KR20200126208A - 경피 전달용 신규한 슈도 세라마이드 리포좀 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본 발명의 슈도 세라마이드 화합물, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 오레익산을 유효성분으로 포함하는 경피전달용 리포좀 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 리포좀 특히, BAI-ω9CL을 이용한 유사 세라마이드 리포좀은 일반 세라마이드 리포좀에 비하여 안정성이 더욱 증대되며, 일반 세라마이드 리포좀 만큼이나 약물을 피부에 효과적으로 전달할 수 있다.

Description

경피 전달용 신규한 슈도 세라마이드 리포좀{A Novel pseudo Ceramide Liposome for Transdermal Delivery}

본 발명은 경피 전달용 신규한 슈도 세라마이드 리포좀에 관한 것이다.

피부는 표피, 진피, 피하지방층으로 구성되어 있으며, 표피의 각질형성세포는 기저층에서 지속적으로 생산되어 유극층, 과립층, 각질층으로 분화하며 4개의 층을 이루게 된다. 분화과정동안 핵과 세포소기관이 소실되고 수분함량이 감소하면서 죽은 각질세포가 층을 이루어 쌓이면서 피부의 최외각인 각질층이 형성된다. 각질층은 피부의 투과장벽 기능에 있어서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 최근에는 외부의 자극 등에 대해 세포 신호전달의 기능을 한다고 보고되었다.

각질층은 “Bricks and Moltar” 구조로 설명되는데, 각질세포(Bricks)와 그 사이를 채우고 있는 세포간지질(Moltar)로 이루어져 있다. 각질세포는 케라틴 다발로 이루어져 있어 피부에 구조적인 안정성과 탄력성을 주고 천연보습인자의 생성, 항염 세포 신호전달 등에 관여한다. 친수성 물질이 투과하기 쉬운 생체막과는 다르게, 각질세포 간 지질은 세라마이드, 콜레스테롤, 지방산 등의 지질이 다중 층상구조를 이루며 배열하고 있어 수분 및 친수성 물질의 투과를 방지하는 장벽의 역할을 한다. 세포간 지질의 주요 성분인 세라마이드, 콜레스테롤, 지방산은 1:1:1 몰비율로 존재하며, 각 구성성분의 양과 조성 비율이 피부장벽에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

세라마이드는 스핑고이드 염기의 아마이드에 지방산이 결합된 구조로, 사람피부의 세라마이드는 스핑고이드 염기 4종과 지방산 3종의 구성 또는 esterificaion에 따라 12종으로 분류한다. 세라마이드는 세포간 지질 중량의 약 50%를 차지하고 있으며, 세포간 지질 중에서도 손상된 피부에 있어서 중요한 역할을 알려져 있어 많은 연구가 이루어져 왔다. 아토피, 건선과 같은 피부 염증 질환이나 LPS같은 화학물질로 유발된 피부손상을 대상으로 한 연구에서는 병변 부위뿐만 아니라 정상피부에서도 세라마이드의 현저한 감소가 나타났으며, 외인성 세라마이드를 공급할 때 피부장벽 회복 촉진과 경피수분손실량 (TEWL)이 감소한다고 보고되었다. 또한 세라마이드의 감소는 피부장벽 기능의 이상, TEWL의 증가, NMF양의 감소, 염증성 사이토카인 유발도 연관되어 있다고 보고되었다. 세라마이드의 감소는 Glucosylceramidase 및 shhingomyelinase와 같은 세라마이드 합성효소의 감소와 ceramidase 등에 의한 세라마이드 대사가 비정상적으로 증가하였기 때문이라고 보고되고 있다.

세라마이드는 피부 손상에 있어서 치료효과뿐만 아니라 노화에도 효과를 나타내 화장품 원료로도 이용하려는 많은 연구가 시도되어 왔다. 그러나 세라마이드는 용해도가 낮아 천연에서 고순도로 추출하기에는 비경제적이며, 제제로 만드는 데도 제한적이어서 합성 세라마이드의 제조 및 세라마이드와 구조적으로 유사한 슈도 세라마이드를 제조하는 연구들이 진행되어 왔다[Park, B. D., 외 J. Invest. Dermatol. 121(4) (2003) 794-801; Chamlin, S. L., 외. J. Am. Acad. Dermatol. 47(2) (2002) 198-208]. 효소를 이용한 바이오 공정으로 합성 세라마이드를 세라마이드-3와 세라마이드를 생산하는 데 성공하여 화장품 원료로 사용하고 있으나, 원가 경쟁력에서 고비용이 소모되는 단점이 있다. 세라마이드는 두개의 사슬을 비대칭 구조로 가지고 있으며, 극성인 헤드그룹에는 아마이드 구조와 함께 주변과 수소 결합이 가능한 구조를 가지고 있다. 세라마이드와 구조적 유사점은 유지하면서 헤드 그룹에 다른 기능을 가진 그룹을 붙여 설계하여 피부장벽으로서의 효능을 그대로 가지도록 하는 슈도 세라마이드들이 개발되었다. 슈도 세라마이드의 최초 개발은 로레알의 Ceramide R⁴이며, 이후 아모레퍼시픽의 PC104, 네오팜의 PC-9S, 가오의 Spingolipid E 등이 보고되었다[] Kim, D. H., 외 Colloids Surf. B Biointerfaces 94 (2012) 236-241; Kang, J. S., 외, Exp. Dermatol. 17(11) (2008) 958-964; Uchida, Y., & Hamanaka, S., Skin Barrier. New York: Taylor & Francis, (2006) 43-64].

약물이나 효능물질이 피부에 흡수되기 위해서는 피부 표피층의 최외각에 존재하는 각질층을 먼저 투과해야 하는데, 각질층은 외부물질의 흡수에 있어서 장벽으로 작용하기 때문에 통과하기가 쉽지 않다. 그래서 피부 통과를 촉진하는 여러가지 물리적인 기술 및 효율적으로 약물을 전달하기 위한 제형 개발 등 경피약물전달시스템 (TDDS)이 개발이 이루어지고 있다. 각질층을 통과하는 경로는 각질세포를 통과하는 transcellular pathway, 세포간 지질층을 통과하는 intercellular pathway, 모공이나 땀샘 등을 통과하는 follicular pathway 세가지 통로가 있다[21]. 각질세포를 통과하는 경로는 친수성 물질의 통로로 고려된다. 각질세포는 친수성인 단백질로 채워져 있지만 소수성인 CLE (corneocyte lipid envelop)로 둘러싸여 있고, 각질세포와 세포사이를 채우고 있는 세포간 지질층으로 인해 친수성 물질이 통과하는데 문제점이 있다. 대부분의 소수성 약물이나 화장품의 활성물질이 물질 투과경로는 각질 세포간 지질을 통과하는 경로가 가장 효율적인 방법으로 이용되어 왔다. 세포간 지질을 통과시키기 위해 리포좀, 탄성리포좀, 에토좀, SLN, NLC와 같은 지질 기반으로 만들어진 전달체들이 개발되어 왔다[Dwarakanadha, R. P., & Swarnalatha, D. Int. J. Pharmtech Res. 2(3) (2010) 2025-2027; Park, S. N., 외. Korean J. Chem. Eng. 30(3) (2013) 688-692].

리포좀은 인지질로 구성된 구형 소포체로 생체 구성성분으로 이루어져 생체내에서 분해가 가능하고 독성이 낮아 의약품, 화장품, 식품 등의 제조에 널리 이용되어 왔다. 인지질은 양친매성 분자로 구조 특성상 물에 분산되면 자발적으로 내부에 수용액을 포집할 수 있는 구형의 닫힌 이중층 막으로 둘러싸인 소포체를 형성한다. 지질 이중층 막 구조로 인하여 포집물질과 화학적 결합 없이도 코어에는 수용성 물질을 담지할 수 있으며, 지질막에는 지용성 약물을 녹이거나 분산하여 포집하여, 친수성 물질과 소수성물질을 모두 담지할 수 있다는 장점이 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 계면활성제, 당지질, 세포막 단백질 등 다양한 물질을 첨가하여 제조가 가능하며, 조성 및 제조방법에 따라 다양한 크기와 다층구조로 제조할 수 있다. 체내에 흡수된 리포좀은 세포막에 융합하여 인지질은 세포막에 약물은 세포내로 방출하게 된다. 이런 장점들에도 불구하고, 리포좀은 물리화학적 불안정성, 정상피부에서 낮은 피부흡수율, 지질의 산화 및 가수분해와 같은 문제점이 지적되어 왔다. 이러한 문제점을 극복하고 리포좀의 효율적인 피부 투과 흡수 및 제형 안전성을 높이기 위해서는 리포좀의 조성, 입자크기, 표면전하, 제타전위 크기 등의 리포좀 특성을 최적화하는 과정이 필요하다. 리포좀 이중층의 안정성은 주로 수화정도, 온도, 아실기의 불포화도, 전하, 콜레스테롤의 존재여부와 같은 지질의 성질에 의해 결정된다고 알려져 있다. 리포좀에 콜레스테롤을 첨가시키면 유동성을 증가시키고, 인지질 분자의 안정성을 증가시킨다고 알려져 있다. 리포좀의 표면전하는 이중층의 융합을 막아주고, 항산화제는 산화를 줄여주며, 콜레스테롤이나 스핑고미엘린은 약물의 유출이나 투과도를 줄여준다고 보고되었다.

Baicalein (BAI)은 약용식물인 황금(Scutellaria baicalensis Georgi) 뿌리에서 발견되는 polyphenolic flavonoid 성분으로, 항산화, 항균, 항염, 항암 등의 효과가 있다고 보고되었다. 피부에서 자외선에 의한 손상에서 항산화 효과 및 피부보호 효과를 나타냈으며, 아토피 피부염에서 피부 염증반응을 감소시키며, 진피세포에서 콜라겐 합성에도 관여한다고 보고되어 있다. 하지만 이러한 유효성분을 피부 깊숙이 전달하여 효과를 더욱 향상시키기 위해서는 약물전달 시스템의 전달체가 필요하다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 경피 전달용 리포좀 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1 내지 3 중의 어느 하나의 화합물, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 오레익산을 유효성분으로 포함하는 경피전달용 리포좀 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화학식 1 내지 3 중의 어느 하나의 화합물: 포스파티딜콜린의 혼합비는 1:2인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 바이칼레인(Baicalein)을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 화학식 1 내지 3의 신규 슈도세라마이드(PO3C, PO6C, PO9C)를 사용하여 피부 구성 성분과 유사한 리포좀을 제조하여 피부장벽의 기능을 할 수 있는 전달체로서의 역할을 확인하였다. 제조한 리포좀의 물리화학적 특성 측정을 통해 신규 슈도 세라마이드의 이중 결합 수에 따른 리포좀의 가장 최적화된 리포좀의 조성비 및 6주 동안의 안정성을 확인하였다. 또한 리포좀에 항산화 효능을 나타내는 바이칼레인을 담지시키고, 약물의 포집효율 및 in vitro 약물방출과 피부투과를 측정하였다. 그 결과 유사세라마이드를 이용한 리포좀이 바이칼레인을 잘 담지하여 피부에 효과적으로 침투되는 것을 확인하였다. 결과적으로 슈도 세라마이드를 이용하여 제조한 리포좀이 체내의 피부장벽으로서의 역할 뿐 아니라 난용성 약물인 바이칼레인을 효과적으로 피부에 투과시키는 전달체로서의 기능을 수행함을 확인하였다.

본 발명에서는 천연 세라마이드의 단점을 보완하기 위해 새롭게 합성된 슈도 세라마이드 (PO3C, 6C, 9C)를 이용하여 유사 세라마이드 리포좀을 제조하였다. PO9C를 이용한 리포좀이 가장 작은 사이즈를 나타내었으며, 특히 PO9C 함량이 PC와 2 : 1일 때 입자 사이즈는130 nm였다. 유사 세라마이드 리포좀의 PC : 세라마이드의 비율에 따른 안정성을 측정한 결과 2:1 이나 2:2 인 경우 일반 세라마이드 리포좀과 비교했을 때보다 비교적 안정성이 증대되었고, ω9CL을 이용한 리포좀의 경우 안정성이 더욱 높게 나타났다. 따라서 리포좀의 입자사이즈가 적당하고 안정성이 증대된 PC : 세라마이드 = 2:1 비율을 최종 선정하여 BAI를 담지하였다. 약물 담지 후에도 유사 세라마이드 리포좀은 일반 세라마이드 리포좀에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 확인하였다. 일반 세라마이드 리포좀(CL)의 포집효율은 78.40%였으며, 유사 세라마이드 리포좀의 포집효율은 80% 이상으로 CL에 비해 증가하였다. 또한 ω9CL을 이용한 리포좀의 경우 가장 큰 포집효율을 나타냈다. TEM을 이용하여 BAI가 담지된 유사 세라마이드 리포좀들의 구형의 형태 및 지질막을 확인하였다. 유사 세라마이드 리포좀에 담지된 BAI의 피부 투과 연구를 진행한 결과, 피부 부위별 투과된 BAI의 양은 일반 세라마이드 리포좀의 경우 각질층(Tape), 표피 및 진피층(Skin)에 존재하는 양 그리고 피부 전체(Transdermal)를 투과한 양은 각각 7.82, 38.59, 49.46 μg/cm³ 였으며, BAI-ω9CL을 이용한 유사 세라마이드 리포좀의 값(8.37, 45.04, 46.31 μg/cm³)과 비슷하였다. 하지만 skin에 존재하는 양은 BAI-ω9CL에서 보다 크게 나타났다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 리포좀 특히, BAI-ω9CL을 이용한 유사 세라마이드 리포좀은 일반 세라마이드 리포좀에 비하여 안정성이 더욱 증대되며, 일반 세라마이드 리포좀 만큼이나 약물을 피부에 효과적으로 전달할 수 있음을 시사한다.

도 1은 슈도 세라마이드(PO3C, PO6C, PO9C)의 분자 구조,
도 2는 슈도 세라마이드 리포좀의 안정성을 나타낸 그림,
도 3은 baicalein을 포함한 슈도 세라마이드 리포좀의 안정성을 나타낸 그림,
도 4는 (A) BAI-CL, (B) BAI-ω3CL, (C) BAI-ω6CL, (D) BAI-ω9CL의 TEM 이미지,
도 5는 baicalein을 포함한 슈도 세라마이드 리포좀의 세포 생존률을 나타낸 그림,
도 6은 1,3-butylene glycol 용액 (1,3-BG), 세라마이드 리포좀 (BAI-CL) 및 슈도 세라마이드 리포좀 (BAI-ω3CL, BAI-ω6CL BAI-ω9CL)을 통한 BAI의 인 비트로 피부 투과를 나타낸 그림,
도 7은 24시간 후 1,3-butylene glycol 용액 (1,3-BG), 세라마이드 리포좀 (BAI-CL) 및 슈도 세라마이드 리포좀 (BAI-ω3CL, BAI-ω6CL BAI-ω9CL) 내에서 BAI 투과 (%)의 비율을 나타낸 그림,(테이프: 각질층, 피부: 표피 및 진피, 경피: 피부를 투과됨).
도 8은 UVB-조사된 HaCaT 세포에서 MMP-1 단백질 발현에 대한 W-3, -6, -9의 효과. 세포를 UVB 조사 (80 mJ/cm²) 전에 기재된 농도의 licoricidin로 전처리하고, UVB 노출 후 72시간에 분비된 MMP-1 레벨을 배양 배지에서 단백질의 웨스턴 블럿을 수행하여 결정하였음.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 목적은 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

본 발명에 사용된 L-α-phosphatidylcholine (from egg yolk, ≥ 99.0%), cholesterol, oleic acid, baicalein, Folin-ciocalteu’s phenol reagent, 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-di-phenytetrazolium bromide (MTT) 및 인산 완충 용액에 사용한 sodium phosphate monobasic (NaH₂PO₄·2H₂O) 및 sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄·2H₂O)는 모두 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 에서 구입하였다. Ceramide-3는 DS-CERAMIDE Y30 제품을 (주)두산글로넷(Korea)으로부터 공급받아 사용하였으며, 슈도 세라마이드 PO3C, PO6C 및 PO9C는 Daebong LS Co.에서 합성된 것을 받아 사용하였다[Lee, N. H., Park, S. H., &Park, S. N., J. Drug. Deliv. Sci. Technol. 48 (2018) 245-252] (도 1). Ethanol, methanol 및 chloroform과 같은 용매들은 Daejung Chemical Co., Ltd (Korea)의 제품을 사용하였고, 증류수는 Milli-Q로 정제하여 사용하였다.

실시예 1: 유사 세라마이드 리포좀의 제조

세라마이드를 이용한 리포좀 제조는 얇은 막 수화법을 이용하였으며, 그 구성성분과 조성은 표 1에 나타내었다. BAI를 담지한 리포좀의 조성은 Table 2에 나타내었다. 구성성분을 용매인 클로로포름-메탄올 (4 : 1) 25 mL에 완전히 용해될 때까지 녹인 후 회전증발농축기를 이용하여 용매를 완전히 제거한 후 필름을 형성시켰다. 형성된 필름에 10 mL의 인산완충용액(phosphate buffer, PB, pH 7.4)을 첨가하여 수화시킨 다음 probe sonicator를 이용하여 10 min 간 균질화시켰다. 그 다음 1.2 μm filter (Minisart CA 26 mm)를 통과시켜서 보관하였다. 제조된 리포좀 제형의 최종 유사세라마이드 농도는 0.2% (w/v)로 하였다.

Molar ratio	PC	Ceramide-3	PO3C	PO6C	PO9C	Chol	OA
CL1	2	0.5				1	1
CL2	2	1	-	-	-	1	1
CL3	2	2	-	-	-	1	1
ω3CL1	2	-	0.5	-	-	1	1
ω3CL2	2	-	1	-	-	1	1
ω3CL3	2	-	2	-	-	1	1
ω6CL1	2	-	-	0.5	-	1	1
ω6CL2	2	-	-	1	-	1	1
ω6CL3	2	-	-	2	-	1	1
ω9CL1	2	-	-	-	0.5	1	1
ω9CL2	2	-	-	-	1	1	1
ω9CL3	2	-	-	-	2	1	1
PC : L-α-phosphatidylcholine, Chol : cholesterol, OA : oleic acid, CL : ceramide liposome, ω3CL, ω6CL, ω9CL :Pro omega-3 세라마이드, Pro omega-6 세라마이드, 및 Pro omega-9 세라마이드에 기반한 슈도 세라마이드 리포좀

표 1은 세라마이드 농도에 의존한 슈도 세라마이드 리포좀의 조성

Molar ratio	PC	Ceramide-3	PO3C	PO6C	PO9C	Chol	OA	Baicalein
BAI-CL	2	1	-	-	-	1	1	0.5
BAI-ω3CL	2	-	1	-	-	1	1	0.5
BAI-ω6CL	2	-	-	1	-	1	1	0.5
BAI-ω9CL	2	-	-	-	1	1	1	0.5
BAI-ω9CL0	2	-	-	-	1	1	0	0.5

표 2는 Baicalein을 포함하는 슈도 세라마이드 리포좀의 조성

실시예 2: 입자 사이즈 및 제타 포텐셜

리포좀의 입자 사이즈는 dynamic light scattering(Otsuka ELS-Z2, Otsuka Electronics, Japan)을 이용하여 측정하였다. 측정 온도는 25 ℃, 산란각은 165°, 광원으로는 argon 레이저를 사용하였다. 평균 입자 크기는 cumulative 분석법으로 나타내었고 분포도는 contin 법을 이용하여 해석하였다. 입자 사이즈는 70번씩 3회를 측정하여 평균을 나타내었다. 제타 포텐셜은 zetasizer (Otsuka ELS-Z2, Otsuka Electronics, Japan)를 이용하였으며 10번씩 3회 측정하였다.

실시예 3: 유사 세라마이드 리포좀의 안정성

제조된 리포좀 제형들의 안정성을 확인하기 위해 리포좀 현탁액을 4주간 4 ℃에서 보관하며 관찰하였다. 4주간 입자 크기, 다분산 지수(polydispersity index, P.I.)값의 변화를 측정하였으며 침전 형성의 여부를 관찰하였다. 입자 크기, P.I. 값 및 제타 포텐셜 측정은 앞서 언급한 방법과 동일하게 진행하였다.

실시예 4: 약물 포집 효율

담지되지 않은 BAI는 0.45 μm 필터를 이용해 제거한 후, 리포좀 현탁액 1 mL를 취하여 에탄올 10 mL를 넣고, sonicate하여 리포좀 막을 파괴시킨다. 회전 증발기를 이용하여 용매를 증발시킨 후 BAI를 1 mL 에탄올에 다시 녹인다. BAI의 농도는 UV-vis spectrometer를 이용하여 UV wavelength nm에서 측정하였고, 표준용액을 이용하여 농도별 BAI의 표준 검정 곡선을 작성한 후 포집된 BAI의 농도를 산출하였다. 이 때 얻은 값을 식 (1)에 대입하여 리포좀의 포집 효율을 계산하였다.

포집 효율(%) =

× 100 (1)

C_i: 처음 넣어준 BAI의 농도

C_e: 포집된 BAI의 농도

실시예 5: 형태학적 관찰

제조된 유사 세라마이드 리포좀들의 형태학적 관찰을 위해 transmission electron microscopy (TEM) (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)을 이용하였다. 샘플을 200-mesh copper grid에 2분간 흡착시키고, 0.2% (w/v%) phosphotungstic acid 용액으로 45s간 염색시킨 후 건조시켰다. 분석은 80 kV에서 수행되었다.

실시예 6: 세포 독성 평가 (Cell Viability Assay)

리포좀을 피부에 적용하기 위해서는 세포 독성이 없는지 확인하여야 한다. 따라서 Methylthiazoldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay를 이용하여 세포 독성을 평가하였다. 96 well-plate에 HaCaT cell을 1 × 10⁴ cells 밀도로 분주하여 하루 동안 5% CO₂, 37 ℃조건에서 in vitro 세포배양을 한 후 리포좀 용액을 분주하였다. 다음날 MTT assay를 이용하여 샘플에 의한 HaCaT cell 생존율을 비교함으로써 세포독성을 평가하였다. ELISA reader를 이용하여 570 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였으며 비 처리군(untreated group)에 의한 흡광도를 음성 대조군(100%)으로 하여 식(2)에 따라 처리군(treated group)에 대한 상대적인 세포생존율을 구하였다.

세포 생존률 (%) =

× 100 (2)

실시예 7: 유사 세라마이드 리포좀의 In Vitro 피부 투과 연구

BAI를 포집한 유사 세라마이드 리포좀의 in vitro 피부투과 연구는 Franz diffusion cells (permegear, USA)를 이용하여 수행하였다. 실험에는 52세 남성의 등 피부를 피하지방과 과도한 조직들을 제거하고 사용하였다. Donor와 receptor phase 사이에 각질층이 위로 향하도록 피부를 고정시켰다. Receptor chamber에 receptor phase (HCO-60 : EtOH : PBS = 2 : 20 : 78, weight ratio)를 채우고 24 h 동안 120 rpm으로 교반하였다. 항온수조를 이용하여 온도는 37 ℃로 유지하였다. 대조군으로는 1,3-BG/PB에 동일 농도로 용해시킨 BAI 용액을 사용하였다. Donor compartment 내 피부에 동일한 농도의 리포좀을 처리하였다. 각 시간당 sampling port를 통해 receptor phase를 채취하였다. 24h 후, 각질층과 피부가 함유하고 있는 BAI의 양을 측정하기 위해 피부의 표면을 PBS 용액으로 세척한 후, 각질층을 3 M scotch tape (Korea 3M)를 이용하여 stripping 방법으로 3회 제거하였다. 이 후 tape와 피부 내에 있는 BAI는 각각 100% 에탄올로 sonication을 이용하여 용해시켰다. 채취된 BAI의 농도는 UV/Vis 분광 광도계를 이용하여 측정하였다.

실시예 8: 유사 세라마이드의 MMP -1 발현 측정

배양 배지 내의 MMPs 발현을 western blot을 통해 분석하였다. 각질 형성 세포를 60 mm dish에 분주하여 70-80% 배양 후, 여러 농도의 W-3, -6, -9을 무혈청 배지에 희석하여 처리하였다. 24 h 배양 후, PBS로 2번 세척하여 PBS를 넣고 UVB 80 mJ/cm2를 처리한 후 무혈청 배지로 교체해주었다. 72 h 배양 후 세포 상층액을 Amicon (Millipore, USA)으로 농축하여 이용하였다. 각각의 배지 농축액을 5 Х loading buffer와 섞어 5 min 동안 끓였다. 10% SDS-PAGE gels에 단백질을 분리하여 PVDF membranes (Millipore, USA)에 transfer 하였다. 5% BSA로 blocking한 뒤, membranes를 1차 항체를 결합하여 24 h, 4 ℃에서 배양하였다. 0.1% Tween-20을 함유한 tris-buffered saline 로 3번 세척 후 horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 이차항체를 1 h 처리하였다. 마지막으로 chemiluminescence reagents (GE Healthcare, USA)로 검출하였고, chemiluminescence imaging system로 감광하였다.

상기 실시예의 결과를 상술한다.

입자사이즈 및 제타 포텐셜

유사 세라마이드(PO3C, PO6C, PO9C)를 이용하여 리포좀을 제조하였고, 일반적인 세라마이드와 비교를 위해 대조군으로 Ceramide-3를 이용한 일반 세라마이드 리포좀(CL)을 제조하여 입자사이즈, polydispersity Index (P.I.) 및 제타 포텐셜을 측정하였다(표 3). 리포좀의 구성성분으로는PC와 콜레스테롤, 세라마이드 및 유사세라마이드, Oleic aicd를 첨가하여 각질층 세포간 지질의 구성성분과 동일하게 제조하였다. 리포좀 제형제조에 가장 적합한 조성을 찾고자 세라마이드 양을 각각 0.5, 1, 2의 비율로 하여 세라마이드 : 콜레스테롤 : 지방산의 조성 비율을 0.5:1:1, 1:1:1, 2:1:1로 각기 달리하여 제조하였다.

일반적으로 리포좀이 피부에 잘 흡수되기 위해서는 100~150nm의 입자사이즈를 가지는 것이 가장 적당하다고 보고되고 있다.

각 리포좀들의 입자사이즈를 비교해 본 결과, PO3C를 이용한 리포좀의 입자사이즈가 현저하게 크게 나타났다. 이는 유사 세라마이드의 이중 결합 수가 증가함에 따라 이중 결합의 꼬임 구조로 인해 지질 분자간 입체 효과가 증가하기 때문인 것으로 사료된다. 또한 PO3C 및 PO6C의 함량이 증가할수록 입자사이즈도 커지는 경향을 보였다. 한편 PO9C를 이용한 리포좀의 경우 PO9C 함량이 PC와 2 : 1일 때 입자 사이즈가 130 nm로 가장 피부에 흡수되기 좋은 크기를 가지는 것으로 나타났다. 이를 통해 우리는 in vitro 피부 투과 연구에서 PO9C를 이용한 리포좀의 피부 투과율이 더욱 증대될 것이라고 예상하였다.

리포좀의 입자크기의 분산정도를 나타내는 다분산지수 (Polydispersity index, P.I.)는 0.3 이하일 경우 단분산, 0.3 이상일 경우 다분산을 나타낸다. 모든 리포좀의 P.I.는 모두 0.3 이하로 단분산을 나타내었으나, ω3CL3은 세라마이드 함량비가 2인 경우에 0.3보다 큰 값을 냈으며, 입자사이즈도 가장 크게 나타났다.

Zeta potential은 리포좀의 표면 전하를 나타내며 정전기적 반발력으로 리포좀 간의 응집을 방해하여 리포좀의 물리적 안정성을 예측할 수 있는 값이다. 일반적으로 -25 mV 이하 값을 나타내면 안정하다고 보고되고 있다. 측정한 리포좀들의 zeta potential은 모두 -25 mV 이하 값을 나타내는 것으로 보아 안정하다는 것을 알 수 있으며, 세라마이드의 함량이 증가할수록 이 값은 약간씩 증가하는 경향을 보였다.

BAI를 담지한 리포좀들의 1일 후 입자사이즈, P.I. 및 제타 포텐셜은 표 4에 나타내었다. BAI 담지 전 리포좀들의 입자사이즈와 비교해 보았을 때, 큰 차이는 없었으며 사이즈가 약간씩 증가하는 경향을 보였다. 또한 oleic acid를 첨가하지 않을 경우(BAI-ω9CL0), 리포좀의 사이즈는 현저하게 감소하였다.

Molar ratio	Particle size (nm)	Polydispersity index (P. I.)	Zeta potential (mV)
CL1	88.97 ±0.85	0.27 ±0.01	-46.40 ±0.50
CL2	146.73 ±0.49	0.25 ±0.00	-47.62 ±0.02
CL3	162.93 ±3.30	0.25 ±0.00	-44.99 ±0.50
ω3CL1	292.50 ±8.22	0.19 ±0.02	-44.91 ±0.68
ω3CL2	453.80 ±3.04	0.20 ±0.02	-43.76 ±0.50
ω3CL3	697.13 ±7.48	0.34 ±0.01	-41.43 ±0.32
ω6CL1	172.20 ±2.90	0.22 ±0.02	-43.51 ±0.61
ω6CL2	193.20 ±2.43	0.16 ±0.02	-44.48 ±0.26
ω6CL3	416.70 ±2.52	0.14 ±0.00	-40.44 ±0.28
ω9CL1	140.40 ±3.21	0.23 ±0.01	-44.47 ±0.55
ω9CL2	130.40 ±1.85	0.19 ±0.01	-44.08 ±0.51
ω9CL3	410.33 ±2.85	0.19 ±0.01	-41.61 ±0.37

표 3은 슈도 세라마이드 리포좀의 평균 입자 사이즈, 다분산 지수 및 제타 포텐셜

	BAI-CL	BAI-ω3CL	BAI-ω6CL	BAI-ω9CL	BAI-ω9CL0
입자 크기 (nm)	146.35 ±0.21	459.40 ±7.14	210.45 ±1.48	137.75 ±0.36	68.9 ±1.24
다분산 지수(P. I.)	0.23 ±0.00	0.14 ±0.02	0.23 ±0.00	0.26 ±0.00	0.24 ±0.03
Zeta potential (mV)	-41.88 ±0.43	-45.54 ±0.11	-39.76 ±0.22	-42.37 ±0.40	-35.07 ±0.34

표 4는 Baicalein를 함유하는 슈도 세라마이드 리포좀의 평균 입자 사이즈, 다분산 지수 및 제타 포텐셜

리포좀의 안정성

제조된 세라마이드 리포좀의 안정성을 평가하기 위하여 4주간 4 ℃에서 보관 후 리포좀의 입자사이즈 변화를 측정하였다(도 2). 일반적으로 리포좀이 불안정할 경우 입자들이 서로 응집되어 평균 입자사이즈가 커지게 된다.

측정 결과 일반 세라마이드 리포좀은 세라마이드 함량이 높을수록 불안정한 경향이 나타냈다. 반면 유사 세라마이드 리포좀의 경우 PC : 세라마이드의 비율이 2:0.5(ω3CL1, ω6CL1, ω9CL1)인 경우에는 오히려 3주 후 입자사이즈 변화가 크게 나타났다. PC : 세라마이드의 비율이 2:1(ω3CL2, ω6CL2, ω9CL2) 및 2:2 (ω3CL3, ω6CL3, ω9CL3)일 때 4주간 입자사이즈의 변화가 작아 안정성을 나타내었다. 이는 유사 세라마이드의 이중결합이 지질막 산화를 억제하여 안정성에 기여했을 것으로 생각된다.

PDI는 3주간 특별한 변화를 보이지 않았으며

3CL3를 제외하고는 0.3이하의 값을 나타냈다.

3주 후 제타 포텐셜을 측정한 결과 CL2, ω3CL2, ω6CL2, ω9CL2가 각각 -52.01, -50.79, -50.75, -44.65의 값을 나타냈다. 1일 후 제타 포텐셜 값(-47.62, -43.76, -44.48, -44.08)과 비교해보았을 때 절대값이 약간씩 증가한 것으로 보아 3주 후 리포좀의 입자가 소량 응집되어 표면 전하가 증가된 것으로 판단된다. 하지만 유의한 변화는 나타나지 않아 제조된 리포좀이 안정된 분산을 이루고 있음을 확인하였다. 한편, 3주 후 CL의 제타 포텐셜 절대값이 가장 큰 것으로 보아 안정성이 낮고 응집이 많이 되었을 것으로 사료된다. 결과적으로 유사 세라마이드의 비율이 인지질과 2:1 이나 2:2 인 경우, 일반 세라마이드 리포좀과 비교했을 때보다 비교적 안정성이 증대되었고, ω9CL의 경우 안정성이 더욱 높게 나타났다. 따라서 리포좀의 입자사이즈가 적당하고 안정성이 증대된 PC : 세라마이드 = 2:1 비율을 최종 선정하여 BAI를 담지하였고, BAI가 담지된 리포좀의 6주간 입자사이즈의 변화를 도 3에 나타내었다. 6주 후 일반 세라마이드 리포좀(BAI-CL) 및 유사 세라마이드 리포좀(BAI-3CL, BAI-6CL, BAI-9CL)의 사이즈는 각각 222.30, 494.02, 245.52, 155.35 nm로 0주차 사이즈(146.35, 459.40, 210.45, 137.75 nm)와 비교해보았을 때 약간씩 증가하였다. 이는 소수성인 유사세라마이의 이중 결합으로 인한 입체적 꼬임구조로 인해 바이칼레인을 담지하는데 부피가 증가했기 때문으로 생각된다. 또한 일반 세라마이드 리포좀 보다 유사세라마이드 리포좀에서 6주간 사이즈 변화가 작게 나타난 것으로 보아 약물 담지 후에도 유사 세라마이드 리포좀이 일반 세라마이드 리포좀에 비해 더욱 증가된 안정성을 가짐을 확인하였다. 또한 oleic acid를 넣지 않은 경우의 리포좀(BAI-9CL0)의 안정성을 측정하였다. Oleic acid는 이중결합을 1개 가지고 있는 C18의 지방산으로 리포좀의 유동성을 증가시키고, 지질 이중층의 산화를 방지하여 리포좀 안정성에 도움을 준다. 측정결과 oleic acid를 넣지 않을 경우 안정성이 파괴되는 것으로 나타나 oleic acid가 리포좀 안정성 증대에 기여함을 확인하였다.

약물 포집 효율

BAI가 담지된 세라마이드 리포좀들의 약물 포집효율(encapsulation efficiency)은 표 5에 나타내었다. 일반 세라마이드 리포좀(CL)의 포집효율은 78.40%였으며, 유사 세라마이드 리포좀의 포집효율은 80% 이상으로 CL에 비해 약간 증가하는 것으로 나타났다. 또한 ω9CL의 경우 가장 큰 포집효율을 나타냈다. 이는 이중결합이 1개인 PO9C를 이용하여 리포좀을 제조할 경우 이중결합으로 인한 지질간 입체효과에 의한 영향이 가장 적기 때문인 것으로 사료된다.

	Entrapment efficiency (%)
BAI-CL	78.40 ± 0.10
BAI-3CL	80.04 ± 0.11
BAI-6CL	81.56 ± 0.10
BAI-9CL	81.71 ± 0.14

표 5는 Baicalein를 함유하는 슈도 세라마이드 리포좀의 포집 효율

형태학적 관찰

BAI가 담지된 세라마이드 리포좀들의 형태학적 분석을 위해 TEM을 이용하였다(도 4). 모든 리포좀들은 dynamic light scattering을 이용하여 측정한 사이즈와 유사하였다. 모두 구형의 형태를 가진 것으로 보아 리포좀이 잘 형성되었음을 알 수 있으며, 리포좀들의 지질막 또한 뚜렷하게 관찰되었다.

리포좀의 세포 독성 평가(Cell Viability Assay)

리포좀을 피부 전달체로 사용하기 위해서는 세포 독성이 있는지를 확인해야할 필요가 있다. 본 연구에서는 HaCaT 세포를 이용하여 BAI와 BAI를 담지한 리포좀의 세포 독성을 평가하였다(도 5). BAI 및 BAI를 담지한 리포좀의 농도 범위는 15.6-250.0 μM로 설정하였다. 그 결과, 약물인 BAI에 의한 세포 독성은 없었으며, BAI를 담지한 리포좀의 세포 독성은 BAI에 의해 영향을 받지 않았다. BAI 62.5 μM까지 모두 세포 생존률이 90 % 이상으로 나타났다. 고농도의 BAI가 담지된 경우, 유사 세라마이드 리포좀에서 세포생존률이 감소되었지만, 이 MTT 분석 결과는 PO3C, PO6C, PO9C를 이용한 유사 세라마이드 리포좀의 실제 적용에 대해 의미 있는 데이터를 제공한다.

Franz Cell을 이용한 In Vitro 피부투과 연구

Franz diffusion cell을 이용하여 유사 세라마이드 리포좀에 담지된 BAI의 피부 투과 연구를 진행하였다. 시간 별 피부 투과된 BAI의 함량은 도 6에 나타내었다. 일반 세라마이드 리포좀에서 시간 별 피부를 투과한 BAI 양이 가장 많았으며, ω9CL의 경우 일반 세라마이드 리포좀과 비슷하지만 약간 적은 투과양을 나타냈다. 그 다음 ω6CL, ω3CL 순으로 BAI의 피부 투과양이 감소하였다. 이는 입자 사이즈의 순서가 ω9CL < ω6CL < ω3CL인 결과와 반대로 나타났으며 입자 사이즈가 피부 투과양에 영향을 미치기 때문인 것으로 사료된다. 피부 부위별 투과된 BAI의 양은 도 7에 나타내었다. 대조군인 1,3 BG의 경우 각질층(Tape), 표피 및 진피층(Skin)에 존재하는 양 그리고 피부 전체(Transdermal)를 투과한 양은 각각 3.60, 16.47, 21.88μg/cm³ 이였다. BAI을 담지한 일반 세라마이드 리포좀에서 약물이 각질층(Tape), 표피 및 진피층(Skin)에 존재하는 양 그리고 피부 전체(Transdermal)를 투과한 양은 7.82, 38.59, 49.46 μg/cm³ 이였으며, BAI-ω9CL의 값(8.37, 45.04, 46.31 μg/cm³)과 유사하였다. 하지만 skin에 존재하는 양은 BAI-ω9CL에서 보다 크게 나타났다. 결론적으로 BAI-ω9CL은 일반 세라마이드 리포좀만큼 약물을 피부에 효과적으로 전달할 수 있음을 시사한다.

MMP -1 발현 억제 효과

MMPs는 중심부에 아연을 갖는 금속 단백질 분해 효소로서 세포외 기질을 분해하며, 그 종류는 구조와 기능에 따라 구분된다. 그 중 MMP-1은 collagen을 분해하는 단백질로, 노화기작에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 MMP-1의 발현에 대한 W-3, -6, -9의 억제 효과를 같은 농도에서 비교하였다. 실험 결과, UVB를 조사하였을 때, 비조사군에 비해 MMP-1의 단백질 발현이 현저하게 증가하였으며, W-3, -6를 전 처리한 경우 억제 효능을 나타내지 않았다. 그에 반해 W-9를 전 처리한 경우 농도 의존적으로 MMP-1의 발현을 저해한 것을 확인할 수 있었다(도 8).

Claims (3)

1. 하기 화학식 1 내지 3 중의 어느 하나의 화합물, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 오레익산을 유효성분으로 포함하는 경피전달용 리포좀 조성물.
   

   

   
   [화학식 1]
   

   

   
   [화학식 2]
   

   

   
   [화학식 3]
   
2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1 내지 3 중의 어느 하나의 화합물: 포스파티딜콜린의 혼합비는 1:2인 것을 특징으로 하는 경피전달용 리포좀 조성물
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 바이칼레인(Baicalein )을 포함하는 것을 특징으로 하는 경피전달용 리포좀 조성물.
   

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