TWI496774B - 作為ｃｄｋ抑制劑之經亞碸亞胺取代的苯胺嘧啶衍生物，其製造及其作為醫藥品之用途 - Google Patents

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Description

作為CDK抑制劑之經亞碸亞胺取代的苯胺嘧啶衍生物，其製造及其作為醫藥品之用途
本發明係關於所選經亞碸亞胺取代的苯胺嘧啶衍生物、其製造方法及其作為治療各種疾病之藥物之用途。
細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)係在細胞週期調節中具有重要作用之酶家族，且因此成為研發抑制性小分子之尤其令人關注的目標。可使用CDK之選擇性抑制劑來治療癌症或其他因細胞增殖失調引發之疾病。
已闡述作為活性物質之嘧啶及類似物，例如作為殺真菌劑之2-苯胺嘧啶(DE 4029650)或治療神經疾病或神經變性疾病之經取代嘧啶衍生物(WO 99/19305)。已闡述極多種作為CDK抑制劑之嘧啶衍生物，例如2-胺基-4-經取代嘧啶(WO 01/14375)、嘌呤(WO 99/02162)、5-氰基-嘧啶(WO 02/04429)、苯胺嘧啶(WO 00/12486)及2-羥基-3-N,N-二甲基胺基丙氧基-嘧啶(WO 00/39101)。
具體而言，對CDK具有抑制效應之嘧啶衍生物揭示於WO 02/096888及WO 03/076437中。
含有苯基磺醯胺基團之化合物係人類碳酸酐酶(尤其碳酸酐酶-2)之已知抑制劑且可用作尤其用於治療青光眼之利尿劑。磺醯胺之氮原子及氧原子經由氫橋結合碳酸酐酶-2活性中心中之鋅2+ 離子及胺基酸Thr 199，且由此阻斷其酶功能(A.Casini,F.Abbate,A.Scozzafava,C.T.Supuran,Bioorganic.Med.Chem.Lett.2003,1,2759)。含有苯基磺醯胺基團之CDK抑制劑之臨床應用可受限於抑制碳酸酐酶之可能性及所導致之多種副作用。
亞碸亞胺活性物質之實例係作為殺真菌劑之經亞碸亞胺醯基修飾之三唑(H.Kawanishi,H.Morimoto,T.Nakano,T.Watanabe,K.Oda,K.Tsujihara,Heterocycles 1998,49,181)或作為除草劑及殺蟲劑之芳烷基亞碸亞胺(Shell International Research,Ger.P.2 129 678)。
WO 2005/037800揭示作為細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑之經開鏈亞碸亞胺取代的苯胺嘧啶衍生物。所述實例係未經取代、或經鹵素取代、具體而言在嘧啶之5位經溴取代之結構。具體揭示結構中皆不含5-三氟甲基取代基。
根據此先前技術，本發明所面對之問題係提供不僅係有效CDK抑制劑且亦可有效抑制腫瘤生長之化合物。實際上，有效CDK抑制係有效腫瘤抑制之必要條件，而非充分條件。該等結構亦需要其他特性，例如滲透至腫瘤細胞中的特性。
現已發現通式(I)化合物 其中X 代表-O-或-NH-，且R1 代表甲基、乙基、丙基或異丙基，且R2 及R3 彼此獨立地代表氫、甲基或乙基，且R4 代表C1 -C6 -烷基或C3 -C7 -環烷基環；及其鹽、非對映異構體及對映異構體，不僅可有效抑制CDK，且亦可尤其有效地抑制腫瘤生長。
X代表-O-之化合物統一歸類為式(Ia)。
X代表-NH-之化合物統一歸類為式(Ib)。
本發明係基於以下定義：
C 1 -C 6 -烷基
在每一情形下，C1 -C6 -烷基皆理解為直鏈或具支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基或己基。
C 3 -C 7 -環烷基
C3 -C7 -環烷基環應理解為環丙基、環丁基、環戊基、環己基或環庚基環。
在通式(I)中，X可代表-O-或-NH-。
較佳地X代表-O-。
在通式(I)中，R1 可代表甲基、乙基、丙基或異丙基。
較佳地，R1 代表甲基。
在通式(I)中，R2 及R3 可彼此獨立地代表氫、甲基或乙基。
較佳地，R2 及R3 彼此獨立地代表氫或甲基。
尤佳地，R2 代表甲基且R3 代表氫或甲基。
在通式(I)中，R4 可代表C1 -C6 -烷基或C3 -C7 -環烷基環。
較佳地，R4 代表甲基或乙基或代表環丙基環。
通式(I)化合物之較佳亞群包含如下通式(I)化合物：其中 X 代表-O-或-NH-，且R1 代表甲基，且R2 代表甲基，且R3 代表氫或甲基，且R4 代表甲基或乙基或代表環丙基環；及其鹽、非對映異構體及對映異構體。
本發明化合物適於治療以下疾病●癌症，例如實體瘤、腫瘤轉移、及血液腫瘤，具體而言：頭頸瘤；肺及支氣管腫瘤；胃腸腫瘤，例如胃癌、結腸直腸癌、胰癌、肝細胞癌；內分泌活性腫瘤；乳癌及婦科腫瘤；泌尿生殖腫瘤，例如腎癌、膀胱癌、前列腺癌；皮膚腫瘤；肉瘤；白血病及淋巴瘤；●病毒性疾病；及●心血管疾病，如：狹窄、動脈硬化及再狹窄、支架誘導再狹窄。
將根據本發明化合物調配為醫藥製劑之方法係依本身已知之方式，將活性物質(群)使用蓋倫製劑(galenical)常用之賦形劑轉化成所需劑型。
可使用例如，載劑、填充劑、崩解劑、黏合劑、保濕劑、助流劑、吸收劑及吸附劑、稀釋劑、溶劑、共溶劑、乳化劑、增溶劑、矯正藥、著色劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、調節滲透壓之鹽或緩衝液作為賦形劑。
應參照Remington's Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing公司，East Pennsylvania(1980)。
醫藥調配物可呈
固體 形式，例如錠劑、糖衣錠劑、丸劑、栓劑、膠囊、穿皮系統或呈半固體 形式，例如軟膏劑、乳霜、凝膠、栓劑、乳液或呈液體 形式，例如溶液、酊劑、懸浮液或乳液。
例如，本發明所用賦形劑可為鹽、糖類(單-、二-、三-、寡-、及/或多醣)、蛋白質、胺基酸、肽、脂肪、蠟、油、烴類及其衍生物，其中該等賦形劑可具有天然來源或可依合成方式或部分合成方式獲得。
人們認為錠劑、糖衣錠劑、膠囊、丸劑、粉劑、顆粒劑、軟錠劑、懸浮液、乳液或溶液尤其可用於經口或口服施用。
人們認為懸浮液、乳液、及(尤其)溶液尤其可用於非經腸施用。
圖1 展示在用實例5-SI-2處理期間對人類HeLa-MaTu宮頸腫瘤異種移植模型中腫瘤生長之抑制。在第0天經皮下將HeLa-MaTu細胞植入NMRI裸鼠中。在腫瘤尺寸達到約20mm2 後之第4天開始處理。以以下劑量及投與方案來實施處理：第1組：(對照組)-增溶劑(40% PEG400/60%水)第2組：實例5-SI-2，週期性處理方案，在第4、5、11、12天每天2x，經口，劑量5mg/kg。
A)隨時間而變之HeLa-MaTu異種移植腫瘤之生長。
B)在第17天HeLa-MaTu腫瘤之重量，以及處理組平均腫瘤重量與對照組平均腫瘤重量之比(T/C)。
圖2 展示在用V11處理期間對人類HeLa-MaTu宮頸腫瘤異種移 植模型中腫瘤生長之抑制。在第0天經皮下將HeLa-MaTu細胞植入NMRI裸鼠中。在腫瘤尺寸達到約20mm2 後之第4天開始處理。 以以下劑量及投與方案來實施處理：第1組：(對照組)-增溶劑(30% HPβCD/70%水，在第4-17天每天1x，經口)；第2組：V11，週期性處理方案，在第4、5、11、12天每天2x，經口，劑量8mg/kg。
A)隨時間而變之HeLa-MaTu異種移植腫瘤之生長。
B)在第17天HeLa-MaTu腫瘤之重量，以及各處理組平均腫瘤重量與對照組平均腫瘤重量之比(T/C)。
圖3： 展示在用實例6-SI-2處理期間對人類HeLa-MaTu宮頸腫瘤異種移植模型中腫瘤生長之抑制。在第0天經皮下將HeLa-MaTu細胞植入NMRI裸鼠中。在腫瘤尺寸達到約20mm2 後之第4天開始處理。以以下劑量及在第4、5、11、12、17及18天每天兩次經口投與之週期性處理方案實施處理：第1組：(對照組)-增溶劑(40% PEG400/60%水)；第2組：實例6-SI-2，劑量3mg/kg；第3組：實例6-SI-2，劑量4mg/kg；第4組：實例6-SI-2，劑量5mg/kg。
A)隨時間而變之HeLa-MaTu異種移植腫瘤之生長。
B)在第20天HeLa-MaTu腫瘤之重量，以及各處理組平均腫瘤重量與對照組平均腫瘤重量之比(T/C)。
圖4： 展示在用V12處理期間對人類HeLa-MaTu宮頸腫瘤異種移植模型中腫瘤生長之抑制。在第0天經皮下將HeLa-MaTu細胞植入NMRI裸鼠中。在腫瘤尺寸達到約20mm2 後之第4天開始處 理。以以下劑量及在第4、5、11、12、17、18、23及24天每天兩次經口投與之週期性處理方案實施處理：第1組：(對照組)-增溶劑(40% PEG400/60%水)；第2組：V12，劑量7mg/kg；第3組：V12，劑量8.5mg/kg；第4組：V12，劑量10mg/kg。
A)隨時間而變之HeLa-MaTu異種移植腫瘤之生長。
B)在第28天HeLa-MaTu腫瘤之重量，以及各處理組平均腫瘤重量與對照組平均腫瘤重量之比(T/C)。
圖5： 展示在用實例2-SI-2處理期間對人類HeLa-MaTu宮頸腫瘤異種移植模型中腫瘤生長之抑制。在第0天經皮下將HeLa-MaTu細胞植入NMRI裸鼠中。在腫瘤尺寸達到約20mm2 後之第5天開始處理。以以下劑量及在第5、6、12、13、19及20天每天兩次經口投與之週期性處理方案實施處理：第1組：(對照組)-增溶劑(40% PEG400/60%水)；第2組：實例2-SI-2，劑量1.5mg/kg；第3組：實例2-SI-2，劑量2mg/kg；第4組：實例2-SI-2，劑量2.5mg/kg。
A)隨時間而變之HeLa-MaTu異種移植腫瘤之生長。
B)在第20天HeLa-MaTu腫瘤之重量，以及各處理組平均腫瘤重量與對照組平均腫瘤重量之比(T/C)。
圖6： 展示在用V13處理期間對人類HeLa-MaTu宮頸腫瘤異種移植模型中腫瘤生長之抑制。在第0天經皮下將HeLa-MaTu細胞植入NMRI裸鼠中。在腫瘤尺寸達到約20mm2 後之第5天開始處理。以以下劑量及在第5、6、12、13、19及20天每天兩次經口投 與之週期性處理方案實施處理：第1組：(對照組)-增溶劑(40% PEG400/60%水)；第2組：V13，劑量6mg/kg；第3組：V13，劑量8mg/kg；第4組：V13，劑量10mg/kg。
A)隨時間而變之HeLa-MaTu異種移植腫瘤之生長。
B)在第20天HeLa-MaTu腫瘤之重量，以及各處理組平均腫瘤重量與對照組平均腫瘤重量之比(T/C)。
圖7： 展示在用實例1-SI-2處理期間對人類HeLa-MaTu宮頸腫瘤異種移植模型中腫瘤生長之抑制。在第0天經皮下將HeLa-MaTu細胞植入NMRI裸鼠中。在腫瘤尺寸達到約20mm2 後之第5天開始處理。以以下劑量及在第5、6、12、13、19及20天每天兩次經口投與之週期性處理方案實施處理：第1組：(對照組)-增溶劑(40% PEG400/60%水)；第2組：實例1-SI-2，劑量1.5mg/kg；第3組：實例1-SI-2，劑量2mg/kg；第4組：實例1-SI-2，劑量2.5mg/kg。
A)隨時間而變之HeLa-MaTu異種移植腫瘤之生長。
B)在第20天HeLa-MaTu腫瘤之重量，以及各處理組平均腫瘤重量與對照組平均腫瘤重量之比(T/C)。
圖8： 展示在用V14處理期間對人類HeLa-MaTu宮頸腫瘤異種移植模型中腫瘤生長之抑制。在第0天經皮下將HeLa-MaTu細胞植入NMRI裸鼠中。在腫瘤尺寸達到約20mm2 後之第5天開始處理。以以下劑量及在第5、6、12、13、19及20天每天兩次經口投與之週期性處理方案實施處理： 第1組：(對照組)-增溶劑(40% PEG400/60%水)；第2組：V14，劑量6mg/kg；第3組：V14，劑量8mg/kg；第4組：V14，劑量10mg/kg。
A)隨時間而變之HeLa-MaTu異種移植腫瘤之生長。
B)在第20天HeLa-MaTu腫瘤之重量，以及各處理組平均腫瘤重量與對照組平均腫瘤重量之比(T/C)。
 本發明化合物之製備
亞碸亞胺之結構及構型通常具有高穩定性(C.Bolm,J.P.Hildebrand,J.Org.Chem.2000,65,169)。
官能團之該等特性經常容許使用甚至劇烈之反應條件且使得亞碸亞胺可在亞胺氮及α-碳上進行簡單衍生。對應異構純淨之亞碸亞胺亦可在非對映異構選擇性合成中用作輔助劑((a)S.G.Pyne,Sulfur Reports 1992,12,57；(b)C.R.Johnson,Aldrichimica Acta 1985,18,3)。
例如，經由用對應異構純淨之樟腦-10-磺酸拆分外消旋體來製備對應異構純淨之亞碸亞胺已闡述於((a)C.R.Johnson,C.W.Schroeck,J.Am.Chem.Soc.1973,95,7418；(b)C.S.Shiner,A.H.Berks,J.Org.Chem.1988,53,5542)中。製備光學活性亞碸亞胺之另一種方法係光學活性亞碸之立體選擇性亞胺化((a)C.Bolm,P.Müller,K.Harms,Acta Chem.Scand.1996,50,305；(b)Y.Tamura,J.Minamikawa,K.Sumoto,S.Fujii,M.Ikeda,J.Org.Chem.1973,38,1239；(c)H.Okamura,C.Bolm,Org.Lett.2004,6,1305)。
關於亞碸亞胺之綜述性文獻參見(例如)：a)M. Regglin, C. Zur, Synthesis 2000, 1；(b) C.R. Johnson, Aldrichimica Acta 1985, 18,3。
以下實例闡釋本發明化合物之製備，而並不將所主張化合物限制於該等實例。
式(Ia)化合物(4-O衍生物)之製備
本發明化合物可藉由特徵在於以下步驟之方法來製備：a)將式(IVd)化合物氧化為式(IVc)亞碸； b1 )將式(IVc)亞碸直接亞胺化為式(IVa)受保護亞碸亞胺； 或b2 )將式(IVc)亞碸進行亞胺化，成為式(IVb)未受保護亞碸亞胺且隨後將保護基團引入式(IVa)化合物； c)將式(IVa)化合物還原為式(IV)化合物； d)藉由與式(VI)單保護二醇反應來使2,4-二氯-5-碘-嘧啶(VII)之4-位官能化，形成式(Va)中間體； e)製備5-CF3 中間體(V)； f)將式(IV)化合物與式(V)化合物偶合成式(III)中間體； g)裂解保護基團(PG)，形成(II)； h)裂解亞碸亞胺上之保護基團，形成(Ia)；
其中取代基R1 、R2 、R3 及R4 具有通式(I)中所述之含義。
步驟a)
將式(IVd)化合物氧化為式(IVc)亞碸。包括立體選擇性方法在內之多種方法可用於將硫醚轉化為亞碸(例如參見：(a)M.H.Ali等人，Synthesis 1997,764；b)M.C.Carreno,Chem.Rev.1995,95,1717；c)I.Patel等人，Org.Proc.Res.Dev.2002,6,225；c)N.Khiar等人，Chem.Rev.2003,103,3651)。尤其適合使用所述高碘酸/氯化鐵(III)來製備式(IVc)化合物。
步驟b 1 )
式(IVc)亞碸與三氟乙醯胺以及二乙酸碘苯、氧化鎂及催化量之乙酸銠(II)二聚體之反應使得可製備式(IVa)受保護亞碸亞胺。此反應具有立體特異性且在進行時可保留立體中心之構型(參見：(a)H.Okamura,C.Bolm,Org.Lett.2004,6,1305)。
步驟b 2 )
首先使式(IVc)亞碸發生反應成為式(IVb)未受保護亞碸亞胺。適宜方法係(例如)：
a)使亞碸與疊氮化鈉/濃硫酸反應(例如參見：(a)C.R.Johnson,P.E.Rogers,J.Org.Chem.1973,38,1793)。
b)使亞碸與疊氮化鈉/發煙硫酸反應(例如參見(a)N.V.Kondratenko,O.A.Radchenko,L.M.Yagupol' ski,J.Org.Chem.USSR 1984,20,2051)。
c)使亞碸與o-三甲苯磺醯羥胺(MSH)反應(例如參見(a)C.R.Johnson,R.A.Kirchhoff,H.G.Corkins,J.Org.Chem.1974,39,2458)。
隨後可(例如)根據所述藉由在鹼性條件下與三氟乙酸酐反應來引入保護基團，形成式(IVa)化合物。
步驟c)
對於隨後將芳香族硝基還原為式(IV)化合物，原則上可使用多種反應條件(例如參見R.C.Larock,Comprehensive Organic Transformations, VCH,New York,1989,411)。例如，尤其適合使用所述氯化鈦(III)或使用炭載鈀實施之氫化。
步驟d)
使2,4-二氯-5-碘-嘧啶(VII)與式(VI)之醇反應使得可製備式(Va)中間體(例如參見U.Lücking等人，WO 2007/071455)。
步驟e)
原則上，多種方法可用於在含氮雜芳香族化合物中用三氟甲基替代鹵素(例如參見a)G.E.Carr,R.D.Chambers,T.F.Holmes,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1,1988,921；b)F.Cottet,M.Schlosser,Eur.J.Org.Chem.2002,327；c)F.G.Njoroge等人，J.Med.Chem 1997,40,4290)。
具體而言，適合使用所述存於N-甲基-2-吡咯啶酮及THF中之碘化銅(I)、氟化鉀及(三氟甲基)-三甲基矽烷在5位引入嘧啶(Va)，形成中間體(V)。
步驟f)
可使式(V)2-氯-嘧啶與式(IV)苯胺反應生成式(III)中間體(例如參見(a)J.Bryant等人，WO 2004/048343)。
步驟g)
自中間體(III)裂解保護基團(PG)來產生中間體(II)(例如參見P.J.Kocienski,Protecting Groups,Georg Thieme Verlag Stuttgart,New York,1994)。
所述氫化尤其適合於所述苄基之裂解。若需要可在步驟f)之 條件下實施THP基團之裂解。
步驟h)
裂解亞碸亞胺(II)上之三氟乙醯基來產生式(Ia)化合物。所述在室溫下使用存於甲醇中之碳酸鈉之技術尤其適用於此(例如參見(a)H.Okamura,C.Bolm,Org.Lett.2004,6,1305)。
通則
所有與氧化敏感性或水解敏感性化合物進行之反應皆係在氬下以無水溶劑來實施。
除亞碸亞胺衍生物外，使用程式Autonom 2000 Name 對各種物質進行命名，該程式係以MDL ISIS Draw來執行。Autonom 2000 Name 不接受任何亞碸亞胺，故亞碸亞胺之命名遵循IUPAC原則(IUPAC，Nomenclature of Organic Chemistry，1979版，C-6.3.Sulfoxides and Sulfones,Rule C-633,633.1Sulfimide and Sulfoximide)。
縮寫
實例1 (RS)-S-環丙基-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-羥基-1-甲基丙基]氧基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)亞碸醯亞胺
1a)中間體之製備 化合物1.1 1-環丙基硫烷基-4-硝基苯
將1.78g(44.6mmol)氫化鈉(60%)逐份添加至3.00g(40.5mmol)環丙烷硫醇(根據以下來製備：E.Block等人，J.Am.Chem.Soc. 1992,114 ,3492)存於100ml THF/100ml二乙醚中之溶液中且在室溫下將其攪拌30分鐘。然後逐份添加6.00g(38.7mmol)1-氟-4-硝基苯。在40℃下將混合物攪拌2小時。在其冷卻後，將混合物置於水中並用苯(3x)來萃取。蒸發濃縮經合併有機相且藉由層析(己烷/乙酸乙酯95：5)來純化殘餘物。獲得4.6g(23.6mmol；產率：61%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.12(m,2H),7.54(m,2H),2.35(m,1H),1.16(m,2H),0.61(m,2H)。
化合物1.2 (RS)-1-環丙烷亞磺醯基-4-硝基苯
將179mg(1.11mmol)氯化鐵(III)添加至7.2g(36.88mmol)1-環丙基硫烷基-4-硝基苯存於140ml乙腈中之混合物中且在室溫下將其攪拌15分鐘。然後在25℃下逐份添加9.25g(40.57mmol)高碘酸。將混合物攪拌30分鐘，且隨後在攪拌的同時將其添加至冷卻的飽和硫代硫酸鈉溶液中。隨後用乙酸乙酯(2x)實施萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(己烷/乙酸乙酯1：1)來純化所獲得殘餘物。獲得5.93g(28.07mmol；產率：76%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.41(m,2H),7.98(m,2H),2.60(m,1H),1.01(m,3H),0.86(m,1H)。
化合物1.3 (RS)-S-環丙基-S-(4-硝基苯基)-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺
在氬下將1.58g(3.58mmol)乙酸銠(II)二聚體添加至15.1g(71.53mmol)(RS)-1-環丙烷亞磺醯基-4-硝基苯、17.8g(157.37mmol)三氟乙醯胺、38.0g(118.02mmol)二乙酸碘苯及12.7g(314.73mmol)氧化鎂存於801ml DCM中之懸浮液中且在室溫下攪拌過夜。經由矽藻土抽吸過濾混合物且蒸發濃縮。藉由層析(己烷/乙酸乙酯2：1)來純化剩餘殘餘物。獲得18.0g(55.97mmol；產率：78%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.49(m,2H),8.25(m,2H),3.56(m,1H),1.51(m,1H),1.41(m,1H),1.18(m,2H)。
化合物1.4 (RS)-S-(4-胺基苯基)-S-環丙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺
將1.4g炭載鈀(10%/50%濕度)添加至6.9g(21.44mmol)(RS)-S-環丙基-S-(4-硝基苯基)-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺存於214ml乙醇及39ml THF中之溶液中，且在常壓及25℃下將其氫化1小時。再添加1.4g炭載鈀且在常壓下再將其氫化4.5小時。過濾混合物，再次將1.4g炭載鈀添加至濾液中並最後氫化45分鐘。過濾混合物並蒸發濃縮。獲得5.8g(19.91mmol；產率：93%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=7.53(m,2H),6.71(m,2H),6.40(br,2H),3.21(m,1H),1.28(m,2H),1.08(m,2H)。
化合物1.5 (2R,3R)-3-苯甲氧基-丁-2-醇
在室溫下將5.00g(44.6mmol)第三丁醇鉀添加至4.00g(44.4mmol)(2R,3R)-丁烷-2,3-二醇存於300ml THF中之溶液中且使混合物回流15分鐘。使混合物冷卻至約50℃且添加5.3ml(44.6mmol)苄基溴。使其回流3小時，且隨後在室溫下將其攪拌過夜。用乙酸乙酯及氯化鈉溶液稀釋混合物且隨後用1N氯化氫溶液(1x)及氯化鈉溶液(2x)洗滌。乾燥有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(己烷/乙酸乙酯1：1)來純化所獲得殘餘物。獲得3.41g(18.9mmol；產率：43%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=7.35(m,4H),7.28(m,1H),4.52(m,3H),3.67(m,1H),3.37(m,1H),1.05(d,3H),1.01(d,3H)。
化合物1.6 4-((1R,2R)-2-苯甲氧基-1-甲基-丙氧基)-2-氯-5-碘-嘧啶
在0℃及攪拌下將2.07g氫化鈉(55%)逐份添加至存於56ml二乙醚中之8.55g(47.4mmol)(2R,3R)-3-苯甲氧基-丁-2-醇中。在10分鐘後移除冰浴，且在室溫下將其再攪拌3分鐘。在0℃下將所形成懸浮液添加至6.52g(23.7mmol)2,4-二氯-5-碘-嘧啶之溶液中。在40℃下將混合物攪拌4小時且隨後添加稀氯化鈉溶液。隨後用乙酸乙酯(2x)實施萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(己烷/乙酸乙酯4：1)來純化所獲得殘餘物。獲得4.12g(9.8mmol；產率：41%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.78(s,1H),7.29(m,5H),5.27(m,1H),4.64(d,1H),4.53(d,1H),3.73(m,1H),1.30(d,3H),1.19(d,3H)。
化合物1.7 4-((1R,2R)-2-苯甲氧基-1-甲基-丙氧基)-2-氯-5-三氟甲基-嘧啶
在室溫下將3.82g(20.0mmol)碘化銅(I)、0.97g(16.7mmol) 氟化鉀及2.47ml(16.7mmol)(三氟甲基)-三甲基矽烷在攪拌下添加至4.66g(11.1mmol)4-((1R,2R)-2-苯甲氧基-1-甲基-丙氧基)-2-氯-5-碘-嘧啶存於15.8ml NMP及15.8ml THF中之溶液中。在80℃下將混合物攪拌5.5小時。在冷卻後，將混合物添加至稀氯化鈉溶液中並用乙酸乙酯(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(己烷/乙酸乙酯4：1)來純化所獲得殘餘物。獲得2.17g(6.0mmol；產率：54%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.81(s,1H),7.21(m,5H),5.40(m,1H),4.57(d,1H),4.42(d,1H),3.70(m,1H),1.28(d,3H),1.13(d,3H)。
化合物1.8 (RS)-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-(苯甲氧基)-1-甲基丙基]氧基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)-S-環丙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺
將0.96ml氯化氫存於二噁烷中之4N溶液添加至存於18.8ml乙腈中之1.39g(3.85mmol)4-((1R,2R)-2-苯甲氧基-1-甲基-丙氧基)-2-氯-5-三氟甲基-嘧啶及1.35g(4.62mmol)(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-環丙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺中，且在80℃下將其攪 拌5小時。在冷卻後，用乙酸乙酯稀釋混合物且用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化鈉溶液洗滌，乾燥(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(己烷/乙酸乙酯4：1)來純化所獲得殘餘物。獲得1.32g(2.14mmol，產率：56%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.71(s,1H),8.84(s,1H),8.08(m,2H),7.93(m,2H),7.26(m,5H),5.52(m,1H),4.62(d,1H),4.51(d,1H),3.78(m,1H),3.35(m,1H),1.37(m,5H),1.16(m,5H)。
化合物1.9 (RS)-S-環丙基-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-羥基-1-甲基丙基]氧基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺
將1.64g炭載鈀(10%)添加至1.31g(2.12mmol)(RS)-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-(苯甲氧基)-1-甲基丙基]氧基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)-S-環丙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺存於66ml乙醇中之溶液中且在常壓及室溫下進行氫化。過濾混合物並蒸發濃縮。獲得0.88g(1.67mmol；產率：79%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.65(s,1H),8.58(s,1H),8.04(m,2H),7.89(m,2H),5.28(m,1H),4.86(d,1H),3.82(m,1H),3.35(m,1H),1.45(m,5H),1.15(m,5H)。
1b)終產物之製備
將1130mg(8.20mmol)碳酸鉀添加至存於35ml甲醇中之863mg(1.64mmol)(RS)-S-環丙基-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-羥基-1-甲基丙基]氧基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺中並在室溫下攪拌1.5小時。用飽和氯化鈉溶液加以稀釋並用乙酸乙酯(3x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。獲得709mg(1.64mmol)粗產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.50(s,1H),8.59(s,1H),7.94(m,2H),7.84(m,2H),5.32(m,1H),4.91(d,1H),4.07(s,1H),3.86(m,1H),2.63(m,1H),1.30(d,3H),1.11(m,4H),0.91(m,3H)。
MS：431(ES+)。
藉由製備型HPLC將非對映異構體之混合物分離為純淨立體異構體：
管柱：Chiralpak IA 5μ 250x30mm
洗脫劑：己烷/乙醇8：2
流速：40.0mL/min
檢測器：UV 254nm
溫度：室溫
保留時間：10.8-13.4min；立體異構體1(=實例1-SI-1)13.6-18.5min；立體異構體2(=實例1-SI-2)
實例2 (RS)-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-羥基-1-甲基丙基]氧基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)-S-甲基亞碸醯亞胺
2a)中間體之製備 化合物2.1 (RS)-S-(4-硝基苯基)-S-甲基亞碸醯亞胺
將0.70g(10.76mmol)疊氮化鈉添加至存於20ml DCM中之1.56g(8.42mmol)1-(甲基亞磺醯基)-4-硝基苯中。在0℃下將2.3m1濃硫酸緩慢添加至混合物中，且隨後將其加熱至45℃。在16h後使混合物冷卻至室溫，且在添加水後用DCM萃取。用15%氫氧化鈉溶液將水相調節至pH 11且用DCM(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。獲得1.08g(5.39mmol；產率：63%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.43(m,2H),8.17(m,2H),4.62(s,1H),3.18(s,3H)。
化合物2.2 (RS)-S-甲基-S-(4-硝基苯基)-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺
在冰冷卻下將1.00ml(7.08mmol)三氟乙酸酐逐滴添加至1000mg(4.99mmol)(RS)-S-(4-硝基苯基)-S-甲基亞碸醯亞胺、55mg(0.45mmol)DMAP及0.76ml(5.49mmol)三乙胺存於32ml DCM中之溶液中。在冰浴上將混合物再攪拌2小時。用DCM稀釋並用不完全濃縮氯化鈉溶液洗滌。乾燥有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(己烷/乙酸乙酯60：40)來純化所獲得殘餘物。最後將所獲得產物與二異丙醚一起攪拌。抽吸過濾出固體並乾燥。獲得1444mg(4.87mmol；產率：98%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.50(m,2H),8.24(m,2H),3.87(s,3H)。
化合物2.3 (RS)-S-(4-胺基苯基)-S-甲基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺
將292mg炭載鈀(10%/50%濕度)添加至1.34g(4.52mmol)(RS)-S-甲基-S-(4-硝基苯基)-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺存於45ml乙醇及8ml THF中之溶液中且在常壓及24℃下將其氫化45分鐘。過濾混合物並蒸發濃縮。將所獲得殘餘物與二異丙醚一起攪拌。抽吸過濾出固體並乾燥。獲得1.07g(4.03mmol；產率：89%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=7.54(m,2H),6.67(m,2H),6.35(s,2H),3.55(s,3H)。
化合物2.4 (RS)-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-(苯甲氧基)-1-甲基丙基]氧基}-5-(三氟 甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)-S-甲基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺
將0.97ml氯化氫存於二噁烷中之4N溶液添加至存於19.0ml乙腈中之1.40g(3.88mmol)4-((1R,2R)-2-苯甲氧基-1-甲基-丙氧基)-2-氯-5-三氟甲基-嘧啶及1.20g(4.51mmol)(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-甲基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺中，且隨後在80℃下將其攪拌6小時。在冷卻後，用乙酸乙酯稀釋混合物並用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化鈉溶液洗滌，乾燥(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(己烷/乙酸乙酯1：1)來純化所獲得殘餘物。獲得1.76g(2.98mmol，產率：77%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.66(s,1H),8.60(s,1H),8.02(m,2H),7.93(m,2H),7.21(m,5H),5.46(m,1H),4.57(d,1H),4.46(d,1H),3.72(m,1H),3.68(s,3H),1.31(d,3H),1.16(d,3H)。
化合物2.5 (RS)-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-羥基-1-甲基丙基]氧基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)-S-甲基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺
將0.18g炭載鈀(10%)添加至1.75g(2.96mmol)(RS)-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-(苯甲氧基)-1-甲基丙基]氧基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)-S-甲基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺存於35ml乙醇中之溶液中，且在常壓及室溫下將其氫化。過濾混合物並蒸發濃縮。獲得1.40g粗產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.65(s,1H),8.58(s,1H),8.04(m,2H),7.93(m,2H),5.28(m,1H),4.86(d,1H),3.83(m,1H),3.70(s,3H),1.26(d,3H),1.07(d,3H)。
2b)終產物之製備
將1.92g(13.89mmol)碳酸鉀添加至存於60ml甲醇中之1.39g(2.78mmol)(RS)-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-羥基-1-甲基丙基]氧基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)-S-甲基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺中且在室溫下將其攪拌1.5小時。用飽和氯化鈉溶液稀釋且用乙酸乙酯(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(DCM/EtOH 9：1)來純化殘餘物。獲得862mg(2.13mmol；產率：77%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.47(s,1H),8.55(s,1H),7.90(m,2H),7.83(m,2H),5.27(m,1H),4.86(d,1H),4.04(s,1H),3.82(m, 1H),3.00(s,3H),1.26(d,3H),1.07(d,3H)。
藉由製備型HPLC將非對映異構體之混合物分離為純淨立體異構體：
管柱：Chiralpak IC 5μ 250x20mm
洗脫劑：己烷/乙醇8：2
緩衝液：己烷/0.1% DEA
流速：25.0mL/min
檢測器：UV 280nm
溫度：室溫
保留時間：9.5-12.1min；立體異構體1(=實例2-SI-1)13.1-16.0min；立體異構體2(=實例2-SI-2)
實例3 (RS)-S-(4-{[4-{[(R)-2-羥基-1,2-二甲基丙基]氧基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)-S-甲基亞碸醯亞胺
3a)中間體之製備 化合物3.1. (R)-2-甲基-丁烷-2,3-二醇
將10.0g(96.1mmol)(R)-(+)-乳酸甲酯存於20ml THF中之溶 液緩慢逐滴添加至160ml(480.0mmol)甲基氯化鎂存於THF中之冰冷3N溶液中。首先將混合物緩慢加熱至室溫且隨後使其回流30分鐘。在冷卻後，將混合物添加至飽和氯化銨溶液中並用乙酸乙酯(3x)萃取。在Whatman濾器上過濾經合併有機相並蒸發濃縮。獲得4.5g(43.1mmol)粗產物，且不經進一步純化即使用該粗產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=4.21(d,1H),3.93(s,1H),3.29(m,1H),0.97(m,9H)。
化合物3.2. (R)-3-(2-氯-5-碘-嘧啶-4-基氧基)-2-甲基-丁-2-醇
在攪拌及0℃下將1.84g(42.3mmol)氫化鈉(55%)逐份添加至4.40g(42.3mmol)(R)-2-甲基-丁烷-2,3-二醇存於83ml二乙醚中之溶液中且將其攪拌10分鐘。在室溫下將其再攪拌3分鐘且隨後將混合物添加至9.68g(35.2mmol)2,4-二氯-5-碘-嘧啶存於97ml乙腈中之冰冷溶液中。在40℃下將混合物攪拌4小時，且在冷卻後添加冰及飽和NaCl溶液。隨後用乙酸乙酯(3x)實施萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(己烷/乙酸乙酯4：1)來純化所獲得殘餘物。獲得4.96g(14.5mmol；產率：41%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.73(s,1H),4.96(q,1H),4.62(s,1H),1.21(d,3H),1.13(s,6H)。
ES：343(CI+)。
化合物3.3. 2-氯-4-[(R)-1,2-二甲基-2-(四氫-吡喃-2-基氧基)-丙氧基]-5-碘-嘧啶
將2.64ml(29.0mmol)二氫吡喃及0.36g(1.5mmol)甲苯磺酸吡啶鎓添加至4.96g(14.5mmol)(R)-3-(2-氯-5-碘-嘧啶-4-基氧基)-2-甲基-丁-2-醇存於30ml DCM中之溶液中並在室溫下攪拌22小時。用DCM稀釋混合物並用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。乾燥有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(己烷/乙酸乙酯4：1)來純化所獲得殘餘物。獲得5.50g(12.9mmol；產率：89%)非對映異構體之混合物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.75(s,1H),8.74(s,1H),5.15(m,2H),4.91(m,2H),3.70(m,2H),3.30(m,2H),1.31(m,30H)。
化合物3.4. 2-氯-4-[(R)-1,2-二甲基-2-(四氫-吡喃-2-基氧基)-丙氧基]-5-三氟甲基-嘧啶
在室溫下將1.61g(8.44mmol)碘化銅(I)、0.41g(7.03mmol)氟化鉀及1.04ml(7.03mmol)(三氟甲基)-三甲基矽烷添加至1.00g(2.34mmol)2-氯-4-[(R)-1,2-二甲基-2-(四氫-吡喃-2-基氧基)-丙 氧基]-5-碘-嘧啶存於3.3ml NMP及3.3ml THF中之溶液中。在90℃下將混合物攪拌2小時。在冷卻後，將混合物添加至稀氯化鈉溶液中並用乙酸乙酯(3x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(己烷/乙酸乙酯4：1)來純化所獲得殘餘物。獲得0.53g(1.43mmol；產率：61%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.84(s,1H),5.32(m,1H),4.85(m,1H),3.68(m,1H),3.30(m,1H),1.31(m,15H)。
3b)終產物之製備
在70℃下將存於5ml乙醇中之200mg(0.54mmol)2-氯-4-[(R)-1,2-二甲基-2-(四氫-吡喃-2-基氧基)-丙氧基]-5-三氟甲基-嘧啶及87mg(0.33mmol)(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-甲基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺攪拌6小時。在旋轉蒸發器中將混合物蒸發至乾燥且將殘餘物吸收於11.6ml中。將373mg(2.70mmol)碳酸鉀添加至溶液中且在室溫下將其攪拌1.5小時。用飽和氯化鈉溶液稀釋且用乙酸乙酯(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由製備型HPLC來純化殘餘物。獲得31mg(0.07mmol；產率：14%)產物。
管柱：XBridge C18 5μ 100x30mm
洗脫劑A：H2 O/0.1% HCOOH
洗脫劑B：乙腈
流速：50.0mL/min
檢測：DAD掃描範圍210-400nm； MS ESI+，ESI-，掃描範圍160-1000m/z
溫度：RT
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.48(s,1H),8.56(s,1H),7.90(m,2H),7.83(m,2H),5.13(q,1H),4.67(s,1H),4.06(s,1H),3.01(s,3H),1.28(d,3H),1.12(m,6H)。
通式(Ib)化合物(4-N衍生物)之製備
本發明化合物可藉由特徵在於以下步驟之方法來製備：a)將式(IVd)化合物氧化為式(IVc)亞碸； b1 )將式(IVc)亞碸直接亞胺化為式(IVa)受保護亞碸亞胺； 或b2 )將式(IVc)亞碸進行亞胺化，成為式(IVb)未受保護亞碸亞胺且隨後將保護基團引入式(IVa)化合物； c)將式(IVa)化合物還原為式(IV)化合物； d)藉由與式(VIa)之胺反應來使2,4-二氯-5-三氟甲基-嘧啶(VIIb)之4-位官能化，形成式(Vb)中間體； e)將式(Vb)化合物與式(IV)化合物偶合成式(IIb)中間體； f)裂解亞碸亞胺上之保護基團，形成(Ib)；
其中取代基R1 、R2 、R3 及R4 具有通式(I)中所述之含義。
步驟a)-c)
該等步驟與製備通式(Ia)化合物之步驟a)-d)相同。
步驟d)
使2,4-二氯-5-三氟甲基-嘧啶(VIIb)與式(VIa)之胺反應來提供產物(Vb)與(Vc)之混合物。可藉由(例如)層析來分離期望產物(Vb)(例如參見(a)J.Bryant等人，WO 2004/048343)。
步驟e)
可使式(Vb)2-氯-嘧啶與式(IV)苯胺反應生成式(IIb)中間體(例如參見(a)J.Bryant等人，WO 2004/048343)。
步驟f)
裂解亞碸亞胺(IIb)上之三氟乙醯基來提供式(Ib)化合物。所述在室溫下使用存於甲醇中之碳酸鉀之技術尤其適用於此。
實例4 (RS)-S-環丙基-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-羥基-1-甲基丙基]胺基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)亞碸醯亞胺
4a)中間體之製備 化合物4.1 (2R,3R)-3-(2-氯-5-三氟甲基-嘧啶-4-基胺基)-丁-2-醇
在0℃下將72.2ml(520.71mmol)三乙胺逐滴添加至存於1035ml乙腈中之56.5g(260.35mmol)2,4-二氯-5-三氟甲基-嘧啶及32.7g(260.35mmol)(2R,3R)-3-胺基-丁-2-醇鹽酸鹽中。將化合物過夜緩慢加熱至室溫。將混合物添加至不完全濃縮氯化鈉溶液中並用乙酸乙酯(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(己烷/乙酸乙酯0-100%)來純化剩餘殘餘物。獲得18.6g(68.97mmol；產率：27%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.38(s,1H),6.71(d,1H),5.00(d,1H),4.08(m,1H),3.71(m,1H),1.12(d,3H),1.01(d,3H)。
(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-環丙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺之製備如關於化合物1.4中所述。
4b)終產物之製備
將0.21ml氯化氫存於二噁烷中之4N溶液添加至存於3.75ml乙腈中之250mg(0.86mmol)(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-環丙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺及231mg(0.86mmol)(2R,3R)-3-(2-氯-5-三氟甲基-嘧啶-4-基胺基)-丁-2-醇中，且隨後在60℃下將其攪拌3.5小時。將混合物蒸發至乾燥。添加18.4ml甲醇及590mg(4.28mmol)碳酸鉀且在室溫下將其攪拌1小時。用飽和氯化鈉溶液稀釋且用乙酸乙酯(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由層析(DCM/MeOH 4：1)來純化剩餘殘餘物。獲得242mg(0.56mmol；產率：65%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.04(s,1H),8.25(s,1H),7.91(m, 2H),7.74(m,2H),6.05(d,1H),5.07(d,1H),4.14(m,1H),3.97(s,1H),3.77(m,1H),2.56(m,1H),1.19(d,3H),1.05(m,4H),0.86(m,3H)。
MS：430(ESI+)。
藉由製備型HPLC將非對映異構體之混合物分離為純淨立體異構體：
管柱：Chiralpak IA 5μ 250x20mm
洗脫劑：己烷/2-丙醇50：50
緩衝液：己烷/0.1% DEA
流速：15.0mL/min
檢測器：UV 254nm
溫度：室溫
保留時間：5.9-6.6min；立體異構體1(=實例4-SI-1)7.1-8.8min；立體異構體2(=實例4-SI-2)
實例5 (RS)-S-環丙基-S-(4-{[4-{[(R)-2-羥基-1,2-二甲基丙基]胺基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)亞碸醯亞胺
5a)中間體之製備 化合物5.1 (R)-3-(2-氯-5-三氟甲基-嘧啶-4-基胺基)-2-甲基-丁-2-醇
將3.6g(35.03mmol)(R)-3-胺基-2-甲基-丁-2-醇逐滴添加至7.6g(35.03mmol)2,4-二氯-5-三氟甲基-嘧啶存於139ml乙腈中之溶液中。現於0℃下逐滴添加9.7ml(70.1mmol)三乙胺且將混合物過夜緩慢加熱至室溫。在室溫下將其再攪拌2天。將混合物添加至不完全濃縮氯化鈉溶液中並用乙酸乙酯(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。藉由製備型HPLC來純化剩餘殘餘物。獲得3.0g(10.65mmol；產率：30%)產物。
管柱：XBridge C18 5μ 150x20mm
洗脫劑A：H2 O/0.2% NH3
洗脫劑B：乙腈
梯度：70%A+30%B(2')30->60%B(10')60->99%B(0.1')
流速：50.0mL/min
檢測器：DAD(200-400nm)TAC；MS-ESI+(160-1000m/z)TIC
溫度：室溫
保留時間：5.6-6.4min
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.42(s,1H),6.52(d,1H),5.01(s,1H),4.10(m,1H),1.11(m,9H)。
(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-環丙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺之製備如關於化合物1.4中所述。
5b)終產物之製備
將0.34ml氯化氫存於二噁烷中之4N溶液添加至存於6.0ml乙 腈中之400mg(1.37mmol)(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-環丙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺及388mg(1.37mmol)(R)-3-(2-氯-5-三氟甲基-嘧啶-4-基胺基)-2-甲基-丁-2-醇中，且在60℃下將其攪拌3.5小時。將混合物蒸發至乾燥。添加29.4ml甲醇及950mg(6.84mmol)碳酸鉀且在室溫下將其攪拌1小時。用飽和氯化鈉溶液稀釋且用乙酸乙酯(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。獲得600mg(1.35mmol)粗產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.08(s,1H),8.30(s,1H),7.94(m,2H),7.80(m,2H),6.07(d,1H),4.95(s,1H),4.16(m,1H),4.02(s,1H),2.62(m,1H),1.20(m,6H),1.10(m,4H),0.89(m,3H)。
MS：444(ESI+)。
藉由製備型HPLC將非對映異構體之混合物分離為純淨立體異構體：
管柱：Chiralpak AD-H 5μ 250x20mm
洗脫劑：己烷/2-丙醇60：40
緩衝液：己烷/0.1% DEA
流速：20.0mL/min
檢測器：UV 280nm
溫度：室溫
保留時間：5.1-6.3min；立體異構體1(=實例5-SI-1)8.0-10.8min；立體異構體2(=實例5-SI-2)
實例6 (RS)-S-乙基-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-羥基-1-甲基丙基]胺基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)亞碸醯亞胺
6a)中間體之製備 化合物6.1 1-乙基硫烷基-4-硝基苯
在用水冷卻的同時將16.56g(106.72mmol)4-硝基苯硫醇添加至4.27g(106.76mmol)氫氧化鈉存於320ml乙醇中之溶液中且在室溫下將其攪拌15分鐘。然後在用水冷卻的同時添加8.63ml(106.79mmol)乙基碘且在室溫下將混合物攪拌過夜。將混合物添加至飽和氯化鈉溶液中並用乙酸乙酯(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。然後使其溶解於DCM中並再次過濾且蒸發至乾燥。獲得16.86g(92.02mmol)粗產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.14(m,2H),7.49(m,2H),3.14(q,2H),1.31(tr,3H)。
化合物6.2 (RS)-1-乙基亞磺醯基-4-硝基苯
將428mg(2.64mmol)氯化鐵(III)添加至16.86g(92.02mmol) 1-乙基硫烷基-4-硝基苯存於75ml乙腈中之混合物中且在室溫下將其攪拌10分鐘。然後逐份添加22.44g(98.44mmol)高碘酸，從而使得溫度不超過30℃。將混合物攪拌50分鐘且隨後在攪拌下將其添加至170ml DCM、500ml冰水與100g硫代硫酸鈉五水合物之混合物中。用DCM(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。用乙酸乙酯/己烷使所獲得殘餘物重結晶。獲得12.49g(62.69mmol；產率：68%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.35(m,2H),7.88(m,2H),3.12(m,1H),2.84(m,1H),0.99(tr,3H)。
化合物6.3 (RS)-S-乙基-S-(4-硝基苯基)亞碸醯亞胺
在冰浴上將30.5ml發煙硫酸(20% SO3 )小心地添加至6.00g(30.12mmol)(RS)-1-乙基亞磺醯基-4-硝基苯中。然後在氬及攪拌下小心地逐份添加2.35g(36.14mmol)疊氮化鈉，且將混合物加熱至45℃。在6小時後使混合物冷卻至室溫且將其小心地傾至冰上。用碳酸氫鈉使混合物鹼化且用乙酸乙酯(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。獲得5.74g(26.79mmol；產率：89%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.37(m,2H),8.09(m,2H),4.56(s,1H),3.18(q,2H),1.04(tr,3H)。
化合物6.4 (RS)-S-乙基-S-(4-硝基苯基)-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺
在冰冷卻下將4.53ml(32.04mmol)三氟乙酸酐逐滴添加至5.72g(26.70mmol)(RS)-S-乙基-S-(4-硝基苯基)亞碸醯亞胺及4.07ml(29.37mmol)三乙胺存於175ml DCM中之溶液中。在冰浴上將混合物再攪拌3小時，其中使溫度升高至約10℃。用DCM稀釋且用不完全濃縮氯化鈉溶液洗滌。乾燥有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。獲得8.17g(26.33mmol)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=8.52(m,2H),8.22(m,2H),3.99(m,2H),1.16(tr,3H)。
化合物6.5 (RS)-S-(4-胺基苯基)-S-乙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺
在冰冷卻下將88.5ml氯化鈦(III)存於約10%鹽酸中之15%溶液緩慢添加至4.05g(13.05mmol)(RS)-S-乙基-S-(4-硝基苯基)-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺存於191ml THF中之溶液中。在室溫下將混合物攪拌3.5小時，用乙酸乙酯稀釋且隨後用不完全濃縮氯化鈉溶液(3x)洗滌。乾燥有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。獲得3.17g(11.31mmol)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=7.48(m,2H),6.68(m,2H),3.64(m,2H),1.06(tr,3H)。
(2R,3R)-3-(2-氯-5-三氟甲基-嘧啶-4-基胺基)-丁-2-醇之製備如關於化合物4.1中所述。
6b)終產物之製備
將0.36ml氯化氫存於二噁烷中之4N溶液添加至存於7.0ml乙腈中之400mg(1.43mmol)(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-乙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺及385mg(1.43mmol)(2R,3R)-3-(2-氯-5-三氟甲基-嘧啶-4-基胺基)-丁-2-醇中且在60℃下將其攪拌4.5小時。將混合物蒸發至乾燥。添加19.0ml甲醇及608mg(4.40mmol)碳酸鉀，且在室溫下將其攪拌1小時。用飽和氯化鈉溶液稀釋且用乙酸乙酯(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。獲得590mg(1.41mmol)粗產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.10(s,1H),8.30(s,1H),7.96(m,2H),7.78(m,2H),6.10(d,1H),5.11(d,1H),4.19(m,1H),4.00(s,1H),3.82(m,1H),3.07(q,2H),1.24(d,3H),1.06(m,6H)。
MS：418(ESI+)。
藉由製備型HPLC將非對映異構體之混合物分離為純淨立體異構體：
管柱：Chiralpak AD-H 5μ 250x20mm
洗脫劑：己烷/2-丙醇60：40
緩衝液：己烷/0.1% DEA
流速：20.0mL/min
檢測器：UV 280nm
溫度：室溫
保留時間：6.2-6.8min；立體異構體1(=實例6-SI-1)7.2-8.9min；立體異構體2(=實例6-SI-2)
實例7 (RS)-S-乙基-S-(4-{[4-{[(R)-2-羥基-1,2-二甲基丙基]胺基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)亞碸醯亞胺
7a)中間體之製備
(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-乙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺之製備如關於化合物6.5中所述。
(R)-3-(2-氯-5-三氟甲基-嘧啶-4-基胺基)-2-甲基-丁-2-醇之製備如關於化合物5.1中所述。
7b)終產物之製備
將0.36ml氯化氫存於二噁烷中之4N溶液添加至存於7.0ml乙腈中之400mg(1.43mmol)(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-乙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺及405mg(1.43mmol)(R)-3-(2-氯-5-三氟甲基-嘧啶-4-基胺基)-2-甲基-丁-2-醇中且在60℃下將其攪拌4.5小時。將混合物蒸發至乾燥。添加25.0ml甲醇及788mg(5.70mmol)碳酸鉀且在室溫下將其攪拌1小時。用飽和氯化鈉溶液稀釋且用乙酸乙酯(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。獲得620mg(1.43mmol)粗產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.06(s,1H),8.28(s,1H),7.92(m,2H),7.74(m,2H),6.03(d,1H),4.90(s,1H),4.12(m,1H),3.96(s,1H),3.03(q,2H),1.16(m,6H),1.08(m,3H),1.02(tr,3H)。
MS：432(ESI+)。
藉由製備型HPLC將非對映異構體之混合物分離為純淨立體異構體：
管柱：Chiralpak AD-H 5μ 250x20mm
洗脫劑：A：己烷 B：2-丙醇
緩衝液：己烷/0.1% DEA
梯度：20->40%B(20')+40%B(5')
流速：10.0mL/min
檢測器：UV 280nm
溫度：室溫
保留時間：17.5-19.8min；立體異構體1(=實例7-SI-1)20.1-22.0min；立體異構體2(=實例7-SI-2)
實例8 (RS)-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-羥基-1-甲基丙基]胺基}-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)-S-甲基亞碸醯亞胺
8a)中間體之製備
(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-甲基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺之製備如關於化合物2.3中所述。
(2R,3R)-3-(2-氯-5-三氟甲基-嘧啶-4-基胺基)-丁-2-醇之製備如關於化合物4.1中所述。
8b)終產物之製備
將0.38ml氯化氫存於二噁烷中之4N溶液添加至存於7.3ml乙腈中之399mg(1.50mmol)(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-甲基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺及404mg(1.50mmol)(2R,3R)-3-(2-氯-5-三氟甲基-嘧啶-4-基胺基)-丁-2-醇中且在60℃下將其攪拌9小時。將混合物蒸發至乾燥。添加32.2ml甲醇及1040mg(7.50mmol)碳酸鉀且在室溫下將其攪拌1.5小時。用飽和氯化鈉溶液加以稀釋並用乙酸乙酯(3x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。獲得565mg(1.40mmol)粗產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：10.09(s,1H),8.30(s,1H),7.96(m,2H),7.83(m,2H),6.10(d,1H),5.11(d,1H),4.18(m,1H),4.03(s,1H),3.82(m,1H),3.03(s,3H),1.25(d,3H),1.10(d,3H)。
藉由製備型HPLC將非對映異構體之混合物分離為純淨立體異構體：
管柱：Chiralpak IC 5μ 250x20mm
洗脫劑：己烷/乙醇50：50
緩衝液：己烷/0.1% DEA
流速：20.0mL/min
檢測器：UV 254nm
溫度：室溫
保留時間：5.1-5.8min；立體異構體1(=實例8-SI-1)6.1-6.7min；立體異構體2(=實例8-SI-2)
實例9
9a)中間體之製備
(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-甲基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺之製備如關於化合物2.3中所述。
(R)-3-(2-氯-5-三氟甲基-嘧啶-4-基胺基)-2-甲基-丁-2-醇之製備如關於化合物5.1中所述。
9b)終產物之製備
將0.38ml氯化氫存於二噁烷中之4N溶液添加至存於7.3ml乙腈中之399mg(1.50mmol)(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-甲基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺及425mg(1.50mmol)(R)-3-(2-氯-5-三氟甲基-嘧啶-4-基胺基)-2-甲基-丁-2-醇中且在60℃下將其攪拌4小時。將混合物蒸發至乾燥。添加32.2ml甲醇及1040mg(7.50mmol)碳酸鉀且在室溫下將其攪拌1.5小時。用飽和氯化鈉溶液稀釋且用乙酸乙酯(2x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。獲得600mg(1.44mmol)粗產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.05(s,1H),8.26(s,1H),7.91(m,2H),7.79(m,2H),6.03(d,1H),4.91(s,1H),4.11(m,1H),3.99(s,1H),2.99(s,3H),1.16(m,6H),1.10(m,3H)。
MS：418(ESI+)。
藉由製備型HPLC將非對映異構體之混合物分離為純淨立體異構體：
管柱：Chiralpak IC 5μ 250x20mm
洗脫劑：己烷/乙醇80：20
流速：30.0mL/min
檢測器：UV 254nm
溫度：室溫
保留時間：6.0-6.7min；立體異構體1(=實例9-SI-1)7.1-8.9min；立體異構體2(=實例9-SI-2)
比較物質之製備
比較本發明化合物(特徵尤其在於嘧啶5位上之5-CF3 取代基)與其5-Br類似物(明確揭示於WO 2005/037800中或由該專利之一般揭示內容所涵蓋)之體外及體內效能。
V11=實例11中之5-Br比較物質
實例11中之比較物質係非對映異構體混合物(RS)-S-[4-({5-溴-4-[(R)-(2-羥基-1,2-二甲基丙基)胺基]嘧啶-2-基}胺基)苯基]-S-環丙基-亞碸醯亞胺之活性更強之立體異構體，其作為實例1.6揭示於申請案WO 2005/037800(第35頁)中。
對於體內比較，在實例11中使用非對映異構體(R)-S-[4-({5-溴-4-[(R)-(2-羥基-1,2-二甲基丙基)胺基]嘧啶-2-基}胺基)苯基]-S-環丙基-亞碸醯亞胺，其體外效能高於(S)-S-[4-({5-溴-4-[(R)-(2-羥基-1,2-二甲基丙基)胺基]嘧啶-2-基}胺基)苯基]-S-環丙基-亞碸醯亞胺。
出於此目的，藉由以下方法來製備V11：
V11a)中間體之製備
將0.07ml氯化氫存於二噁烷中之4N溶液添加至存於16.50ml丁醇及1.65ml甲醇中之988mg(3.35mmol)(R)-3-(5-溴-2-氯-嘧啶-4-基胺基)-2-甲基-丁-2-醇及750mg(2.79mmol)(R)-S-(4-胺基苯基)-N-(乙氧基羰基)-S-環丙基亞碸醯亞胺(根據以下來製備：U.Lücking等人，WO 2007/071455，第112頁，實例4)中，且在60℃下將其攪拌3天。在冷卻後，將混合物蒸發至乾燥且藉由層析來純化(DCM/EtOH 9：1)。獲得319mg(0.61mmol，產率：22%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=9.96(s,1H),8.13(s,1H),7.92(m,2H),7.73(m,2H),6.28(d,1H),4.05(m,1H),3.84(m,2H),2.96(m,1H),1.05(m,16H)。
V11b)終產物之製備
將2.0ml新製備之1.5M乙醇鈉溶液添加至存於4.3ml乙醇中之319mg(0.61mmol)中間體中且在60℃下將其攪拌18小時。在冷卻後，將混合物添加至飽和氯化鈉溶液中並用乙酸乙酯(3x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。在最終重結晶(DCM/乙酸乙酯)後，獲得215mg(0.47mmol；產率：78%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=9.68(s,1H),8.08(s,1H),7.86(m,2H),7.70(m,2H),6.07(d,1H),4.82(s,1H),4.05(m,1H),3.93(s,1H),2.55(m,1H),1.15(m,6H),1.10(m,3H),1.03(m,1H),0.83(m,3H)。
管柱：Chiralpak AD-H 5μ 150x4.6mm
洗脫劑：己烷/乙醇80.20
流速：1.0mL/min
檢測：PDA 280nm
溫度：25℃
保留時間：11.64min
V12=實例12中之5-Br比較物質
實例12中之比較物質係根據WO 2005/037800中之實例1.52來製備。實例1.52之體外效能大於實例1.53。
V13=實例13中之5-Br比較物質
比較物質實例13係根據WO 2005/037800中之實例3.13來製 備。實例3.13之體外效能大於實例3.12。
V14=實例14中之5-Br比較物質
V14a)中間體之製備
將1.5ml氯化氫存於二噁烷中之4N溶液添加至存於13.1ml乙腈中之845mg(3.00mmol)(2R,3R)-3-(5-溴-2-氯-嘧啶-4-基氧基)-丁-2-醇(根據以下來製備：WO 2005/037800，第93頁)及877mg(3.00mmol)(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-環丙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺中，且在80℃下將其攪拌5小時。將另外422mg(1.50mmol)(2R,3R)-3-(5-溴-2-氯-嘧啶-4-基氧基)-丁-2-醇添加至混合物中且在80℃下再對其實施攪拌。在3小時後，再次添加0.75ml氯化氫存於二噁烷中之4N溶液且在80℃下再次實施攪拌。在33小時後，再次添加175mg(0.60mmol)(RS)-S-(4-胺基苯基)-S-環丙基-N-(三氟乙醯基)亞碸醯亞胺且在80℃下最後將其攪拌18小時。
在冷卻後，蒸發濃縮混合物且藉由層析來純化剩餘殘餘物(DCM/EtOH 9：1)。獲得740mg(1.38mmol，產率：46%)產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.31(s,1H),8.44(s,1H),8.01(m, 2H),7.84(m,2H),5.19(m,1H),4.88(d,1H),3.81(m,1H),3.31(m,1H),1.40(m,1H),1.29(m,4H),1.08(m,5H)。
V14b)終產物之製備
將950mg(6.84mmol)碳酸鉀添加至存於29ml甲醇中之735mg(1.37mmol)中間體中且在室溫下將其攪拌1.5小時。用飽和氯化鈉溶液稀釋並用乙酸乙酯(3x)萃取。乾燥經合併有機相(Na2 SO4 )，過濾並蒸發濃縮。獲得607mg(1.37mmol)粗產物。
1 H-NMR(400MHz,DMSO)：δ=10.08(s,1H),8.40(s,1H),7.86(m,2H),7.75(m,2H),5.19(m,1H),4.87(d,1H),3.97(s,1H),3.82(m,1H),2.56(m,1H),1.25(d,3H),1.09(d,3H),1.05(m,1H),0.86(m,3H)。
藉由製備型HPLC將非對映異構體之混合物分離為純淨立體異構體：
管柱：Chiralpak IC 5μ 250x20mm
洗脫劑：己烷/乙醇7：3
流速：20.0mL/min
檢測器：UV 280nm
溫度：室溫
保留時間：9.6-11.2min；立體異構體1 11.3-14.9min；立體異構體2
立體異構體2顯示體外效能大於立體異構體1且因此用作比較物質實例14。
實例10 10.1分析1：CDK1/CycB激酶分析
自感染桿狀病毒之昆蟲細胞(Sf9)純化之重組CDK1及CycB- GST融合蛋白係購自ProQinase GmbH,Freiburg。用作激酶受質之組蛋白IIIS係自Sigma公司購得。
在22℃及存於分析緩衝液[50mM Tris/HCl pH 8.0，10mM MgCl2 ，0.1mM正釩酸Na，1.0mM二硫蘇糖醇，0.5μM三磷酸腺苷(ATP)，10μg/量測點組蛋白IIIS，0.2μCi/量測點33 P-γATP，0.05% NP40，1.25%二甲基亞碸]中之各種濃度之測試物質(0μM、及在0.01-100μM範圍內)存在下將CDK1/CycB(200ng/量測點)培養10min。藉由添加EDTA溶液(250mM,pH 8.0,15μl/量測點)來終止反應。
將15μl各反應混合物施加至P30過濾片(來自Wallac)中，且藉由在0.5%磷酸中將過濾片洗滌三次(每次10min)來移除未納入33 P-ATP。在70℃下將過濾片乾燥1小時後，用閃爍劑片(MeltiLexTM A，來自Wallac)覆蓋過濾片且在90℃烘箱中烘乾1小時。藉由在γ輻射量測儀器(Wallac)中實施閃爍量測來測定經納入33 P(受質磷酸化)之量。將所量測數據標準化為0%抑制(無抑制劑情況下之酶反應)及100%抑制(除酶以外之所有分析組份)。藉助4參數擬合使用該公司之自有軟體來測定IC50 值。
10.2分析2：CDK2/CycE激酶分析
自桿狀病毒感染之昆蟲細胞(Sf9)純化之重組CDK2及CycE-GST融合蛋白係購自ProQinase GmbH,Freiburg。用作激酶受質之組蛋白IIIS係購自Sigma公司。
在22℃及存於分析緩衝液[50mM Tris/HCl pH 8.0，10mM MgCl2 ，0.1mM正釩酸Na，1.0mM二硫蘇糖醇，0.5μM三磷酸腺苷(ATP)，10μg/量測點組蛋白IIIS，0.2μCi/量測點33 P-γATP，0.05% NP40，1.25%二甲基亞碸]中之各種濃度之測試物質(0 μM、及在0.01-100μM範圍內)存在下，將CDK2/CycE(50ng/量測點)培養10min。藉由添加EDTA溶液(250mM,pH 8.0,15μl/量測點)終止反應。
取15μl各反應混合物施加至P30過濾片(來自Wallac)中，且藉由在0.5%磷酸中將過濾片洗滌三次(每次10min)來移除未吸收之33 P-ATP。在70℃下將過濾片乾燥1小時後，用閃爍劑片(MeltiLexTM A，來自Wallac)覆蓋過濾片且在90℃烘箱中烘乾1小時。藉由γ輻射量測儀器(Wallac)閃爍測定所吸收之33 P(受質磷酸化)之量。將所量測數據標準化為0%抑制(無抑制劑情況下之酶反應)及100%抑制(除酶以外之所有分析組份)。藉助4參數擬合法，使用該公司之自有軟體來測定IC50 值。
10.3分析3：VEGF受體-2激酶分析
重組VEGF受體酪胺酸激酶-2係自感染桿狀病毒之昆蟲細胞(Sf9)中純化之GST融合蛋白。用作激酶受質之聚(Glu4Tyr)係購自Sigma公司。
在22℃及存於30μl分析緩衝液[40mM Tris/HCl pH 5.5，10mM MgCl2 ，1mM MnCl2 ，3μM正釩酸Na，1.0mM二硫蘇糖醇，8μM三磷酸腺苷(ATP)，0.96μg/量測點聚(Glu4Tyr)，0.2μCi/量測點33 P-γATP，1.4%二甲基亞碸]中之各種濃度之測試物質(0μM、及在0.001-30μM範圍內)存在下，將VEGF受體酪胺酸激酶(90ng/量測點)培養10min。藉由添加EDTA溶液(250mM,pH 8.0,15μl/量測點)終止反應。
將15μl各反應混合物施加至P30過濾片(來自Wallac)中，且藉由在0.5%磷酸中將過濾片洗滌三次(每次10min)來移除未納入33 P-ATP。在70℃下將過濾片乾燥1小時後，用閃爍劑片 (MeltiLexTM A，來自Wallac)覆蓋過濾片且在90℃烘箱中烘乾1小時。藉由在γ輻射量測儀器(Wallac)中實施閃爍量測來測定經納入33 P(受質磷酸化)之量。將所量測數據標準化為0%抑制(無抑制劑情況下之酶反應)及100%抑制(除酶以外之所有分析組份)。藉助4參數擬合使用該公司之自有軟體來測定IC50 值。
10.4分析4：增殖分析
將經培養人類HeLa-MaTu宮頸癌細胞(得自EPO-GmbH,Berlin)以3000細胞/量測點之密度平鋪於96孔多孔滴定板之200μl生長培養基(DMEM/HAMS F12，2mM L-麩胺醯胺，10%胎牛血清)中。在24小時後，用結晶紫對一個板(零點板)之細胞進行染色(見下文)，而用新鮮培養基(200μl)替代其他板之培養基，該新鮮培養基中已添加有各種濃度之測試物質(0μM，及在0.01-30μM範圍內；溶劑二甲基亞碸之最終濃度為0.5%)。在測試物質存在下將細胞培養4天。藉由用結晶紫對細胞實施染色來測定細胞增殖：藉由在室溫下經15min添加20μl/量測點之11%戊二醛溶液來固定細胞。在用水將已固定細胞洗滌三次後，在室溫下乾燥各板。藉由添加100μl/量測點之0.1%結晶紫溶液(藉由添加乙酸將pH調節為pH 3)來對細胞實施染色。在用水將經染色細胞洗滌三次後，在室溫下乾燥各板。藉由添加100μl/量測點之10%乙酸溶液來溶解染料。在595nm波長下以光測方式來測定消光。藉由將所量測數值標準化為零點板之消光值(=0%)及未處理(0μM)細胞之消光(=100%)來計算細胞生長之變化百分比。將所量測數據標準化為0%抑制(無抑制劑情況下之細胞增殖)及100%抑制(零點板)。藉助4參數擬合使用該公司之自有軟體來測定IC50 值。
10.5酶及增殖分析之結果
酶及增殖分析之結果顯示本發明化合物相對於先前技術中之化合物並無任何系統優越性。
體內比較
在實例11中用比較用V11來研究實例5-SI-2之體內效能。
在實例12中用來自WO 2005/037800之比較用實例1.52(=比較 物質V12)來研究實例6-SI-2之體內效能。
在實例13中用來自WO 2005/037800之比較用實例3.13(=比較物質V13)來研究實例2-SI-2之體內效能。
在實例14中用比較用V14來研究實例1-SI-2之體內效能。
實例11
將在細胞培養中生長之HeLa-MaTu(EPO-GmbH,Berlin)人類宮頸癌細胞經皮下植入雌性NMRI裸鼠之側腹中。在腫瘤生長至約20mm2 尺寸後立即開始處理。在各組中有一組之腫瘤達到約150mm2 尺寸後立即終止研究。
使用以下測試組：
第1組：對照，用增溶劑(40% PEG400/60%水)處理
第2組：根據實例5製備之立體異構體2(=實例5-SI-2)
(5mg/kg，經口，在第4、5、11、12天每天2x)
該研究設計為測定人類宮頸癌異種移植模型對用實例5-SI-2處理之初始反應。在作為NMRI裸鼠上之異種移植之HeLa-MaTu宮頸腫瘤模型中測試各種化合物之生長抑制效應。實例5-SI-2在增溶劑40%聚乙二醇(PEG)400/60%水中以0.5mg/ml之終濃度完全溶解。在接種腫瘤後第4天開始對已建立腫瘤進行治療。在第1組(對照)動物中之腫瘤尺寸超過約150mm2 尺寸後之第17天終止研究。
研究結果(圖1)顯示，在週期性處理方案(在連續2天中每天處理2x，隨後5天無處理)中，所選經口劑量為5mg/kg之實例5-SI-2顯著抑制腫瘤生長(第3組，在研究結束時腫瘤重量降低至對照組之7%，p<0.05)。
5-Br比較物質(=V11)
將在細胞培養中生長之HeLa-MaTu(EPO-GmbH,Berlin)人類宮頸癌細胞經皮下植入雌性NMRI裸鼠之側腹中。在腫瘤生長至約20mm2 尺寸後立即開始處理。在各組中有一組之腫瘤達到約150mm2 尺寸後立即終止研究。
使用以下測試組：
第1組：對照，用增溶劑(30% HPβCD/70%水)處理
第2組：根據上文所揭示V11之製備來製備之WO 2005/037800化 合物(8mg/kg，經口，在第4、5、11、12天每天2x)
該研究設計為測定人類宮頸癌異種移植模型對用5-Br比較物質V11處理之初始反應。在作為NMRI裸鼠上之異種移植之HeLa-MaTu宮頸腫瘤模型中測試各種化合物之生長抑制效應。V11在增溶劑30% β-羥基丙基-環糊精(HPβCD)/70%水中以0.8mg/ml之終濃度完全溶解。在接種腫瘤後第4天開始對已建立腫瘤進行治療。在第1組(對照)動物中之腫瘤尺寸超過約150mm2 尺寸後之第17天終止研究。
研究結果(圖2)顯示，所選經口劑量為8mg/kg之V11(在連續2天中每天2x，隨後5天無處理)抑制HeLa-MaTu異種移植模型中之腫瘤生長(第2組，在研究結束時腫瘤重量降低至對照組之39%，p<0.05)。
結論
在由連續兩天每天兩次以5mg/kg之劑量經口投與及隨後5天無處理組成之週期性處理方案中，實例5之立體異構體2(實例5-SI-2(5-CF3 ))達成對HeLa-MaTu異種移植模型中腫瘤生長之完全抑制(處理/對照比T/C=0.07)。在以8mg/kg之劑量實施之相應良好耐受性週期性處理方案中，5-Br比較物質(=V11)僅可遲滯HeLa- MaTu異種移植模型中之腫瘤生長(處理/對照比T/C=0.39)。令人驚訝地，與V11(5-Br)相比，實例5-SI-2(5-CF3 )顯示較高效力(實例5-SI-2之5mg/kg劑量與V11之8mg/kg相比)及顯著較佳之抗腫瘤效能(實例5-SI-2以T/C=0.07完全抑制腫瘤生長，與之相比，V11以T/C=0.39減緩腫瘤生長)。
實例12
將在細胞培養中生長之HeLa-MaTu(EPO-GmbH,Berlin)人類宮頸癌細胞經皮下植入雌性NMRI裸鼠之側腹中。在腫瘤生長至約20mm2 尺寸後立即開始處理。在各組中有一組之腫瘤達到約150mm2 尺寸後立即終止研究。
使用以下測試組：
第1組：對照，用增溶劑(40% PEG 400/60%水)處理
第2組：根據實例6製備之立體異構體2(=實例6-SI-2)
(3mg/kg，經口，在第4、5、11、12、17、18天每天2x)
第3組：根據實例6製備之立體異構體2(=實例6-SI-2)
(4mg/kg，經口，在第4、5、11、12、17、18天每天2x)
第4組：根據實例6製備之立體異構體2(=實例6-SI-2)
(5mg/kg，經口，在第4、5、11、12、17、18天每天2x)
該研究設計為測定人類宮頸癌異種移植模型對用實例6-SI-2處理之初始反應。在作為NMRI裸鼠上之異種移植之HeLa-MaTu宮頸腫瘤模型中測試各種化合物之生長抑制效應。實例6-SI-2在增溶劑40%聚乙二醇400(PEG 400)/60%水中以0.3mg/ml(第2組)、0.4mg/ml(第3組)或0.5mg/ml(第4組)之終濃度完全溶解。在接種腫瘤後第4天開始對已建立腫瘤進行治療。在第1組(對照)動物中之腫瘤尺寸超過約150mm2 尺寸後之第20天終止研究。 研究結果(圖3)顯示，在由連續2天每天兩次經口投與及隨後5天無處理組成之處理方案中，實例6-SI-2提供對HeLa-MaTu異種移植模型中腫瘤生長之劑量依賴性抑制。在最高劑量組(第4組)中，幾乎完全抑制腫瘤生長且在研究結束時腫瘤重量降低至對照組之8%(T/C=0.08,p<0.05)。
5-Br比較物質(=V12)
將在細胞培養中生長之HeLa-MaTu(EPO-GmbH,Berlin)人類宮頸癌細胞經皮下植入雌性NMRI裸鼠之側腹中。在腫瘤生長至約20mm2 尺寸後立即開始處理。在各組中有一組之腫瘤達到約150mm2 尺寸後立即終止研究。
使用以下測試組：
第1組：對照，用增溶劑(40% PEG 400/60%水)處理
第2組：WO 2005/037800中實例1.52之化合物(=V12)
(7mg/kg，經口，在第4、5、11、12、17、18、23、24天每天2x)
第3組：WO 2005/037800中實例1.52之化合物(=V12)
(8.5mg/kg，經口，在第4、5、11、12、17、18、23、24天每天2x)
第4組：WO 2005/037800中實例1.52之化合物(=V12)
(10mg/kg，經口，在第4、5、11、12、17、18、23、24天每天2x)
該研究設計為測定人類宮頸癌異種移植模型對用5-Br比較物質V12處理之初始反應。在作為NMRI裸鼠上之異種移植之HeLa-MaTu宮頸腫瘤模型中測試各種化合物之生長抑制效應。V12在增溶劑40%聚乙二醇400(PEG 400)/60%水中以0.7mg/ml(第2組)、0.85mg/ml(第3組)或1.0mg/ml(第4組)之終濃度完全溶解。在接種 腫瘤後第4天開始對已建立腫瘤進行治療。在第1組(對照)動物中之腫瘤尺寸超過約150mm2 尺寸後之第28天終止研究。
研究結果(圖4)顯示，在由連續2天每天兩次經口投與及隨後5天無處理組成之處理方案中，V12對HeLa-MaTu異種移植模型中之腫瘤生長產生劑量依賴性弱抑制。在最高劑量組(第4組)中，相對於對照組腫瘤生長被抑制至一半左右(T/C=0.51)。
結論：
在由連續兩天每天兩次以5mg/kg之劑量經口投與及隨後5天無處理組成之週期性處理方案中，實例6之立體異構體2(實例6-SI-2(5-CF3 ))達成對HeLa-MaTu異種移植模型中腫瘤生長之幾乎完全抑制(處理/對照比T/C=0.08)。在以10mg/kg之劑量實施之相應良好耐受性週期性處理方案中，WO 2005/037800中實例1.52之化合物(=V12(5-Br))僅可遲滯HeLa-MaTu異種移植模型中之腫瘤生長(處理/對照比T/C=0.51)。令人驚訝地，與V12(5-Br)相比，實例6-SI-2(5-CF3 )顯示較高效力(實例6-SI-2之5mg/kg劑量與V12之10mg/kg相比)及顯著較佳之抗腫瘤效能(實例6-SI-2以T/C=0.08完全抑制腫瘤生長，與之相比，V12以T/C=0.51減緩腫瘤生長)。
實例13
將在細胞培養中生長之HeLa-MaTu(EPO-GmbH,Berlin)人類宮頸癌細胞經皮下植入雌性NMRI裸鼠之側腹中。在腫瘤生長至約20mm2 尺寸後立即開始處理。在各組中有一組之腫瘤達到約160mm2 尺寸後立即終止研究。
使用以下測試組：
第1組：對照，用增溶劑(40% PEG 400/60%水)處理
第2組：根據實例2製備之立體異構體2(=實例2-SI-2)
(1.5mg/kg，經口，在第5、6、12、13、19、20天每天2x)
第3組：根據實例2製備之立體異構體2(=實例2-SI-2)
(2.0mg/kg，經口，在第5、6、12、13、19、20天每天2x)
第4組：根據實例2製備之立體異構體2(=實例2-SI-2)
(2.5mg/kg，經口，在第5、6、12、13、19、20天每天2x)
該研究設計為測定人類宮頸癌異種移植模型對用實例2-SI-2處理之初始反應。在作為NMRI裸鼠上之異種移植之HeLa-MaTu宮頸腫瘤模型中測試各種化合物之生長抑制效應。實例2-SI-2在增溶劑40%聚乙二醇400(PEG 400)/60%水中以0.15mg/ml(第2組)、0.2mg/ml(第3組)或0.25mg/ml(第4組)之終濃度完全溶解。在接種腫瘤後第5天開始對已建立腫瘤進行治療。在第1組(對照)動物中之腫瘤尺寸超過約160mm2 尺寸後之第20天終止研究。
研究結果(圖5)顯示，在由連續2天每天兩次經口投與及隨後5天無處理組成之處理方案中，實例2-SI-2對HeLa-MaTu異種移植模型中之腫瘤生長產生劑量依賴性抑制。在最高劑量組(2.5mg/kg，第4組)中，幾乎完全抑制腫瘤生長且在研究結束時腫瘤重量降低至對照組之18%(T/C=0.18,p<0.05)。
5-Br比較物質(=V13)
將在細胞培養中生長之HeLa-MaTu(EPO-GmbH,Berlin)人類宮頸癌細胞經皮下植入雌性NMRI裸鼠之側腹中。在腫瘤生長至約20mm2 尺寸後立即開始處理。在各組中有一組之腫瘤達到約160mm2 尺寸後立即終止研究。
使用以下測試組：
第1組：對照，用增溶劑(40% PEG 400/60%水)處理
第2組：WO 2005/037800中實例3.13之化合物(=V13)
(6mg/kg，經口，在第5、6、12、13、19、20天每天2x)
第3組：WO 2005/037800中實例3.13之化合物(=V13)
(8mg/kg，經口，在第5、6、12、13、19、20天每天2x)
第4組：WO 2005/037800中實例3.13之化合物(=V13)
(10mg/kg，經口，在第5、6、12、13、19、20天每天2x)
該研究設計為測定人類宮頸癌異種移植模型對用5-Br比較物質V13處理之初始反應。在作為NMRI裸鼠上之異種移植之HeLa-MaTu宮頸腫瘤模型中測試各種化合物之生長抑制效應。V13在增溶劑40%聚乙二醇400(PEG 400)/60%水中以0.6mg/ml(第2組)、0.8mg/ml(第3組)或1.0mg/ml(第4組)之終濃度完全溶解。在接種腫瘤後第5天開始對已建立腫瘤進行治療。在第1組(對照)動物中之腫瘤尺寸超過約160mm2 尺寸後之第20天終止研究。
研究結果(圖6)顯示，在由連續2天每天兩次經口投與及隨後5天無處理組成之處理方案中，V13對HeLa-MaTu異種移植模型中之腫瘤生長產生劑量依賴性抑制。在最高劑量組(10mg/kg，第4組)中，極顯著地抑制腫瘤生長且在研究結束時腫瘤重量降低至對照組之23%(T/C=0.23,p<0.05)。
結論：
在由連續兩天每天兩次以2.5mg/kg之劑量經口投與及隨後5天無處理組成之週期性處理方案中，實例2之立體異構體2(實例2-SI-2(5-CF3 ))達成對HeLa-MaTu異種移植模型中腫瘤生長之幾乎完全抑制(處理/對照比T/C=0.18)。在以10mg/kg之劑量實施之相應良好耐受性週期性處理方案中，WO 2005/037800中實例3.13之化合物(=V13(5-Br))達成對HeLa-MaTu異種移植模型中腫瘤生長之稍弱遲滯(處理/對照比T/C=0.23)。令人驚訝地，與V13(5-Br) 相比，實例2-SI-2(5-CF3 )顯示顯著較高之效力(實例2-SI-2之2.5mg/kg劑量與V13之10mg/kg相比)及略佳抗腫瘤效能(實例2-SI-2以T/C=0.18抑制腫瘤生長，與之相比，V13以T/C=0.23抑制腫瘤生長)。
實例14
將在細胞培養中生長之HeLa-MaTu(EPO-GmbH,Berlin)人類宮頸癌細胞經皮下植入雌性NMRI裸鼠之側腹中。在腫瘤生長至約20mm2 尺寸後立即開始處理。在各組中有一組之腫瘤達到約160mm2 尺寸後立即終止研究。
使用以下測試組：
第1組：對照，用增溶劑(40% PEG 400/60%水)處理
第2組 根據實例1製備之立體異構體2(=實例1-SI-2)
(1.5mg/kg，經口，在第5、6、12、13、19、20天每天2x)
第3組：根據實例1製備之立體異構體2(=實例1-SI-2)
(2.0mg/kg，經口，在第5、6、12、13、19、20天每天2x)
第4組：根據實例1製備之立體異構體2(=實例1-SI-2)
(2.5mg/kg，經口，在第5、6、12、13、19、20天每天2x)
該研究設計為測定人類宮頸癌異種移植模型對用實例1-SI-2處理之初始反應。在作為NMRI裸鼠上之異種移植之HeLa-MaTu宮頸腫瘤模型中測試各種化合物之生長抑制效應。實例1-SI-2在增溶劑40%聚乙二醇400(PEG 400)/60%水中以0.15mg/ml(第2組)、0.2mg/ml(第3組)或0.25mg/ml(第4組)之終濃度完全溶解。在接種腫瘤後第5天開始對已建立腫瘤進行治療。在第1組(對照)動物中之腫瘤尺寸超過約160mm2 尺寸後之第20天終止研究。
研究結果(圖7)顯示，在由連續2天每天兩次經口投與及隨後5 天無處理組成之處理方案中，實例1-SI-2對HeLa-MaTu異種移植模型中之腫瘤生長產生劑量依賴性抑制。在最高劑量組(2.5mg/kg，第4組)中，幾乎完全抑制腫瘤生長且在研究結束時腫瘤重量降低至對照組之19%(T/C=0.19,p<0.05)。
5-Br比較物質(=V14)
將在細胞培養中生長之HeLa-MaTu(EPO-GmbH,Berlin)人類宮頸癌細胞經皮下植入雌性NMRI裸鼠之側腹中。在腫瘤生長至約20mm2 尺寸後立即開始處理。在各組中有一組之腫瘤達到約160mm2 尺寸後立即終止研究。
使用以下測試組：
第1組：對照，用增溶劑(40% PEG 400/60%水)處理
第2組：根據上文所揭示V14之製備來製備之WO 2005/037800化合物
(6mg/kg，經口，在第5、6、12、13、19、20天每天2x)
第3組：根據上文所揭示V14之製備來製備之WO 2005/037800化合物
(8mg/kg，經口，在第5、6、12、13、19、20天每天2x)
第4組：根據上文所揭示V14之製備來製備之WO 2005/037800化合物
(10mg/kg，經口，在第5、6、12、13、19、20天每天2x)
該研究設計為測定人類宮頸癌異種移植模型對用5-Br比較物質V14處理之初始反應。在作為NMRI裸鼠上之異種移植之HeLa-MaTu宮頸腫瘤模型中測試各種化合物之生長抑制效應。V14在增溶劑40%聚乙二醇400(PEG 400)/60%水中以0.6mg/ml(第2組)、0.8mg/ml(第3組)或1.0mg/ml(第4組)之終濃度完全溶解。在接種 腫瘤後第5天開始對已建立腫瘤進行治療。在第1組(對照)動物中之腫瘤尺寸超過約160mm2 尺寸後之第20天終止研究。
研究結果(圖8)顯示，在由連續2天每天兩次經口投與及隨後5天無處理組成之處理方案中，V14對HeLa-MaTu異種移植模型中之腫瘤生長產生劑量依賴性抑制。在最高劑量組(10mg/kg，第4組)中，弱抑制腫瘤生長且在研究結束時腫瘤重量降低至對照組之44%(T/C=0.44，未達成統計顯著性)。
結論：
在由連續兩天每天兩次以2.5mg/kg之劑量經口投與及隨後5天無處理組成之週期性處理方案中，實例1之立體異構體2(實例1-SI-2(5-CF3 ))達成對HeLa-MaTu異種移植模型中腫瘤生長之幾乎完全抑制(處理/對照比T/C=0.19)。在以10mg/kg之劑量實施之相應良好耐受性週期性處理方案中，WO 2005/037800之5-Br化合物(=V14(5-Br))達成對HeLa-MaTu異種移植模型中腫瘤生長之弱抑制(處理/對照比T/C=0.44)。令人驚訝地，與V14(5-Br)相比，實例1-SI-2(5-CF3 )顯示顯著較高之效力(實例1-SI-2之2.5mg/kg劑量與V14之10mg/kg相比)及顯著優越之抗腫瘤效能(實例1-SI-2以T/C=0.19抑制腫瘤生長，與之相比，V14以T/C=0.44抑制腫瘤生長)。

Claims (9)

  1. 一種具有下式之化合物， 及其鹽、非對映異構體及對映異構體。
  2. 一種具有下式之化合物， 及其鹽、非對映異構體及對映異構體。
  3. 一種具有下式之化合物， 及其鹽、非對映異構體及對映異構體。
  4. 一種具有下式之化合物， 及其鹽、非對映異構體及對映異構體。
  5. 一種具有下式之化合物， 及其鹽、非對映異構體及對映異構體。
  6. 一種具有下式之化合物， 及其鹽、非對映異構體及對映異構體。
  7. 一種具有下式之化合物， 及其鹽、非對映異構體及對映異構體。
  8. 一種具有下式之化合物， 及其鹽、非對映異構體及對映異構體。
  9. 一種具有下式之化合物， 及其鹽、非對映異構體及對映異構體。
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