TWI391136B - 用以改進粒線體功能之含有心磷脂的脂質體 - Google Patents

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Description

用以改進粒線體功能之含有心磷脂的脂質體
本發明係有關於用以改進粒線體功能之含有心磷脂的脂質體。
 發明背景
氧自由基或活性氧物種(ROS)已知係為在細胞損傷中之主要因素的高度活性物種，其係藉著氧化作用以及之後對於脂類、蛋白質與核酸之功能損害而造成損傷。的確，活性氧已經被猜測為老化以及包括癌症的一些疾病之主要因素。已知ROS係特別地會損傷粒線體。粒線體的氧化損傷係被認為是細胞老化與最終之細胞死亡的主要因素。
包含有遺傳物質的粒線體係為在身體中之每個細胞之一部份。其等的確可以在所有真核細胞中發現。粒線體係負責氧之處理而並將來自食物之物質轉換為對細胞功能而言係為必要的能量。粒線體係以三磷酸腺苷(ATP)的形式來產生能量，然後其係被運輸到細胞的細胞質以運用於許多的細胞功能中。粒線體已知係為細胞的發電廠，因為其所生產之ATP會供應多細胞生物所使用之大約90%的新陳代謝能量。
粒線體在氧氣新陳代謝中之角色，使得其等成為氧自由基所損害之主要目標。明確地說，粒線體呼吸鏈(也就是電子傳遞鏈)已經被認為是ROS之主要的細胞內來源。在該粒線體中之ATP的形成會導致具高度活性之超氧化物自 由基的釋放，其可以轉換成例如過氧化氫與氫氧基自由基之其他的ROS。細胞具有對抗此一氧化壓力之機制，但是該對抗效率會隨著年齡以及例如壓力之外在因素而減低。最後粒線體會在其之產生ATP的能力中變得不具效率，而導致一細胞功能的損傷並通常會使得細胞死亡。
ROS會藉著降解在粒線體內膜裡面的蛋白質和脂類之結構而造成對粒線體的傷害。最具傷害性之ROS物種之一係為會使得脂類發生過氧化反應之氫氧基自由基。當脂類的過氧化現象隨著時間而增加，係為在該粒線體的內膜中主要脂類中之一者的心磷脂會產生結構上的變化。這些結構上的變化會對該內膜與相關心磷脂－蛋白質之交互作用(其對於電子傳遞系統而言是重要的)造成傷害。舉例來說，細胞色素c會附接於健康、正常運作之粒線體中的心磷脂上。然而，當心磷脂被分解時，細胞色素c就會被釋放，而接著啟動會導致計畫性細胞死亡之汲聯反應事件。
自外部添加心磷脂已被認為可以改善整體粒線體的功能障礙。然而，在試圖自外部遞送心磷脂時，已經面臨了許多困難。心磷脂係相當不穩定的並且對氧化降解作用係非常地敏感的。舉例來說，人類的心磷脂包含有多不飽和脂肪酸，其中超過85%係屬於亞油酸系列。與飽和或單一不飽合脂肪酸不同的是，例如亞油酸之多不飽和脂肪酸會輕易地被ROS所分解。除此之外，因為心磷脂之氧化分解現象與輸送障壁現象，在以一複雜而功能完整之細胞為基礎的模型中(特別是在活體中)局部地給予心磷脂，並不被 認為可以穿透至該粒線體的內膜。
目前有一些其他的方法來克服粒線體之功能障礙，但是每個都受限於其等無法克服與粒線體老化有關之最關鍵問題。舉例來說，一種已被提出之解決方式係藉著僅提供製造ATP之受質，而針對增加ATP之製造來進行，但是此一方式完全無法克服粒線體之整體功能障礙。粒線體功能障礙之另外一種解決方式係以自外部添加抗氧化劑為基礎。此一方式藉著保護粒線體的現有狀態與功能而達到一定程度之功效。然而，此一方式並無法回復現有的損害，因此並不是一理想的解決方式。此解決方式的又另一具體例係為NeoLipid，其明確地說係為可以自NeoPharm(Waukegan,Illinois)公司取得的與脂類結合之吉西他濱(Lipid Conjugate Gemcitabine)(與心磷脂結合之吉西他濱)。NeoLipid係為一種包埋於一磷脂醯膽鹼脂質體中之一經陽離子修飾的心磷脂。然而，即便是這種解決方式，其對於針對治療粒線體功能障礙之局部治療方式而言並不是理想的。
 發明概要
粒線體的功能障礙係直接地與氧化損傷有關(其包括有由ROS所造成之脂類過氧化反應以及粒線體膜的心磷脂損耗)。粒線體功能障礙也係直接地與細胞老化和死亡有關。本發明係以一獨特的組成物為基礎，其不僅可以維持粒線體之功能，同時也可以改善和回復粒線體之功能及/或 修復粒線體之膜。明確地說，本發明的組成物係為一包埋於脂質體中之心磷脂與抗氧化劑的獨特組合。
在一具體例中，本發明之一組成物係為一心磷脂以及包埋於脂質體中抗氧化劑。
在進一步的具體例中，本發明的組成物係為一脂質體，舉例來說，一主要由磷脂醯膽鹼(或是卵磷脂)所組成之包埋有心磷脂的脂質體，其中該心磷脂係為四油醯基－心磷脂、四棕櫚油醯基－心磷脂或四肉荳蔻醯基－心磷脂，並且係被包埋於該脂質體的雙層磷脂質中；以及一或更多的抗氧化劑，其中該等一或更多的抗氧化劑係被包埋於該脂質體的雙層磷脂質、該脂質體的水性中心或是該等兩者中。在一具體例中，至少一抗氧化劑可以是一水溶性抗氧化劑。在另一具體例中，至少一抗氧化劑可以是脂溶性抗氧化劑。在進一步的具體例中，至少一抗氧化劑可以是一單線態氧(singlet oxygen)的清除劑。在進一步的具體例中，包括在本發明的組成物中之一抗氧化劑可以同時是水溶性並且是一單線態氧清除劑，或者同時是脂溶性並且是一單線態氧清除劑。
在另一具體例中，本發明的一組成物係為一主要由磷脂醯膽鹼所組成之包埋有心磷脂(例如四油醯基－心磷脂)的脂質體，以及至少一抗氧化劑(例如一或更多的龍膽酸甲酯(或甲基龍膽酸酯))以及1－肌肽。
在另一具體例中，本發明的一組成物係為一包埋有一衍生自一種子油之心磷脂的脂質體(舉例來說，一主要地 以磷脂醯膽鹼為主所組成的脂質體)，以及至少一抗氧化劑。在進一步的具體例中，該至少一抗氧化劑可以是龍膽酸甲酯、1-肌肽、丁基化羥基甲苯(BHT)、叔丁基氫醌(TBHQ)或是其等之組合。
在進一步的具體例中，本發明的組成物可以包括一或者更多的脂類、磷脂質、滲透作用增進劑、濕潤劑、芳香劑、神經醯胺、鞘脂類、蛋白質、膽固醇、植物固醇類、膽固醇硫酸酯、糖類、維生素，礦物質或是任何天然地可以在一個細胞膜中發現之其他化合物。
在一具體例中，本發明的組成物係以一乳霜、乳液、凝膠、補充劑、水包油乳化液，油包水乳化液、糊膏或噴霧劑來局部地進行給藥。在其他的具體例中，本發明的組成物可以口服地或是非經腸地(例如藉著注射)來進行給藥。
在進一步的具體例中，本發明的組成物係為安定的，並且在儲存於室溫(大約68℉/21.1℃)下一段介於至少1小時至一天、至數天、至一星期、至數星期、至一個月、至數個月、至一年、至數年的時間內時，對於實質之氧化損害並不敏感。
在另一具體例中，本發明的組成物係為安定的，並且在儲存於介於大約10℃至60℃的溫度下、較佳地介於大約20℃至55℃的溫度下、較佳地介於大約30℃至50℃的溫度下時，對於實質之氧化損害並不敏感。
在進一步的具體例中，本發明係為一種改善、回復或維持粒線體之功能的方法，其包含局部地給予一組成 物，該組成物包含有一包埋有心磷脂之脂質體以及抗氧化劑。在一具體例中，該脂質體係主要地由磷脂醯膽鹼組成並且係包埋有心磷脂，其中該心磷脂可以是例如四棕櫚油醯基-心磷脂、四肉荳蔻醯基-心磷脂或四油醯基-心磷脂，並且係被包埋於該脂質體的雙層磷脂質中；以及一或更多的抗氧化劑，其中該等一或更多的抗氧化劑係被包埋於該脂質體的雙層磷脂質、該脂質體的水性中心或是該等兩者中。在一具體例中，至少一抗氧化劑可以是一水溶性抗氧化劑。在另一具體例中，至少一抗氧化劑可以是脂溶性抗氧化劑。在進一步的具體例中，至少一抗氧化劑可以是一單線態氧(singlet oxygen)的清除劑。在進一步的具體例中，包括在本發明的組成物中之一抗氧化劑可以同時是水溶性並且是一單線態氧清除劑，或者同時是脂溶性並且是一單線態氧清除劑。在又一進一步的具體例中，該包埋於該脂質體中之抗氧化劑可以是龍膽酸甲酯、1-肌肽或是該等二者。
在另一具體例中，本發明係為一種修復粒線體膜的方法，其包含局部地給予一組成物，該組成物包含有一包埋有心磷脂之脂質體以及抗氧化劑。在一具體例中，該脂質體係主要地由磷脂醯膽鹼所組成並且係包埋有心磷脂，其中該心磷脂係較佳地為四棕櫚油醯基-心磷脂、四肉荳蔻醯基-心磷脂或是四油醯基-心磷脂中之一者，並且係被包埋於該脂質體的雙層磷脂質中；以及一或更多的抗氧化劑，其中該等一或更多的抗氧化劑係被包埋於該脂質體的雙層 磷脂質、該脂質體的水性中心或是該等兩者中。在一具體例中，至少一抗氧化劑可以是一水溶性抗氧化劑。在另一具體例中，至少一抗氧化劑可以是脂溶性抗氧化劑。在進一步的具體例中，至少一抗氧化劑可以是一單線態氧(singlet oxygen)的清除劑。在進一步的具體例中，包括在本發明的組成物中之一抗氧化劑可以同時是水溶性並且是一單線態氧清除劑，或者同時是脂溶性並且是一單線態氧清除劑。在又一進一步的具體例中，該包埋於該脂質體中之抗氧化劑可以是龍膽酸甲酯、1-肌肽或是該等二者。
圖式簡單說明
第1圖例示說明一粒線體，其顯示其之(1)嵴、(2)基質、(3)外膜以及(4)內膜。
第2圖係為心磷脂之化學結構的圖式。
第3圖例示說明一脂質體，其顯示其之包括有該脂類的親水性頭部(2)之雙層脂質(1)；該脂類的厭水性尾部(3)；該水性中心(4)；以及在該等厭水性尾部之間的該空間(5)。
第4圖係為磷脂醯膽鹼之化學結構的圖式。
第5圖係為一例示說明使用(a)1-肌肽；(b)DC龍膽酸甲酯1%；(c)中空脂質體(僅具有心磷脂)；(d)具負載脂質體(也就是負載有1-肌肽、龍膽酸甲酯與心磷脂的脂質體)；以及(e)具負載脂質體(也就是負載有1-肌肽、龍膽酸甲酯與心磷脂的脂質體)，所達成之ATP製造能力曲線圖。
第6圖係為二張以Zeiss-902電子顯微鏡之電子能譜影像(ESI)的TEM影像(相片)的比對。第6(a)圖係為一包含有 脂質體之標準乳霜配方的TEM照片(相片)，該脂質體包埋有心磷脂、龍膽酸甲酯與1-肌肽。在6(a)中之該TEM影像(相片)係在該乳霜配方被製備之後不久，於該包含包埋有心磷脂、龍膽酸甲酯與1-肌肽之脂質體的配方乳霜進行任何儲藏作業之前進行拍攝。第6(b)圖係為同一包含有該脂質體之標準乳霜配方的TEM照片(相片)，該脂質體係如第6(a)圖一般包埋有心磷脂、龍膽酸甲酯與1-肌肽，但是第6(b)圖係在該乳霜配方於50℃下儲存1個月在之後才進行拍攝。
 較佳實施例之詳細說明
應該要了解的是，本發明並未侷限於在此所描述之特定的組成物、方法或製程。進一步來說，除非有另外界定，在此所使用之所有的技術上與科學上的術語，都具有與一般習於本發明所屬之技藝者所能了解之相同意義。也可以被了解的是，在此所使用之該命名方式係僅用於描述特定的具體例，而不是要限制僅應由申請專利範圍所侷限之本發明的範圍。
本發明係為包埋有心磷脂與至少一抗氧化劑之脂質體的獨特組合，其可以在進行給藥(例如局部施用)時，改善、維持或是回復粒線體的功能及/或修復粒線體膜。在一具體例中，本發明的脂質體係主要地由磷脂醯膽鹼所組成；該心磷脂係為以例如四油醯基-心磷脂、四棕櫚油醯基-心磷脂，或是四肉荳蔻醯基-心磷脂中之一者；並且該抗氧化劑係為例如一或更多的龍膽酸甲酯和1-肌肽。
除此之外，本發明的獨特組成物在儲存於約室溫或更高的溫度下，具有安定並且可以抗氧化損傷、降解或是不穩定性之令人驚訝的優點。舉例來說，如在下述具體例3中所討論的，本發明之包含有一主要地由磷脂醯膽鹼所組成，並且包埋有四油醯-心磷脂、龍膽酸甲酯與1-肌肽之脂質體的組成物，已被證實會在50℃的儲藏情況下具有顯著的穩定性至少一個月。
一般認為在本發明中該至少一抗氧化劑會穩定該心磷脂，直到該心磷脂藉著例如一局部給予一包含有本發明之該脂質體的組成物而輸送至一細胞。在一具體例中，該至少一可以穩定該心磷脂的抗氧化劑係為龍膽酸甲酯，一種可以避免心磷脂氧化之強效的抗氧化劑。進一步來說，該脂質體輸送技術的特性為該脂質體係包含水性內部。舉例來說，參見第3圖。為了避免心磷脂在該脂質體內部氧化，本發明可以包含有一第二抗氧化劑(例如1-肌肽)，其係為一以胜肽為基礎之有效的水溶性抗氧化劑。
本發明之組成物可以達到一更佳之細胞功能，因為本發明同時包含有一用來保護細胞免於氧化損害之抗氧化劑(例如1-肌肽)，以及一用來改善、維持或者回復粒線體功能及/或修復粒線體膜之心磷脂(例如四油醯基-心磷脂)。針對粒線體的功能活性的改善、維持或者回復之支持證據，係通過例如活體外測試資料來提供。舉例來說，在具體例2中所討論之步驟指出，給予包含有一脂質體(其主要由磷脂醯膽鹼所組成並包埋有四油醯基-心磷脂)、龍膽酸甲酯以及 1-肌肽之本發明的組成物，可以得到比該等成份單獨所產生之更高程度的ATP製造能力。
粒線體
在所有的細胞中之數量係隨著該細胞的新陳代謝活性而改變的粒線體，係為本發明的組成物所欲之標的。的確，本發明的組成物係被設計以將心磷脂輸送至該粒線體的整體結構(該粒線體膜)。
粒線體係被視為細胞的發電廠之桿狀胞器，其會將氧氣與營養物質轉換成三磷酸腺苷(ATP)。ATP係為驅動細胞的新陳代謝活性之化學能量流。在任何的特定細胞中之粒線體的數量係幾乎完全依賴該細胞的新陳代謝活性而定。粒線體是相當有彈性而活細胞的縮時攝影(time-lapse)研究已經證實，粒線體會快速地改變形狀並近乎持續地在細胞中移動。粒線體之移動，似乎係某種方式而與在細胞中出現的微管有關係，並且粒線體可能係藉著運動蛋白質沿著網路來運輸。結果，粒線體可能會被組織成冗長的移動鏈，而緊密地形成相對穩定的群組，或是針對細胞之特別需求與微管網路之特性為基礎，而以許多其他形式來出現。
粒線體具有對於胞器的運作相當關鍵的精細結構。二個特化膜環繞細胞中出現之每個粒線體，而將該胞器區分為一狹窄的膜間間隙以及一大很多之內部基質，其等每個都包含有高度特化之蛋白質。粒線體的該外膜包含有許多以孔蛋白所形成的通道，並且係被用來作為一分子篩子 的功能，以過濾出太大分子。同樣地，該高度旋繞而形成許多被稱為嵴之向內摺疊，也僅允許特定分子通過其並且係比該外膜更具選擇性。為了要確定僅有那些對於該基質係為必要之材料可以被允許進入其中，該內膜係運用一組可以運輸正確的分子之運輸蛋白質。粒線體的各種不同區間可以一起適切地作用，而在一複雜的多步驟過程中產生ATP。
明確地說，ATP係藉著將電子通過4個錯合物而經由一複雜的反應鏈，並驅使其形成一質子濃度，而使得該質子移動動力來產生。這四個錯合物是NADH去氫酶、琥珀酸去氫酶、bc l錯合物與細胞色素c氧化酶。該電子傳遞系統與相關之氧化磷酸化作用係發生於該粒線體內膜上，其包含有大約75%的蛋白質和20%的心磷脂。在該內膜、脂類、心磷脂以及包含有該等錯合物與運輸載體的蛋白質之間所形成的四級結構，係為形成功能性質的整體。例如參見Mileykovskaya等人之"Cardiolipin in Energy Transducing Membranes.",Biochemistry(Mosc).2005.70(2)：154-8，Mileykovskaya等人報告細胞色素c氧化酶與包含緊密地連結之心磷脂的ATP/ADP載體對於結構和功能係相當重要的，其整體內容係在此被併入以供參考。除此之外，參見Gorbenko等人之"Cytochrome c Interaction with Cardiolipin/Phosphatidylcholine Model Membranes：Effect of.Cardiolipin on Protonation."Biophys J.2006.90(11)：4093-103，Gorbenko等人詳細地描述在細胞色素c與心磷 脂之間的交互作用，其整體內容係在此被併入以供參考。同時可以參見Petrosillo等人之"Role of,Reactive Oxygen Species and Cardiolipin in the Release of Cytochrome c from Mitochondria."FASEB J.2003.17：2202-2208，其整體內容係在此被併入以供參考。此外，Paradies等人已顯示在心磷脂與在電子傳遞機制的錯合物III之間存在有關鍵性的關係。參見Paradies等人之“Reactive oxygen species generated by the mitochondrial respiratory chain affect the complex III activity via cardiolipin,peroxidation in beef-heart submitochondrial particles.”Mitochondrion 2001.1：151-159，其整體內容係在此被併入以供參考。同時可以參見Paradies等人之“Reactive oxygen species affect mitochondrial electron transport complex I activity through oxidative cardiolipin damage.”Gene.2002.286：135-141，其整體內容係在此被併入以供參考。
粒線體在細胞凋亡之誘發中扮演了一決定性的角色。自粒線體中所釋放之細胞色素c似乎誘發最終會導向計劃性細胞死亡之該細胞凋亡汲聯反應的中心事件。然而，會觸發促半胱天冬酶(caspase)活化之細胞色素c自粒線體釋放的機制，似乎係主要地由ROS所媒介。除此之外，細胞色素c自該粒線體內膜的分離係發生於自粒線體釋放之前。細胞色素c係連結至該內膜磷脂質(主要地係連結至該心磷脂分子)之該外部表面。細胞色素c與心磷脂的連結已經被廣泛地探討，並且已經闡明了該交互作用之一些分子 層面。心磷脂係富含有未飽和脂肪酸，其對於其與細胞色素c之交互作用，以將該蛋白質固著於該膜中而言似乎係為必要的。ROS的對心磷脂的氧化損傷，係被預期會擾亂在該粒線體內膜層級上的該細胞色素c與此磷脂質之交互作用，而其接下來將會誘使該細胞色素c自該膜分離，而使其釋放進入粒線體外空間。因此，目前已有由於脂類過氧化反應而導致在細胞色素c與心磷脂之間的分子交互作用之損失的報告。除此之外，目前已經發現由於氧化損害或是其之生物合成路徑上改變而導致的心磷脂含量上的變化，會觸發在凋亡的過程期間之自粒線體釋放細胞色素c的現象。
心磷脂
心磷脂係被包埋於本發明的脂質體以輸送至粒線體。心磷脂僅被發現於細菌與粒線體之膜中。在粒線體膜中之心磷脂的獨特與有限的位置，指出了本發明之脂質體的目標係針對，及/或是包埋於在脂質體中之心磷脂的目標係針對於粒線體膜。
進一步來說，如上述所討論的，心磷脂係為該粒線體內膜之主要成分，並負責調節許多獨立的粒線體功能。的確，由於心磷脂係為粒線體的特殊脂類成分，其在此一胞器中之生物功能顯然係相當關鍵的。舉例來說，心磷脂係至少部份地負責維持膜的流動性。的確，當粒線體失去心磷脂之時，其等會變得更固定、失去功能性並最後會導致細胞死亡。因此，本發明的組成物之附加優點在於將心 磷脂輸送至該粒線體與該粒線體膜，將有助於維持、回復或修復粒線體及/或粒線體的膜流動性。
如上述所討論的，心磷脂係主要位於粒線體的內膜上，並在其上與許多的粒線體蛋白質相互作用。此一交互作用會影響特定酵素之功能活化作用，特別是那些與氧化磷酸化作用有關之酵素。與氧化磷酸化作用有關之所有的粒線體蛋白質錯合物，都包含有被一體化成四級該結構之心磷脂分子；其等係為在錯合物與其周圍環境間以及在該錯合物裡面之次單元間之界面的必要成分。
粒線體的心磷脂分子係為氧自由基所攻擊之一目標，因為其等具有高含量的未飽和脂肪酸，並且其在粒線體內膜中之位置係位於ROS產生位置附近。將心磷脂自該粒線體之膜移除會導致該錯合物的崩解與損失功能性。舉例來說，心磷脂係在細胞色素bcl錯合物中扮演一關鍵性的角色，其係為一種會與在還原型泛醌(ubiquinol)與細胞色素c之間轉移之電子結合，以越過該雙層脂質來轉換質子的位置之呼吸鏈的膜蛋白錯合物。明確地說，心磷脂分子係被固定於泛醌(ubiquinone)的還原反應之位置附近，並且係被確信可以確保該催化位置的穩定性並參與了質子吸收作用。
心磷脂係為一種不尋常的結構之磷脂，並且係特別地富含有不飽和脂肪酸。典型地，亞油酸係佔心磷脂中之不飽和脂肪酸的至少85%來存在。因此，在本發明的一具體例中，大約85%由亞油酸所組成之心磷脂係被包埋於一 脂質體中，例如包埋於該脂質體的雙層磷脂質中。在本發明的另一具體例中，四油醯基-心磷脂係被包埋於該脂質體中。四油醯基-心磷脂係由四個油酸成份(C18：1，四油醯基-心磷脂)所組成，比起亞油酸心磷脂其對於氧化損害與崩解現象係較為不敏感的。在其他的具體例中，本發明的心磷脂可以是四棕櫚油醯基-心磷脂、四肉荳蔻醯基-心磷脂，或是源自於種子油的心磷脂。可以被運用於本發明的組成物與方法中之心磷脂的其他具體例，可以取自於例如Avanti® Polar Lipids,Inc.公司(Alabaster,AL)。其所可以得到的心磷脂之具體例，包括有以下物質：1,1',2,2'-四肉荳蔻醯基心磷脂(銨鹽)(產品編號第770332號)；1,1',2,2'-四肉荳蔻醯基心磷脂(鈉鹽)(產品編號第750332或710335號)；1,1'-油基-2,2'-(12-生物素基(十二胺基))心磷脂(銨鹽)(產品編號第860564號)；心磷脂(大腸桿菌，二鈉鹽)(產品編號第841199號)；心磷脂(心臟，小牛-二鈉鹽)(產品編號第770012號)；心磷脂(心臟，小牛-二鈉鹽)(產品編號第840012號)；心磷脂，氫化的(心臟，小牛-二鈉鹽)(產品編號第830057號)；二溶解心磷脂(Dilysocardiolipin)(心臟，小牛-二鈉鹽)(產品編號第850082號)；二溶解心磷脂(心-鈉鹽)；心氫化心磷脂；溶解心磷脂(Lysocardiolipin)；單溶解心磷脂(Monolysocardiolipin)(心臟，小牛-二鈉鹽)(產品編號第850081號)；以及單溶解心磷脂(心-鈉鹽)。
在進一步的具體例中，該包埋於脂質體中的心磷脂可以是雙磷脂醯甘油(diphosphatidylglycerol)，或更明確地 說係為1,3-雙(sn-3'-磷脂醯)-sn-甘油。通常所有形式之心磷脂都具有雙聚合結構，其具有四個醯基基團並可能可以攜帶二個陰性電荷。參見例如第2圖。即使具有四個相同的醯基基團，心磷脂也會具二個化學上相異之磷脂醯部分；在具有二個手性中心時，每個外部甘油基團中都有一個。雖然天然的雙磷脂醯甘油係具有R/R之結構，但是其等可以行成非鏡像立體異構物。結果，這二個磷酸鹽基團將具有不同的化學環境。其等相對於該中央甘油係被描寫為1'-磷酸鹽與3'-磷酸鹽。心磷脂之每個形式都包含有酸性質子，但是其等具有非常不相同之酸度水平，舉例來說pK 1=2.8並且pK 2>7.5。該第二磷酸鹽之弱酸性係被認為是其與該中央的2'-羥基形成一穩定的分子內氫鍵的結果。實際上，在正常的生理情況下，該心磷脂分子可以僅帶有一負電荷。進一步來說，心磷脂的模型顯示，如果一補獲的質子形成一酸性陰離子，其之磷酸鹽就可以形成緊密的二環結構，以提供一特別緊密之結構。
在動物組織中，心磷脂係被認為是膽固醇自該外部移位至該粒線體內膜之一重要的輔助因子，並且在類固醇生成組織中，其會活化粒線體的膽固醇支鏈之分解現像，並且係為一類固醇生成作用之有效刺激因子。磷脂質也可能在蛋白質進入粒線體內的作用中扮演一特別的角色。其係以一高度專一性的方式來與在染色質中之DNA結合，而存在於染色質中之所有心磷脂的確係與DNA結合，其中兩者都具有一共同的'中間磷酸鹽基'結構部份。此一心磷脂似 乎在基因表現之調節作用中具有一功能性的角色。舉例來說，Barth症候群(一種與X染色體聯鎖之人類的疾病狀態(心肌病))，係與心磷脂之脂肪酸組成物中的顯著異常有關(也就是四亞油醯類型分子之減少以及單溶解心磷脂之累積)。
抗氧化劑
依據本發明，至少一抗氧化劑與心磷脂皆包埋於一脂質體中。該抗氧化劑可以被包埋於，例如該脂質體的雙層磷脂質中、在該脂質體的水性中心中，或是在兩者中。如上述所解說的，被包含在本發明的組成物中之抗氧化劑，可能藉著保護該心磷脂免於來自該脂質體的水性中心，或是來自該脂質體之外的ROS所產生之氧化損害或分解作用。的確，在細胞中之抗氧化劑的一主要作用，係要避免由於ROS的作用導致之損害。活性氧物種包括有過氧化氫(H2 O2 )、超氧化物陰離子(O2 - )以及例如羥基自由基(OH- )之自由基。這些分子係為不穩定並且係高度地具有活性，並且可能會藉著例如脂類過氧化反應之化學連鎖反應而損害細胞。
有許多種的抗氧化劑可以被結合至本發明的組成物中。舉例來說，包埋於本發明的一脂質體中的一抗氧化劑可以是水溶性的，並因而可以被包埋於脂質體的水性中心中。在另一具體例中，包埋於一脂質體中之一抗氧化劑可以是脂溶性的，並因而可以被包埋於脂質體的雙層脂質中。在進一步的具體例中，包埋於本發明的一脂質體中之一抗氧化劑，可以是一單線態氧的清除劑。在另一具體例 中，該抗氧化劑可以是同時是水溶性並且是一單線態氧清除劑，或者同時是脂溶性並且是一單線態氧清除劑。在進一步的具體例中，超過一種的抗氧化劑可以被包埋於本發明的脂質體中。舉例來說，下列抗氧化劑中之一或更多種可以被包埋於本發明之脂質體中：龍膽酸甲酯、1-肌肽、丁基化羥基甲苯(BHT)、叔丁基氫醌(TBHQ)或是其等之組合。
在一具體例中，龍膽酸甲酯係被用來作為本發明中之一抗氧化劑，因為龍膽酸甲酯係為脂溶性的所以具有可以穩定心磷脂之能力。雖然在下面所討論之具體例1例示說明龍膽酸甲酯並不具有明顯的氧化壓力保護能力，龍膽酸甲酯具有一高度的含氧自由基吸收能力("ORAC")(25,605 pmol Teg/g)，其代表其係為一強抗氧化劑。然後可以其之ORAC值為基礎來選擇用於本發明中之一抗氧化劑，舉例來說，選擇具有較高的ORAC值抗氧化劑。因此，在一具體例中，龍膽酸甲酯係因為其之高ORAC值而被選擇以用於本發明中。在此一具體例中，本發明係由一在其之，例如雙層磷脂質中，包埋有心磷脂與龍膽酸甲酯的脂質體所組成。
在另一具體例中，，1-肌肽則會因為其之水溶性以及其所具有之保護心磷脂免於由於該脂質體的水性中心所造成氧化損害的能力，而被用來作為一抗氧化劑。因此，在一具體例中，該脂質體的水性中心係包含有1-肌肽。在進一步的具體例中，該脂質體的雙層磷脂質係包埋有心磷脂與龍膽酸甲酯，而該脂質體的水性中心則包含有1-肌肽。
在另一具體例中，包埋於本發明的一脂質體中之一 抗氧化劑，可以是一在粒線體中所發現之抗氧化劑，譬如舉例來說，麩胱甘肽。其顯示當麩胱甘肽係被人工地自細胞中移除的時候，氧化損害就會增加。在粒線體中之麩胱甘肽含量可能甚至是比該細胞的其它部分中之穀麩甘肽含量更為重要。比起在細胞的其它部分中，粒線體的麩胱甘肽含量會隨著年齡更為減低。此一減低現象似乎會使得粒線體對於氧化損害更為敏感。
抗壤血酸(也就是維生素C)與維生素E(也就是生育酚)，係為可以隨著心磷脂而一起包埋於本發明的脂質體中之抗氧化劑的其他具體例。應該要瞭解的是有許多其他的抗氧化劑都可以被包埋於本發明的脂質體中。
脂質體
依據本發明，心磷脂(或許與抗氧化劑一起)係使用一脂質體而輸送至該粒線體。脂質體已知係為用於化妝品與皮膚用產品中的局部應用之有效的藥物輸送系統。明確地說，脂質體係為一具有以雙層磷脂質所組成之膜的球狀小囊。脂質體可以由包括具有混合的脂質鏈的天然衍生之磷脂質的許多種磷脂質所組成，該脂質鏈例如有磷脂醯乙醇胺，或類似DOPE(二油醯磷脂醯乙醇胺)之純物質成分。脂質體係典型地在尺寸上很小(介於大約25至1000 nm的範圍中)。脂質體係為由雙層磷脂質所組成之密閉結構，並且可以在其等之水性核心中包覆水溶性、親水性的分子，並且在該雙層膜的厭水性區域中包覆油溶性、厭水性的分子。第3圖例示說明脂質體的一般性結構。大體而言，脂質 體可以是電中性的、負電性或是正電性的。舉例來說，一正電性脂質體可以由一含有磷脂醯膽鹼、膽固醇、心磷脂與磷脂醯絲胺酸的溶液來形成。脂質體可以是多層狀小囊與單層狀小囊之混合物。
脂質體的該雙層脂質可以與例如細胞及/或粒線體的膜之其他雙層膜融合，藉以輸送該脂質體的內含物。然後，在一具體例中，本發明可以藉著與一粒線體的膜融合並將所包埋的心磷脂輸送至該粒線體，而在維持、回復或修復粒線體及/或粒線體膜上達成改善效果。
如上述所解釋的，脂質體係由磷脂質所組成。磷脂分子具有一本質上係為親水性的“頭部基團”，以及一由兩個醯基鏈所組成之厭水性“尾部”。磷脂質的水性溶解度係依據該厭水性尾部的長度與該頭部基團的親和力而決定。舉例來說，每個醯基鏈包含有14個或更多個係為直鏈(未分枝)的飽和C-C形式之碳的純粹脂類係為非水溶性的。通常，隨著該脂類的醯基鏈長度增加，該臨界微胞濃度值會快速地減低。
本發明的脂質體可以主要地由出現在細胞膜中之包括磷脂質、神經醯胺、鞘脂類、膽固醇和三酸甘油酯的脂類，或是其他例如來自植物的植物固醇類之脂類所組成。在一具體例中，用於本發明中之脂質體可以主要地由磷脂醯膽鹼(或卵磷脂)所組成。磷脂醯膽鹼係為一種磷脂質，其為細胞膜的主要成份。磷脂醯膽鹼也被稱為1,2-十六醯-sn-甘油-3-磷酯醯膽鹼、PtdCho與卵磷脂。未飽和磷脂醯膽鹼 包含有膽鹼、Ω-6未飽和脂肪酸(例如亞油酸)、Ω-3脂肪酸(例如γ-亞油酸)以及低含量(或是不含有)的剩餘甘油酯。第4圖顯示磷脂醯膽鹼的化學結構。磷脂醯膽鹼對於正常的細胞膜之組成與回復係為重要的。
明確地說，磷脂醯膽鹼在維護細胞膜的完整性中之角色，對於包括有在細胞內由DNA至RNA至蛋白質資訊流、細胞能量的形成，以及細胞間的溝通或是訊息傳導之所有的基本生物流程係為重要的。磷脂醯膽鹼(特別是富含有多元未飽和脂肪酸之磷脂醯膽鹼)會在細胞膜上展現顯著的流動性效果。細胞膜的流動性減低與細胞膜完整性的崩解，以及細胞膜修復機制的損傷，係與包括肝病、神經疾病、各種不同的癌症與細胞死亡之一些病變有關。
因此，本發明之組成物的具體例(明確地說在該脂質體係主要地由磷脂醯膽鹼所組成時)之附加優點，在於該脂質體可以將額外的磷脂醯膽鹼提供至細胞與粒線體的膜。
脂質體研究的進展已經可以使得脂質體能夠避免被身體的免疫系統(特別是，網狀內皮系統(RES))發現。此等脂質體係被稱為知道作為“隱形脂質體(stealth liposomes)”，並且係以PEG(聚乙二醇)包覆而加以建構。該在身體中係為惰性的PEG包覆層，允許其在該藥物輸送機制中具有較長效的循環壽命。因此，本發明的組成物可以是一主要地由磷脂醯膽鹼所組成之脂質體，並且其可以係包埋有心磷脂(例如四油醯基-心磷脂)與至少一抗氧化劑(例如龍膽酸甲酯及/或1-肌肽)，且其可以額外地包含有一 PEG“隱形”包覆層。除了PEG包覆層之外，本發明之隱形脂質體也可以與一可以與進行輸送之目標位置結合之配體連接。
在一皮膚保養或化妝品產品中，脂質體可以在例如血清、乳液、凝膠或乳霜中的適當基質中進行調配。較佳地，本發明的脂質體並不會在表面活化劑存在下進行製備。的確，在製造本發明的脂質體時，習於此藝者將會瞭解脂質體之主要的不穩定因素包括有表面活化劑、體溫、酸鹼度以及脂類的過氧化反應。因此，其應該進行適當的照顧以將這些不利影響減到最低。
應該要瞭解的是本發明之脂質體可使用許多種技術來製造並且/或是由許多種來源而取得。舉例來說，本發明的脂質體可運用微射流技術(microfluidization)、配置於水中的脂類之超音波處理，或是在一使用例如卵磷酯之乳化劑的乳化液中形成微胞而加以製造。在其他的具體例中，本發明之脂質體可以取自於Centerchem,Inc.(Norwalk,CT)or Lipotech(西班牙)等公司。
使用該微射流技術來製造本發明之脂質體的一個優點，在於其可以持續大量生產脂質體的能力。該微射流技術不需要以任何的有機溶劑來溶解脂類；並且這一技術可以使用配置於水相中之高濃度的脂類。結果，微射流作用可以被用於例如本發明之化妝品的應用中。
更明確地說，該微射流技術係與在一微射流均質機中導入淤漿狀濃縮脂類/水分散液，其係以一非常高的壓力 (10,000至20,000 psi)來泵送該分散液通過一孔徑尺寸為1-5μm的濾膜。該流體係在一非常高的速度下，藉著將其壓迫通過二已被界定之的微通道而區分為二條流體流。這二條流體流然後於非常高的速度下以直角進行碰撞。藉由該高壓力與高速度所導入之巨大能量，會使得該脂類本身自組裝成脂質體。在最後所收集的流體係被再次通入直到其得到一均質狀分散液。
如上所述，脂質體也可以藉著將磷脂質在水中進行超音波處理來產生。低剪切率可以形成多層狀小囊之脂質體，其像洋蔥一樣具有許多層次。持續的高剪切率超音波處理則易於形成較小的單層狀小囊脂質體。在此一技術中，該脂質體含量可以與水相的含量相同。
表I(如下所示)顯示一些脂質體的具體例，其包括了其等之尺寸、一般製備方法、對應的大約封裝體積、封裝效率，以及POPC(1-棕櫚醯，2-油基磷脂醯膽鹼)分子之計算值。實際的包覆體積或是封裝效率係隨著脂質體的製備方法、該液體種類以及該有效成分本身而有不同。負載量的類型與數量會影響該脂質體之穩定性。該油溶性分子的封裝效率係接近於100%，因為這些分子(例如心磷脂)係屬於該雙層膜之厭水性區域。在表I之最後一欄中顯示每一特定尺寸之POPC脂質體的POPC分子的該計算值。表I也例示說明該主要的熱相變溫度(thermal phase transition temperature；Tm )，其對於選擇用於形成該脂質體的脂類類型而言係為重要的參數。其也可以被用來決定該脂質體的 適當儲藏條件。
厭水性與親水性分子都可以被包埋於脂質體內。如果水溶性分子係在脂質體的製備過程期間進行包埋，這就叫“被動裝載”。其可以將該親水性分子預先溶解於一欲被用來於該乾燥脂類的水合作用中的緩衝液中而達成。之後，任何未被包埋之分子可以藉著相對於空白緩衝液之透 析作用，或是藉著將該分散液通過SephadexTM 凝膠層析柱而移除。對大多數之化妝用與個人保養產品而言，未被包埋分子之移除並未被視為是關鍵的，因為此等處理係需要較高的費用，而化妝品的分子在其等常用之含量下係不具毒性的。
與被包覆於該脂質體的核心中之親水性分子相反地，厭水性分子係典型地被包覆於該雙層脂質的厭水性區域中。該製程包括有一液相分配方法，其中該厭水性分子係隨著該脂類而溶解於一適當的有機溶劑中。之後，該溶劑係藉由抽真空而移除，然後接著進行該脂類的水合作用。如果該分子係可以溶解在乙醇中，其可以隨著該脂類一起溶解於乙醇中；然後以乙醇注射方法來產生脂質體。在主動裝載作用中(其也被稱為反向裝載作用)，在該脂質體的內側與外側之間首先會產生酸鹼值或離子梯度。“空白”(中空)脂質體係首先在一低酸鹼值中製備(檸檬酸鹽緩衝液，酸鹼值=~4)。其後，一包含有該活性成分(例如弱有機酸)之高酸鹼度(酸鹼值=~7.4)緩衝液，然後被添加至該空白脂質體。結果使得該例如弱酸之活性成分，會由於該酸鹼值梯度而分配至該內部核心中。
會影響在該脂質體中包埋分子的效率之因素，包括有用於脂質體製備之脂類組成物、脂質體(SUV/LUV/MLV)的類型、脂質體製備方法以及脂質體電荷。緩衝液強度(較高強度之緩衝液可以減少所產生之封裝的數量)以及被包埋之分子的性質，也是影響該封裝效率的重要的因素。水 溶性負載量(源自於與該脂類頭部基團的相互作用)以及厭水性負載量(源自於與該雙層膜之脂肪醯基鏈的相互作用)兩者都會影響該雙層脂質之分子封裝作用。最後，這些因素都會影響脂質體的穩定性。大約為6.5之酸鹼值對於具有最佳的穩定性之脂質體的製備來說係為較佳的。
本發明之組成物
因此，本發明的組成物包含有一包埋有心磷脂與至少一抗氧化劑的脂質體，並且對於維護、回復或改善粒線體的功能及/或修復粒線體膜而言係為有效的。應該要瞭解的是本發明的組成物可以包含有例如水、蓖麻油、乙二醇單丁醚、二甘醇單乙醚、玉米油、二甲亞碸、乙二醇、異丙醇、大豆油、甘油醇、可溶性膠原蛋白或是高嶺土之添加劑。
更明確地說，本發明的組成物可以另外包含有一或更多的濕潤劑，其包括有但不限於：鄰苯二甲酸二丁酯；可溶性膠原蛋白；山梨糖醇；或是2-吡咯酮-5-羧酸鈉。可能被用來實施本發明之濕潤劑的其他具體例可以參見CTFA化妝品成份手冊(CTFA Cosmetic Ingredient Handbook)，其之相關內容部分係在此被併入以供參考。
進一步來說，本發明的組成物可以另外包含有一或更多的軟化劑，其包括有但不限於：丁-1,3-二醇；棕櫚酸鯨蠟酯；聚二甲基矽氧烷；單蓖麻油酸甘油酯；單硬脂酸甘油酯；棕櫚酸異丁酯；硬脂酸異十六烷酯；棕櫚酸異丙酯；硬脂酸異丙酯；硬脂酸丁酯；月桂酸異丙酯；月桂酸 己酯；油酸癸酯；肉荳蔻酸異丙酯；乳酸月桂酯；十八-2-醇；辛基三甘油酯；羊脂酸三甘油酯；聚乙二醇；丙-1,2-二醇；三甘醇；芝麻油；椰子油；紅花油；月桂酸異戊酯；壬苯醇醚-9；泛醇；氫化蔬菜油；醋酸生育酚酯；亞油酸生育酚酯；尿囊素；丙二醇；花生油；蓖麻油；異硬脂酸；棕櫚酸；亞油酸異丙酯；乳酸月桂酯；乳酸肉荳蔻酯；油酸癸酯；或是肉豆蔻酸肉荳蔻酯。可能被用來實施本發明之軟化劑的其他具體例可以參見CTFA化妝品成份手冊(CTFA Cosmetic Ingredient Handbook)，其之相關內容部分係在此被併入以供參考。
在進一步的具體例中，本發明的組成物可以另外包含有一或更多的滲透增強劑，其包括有但不限於：例如2-吡咯酮之吡咯酮；例如乙醇之醇類；例如癸醇之烷醇類；例如丙二醇、雙丙甘醇、丁二醇之甘醇類；或是萜類。
本發明的組成物也可以包含有各種不同的已知的傳統化妝品用佐劑，只要其等不會對由該組成物所提供之粒線體的維護、改善、回復與修復功能。舉例來說，本發明的組成物可以進一步包括有一或更多的添加劑或是在此技藝中已知的其他可選擇成分，其包括有但不限於填料(例如固體、半固體、液體，等等)；載體；稀釋劑；增稠劑；凝膠劑；維生素、類視黃醇與視黃醇(例如維生素B3、維生素A等等)；色素；芳香劑；防曬乳液和防曬霜；磨砂膏；皮膚調理劑；滋潤劑；神經醯胺、偽神經醯胺(pseudoceramides)、磷脂質、鞘脂類、膽固醇、葡萄糖胺， 藥學上可接受的滲透劑(例如，n-癸基甲基亞碸、卵磷脂有機凝膠、酪胺酸、離胺酸，等等)；防腐劑；抗微生物藥劑；例如脯胺酸之胺基酸、吡咯酮羧酸、其之衍生物與鹽類、異構寡糖、泛醇、包含有例如三乙醇胺或氫氧化鈉之鹼類的緩衝液；例如蜂蠟、地蠟、石蠟；例如蘆薈、矢車菊、金縷梅、接骨木或黃瓜之植物萃取物以及其等之組合。其他適當的添加物及/或附加劑係被描述於美國專利第6,184,247號，其之整體揭示內容係在此被併入以供參考。
本發明的組成物也可以包括有額外的惰性成分，其包括有但不侷限於共溶劑與賦形劑。可以使用的共溶劑包括有酒精和多元醇、聚乙二醇醚、醯胺、酯類，其他適當的共溶劑以及其等之混合物。本發明的組成物也可以包括有賦形劑或是例如甜味劑、食用香料、食用顏料、抗氧化劑、防腐劑、螯合劑、黏度調節劑、張力調節劑(tonicifiers)、氣味物質、乳白劑、懸浮劑、膠合劑之添加劑以及其等之混合物。
習於此藝者瞭解其他可以被包含在本發明的組成物中之添加劑，且其係被包含在本發明的範圍中。
給藥模式
本發明的組成物可以口服地進行給藥、以注射來進行給藥或是局部地進行給藥。一般來說，本發明的組成物係至少以每日為基礎來進行給藥。本發明的組成物之給藥作用可以持續任何一段適當的時間。應該要瞭解的是，化妝品的強化程度以及維護、改善、回復或修復粒線體的程 度，將直接地隨著該組成物被使用的總量與頻率而改變。
有效的劑量形式可以藉著習於此藝者所瞭解之方法和技術來加以製備，並且在產生適當的劑量形式時可以包括使用額外的成分。在一具體例中，本發明之一配方係至少每天一次來局部地進行給藥，該配方係將包埋有心磷脂之本發明的脂質體與至少一抗氧化劑結合。在另一具體例中，該配方可以每日進行給藥兩次。在一進一步的具體例中，該配方可以每日被進行給藥3-5次。在另一具體例中，該配方並未限制每日可以進行給藥之數量。
前面的詳細說明應被視為例示說明而非限制。本發明係藉著以下的實驗研究與具體例來進一步例示說明，其等不應該被解釋為限制條件。所有在本專利各處所引述之參考文獻、專利與出版物的內容，均係在此被併入以供參考。
各種具體例 具體例1：對氧化壓力的防護作用之測量
在此一實驗中所描述的檢測方式，可以測量在該粒線體裡面所出現之氧化壓力。如上述所討論的，粒線體用來產生能量生成ATP分子之生物化學反應，也會產生係為一副產物之高度氧化的超氧化物自由基。使用流式細胞測量術，下述具體例可以藉著監測在以測試材料處理後之粒線體裡面的超氧化物之狀態，來測量各種不同測試樣本對氧化壓力所提供的保護作用。
MitoSOX Red粒線體超氧化物指示劑(Invitrogen cat # M36008)係為一種會被粒線體選擇性地吸收之螢光染料。一旦位在該粒線體中，MitoSOX會與超氧化物自由基反應而形成一與粒線體的核酸結合之螢光產物(激活/發光最大值=510/580 nm)。較高的螢光讀數係對應於在粒線體裡面所出現之較高含量的超氧化物自由基。
細胞培養：每個樣本都使用一6孔培養板。其可以同時地準備多個培養板。參考描述一培養板的表II。THP-1單核白血球(ATCC cat# TIB-202)係以1.5 x 106 個細胞/孔來培養於6孔培養板(包含有2毫升/孔之補充10% FBS的RMPI 1640培養液)中，並在進行處理之前先培養1個小時。
處理：麩胱甘肽單乙酯(GMEE，最終濃度為100 μM)係被用來作為一正向控制組。更明確地說，該正向控制組 係藉著將4毫克的麩胱甘肽單乙酯溶解於10毫升培養液(以10% FBS補充的RMPI 1640培養液)中來產生一1.2毫莫耳儲存溶液而加以準備。該正向控制組工作溶液(300 μM)然後係藉著將2.5毫升的儲存溶液加入至7.5毫升的培養液中而加以製備。一毫升的該正向控制組工作溶液係被加入至該培養板的一孔中，而得到最終處理濃度係為100 μM之麩胱甘肽單乙酯。
負向控制組與正常控制組係藉著將1毫升的培養液(以10% FBS補充之RMPI 1640培養液)，加入至在該培養板上之指定孔(每一控制組1個孔)中而產生。
該測試樣本可以藉著將100毫克的測試樣本置於15毫升的拋棄式離心管內，並加入10毫升之去離子H2 O，而產生一濃度為10毫克/毫升之樣本儲存溶液來加以製備。在此一具體例中，該測試樣本包括有：四油醯基心磷脂、四肉荳蔻基心磷脂、Neolipin®心磷脂、L-肌肽以及龍膽酸甲酯(一培養板中有每一種樣本)。該樣本儲存溶液然後被依序稀釋得到一係為300 pg/毫升的樣本工作溶液。然後，1毫升的樣本工作溶液係被加入至在該培養板上之其餘三個孔(重複三個孔相同)中，而在每個樣本孔中得到係為100 μg/毫升之最終樣本濃度。
然後將該包含有測試樣本與控制組之培養孔的培養板，於37℃，5%CO2 下培養3小時。
逆境：在培養之後3小時，在含有該測試樣本、正向控制組和負向控制組的培養孔中之該等細胞，係藉由導入 一逆境溶液來進行氧化壓力處理。該逆境溶液係依據以下方式來製備：852 μl 8.8 M H2 O2 +4.15 ml培養液(=1.5 M H2 O2 ) 1 ml 1.5 M H2 O2 +9 ml培養液(=150 mM H2 O2 ) 1 ml 150 mM+30 ml培養液(=5 mM H2 O2 )1毫升之5毫莫耳的H2 O2 係被添加至該培養板中除了正常控制組以外的所有培養孔中。1毫升的培養液(以10% FBS補充的RMPI 1640培養液)係被添加至該正常控制組培養孔中。該培養板然後於37℃，5% CO2 下培養3小時。
染色：在以該逆境進行培養之後，所有培養孔的全部內含物都被轉移到流式細胞測量管，並且以100 x g離心分離5分鐘。在細胞上方的培養液移除，而該等細胞然後藉著將1毫升的MitoSOX(5μM)加入至每個測量管以進行染色。明確地說，MitoSOX染劑係藉著以每一小瓶使用13 μL的DMSO來溶解2小瓶的MitbSOX(每小瓶50 μg，Invitrogen cat # M36008)，而產生每一小瓶為5毫莫耳之溶液(mw=760 g/mole)。這兩個小瓶的內含物係被轉移到26毫升之培養液(5 μM)中。該等細胞係在黑暗中於室溫下進行染色15分鐘。
流式細胞測量術：在染色之後，該樣本係運用488 nm激發雷射與FL2 588 nm發散濾波器，而以流式細胞測量儀(舉例來說Becton-Dickinson FAGS Caliber)來進行分析。該資料係被線性化成一由該負向與正常控制組之反應來所界定之曲線(0%防護效果=未經處理的/逆境負向控制組， 100%防護效果=未經處理的/未以逆境處理之正常控制組)。在這些情況下，該正向控制組(100 μM麩胱甘肽甲基酯)可以對氧化壓力提供35%之防護效果。
結果：此一實驗的結果係被描述於下列表III中。該結果證明，四油醯基-心磷脂可以對氧化壓力提供平均為97%之顯著保護效果。
具體例2：ATP含量的測量
細胞的ATP含量係為細胞的與粒線體的健康情況的一指標。如在此具體例中所解釋的，ATP含量可以藉著一會在與ATP存在下產生光之與ATP有關的螢光素來監測。所產生的光之數量係直接地與所存在之ATP含量成比例。
CHO-K1(中國倉鼠卵巢)細胞係自ATCC(Manassas,VA)(細胞存取編號# ATCC CCL 61)購買。細胞培養係以每孔1 x 104 個細胞，而在一96孔不透明培養板中建立。在其黏附之後，該細胞係被轉移到低葡萄糖培養液(1 g/l)並培養隔夜。在低葡萄糖培養液中所培養的細胞係具有較低之ATP含量。
在隔夜培養之後，該細胞係暴露於t-丁基-過氧化物(1毫莫耳)下2小時以誘發細胞的逆境。過氧化物會將ATP的 含量減低至比單獨僅有葡萄糖更低，而模擬一受損傷之細胞狀態。在暴露於過氧化物之後，新鮮的低葡萄糖培養液係被加回至該細胞中。在以過氧化物處理的逆境立即之後，該等細胞立刻暴露於測試樣本(典型地，最終濃度為1、10與100毫克/毫升)。該等細胞係於37℃下以測試樣本培養4小時。如在下述的表IV中所顯示的，被運用於此一具體例中之測試樣本包括有1-肌肽；DC龍膽酸甲酯；中空脂質體(僅有心磷脂)；一自AGI Dermatics,Inc.公司(Freeport，NY)取得之裝載有四油醯基-心磷脂，1-肌肽與龍膽酸甲酯之脂質體；以及一自Centerchem,Inc.公司(Norwalk,CT)取得之裝載有四油醯基-心磷脂，1-肌肽與龍膽酸甲酯之脂質體。
此一測試可以在模擬一受損傷細胞狀態之逆境條件之後，針對回復ATP含量之能力來篩選化合物。因此，在將該經逆境處理之細胞以測試樣本來培養之後，該相對細胞ATP含量係依據該製造商之說明書，而運用來自Promega(Madison,WI)之Cel1-Titer Glo試劑來測量。簡單地說，該等細胞係在該培養液被排出該等培養孔時被平衡至室溫。該經稀釋的試劑係被添加至該等培養孔中，並且該培養板係在室溫下培養15分鐘。該螢光強度係在一Wallach培養板讀取器上進行讀取。
計算每個處理組之平均螢光強度，而未經處理的控制組%則藉著將每個測試組之平均值除以該未經處理的控制組而決定。該未經處理的控制組係被當成100%，因此任何高於100%的結果都被視為一細胞ATP含量中之淨正向增 加。此一具體例的結果係被報告於下列表IV與第5圖中。
這些結果例示說明該經裝載的脂質體可以在較低的濃度下，於暴露於氧化壓力中之細胞內增加ATP含量。該僅具有心磷脂之中空脂質體會在較高的濃度下增加ATP含量，而說明被載入脂質體內之其他成分，在低濃度下對於該經裝載的脂質體的功效而言係為重要的。該結果也顯示 該等其他成分在單獨進行測試時僅具有有少量效果。這些結果說明脂質體輸送載體有助於心磷脂和抗氧化劑進入該細胞。
具體例3：脂質體穩定性
穿隧式電子顯微鏡(TEM)係通常被用來確定脂質體的尺寸與形態特性。用來取得一TEM影像之一般常用的樣本製備方法，係為將一滴的該脂質體懸浮液施加於一具塑膠塗層之格柵，然後以磷鎢酸或鉬酸銨來將該材料負染色。結果係為一包埋於負向染色反應中之單層脂質體。
更明確地說，一種用於TEM造影之樣本可以如下述的加以製備，1%水性瓊脂凝膠(w/v)係被塑膠培養皿中並於室溫下風乾10分鐘。以弗姆瓦(Formvar)或膠棉(collodion)塗覆之格柵，係藉由輝光放電作用(glow discharge)而成為親水性，並且該等格柵係係被置於Whatman no.1濾紙上。一滴樣本懸浮液係被設置於每個格柵上。當大部份的液體係在該格柵的周圍被該濾紙所吸收的時候，該格柵係則被轉移到該瓊脂凝膠上30分鐘至1小時，以協助鹽類與液體滲透進入瓊脂凝膠內。
該未經染色之格柵係運用Zeiss-902而以ESI來檢視並拍照。該脂質體應該會出現不連續圓形結構並而且應該不會觀察到叢集現象。
此一方法係被用來確定本發明的脂質體之穩定性的。拍攝TEM照片來確定於儲藏之前以及儲藏和1個月後，在一乳霜配方中之本發明脂質體的尺寸和結構。明確地 說，該被分析之脂質體係主要地由磷脂醯膽鹼所組成，並且係包埋有四油醯基-心磷脂、龍膽酸甲酯與1-肌肽。該TEM照片係在將該脂質體加入至該乳霜配方中立刻之後，以及在大約室溫(50℃)下在該乳霜配方中儲藏1個月之後拍攝。在儲藏之前以及在1個月的儲藏之後的本發明之脂質體的該TEM照片係被顯示於第6圖中。如同這些TEM照片所證實的，該等脂質體在儲藏1個月之後仍維持具有完整膜之獨立而穩定的結構。
上述說係為本發明之較佳具體例。其等可以進行各種不同的改變與變化，而不會背離在隨附之申請專利範圍中界定之本發明的精神和範圍，其應該依照包含有均等論之該專利法的原則來加以解釋。任何以單數形式(舉例來說，使用“一”、“一個”、“該”或是“此”等詞句)來引述之請求元件，不應被解釋為該元件係被侷限於單數。
1‧‧‧嵴
2‧‧‧基質
3‧‧‧粒線體之外膜
4‧‧‧粒線體之內膜
第1圖例示說明一粒線體，其顯示其之(1)嵴、(2)基質、(3)外膜以及(4)內膜。
第2圖係為心磷脂之化學結構的圖式。
第3圖例示說明一脂質體，其顯示其之包括有該脂類的親水性頭部(2)之雙層脂質(1)；該脂類的厭水性尾部(3)；該水性中心(4)；以及在該等厭水性尾部之間的該空間(5)。
第4圖係為磷脂醯膽鹼之化學結構的圖式。
第5圖係為一例示說明使用(a)1-肌肽；(b)DC龍膽酸甲酯1%；(c)中空脂質體(僅具有心磷脂)；(d)具負載脂質體 (也就是負載有1-肌肽、龍膽酸甲酯與心磷脂的脂質體)；以及(e)具負載脂質體(也就是負載有1-肌肽、龍膽酸甲酯與心磷脂的脂質體)，所達成之ATP製造能力曲線圖。
第6圖係為二張以Zeiss-902電子顯微鏡之電子能譜影像(ESI)的TEM影像(相片)的比對。第6(a)圖係為一包含有脂質體之標準乳霜配方的TEM照片(相片)，該脂質體包埋有心磷脂、龍膽酸甲酯與1-肌肽。在6(a)中之該TEM影像(相片)係在該乳霜配方被製備之後不久，於該包含包埋有心磷脂、龍膽酸甲酯與1-肌肽之脂質體的乳霜配方進行任何儲藏作業之前進行拍攝。第6(b)圖係為同一包含有該脂質體之標準乳霜配方的TEM照片(相片)，該脂質體係如第6(a)圖一般包埋有心磷脂、龍膽酸甲酯與1-肌肽，但是第6(b)圖係在該乳霜配方於50℃下儲存1個月在之後才進行拍攝。

Claims (9)

  1. 一種用來改善、維持或是回復粒線體功能之儲存穩定組成物，其包含複數之脂質體，其中每個脂質體具有一由磷脂醯膽鹼所形成之雙層脂質且具有一心磷脂與龍膽酸甲酯被包埋於該雙層脂質中，該心磷脂係選自於由下述所構成之群組：四油醯基-心磷脂、四棕櫚油醯基-心磷脂、四肉荳蔻基-心磷脂或其等之混合物，以及一被容納於該脂質體的一水性中心之第二抗氧化劑，其中該組成物於10℃至60℃的溫度範圍間係穩定的。
  2. 如申請專利範圍第1項的組成物，其中該第二抗氧化劑係為1-肌肽。
  3. 如申請專利範圍第2項的組成物，其中該組成物包含有：介於重量百分比大約0.01和大約10之間的四油醯基-心磷脂；介於重量百分比大約0.01和大約10之間的龍膽酸甲酯；以及介於重量百分比大約0.01和大約10之間的1-肌肽。
  4. 如申請專利範圍第1項的組成物，其中該心磷脂係四肉荳蔻基-心磷脂。
  5. 如申請專利範圍第1項的組成物，其中該心磷脂係四棕櫚油醯基-心磷脂。
  6. 如申請專利範圍第1項的組成物，其中該脂質體進一步包含有下列之一或更多者：膽固醇、膽固醇硫酸酯、神經醯胺、植物固醇類與糖類。
  7. 如申請專利範圍第2項的組成物，其中該組成物係以一乳霜、一乳液、一凝膠、一補充劑、一水包油乳化液、一油包水乳化液、一糊膏或是一噴霧劑來進行局部給藥。
  8. 如申請專利範圍第7項的組成物，其中該組成物進一步包含有一或更多個的一軟化劑、一濕潤劑、一滲透增強劑、一維生素、一芳香劑、一色素以及一滋潤劑。
  9. 一種使用如申請專利範圍第2項之組成物用於製造一藥物的用途，該藥物係用於改善、維持、或回復細胞中粒線體功能。
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