筒          7    管尖

8    管柱            9    氧化剂

10   洗提液

具体实施方式

可通过本发明检测的物质是胆碱酯酶抑制性物质，包含：有机磷类农药、胺基甲酸盐(或酯)类农药、氟、砷等的1种或2种以上。

同时，本文中所谓“检测”是指决定试料中是否有特定物质的存在。

使用图1说明有关本发明胆碱酯酶抑制性物质检测器件的具体例。

此检测器件1是在容器2内底部的基底层3上，使含有胆碱酯酶4的反应层5以叠层状态固定，并在此器件内添加分析试料，即可用目视判定反应层5中是否有胆碱酯酶抑制反应的器件。

基底层3及反应层5优选为以在固定时不会损害酶活性的材料形成，例如，可以通过亲水性光硬化性树脂形成。因此，具体地，首先，可在容器2内添加亲水性光硬化性树脂后，通过实施光硬化形成基底层3，进一步，将含有胆碱酯酶4的亲水性光硬化性树脂重叠在基底层3上后，通过进行光硬化而形成反应层5。

基底层3是做为使反应层5与容器2的结合物理性地安定化的基盘而使用，同时，可以使反应层5作成薄层，因此，变成可以减轻在反应层5中所含胆碱酯酶4量的结构。同时，在基底层3与反应层5中使用的亲水性光硬化性树脂可设为相同物质。

因此，反应层5中含有胆碱酯酶4。在此，可以使用会对乙酰胆碱进行特异性反应的乙酰胆碱酯酶、会对胆碱酯进行一般反应的丁酰胆碱酯酶中的任意一种胆碱酯酶作为胆碱酯酶4，而在本发明中，尤其以使用丁酰胆碱酯酶者为优选具体实施例。

因此，在使用丁酰胆碱酯酶时，可以使用通过与胆碱酯酶反应而产生发色性强的脂溶性产物者，例如，可以使用乙酸吲哚酯、丁酸5-溴-6-氯-3-吲哚酯(5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl butyrate)、辛酸5-溴-6-氯-3-吲哚酯(5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl caprylate)、棕榈酸5-溴-4-氯-3-吲哚酯等作为发色底物，若考虑发色性等，则优选为乙酸吲哚酯。

例如在使用乙酸吲哚酯时，通过丁酰胆碱酯酶所致的水解而生成靛蓝(indigo)，靛蓝在670nm附近具有最大吸收波长而呈现蓝色，由于是脂溶性而不会在试料液中扩散，而是留在树脂内。因此，在使用丁酰胆碱酯酶及乙酸吲哚酯时，除了可以避免因扩散使发色程度降低而减少感度的情形，更可以目视确认色彩的微细变化。

另一方面，在使用乙酰胆碱酯酶时，虽可以使用5，5’-二硫基双-2-硝基苯甲酸(5，5’-Dithiobis-2-nitrobenzoic acid；DTNB)为发色底物，但由于生成的5-硫基-2-硝基苯酸(TNB)为水溶性，因此会由树脂内向试样溶液中扩散。进一步，TNB在412nm附近因为具有最大吸收波长而会呈现黄色，因此在溶液中很难以目视确认颜色的微细变化。因此，在本发明中，以使用丁酰胆碱酯酶为宜。

再者，反应层5优选为通过以曝气处理或搅拌等作成有多量的空隙结构。此空隙，是从反应层表面穿过反应层内的胆碱酯酶，因此，试料溶液不仅渗入反应层表面也可渗入至内部，因此可以提高胆碱酯酶4与试料溶液的接触性。空隙的大小，可对应试料溶液的黏性而形成，而优选为100μm至1000μm，更优选为可以是500μm左右。因此，当在试料中存在胆碱酯酶抑制性物质时，确实会引起胆碱酯酶抑制反应。

再者，本发明检测器件1的容器2可为密闭性，而优选为具有优异耐冲击性或耐药品性的，例如，可使用树脂制微量离心管(microtube)，更具体而言，可以使用EPPENDORF公司制「Safe-Locktube」等市售品。如考量溶液的搅拌容易度与固定于底部的树脂的物理安定性时，优选为所使用尺寸为1.5mL，又，固定的树脂容量在考量搅拌容器内的液体时，优选为基底部100μL，反应部30μL左右者。

因此，本发明检测试剂盒含有本发明前述检测器件、注射筒、管尖(column tip)、与发色底物。

图2(a)是表示注射筒与管尖接连状态的外观模式图，图2(b)是管尖的扩大模式图。

如图2(a)所示，本发明检测试剂盒是在注射筒6的前端部安装管尖7而使用。

注射筒6可使用抛弃式注射筒，若考虑使用便利性，优选为用量为10ml左右的。

又，管尖是使用在其前端内部充填有管柱粒子8的管尖。又考量试样的操作性及试料浓缩的可行性时，优选为可尽可能处理微量液量的管尖，可以使用市售微滴管用管尖。如考量使用的溶液量时，优选为所使用尺寸为100μL左右。

通过将这类管尖安装在注射筒6前端后使用，即可使用大量液体，而可在管柱8进行试料的浓缩。另外，在本发明检测试剂盒中，也可作成管尖7预先接在注射筒6的试剂盒结构。

再者，在此试剂盒中所含的发色底物，如上所述，可以使用通过胆碱酯酶所致反应而产生发色性强的脂溶性产物的发色底物，例如，可适用乙酸吲哚酯。在本发明检测器件的反应层中，通过丁酰胆碱酯酶的水解而生成脂溶性靛蓝，由于在树脂内呈现蓝色，因此可通过目视予以确认。

其次，使用图3说明有关本发明检测方法的步骤。

在本发明检测方法中，可以将饮用水等作为试样试料，此外，在检测农作物等的残留农药时，例如，可同时将农作物与水放入袋等之内，密闭后经过强烈摇动而当作试样试料。

然后，藉由注射筒6采取此试料，使此试料保存在管柱后，实施：1)试料的前处理、2)在本发明检测器件中添加试料(胆碱酯酶抑制反应)、3)添加发色底物的步骤，可通过目视而判定在试料中有无胆碱酯酶抑制性物质的存在。

试料的前处理是试料中含有有机磷类农药时，为了谋求提高检测感度而实施的。

具体地，使用注射筒6吸取氧化剂9，并使其与管柱中所持有的试料接触，从而使有机磷类农药变化成含氧体。氧化剂可以使用例如：N-溴化琥珀酰亚胺(NBS)、溴水、次氯酸、过氧化氢等。若考量试药的安定性或活性化效率，以NBS为宜。

根据所述前处理，将胆碱酯酶抑制能力增强100至1000倍左右，而可提高检测感度。

虽然可在试料中加入氧化剂而进行向含氧体的转换，但此情形下，因为也含有未反应氧化剂而会变成与胆碱酯酶反应，因此如考量到源自氧化剂的因素而使胆碱酯酶失活，就只能使用低浓度的氧化剂。

而在本发明中，由于是在保持有试料(有机磷类农药)的管柱中使氧化剂9通过的形态，因此以高浓度氧化剂9处理后，可将未反应氧化剂9废弃。据此能充分进行含氧体的转换，从而可以高感度检测。

其次，将经过前述处理的试料自管柱洗提可得到洗提液10。试料的洗提可用已知方法进行。因此，将此洗提液10添入本发明检测器件1中，当试料中含有胆碱酯酶抑制性物质时，检测器件1的反应层5中会引起胆碱酯酶抑制反应。

接着，将发色底物添加到检测器件内。在此，作为检测抑制反应的方法，也可作成以下形态：加入与胆碱酯酶反应的底物，再添加用以检测出此反应的产物的发色剂形态。

因此，试料中含有胆碱酯酶抑制性物质时，由于不会发生由于胆碱酯酶造成的发色底物的水解，因此反应层5维持原有的无色透明形态。

另一方面，试料中不含有胆碱酯酶抑制性物质时，在反应层5中产生发色底物水解造成的发色。在使用乙酸吲哚酯作为发色底物时，可以用目视确认蓝色的发色。

如上所述，若依本发明，就可以高感度并且简便地判定试料中有无胆碱酯酶抑制性物质的存在，尤其针对试料中的有机磷类农药，如前所述，在进行试料的前处理时，即可以高感度地检测出胆碱酯酶抑制性物质。

实施例

实施例1有机磷类农药的检测

依照图3所示步骤，进行有机磷类农药的检测。

首先，准备稀释成0.1ppb浓度的大利松(diazinon)有机磷类农药标准液的水溶液10mL作为试样试料，使用如图2所示在前端连接有管尖的注射筒吸取所述试料。

将已吸取的溶液排放在烧杯内，通过重复3次吸取而在管柱中吸附试样中的大利松后，同样吸取1mL的1％NBS溶液，排出并转换成含氧体后，由管柱中洗提大利松。

将此洗提液添加到图1所示检测器件中，使胆碱酯酶抑制反应产生。5分钟后，在器件内添加作为发色底物的乙酸吲哚酯溶液并进行5分钟发色反应。结果，大利松抑制胆碱酯酶的酶活性，而不产生发色，即可检测出0.1ppb浓度的大利松。

同时，由于在试样试料中不含大利松时，可以确认蓝色的发色，因此依照本发明方法，显示可以确实检测出有机磷类农药。

比较例1氧化处理的效果

为了调查实施例1中氧化处理(NBS溶液吸取处理)的效果而进行比较实验。与实施例1同样，将试样中的大利松吸附至管柱中后，不进行氧化处理(NBS溶液吸取处理)而由管柱中洗提大利松。将此洗提液添加到检测器件中，并在器件内添加乙酸吲哚酯溶液。

结果，由于大利松的检测值是低至5ppm(5000ppb)，因此显示氧化处理的有效性。

实施例2胺基甲酸盐(或酯)类农药的检测

检测方法是根据图3所示步骤，由于以胺基甲酸盐(或酯)类农药为检测对象，因此不进行实施例1所进行的NBS溶液吸取、排放操作。

准备稀释成10ppb浓度的加保利(NAC；Carbaryl)胺基甲酸盐(或酯)类农药标准液的水溶液10mL作为试样，，以如图2所示的在前端连接有管尖的注射筒进行吸取。

将已吸取的溶液排放到烧杯内，通过重复3次吸取而在管柱中吸附试样中的NAC后，由管柱中洗提NAC。放入器件中5分钟，进行酶抑制反应。

5分钟后，在器件内添加作为发色底物的乙酸吲哚酯溶液，进行5分钟发色反应。结果，NAC抑制胆碱酯酶的酶活性，而不产生发色，即可检测出10ppb浓度的NAC。

实施例3

关于其他农药物质，以与实施例1及实施例2方法进行相同的实验时，可得到以下结果。

[表1]

如表1所示，确认本发明器件及方法比以往方法有更优异的检测感度。同时，在上述实施例1、2及表1中所示检测值可依据发色底物、管柱等而变化，并非显示本发明器件及方法所得的检测限制。又，在表1中付有＊记号的是表示胺基甲酸盐(或酯)类农药。

产业上之可利用性

本发明提供一种以低成本即可由目视判定的胆碱酯酶抑制性物质的高感度检测器件、检测试剂盒及检测方法。

Claims (6)

1.一种胆碱酯酶抑制性物质检测器件，其特征是，在容器内底部固定有由亲水性光硬化性树脂构成的基底层，并在基底层上固定有含有胆碱酯酶的由亲水性光硬化性树脂构成的反应层，且在反应层中形成空隙。 

2.如权利要求1所述的胆碱酯酶抑制性物质检测器件，其特征是，容器为树脂制微量离心管。 

3.一种胆碱酯酶抑制性物质检测试剂盒，其特征是，所述试剂盒含有：如权利要求1或2所述的检测器件、注射筒、可安装在注射筒前端部且内部填充有管柱粒子的管尖、以及通过与胆碱酯酶反应而产生发色的底物； 

所述通过与胆碱酯酶反应而产生发色的底物是乙酸吲哚酯。 

4.一种胆碱酯酶抑制性物质检测方法，所述方法是判定试料中是否存在胆碱酯酶抑制性物质的方法，其特征是： 

1)在权利要求1或2所述的检测器件内添加试料； 

2)添加通过与胆碱酯酶反应而产生发色的底物，所述通过与胆碱酯酶反应而产生发色的底物是乙酸吲哚酯； 

3)如不产生发色，则判定在试料中存在胆碱酯酶抑制性物质，所述胆碱酯酶抑制性物质是有机磷类农药、或是胺基甲酸盐或酯类农药。 

5.如权利要求4所述的胆碱酯酶抑制性物质检测方法，其特征是，所述胆碱酯酶抑制性物质是属于有机磷类农药的大利松时，是经管柱捕集10mL的大利松水溶液后，吸取1％的N-溴化琥珀酰亚胺溶液并排出，在进行氧化处理后，将试料添加至权利要求1或2所述的检测器件内。 

6.如权利要求4所述的胆碱酯酶抑制性物质检测方法，其特征是，所述胆碱酯酶抑制性物质是属于胺基甲酸盐或酯类农药的加保利时，不进行N-溴化琥珀酰亚胺的吸取、排放操作。