TWI364292B - Glp-1 pharmaceutical compositions - Google Patents

Description

1364292 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於類升糖素胜肽-1之胜肽類似物，其醫藥 可接受之鹽類，利用此類似物治療哺乳動物之方法以及關 於含有該類似物之醫藥組合物用途。 【先前技術】 類升糖素肽-1(7-36)醯胺（GLP-1)是在腸道l細胞中藉 由對升糖素前體前升糖素（preproglucagon)進行組織特異性 後-轉譯處理而合成的 ’（Varndell，J.M.,etal.,J.Histochem Cytochem，1985 :33 :1080-6)且因進食而釋放進入血液循 環。GLP-1的血漿濃度從空腹時約15 prno丨/L上升至餐後 40 pmol/L的高峰值。已證實，當血漿葡萄糖濃度在—定範 圍内升高時，口服葡萄糖導致的企漿胰島素水平升高比由 靜脈投予葡萄糖高三倍（Kreymann, B.，et al., Lancet 1987:2，1300-4)。這種由進食而造成騰島素釋放之增加，已 知為腸促騰島素（incretin effect)效應，主要係由體液調節， 而現在認為GLP-1是人體中最有效的生理性腸促胰島素。 除了促胰島素作用，GLP-1還可以抑制升，糖素的分泌， 延遲胃的排空（Wettergren A.，et al.，Dig Dis Sci 1993 :38:665-73)以及可能會增加周圍組織對葡萄糖的處理 (D Alessio，D.A. et al.，J. Clin Invest 1994:93:2293-6)。 1994年，有人觀察到單一皮下注射（s/c)GLP-l便可以 使非胰島素依賴型糖尿病（NIDDM)患者的餐後血糖完全降 至正常$&圍’便提出GLP-1之治療功效（Gutniak，M.K.，et 1364292 al·’ Diabetes Care 1994:17:1039_44)。這種作用經認為是通 過增加胰島素釋放以及減少升糖素的分泌兩者而予以調 節。再者，亦顯示靜脈注射GLP-1可延遲NIDDM患者的 •餐後胃排空（Williams，B.，et al.’ J. Clin Endo Metab 1996:81:327-3 2)。與磺醯尿素類藥物不同，glP-1的促騰 島素作用係根據血糖濃度（Holz，G.G. 4th，et al，Nature 1993:361:362-5)。因此，在低血糖濃度情況下減低GLP-1-φ 調節之胰島素釋放可保護對抗嚴重的低血糖。此作用的結 合使GLP-1擁有比目前用於治療nidDM的其他藥物獨特 的治療優勢。 許多研究顯示’當給健康人GLP- 1時，能顯著影響血 糖水平以及胰島素和升糖素的濃度（〇rskov, C，

Diabetologia 35:701-71 1, 1992; Holst, J.J., et al.5 Potential of GLP-1 in diabetes management in Glucagon τττ Handbook of Experimental Pharmacology, Lefevbre PJ, Ed. Berlin, _ Springer Verlag，1996, p. 311-326)，而且這些作用都具有葡 萄糖相關性（Kreymann，B.，et al·，Lancet ii:1300-1304，1987; Weir，G.C·，et al·，Diabetes 38:338-342，1989)。再者，對糖 尿病患者同樣有效（Gutniak，M.， N. Engl J Med 226:13 16-1322, 1992; Nathan, D.M., et al., Diabetes Care 15:270-276，1992)’其可將II型糖尿病患者的血糖水平控 制在正常範圍内（Nauck，M.A., et al., Diagbetologia 36:741-744, 1993)，並可以改善I型糖尿病患者對血糖的控 制（Creutzfeldt，W.O·，et al.，Diabetes Care 19:580-586, V L· 可尤八’證實其增加胰島素敏感性/降低騰島素抗性之 胰L二已提出將GUM及其激動劑用於具有發展出非- 好、、賴型糖尿病風險之對象中（參iwo⑼/_7)以 用於治療姓娘期糖尿病(美國專利公開案第2〇〇4〇26667〇 號）〇 矛、前述外，已提出GLIM及其激動劑於嗜乳動物例 如：人類，中尚有許多治療用途，包含，但非限於：改善 學習，加強神經保護’以及/或減輕中樞神經系統之疾病或 病症之症[例如，經由神經生成之調控，以及例如帕金 森氏症、阿滋海莫症、亨丁頓舞蹈症（Huntingt〇n，s

Disease)、ALS、中風、ADD、及神經精神症候群 (neuropsychiatric syndromes)(美國專利公開案第 20050009742及200201156〇5號）；將肝臟幹細胞/原始細胞 轉變為功能性胰臟細胞（WO03/033697);防止p細胞惡化（美 國專利公開案第2004005381.9及20030220251號）以及刺激 β細胞增生（美國專利公開案第20030224983號）；治療肥胖 (美國專利公開案第20040018975號；W098/19698);抑制 食慾及引起飽足感（美國專利公開案第20030232754號）； 治療大腸激躁症（WO 99/64060);降低與心肌梗塞有關之發 病率及/或死亡率（美國專利公開案第20040162241號， WO98/0853 1)以及中風（參見WO 00/16797);治療以缺乏q 波心肌梗塞為特徵之急性冠心症（美國專利公開案第 20040002454號）；減少手術後分解代謝的改變（美國專利第 6,006,753 號）；治療冬眠心肌（hibernating myocardium)或糖 1364292 尿病心肌病（美國專利公開案第20050096276號）；抑制正 腎上腺素的血漿濃度（美國專利公開案第20050096276 號）；增加尿鈉排泄，降低尿鉀濃度（美國專利公開案第 20050037958號）；治療與毒性高血容量症有關之症狀或病 症，例如，腎衰竭、充血性心衰竭 '腎病症候群、硬化、 肺水腫以及高血壓（美國專利公開案第20050037958號）； 引起肌力反應（inotropic response)以及增加心肌收縮能力 φ (美國專利公開案第20050037958號）；治療多囊性即巢症 候群（美國專利公開案第20040266678及20040029784 號）’’/台療呼吸窘迫（美國專利公開案第20040235726號）； 經由非-消化途徑（alimentaryroute)’亦即，經由靜脈、皮 下、肌肉、腹膜或其他注射或滴注改善營養（美國專利公開 案第20040209814號）；治療腎病（美國專利公開案第 20040209803號）；治療左心室收縮功能障礙，例如，具有 異常之左心室射出率（ejection fracti〇n)(美國專利公開案第 _ 2004009741 1號）；抑制十二指腸腔能動性（antr〇 du〇denai motility)，例如，用於治療或預防腸胃病如腹瀉、術後胃傾 倒症及腸激躁症，以及作為内視鏡程序之前置給藥（美國專 •利公開案第2〇〇30216292號广治療嚴重疾病多發性神經病 (critical illness p〇lyneuropathy，CIPN)以及全身性發炎反 應症候群（SIRS)(美國專利公開案第2〇〇3〇199445號）；調節 三酸甘油酯濃度及治療異常血脂症（美國專利公開案第 20030036504及20030143183號）；治療由局部缺血後血流 之再灌注所造成之器官組織損傷（美國專利公開案第 1364292 20020147131號）；治療冠心病風險因子（CHDRF)症候群（美 國專利公開案第20020045636號）；及其他。 然而，GLP-1於代謝上不穩定，在體内血漿半衰期（t^) 僅1至2分鐘。經投予之外源性GLp_丨亦快速地遭分解 (Deacon, C.F.，et al., Diabetes 44:1126-1 131，1995)。此種代 謝上之不穩定限制了天然的GLP-1之治療潛力。曾試圖通 過改善藥物配方來增強GLP-1及其類似物的治療潛力。例 如，國際專利公開案W0 01/57084便描述了生産類 似物晶體之方法，宣稱此種晶體可用於製備醫藥組合物， 例如注射藥物，包括該晶體及醫藥可接受之載體。 GLP 1(7-37)OH之異源性微晶體竊已經可從鹽溶液中培養 出來，並可以鋅及/或間-甲酚進行晶體浸濕處理後對其進行 檢查（Kim and Haren, Pharma. Res. Vol. 12 No. 1 1 (1995))。 含有針狀晶體及非晶態沉澱之GLP(7_36)NH2粗製晶體懸 浮液已由含有辞或魚精蛋白的鱗酸鹽溶液製備（PHdal，e[ al·, International Journal of Pharmaceutics Vol. 136, PP.53-59 (1996))。歐洲專利公開案Ep 〇619322A2中描述了 藉由將蛋白質溶液在pH 7至8.5的緩衝液中與鹽和低分子 量之聚乙二醇（PEG)之特定組合混合來製備微晶體型 GLP-1(7-37)QH的方法。尤其，美國專利第6 566 49〇號描 述了 GLP-1的微晶體種植，宣稱其有助於純化胜肽産物的 製備。美國專利第6,555,521號（US，521)揭示-種具有四角 形扁平杆或平板狀之GLP-i晶體，宣稱其具有經改善之純 度且展現出經延長之體内活性eUS，521認為此等晶體的 1364292 形態相對統一，在懸浮液中停留的時間比之前的晶體簇和 非晶態晶體懸浮液長，宣稱該晶體會快速沉降、聚集或凝 集，阻塞注射器針頭，使劑量更無法確定。 已提出一種生物可分解之聚[(dl-乳酸-共-甘醇酸）-β-乙二醇-β-(-乳酸-共-甘醇酸）]之三段式共聚物其可用於 GLP-1之經控制之釋放調配物。然而與其他聚合物系統相 似，三段式共聚物之製造涉及複雜之程序以及會形成不均 勻之粒子。 同樣地，亦已提出一種生物可分解.之聚合物，例如， 聚（乳酸-共-甘醇酸）（PLGA)，用於胜肽之持續性遞送調配 物。然而此技藝中已不贊成使用此等生物可分解之聚合 物，因為這些聚合物於製造時通常難溶於水且需要水-不混 溶之有機溶劑，例如二氣甲烷，以及/或嚴格的製備條件。 此等有機溶劑以及/或嚴格的製備條件經視為可能會對有 興趣之胜肽或蛋白質增加誘發構型改變之風險，造成結構 元整性之降低且危及生物活性（Choi et al.，Pharm. Research V〇l· 21，No· 5,（2004))。聚二醇醚共聚物具有同樣的缺點。 (同上）。 前述參考文獻中所描述的GLP-1組合物，於製備GLP 類醫藥調配物時不夠理想，因為其易於含有雜質以及/或另 一方面不易重複性生產以及給藥。此外，已知GLP類似物 在高濃度時會令人感覺噁心，所以需要提供持久的藥效， 同時降低初始的藥物血漿濃度。因此’需要一種Glp _ 1調 配物’其可以更簡單且可靠地生產製造、更簡單且可重複 1364292 地給藥，以及可提供經降低 非所欲之副作用。 的初始 ▲•漿濃度以減少或消除 【發明内容；3 因此， 如式（I) 本發明經㈣於下列段落以及中請專利範圍。 發月之帛個目的為提供一種醫藥組合物其包括 之GLP -1類似物： (Aib 8’35)hGLP -1(7-3 6)NH2 (I) 或其醫藥可接受之鹽’其中該組合物之調配物可提供 優異之製造、投藥、藥物動力學及藥力學特性，以及經減 弱之不良副作用。 於該第-目的之第-方面，本發明提供一種醫藥組合 物’其具有經改善之藥物釋放側繪，較佳為具有經降低之 初始突釋（initial burst)。 於該第一目的之第二方面，本發明提供一種醫藥組合 物’其包括具有經延長作用時間之式（1)化合物。 於該第一目的之第三方面，本發明提供一種醫藥組合 物，其包括式⑴化合物或其醫藥可接受之鹽以及醫藥可接 受之載劑或稀釋劑。較佳地該載劑或稀釋劑包括水。 於該第一目的之第三方面之第一較佳具體實施例中， 該醫藥組合物進一步包括鋅。更佳地，該醫藥組合物中鋅 之濃度係自約0.0005 mg/mL至約50mg/mL。甚至更佳地， 該醫藥組合物中鋅之濃度係自約〇.〇i mg/mL至約〇.50 11 1364292 mg/mL。更佳地，該醫藥組合物包括稀釋劑，其中該稀釋 劑包括醫藥可接受之水溶液。該稀釋劑包括無菌水。 更佳地，該醫藥組合物包括水性混合物、懸浮液或溶 液，其中該式（I)化合物之濃度為約〇.5%-30% (w/w)。 更 佳地，該水性混合物、懸浮液或溶液中該式（I)化合物之濃 度為約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、 20% ^ 21% ' 22% ' 23% ' 24% ' 25% > 26% ' 27% ' 28% ' 29%、或30°/〇 (w/w)。更佳地，該水溶液中該式（I)化合物之 濃度為約 1 %、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、1 0%、 11%、14%、15%、16%、19%、20% ' 21%、22%、23%、 24%、25%、26%、29%、或 30% (w/w)。更佳地，該水溶 液中該式（I)化合物之濃度為約1 %、2%、3%、4%、5%、6%、 9%、10%、11%、22%、23%、24%、25%、或 26% (w/w)。 甚至更佳地，該水溶液中該式（I)化合物之濃度為約1 %、 2%、3%、4%、5%、6%、10%、22%、23%、24%、25%、 或26% (w/w)。又更佳地，該水溶液中該式⑴化合物之濃 度為約 1%、2%、5%、10%、23%或 25% (w/w)。「約」係 指下列：於濃度方面約0.5%至約4%，目標值之士 0.5%為所 欲之範圍（例如，0.5%至1.5%為約1%);於目標濃度方面約 5%及更咼，目標值之20%為所欲之範圍（例如，8%至丨2〇/〇 為約10%) 於該第一目的之第三方面之第二較佳具體實施例中， 該醫藥組合物進一步包括鋅，其中該醫藥組合物中該式⑴ 12 1364292 化σ物對鋅之莫耳比範圍係自約6 : 1至約1 : 1。更佳地， 該比例範圍係自約5.5 : i至約i :】。又更佳地該比例範 •圍係自約5.4 . 1至約1.5 : !。甚至更佳地，該比例係自約 • 4 1 4.〇 . 1，或1 5 : 1。最佳地，該比例為約1.5 : 1。 於本發明之此方面中約係指15: i之各目標值土1〇%之比 例因此所預期之比例包括，例如1.3 5 -1.6 5 : 0.8 5 -1.1 5。 較佳地，於本發明之第一目的之第三方面之第二較佳 • 具體實施例中，該醫藥組合物中[Α^8,35]1^υΜ(7-36)ΝΗ2 •之濃度為約（重量/體積）以及[Aib8,35]hGLP-l(7-36)NH2 對鋅之莫耳比為約1.5 : 1。亦較佳地，於本發明之第一目 的之第三方面之第二較佳具體實施例中’該醫藥組合物中 [AW’WjhGLP-lCWN^之濃度為約2% (重量/體積）以及 [八11)8’35]11〇1^-1(7-36州112對辞之莫耳比為約15:1。又較 佳地，於本發明之第一目的之第三方面之第二較佳具體實 施例中’該醫藥組合物中[Aib8,35]hGLp i(7_36)NH2之濃度 i 為約ίο% (重量/體積）以及[Aib8,35]hGLp_1(7 36_2對辞 之莫耳比為約1.5 : 1。再又較佳地、於本發明之第一目的 之第三方面之第二較佳具體實施例中，該醫藥組合物中 [Aib8’35]hGLp-!(7-36)NH2 之濃度為約 23% 或約 25%(重量 / 體積）以及[Aib8’35]hGLP_l(7-36)NH2對辞之莫耳比為約 1.5:1。

較佳地，於本發明之第一目的之第三方面之第二較佳 具體實施例令，該醫藥組合物中[Aibm]hGLIM(7_36)NH 之濃度為約5 °/。（重量/體積）以及該比例為約5.4 : 13 1364292 地，於本發明之第一目的之第三方面之第二較佳具體實施 例中，該組合物中[Aib8,35]hGLP-l(7-36)NH2之濃度為約 5%(重量/體積）以及該比例為約4.(^ 1。亦較佳地，於本發 明之第一目的之第三方面之第二較佳具體實施例中該組 合物中[AiP’^hGLP-lQdG^H2之濃度為約1〇%(重量/體 積）以及該比例為約5.4 : 1。再又較佳地’於本發明之第一 目的之第三方面之第二較佳具體實施例中，該組合物中 [Ail/’^hGLP· 1(7_36)NH2之濃度為約1〇% (重量/體積）以 及該比例為約4.0 : 1。 較佳地，於該第-目的之第三方面之第二較佳具體t 施例中，該鋅係以氯化鋅或乙、釀辞提供。更佳地，該乙酸 鋅係以ZnAc2.2H20提供。 較佳地，於該第一目的之第三方面之第一及第二較佳 具體實施例兩者中’該醫藥組合物之pH係使用鹼予以調

升:更佳地’該pH調整係使用Na〇H進行。又更佳地，該 醫藥組合物之PH係、以Na〇H調整，使得使用〇 9%1^ 稀釋成約1,2之起始濃度時，利用直接電位測定所得之奸 值為約5.0-5.5。 、 如熟於醫藥調配之技藝者所了解，本發明組合物之pH 可利用適當之„可接受之酸類及_進行比上述更廣範 調聲最、、組合物之pH之進一步調整可調控參數例如， 胜肽濃度、鋅濃度、及體内之釋放側繪。 於該第一目 本發明以該第三 的之第二方面之第—較佳具體實施例中， 方面之醫藥組合物為特徵’包含，獨立於

14 1364292 各事件’該第三方面之各較佳具體實施例，其中該組合物 係經調配俾使式（I)之化合物可於有需要之對象體内（例 .. 如，哺乳動物，較佳為人類）長時間釋放。較佳地該化合物 • 之釋放可延長至少一小時’更佳為至少4、6、12、或24 小時。又更佳地，該組合物係經調配俾使式⑴之化合物可 於—對象體内釋放至少36、48、60、72、84、或96小時。 又更佳地，該組合物係經調配俾使式⑴之化合物可於一對 • 象體内釋放至少約5、6、7、8、9、、10、n、12、13、或 1 4天。又更佳地，該組合物係經調配俾使式⑴之化合物可 於—對象體内釋放至少約2、3或4週。甚至更佳地，該組 合物係經調配俾使式⑴之化合物可於一對象體内釋放至少 約1、1.5、2、或3個月，或更久。 本發明之第二目的為提供一種引起GLp_丨激動作用之 方法，該方法包括將GLP· 1(7-3 6)NH2配位體之受體與式（I) 化合物接觸，式（I)之化合物可經由該第三方面之組合物直 接或間接地提供給該受體，包含，獨立於各事件，該第三 方面之各較佳具體實施例。 . 本發明之第二目的之第一較佳具體實施例中， ' LP 1(7_36)NH2配位體之受體係存在於動物對象體内，該 對象較佳為靈長類，更佳為人類。因此，此具體實施例中 本發明提供一種於有需要之對象體内自GLP-1受體引起激 動作用之方法，其包括對該對象投予本發明之組合物，其 中該組合物包括有效量之式（I)化合物或其醫藥可接受之 鹽。 15 本"發"日月$楚_ 卑二目的之更佳的具體實施例中，該對象係 患有’或具有發展出選自由j型糖尿病、Μ糖尿病、姓 糖尿病、肥胖、食欲亢進、飽足感不足、及代謝失調 所組成之在，戌+十+ 戌届或病症之風險之人類。較佳地該疾病為I型 糖尿病或II型糖尿病。 ^ 弟—目的之另一更佳的具體實施例中，該對

象係患有下列疾病或病，症’或具有發展出下列疾病或病症 八險之人類，該疾病或病症係選自由I型糖尿病、II型 尿病肥胖、胰高血糖素瘤（giucagonomas)、氣管之分泌 失調關節炎'骨質疏鬆症、中樞神經系統疾病、再狹窄、 神里退化’疾病、腎衰竭、充血性心臟衰竭、腎病症候群、 硬化肺水腫、高血麗、A其中需要減少食物攝取之病症、 拖神、、’1系統之疾病或病症（例如，經由神經生成之調控， 乂及例如帕金森氏症、阿滋海莫症、亨丁頓舞蹈症、、

以及神經精神症候群）、腸激躁症、心肌梗塞 (例如，降低與其有關之發.病率及/或死亡率）、中風、急性 冠心症（例如，以缺乏Q波為特徵）心肌梗塞、手術後分解 代謝的改變、冬眠心肌或糖尿病心肌病、尿鈉排泄不足、 尿鉀濃度過量、與毒性高血容量症有關之症狀或病症（例 如腎哀竭充血性心衰竭、腎病症候群、硬化、肺水腫 以及同血壓）、多囊性卵巢症候群、呼吸窘迫、腎病、左心 至收縮功能障礙，（例如’具有異常之左心室射出率）、腸 胃病如腹瀉、術後胃傾倒症及腸激躁症，（亦即，經由抑制 十一指腸腔能動性）、嚴重疾病多發性神經病（CIPN)、全身 16 1364292 •性發炎反應症候群（SIRS)、異常血脂症、由局部缺血後血 流之再灌注所造成之器官組織損傷、以及冠心病風險因子 (CHDRF)症候群所組成之群組。 該第二目的之另一方面中，本發明係以於有此需要之 對象體内將肝臟幹細胞/原始細胞轉變為功能性胰臟細 胞，防止β細胞惡化以及刺激p細胞增生，抑制正腎上腺 素的血漿濃度，引起肌力反應以及增加心肌收縮能力，經 φ 由非-消化途徑（例如，經由靜脈、皮下、肌肉、腹膜或其 他注射或滴注途徑）改善營養，對欲進行内視鏡程序之對象 進行前處理，以及調節三酸甘油酯濃度之方法為特徵，該 方法包括對該對象投予本發明之調配物，該調配物包括= 效量之式⑴化合物或其醫藥可接受之鹽。該對象較佳為哺 乳動物’更佳為靈長類，又更佳為人類。 【實施方式】 本文中本發明之胜肽於係由下列格式表示，例如， (ΑΜ，35)1^ρ_1(7_36)ΝΗ2，第一組括弧中之原序列具有缓 取代之胺基酸（例如，Aib8,35代表於hGUM中係以取 代Ala8& Gly35)eAib為α_胺基異丁酸之縮寫。縮寫Gw] 係指類升糖素肽·丨；hGLPd係指人類類升糖素肽_丨。第二 組括弧中的數字係指胜肽中存在之胺基酸數（例如， hGLP_1(7-36)係指人類GLP-1胜肽序列中的第7到％個胺 基酸）°hGLP-l(7-37)之序列係列於 Mojsov, S.，Int 了

Peptide Protein Res” 4〇，1992, pp. 333-342。 17 1364292 hGLP-l(7_36)NH2巾「而2」代表胜肽之c端已酿胺化。 hGLP-1(7-36)表示C端為游離酸。除非另行說明， hGLIM(7-38)中，位置37及38之殘基分別為吻及化。 . 有利地’本發明中所使用之胜肽可呈醫藥可接受之鹽 類的形式提供。此等鹽類之實例包含，但非限於與有機 ^⑴如乙I、乳酸、順丁埽二酸、擰檬酸、蘋果酸、抗 壞血酸、琥辑酸'苯甲酸、曱烷磺酸、甲笨磺酸、或雙羥 _ 萘酸（pam〇icaCid))，無機酸（例如，鹽酸、硫酸、或磷酸）， 以及多元酸（例如，單寧酸、羧曱基纖維素、聚乳酸、聚羥 基乙酸、或聚乳酸·羥基乙酸之共聚物）所形成之鹽類。製 造本發明胜肽之鹽類的典型的方法為熟於此技藝者所知 悉，其可藉由鹽之置換反應標準方法而得到。因此，本發 明胜肽之TFA鹽（該TFA鹽係經由使用製備性HpLC，以含 TFA之緩衝液進行洗提純化該胜肽而得）可轉變為另一種 鹽，例如藉由將該胜肽溶解於少量之〇.25n之乙酸水溶液 鲁 而可得乙酸鹽。將所得之溶液施用於半-製備性HpLC管柱 (semi-prep HPLC column ’ Zorbax，300 SB, C-8)。將管柱以 (1) 0.1N乙酸錢水溶液洗提〇·5小時，（2) 〇 25N乙酸水溶 液洗提〇·5小時，以及（3)以4 ml/min流速之線性梯度（2〇% 至1 00%之溶液B洗提3 0分鐘以上）洗提（溶液A為〇 25N 之乙酸水溶液；溶液B為0.2 5N之乙酸，其係溶於乙睛/ 水’ 80: 20)。收集含有該胜肽之分液且冷束至乾。 如熟於此技藝者所知，GLP-1已知之用途和潛在用途 為多種多樣的（參見 Todd，J.F.，et al., Clinical Science 1998 18 1364292 95, pp.325-329 , A Todd, J.F. et al.} European Journal of

CnnicalInvestigation，1997,27 pp 533-536)。因此，為了 引起激動效應之目的’投予本發明化合物可產生盘使用

本身一樣的效果eGUM之各種用途總結如下，其 係用於治療：I型糖尿病、Π型糖尿病、肥胖、騰高灰糖素 瘤、呼吸道分泌失調、代謝失調、關節炎、骨質疏鬆症 中樞神經线疾病' 再狹窄、神經退化性疾病、腎衰竭、 充血性心臟表竭、腎病症候群、硬化、肺水腫、高灰壓、 需要減少食物攝入之病症、以及本文所討論之各種其他症 狀及病症。因此’本發明之範圍包含本文所界定之醫藥組 合物，該組合物係以式⑴化合物作為活性成分。 本發明之調配物中活性成分之劑量係可變的；然而， 其含量必須達到適當之劑量。所選擇之劑量係取決於欲達 到的療效、投藥途徑、及治療時間，料常由主治醫生決 定。一般，本發明之活性作用的有效劑量係在1χ1〇_7至2〇〇 mg/kg/日’較佳為1χ1〇-4至1〇〇 日之範圍，其可以 單一劑量投予，或分成多個劑量投予。 本發明之調配物較佳係由非腸胃途徑投予，例如，肌 肉庄射、腹膜注射、靜脈注射、皮下注射等。 本發明之非腸胃途徑投予之製劑包含無菌之水性或非 水性溶液、懸浮液、凝膠、或乳液，惟其於體内可連到所 欲之釋放側緣。非水性溶劑或載劑之實例為丙二醇、聚乙 二醇、植物油，例如撖欖油及玉米油、明膠及可注射之有 機醋類’例如油酸乙酯。這些劑型亦可包含佐劑，例如防 19 U64292 腐劑㈤/‘#、劑、礼化劑、及分散劑。其可經以下方式滅菌， 例如，經由細菌-阻隔過濾器（bacteria retaining fmer)之過 /慮作用’於該組合物中加入消毒劑，以放射線照射該組合 物，或將組合物加熱。纟亦可製成無菌之固體組合物形式， 於使用刖使該固體組合物立即溶解於無菌纟或其他某些 無菌之注射介質中。 胜肽之合成 為實行本發明所使用的胜肽可由標準的固相胜肽合成 法予以製備。參見’例如，stewart，; M，et al，s〇lid phase

Synthesis (Pierce Chemical Co., 2d ed. 1984) 〇 - 下列實施例中說明可使用之製造胜狀的合成方法而有 利於實行本發明’ Λ等合成方法為熟於此技藝者所知悉。 熟於此技藝者亦知道其他方法。該等實施例僅用以說明之 目的而非欲以任何方式限制本發明之範疇。

Boc-pAla-OH、Boc-D-ArgCTospOH 及 B〇C-D，Asp(0cHex)係購自 N〇va Bi〇chem，^ ❿⑼， California 〇B〇c-Aun_OH 係購自 Bachem King〇fprussia， PA。Boc-Ava-OH 及 B〇c_Ado_〇H 係購自 Chem Impex International，Wood Dale，IL。B〇c 2Nal 〇H 係購自

Synthetech，lnc· Albany, OR。 本文中所使用之其他縮寫的全名如下：Boc為第三-丁 氧基羰基，HF為氟化氫，Fm為甲醯基，Xan為黃嘌呤酸 基，Bzl為苯甲基’ T〇s為苯甲磺醯基，DNp為2,4_二硝基 笨基，DMF為二曱基甲醯胺，DCM為二氯曱烷，hbtu為 20 1364292 2-(1Η-苯并三唑-l-yl)-l，l，3,3_四甲基六氟磷酸尿鏽，DIEA 為二異丙基乙胺，HOAc為乙酸，TFA為三氟乙酸，2C1Z • 為2_氣苯甲氡基羰基，2BrZ為2-溴笨甲氧基羰基，〇cHex 為〇-環己基，Fmoc為9-第基甲氧基羰基，HOBt為N-羥基苯并二唑’ PAM樹脂為4-羥基曱基苯基乙醯胺基曱基 樹脂’ Tris為三（羥曱基）胺基甲烷，以及Bis_Tris為雙（2_ 羥乙基）胺基·三（羥甲基）曱烷（亦即’ 2-雙（2-羥乙基）胺基 • -2-(羥甲基）-丨，3-丙二醇）。「鹵基」或「鹵素」包括氟基、 氣基、溴基、以及碘基。 除非另行界定，否則本文中使用之所有技術及科學用 网之意義與熟於本發明所屬之領域之人士所理解者相同。 再者，本文中提及之所有刊物、專利申請案、專利、及其 他參考資料之内容係以參考資料合併於本文。 【實施例】 實施例1 (Aib8’35)hGLP_l(7-36)NH2 (Aib8’35)hGLP-l(7-3 6)NH2之詳細的合成程序已由國際 專利公開案WO 00/3433 1 (PCT/EP99/09660)提供，其全部 内容係合併於本文。簡言之，該化合物係以Applied

Biosystems (Foster City，CA) 430A 型胜肽合成儀合成，此 儀器已經修改俾用於加速Boc_化學固相胜肽合成。參見 Schnolzer, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 90:180 (1992)。使用0.91 mmol/g之4·曱基二苯曱胺（MBHA)樹脂 (Peninsula，Belmont, CA)進行置換。Boc 胺基酸（Bachem， 21 1364292 CA，Torrance, CA; Nova Biochem·，LaJolla, CA)係與下列側 鏈保護基一同使用：Boc-Ala-OH、Boc-Arg(Tos)-OH、 Boc-Asp(OcHex)-OH、Boc-Tyr(2BrZ)-OH、 Boc-His(DNP)-OH ' Boc-Val-OH ' Boc-Leu-OH ' Boc-Gly-OH ' Boc-Gln-OH ' Boc-Ile-OH ' Boc-Lys(2ClZ)-OH、Boc-Thr(Bzl)-OH、Boc-Ser(Bzl)-OH、 Boc-Phe-OH、Boc-Aib-OH、Boc-Glu(OcHex)-OH 及 Boc-Trp(Fm)-OH。Boc 基團係以 100% TFA 處理 2 x 1 分鐘 而予以移除。.Boc胺基酸（2·5 mmol)以HBTU (2.0 mmol)及 DIEA (1.0 mL)於4 mL之DMF中預先活化，且偶合前不需 對胜肽-樹脂TFA鹽進行中和。 偶合時間為 5分鐘，除 了 Boc-Aib-OH 殘基及下列殘基，Boc-Lys(2ClZ)-OH 及 Boc-His(DNP)-OH外其中該偶合時間為 2小時。 在胜肽鏈裝配結束時，將樹脂以20%酼基乙醇/1 0% DIEA於DMF溶液中處理 2 X 30分鐘以移除His側鏈上之 DNP基團。藉由以1 00% TFA處理2x2分鐘以移除N端之 Boc基團。於以溶於DMF之10%之DIEA中和該胜肽-樹脂 後（1 X 1分鐘），Trp側鏈上的曱醯基係以15%乙醇胺/15% 水/70% DMF之溶液處理 2 X 30分鐘予以移除。以〇]^? 及DCM洗滌胜肽-樹脂，並於減壓下乾燥。於0°C下在含 有1 ml苯甲醚及二硫蘇糖醇（24 mg)之10 ml HF中攪拌該 胜肽-樹脂75分鐘後完成最後的裂解。以氮氣流移除 HF。 殘質以乙醚（6 X 10 mL)洗滌且以4N HOAc (6 X 10 mL)萃 22 1364292 水性萃取物中之胜肽混合物係以逆相製備性之高壓液 相層析術（HPLC)，使用逆相VYDAC㊣Cl8管柱（Nest Gr〇up， • Southb〇r〇ugh，MA)進行純化。將管柱以1〇mL/min之流速 _ 進行線性梯度之洗提（2〇°/。至50%之溶液B洗提1〇5分鐘以 上）（溶液A:含〇. 1% TFA之水；溶液B =含〇丨％ tfa之乙 腈）。收集分液且以分析性HPLC進行檢驗，將含有純産物 者合併’以及將其凍乾。此化合物之一合成實例中，得到 • 約135mg之白色固體。根據分析性HPLC的分析，純度為 „ 98.6%。由電喷灑質譜儀（MS(ES))S之分析算出分子量為 3339.7 (與之前計算的分子量3339·7 一致）。 實施例2

調配程序I ?·1材料，儲借溶液，計糞 材料：ZnCl2、NaOH顆粒、及鹽酸，35%，係得自Panreac Quimica，Barcelona，Spain。WFI (無菌注射用水（冗1〇犷 • injection)/沖洗用水）係得自 B. Braun Medical，Barcel()na, Spain ° B)儲備溶液 (Π ZnCli，pH==3 :— 1. 攪拌下，於WFI中添加35% HC1以達到pH=3。 2. 於量瓶中，加入經秤量之ZnC12。攪拌下，加入pH=3 之HC1以達到最終濃度約！至4mg2ZnCl2/mL。 ΠΠ ZnCl，. = 2 : 1.攪拌下，於WFI中添加35% HC1以達到pH=2。 23 1364292 2.於量瓶中，加入經秤量之ZnC11 2 3 4 5 6 7。攪拌下，加入pH=2 之HC1以達到最終濃度約4至12 mg之ZnCl2/mL。 ·· 〇.ii) Na〇l· 0.1 ξ, l〇 mg/ml ： _ _ 1 ·於量瓶中，加入經秤量之NaOH »授拌下，加入 WFI以達到最终濃度約〇」至1〇 mg之Na〇I1/mL。 24 1 也）冷束之 20 mg 等份 小瓶： φ 1.製備乙酸與WFI之0.04% (v/v)稀釋液。 2.於量版中，加入經秤量之（Aib8,35)HGLP-l(7-36；)NH2 (乙皱鹽）。攪拌下，加入足量之〇〇4%乙酸使最終濃度為 20 mg (Aib8,35)HGLp_1(7_36)NH2/mL。使用 〇 45 微米之過 慮器進行過濾除菌後，將1 ml等份之溶液轉移至凍乾小 瓶’予以冷凍乾燥及將乾燥之產物儲存於-22°c。 1^)冷表二乾燥之 50 mg 箄份 iAib8,35mrTT P-1 ' — 小瓶： Φ 1.製備乙酸與WFI之0· 1 % (v/v)稀釋液。 2 .於量瓶中，加入經秤量之（Aib8,35)HGLP-1(7-36)NH2 3 (乙酸鹽）。攪拌下，加入足量之0.1%乙酸使最終濃度為50 mg (Aib8,35)HGLP-l(7-36)NH2/mL。過濾除菌後，將 1 ml 4 等份之溶液轉移至凍乾小瓶且予以冷凍乾燥。 5 C)計t 6 (0測定組合物之賦形劑（E)之總重/體積： 7 E = (A X 100/T)-(A/P) 8 其中： 1364292 賦形劑，單位為mg A=純胜肽之含量（mg); Τ'-組合物之目標濃度；例如，若目標為2%時τ為2 . 以及 ’ p==純胜肽之濃度（mg胜肽/1〇〇 mg調配物） 相對於賦形劑之總體積，假設1 mL = 1 g。 (ii) 測定於每毫升或公克之組合物溶液中所添加之 ZnCl2之體積/重量（w): a) W= 100%之E時該組合物未進行pH調整； b) W=80%之E時該液體調配物中胜肽為約1 %，或約 2%或高達約10%以及pH係使用鹼調整； c) W=50%之E時該半-固體或凝膠調配物中胜狀為約 1 %，或約2%或高達約1 0%以及pH係使用驗調整； d) W=66.66%之E時該半-固體或凝膠調配物中胜狀 為約25%以及pH係使用鹼調整； e) W=90%之E時該調配物中胜肽1係由冷;東乾燥製備 物重建以及pH係使用驗調整。. (iii) 測定於各毫升或公克之組合物溶液中所添加之 NaOH之體積/重量（W): .a) W=20%之E時該調配物中胜肽為約1%，或約2〇/〇 或高達約1 〇°/〇以及PH係使用鹼調整； b) W=50%之E時該半-固體或凝膠調配物中胜肽為約 1 %，或約2%或高達約10%以及pH係使用鹼調整； c) W=33.3 3 %之E時該半-固體或凝膠調配物中胜肽 25 1364292 為約25%以及pH係使用鹼調整； d) W= 10%之E時該調配物中胜肽係由冷凍乾燥製備 .. 物重建以及pH係使用鹼調整。 _ (iv)測定於各組合物中所使用之ZnCh之濃度（mg/ml或 mg/g) [ZnCl2] = (136.29 x A)/(W x 3339.76 x R) 其中： ^ A=純胜肽之含量（mg); R=胜肽/Zn之莫耳比 R=1.5時調配物中該胜肽為約1%，或約2%或約1〇% 或高達約23% ; R=4.0時調配物中該胜肽為約25% ;以及 W=於每公克或毫升之組合物溶液中所添加之znci2之 重量（g)或體積（mL)。 製備具有1-10%冷康-乾燥之胜肽及ZnC丨2，Η表調替 • PH之組合物 如本文所使用’具有特定百分比胜肽之調配物係表示 該組合物之總重中具有特定重量胜肽之調配物，例如，1% 胜肽，表示每100g之總組合物中具有lg胜肽之調配物。 具有約1 %，或約2%高達約1 〇。/。胜肽之調配物係如下述製 備。將前述製備之（Aib8’35)HGLP-l(7-36)NH2之冷凍-乾燥 樣本與100%之總賦形劑體積之pH 3之ZnCl2儲備溶液徹 底混合且[胜肽：Zn] = 1.5 : 1。 A) 1°/。之組合物係藉由將2〇 mg冷凍-乾燥之 26 1364292 (Aib⑶）HGUM(7_36)NH2 (參見上述 2」b (iv))與 2 d 之 ZnCh溶液(0.272 mg/ml，·參見上述2」B⑴)混合而製備 B) 2%之組合物係藉由將2〇 mg冷凍乾燥之 (AibU)HGLP-1(7_36)NH2 (參見上述2」b㈣)與工μ之 ZnCl2溶液(0.544 mg/ml，·參見上述2」B⑴)混合而製備 C) 10%之組合物係藉由將50 mg冷凍乾燥之 (Aib8>35)HGLP-l(7-36)NH2(#^_Li4 2.1 B (v))^ 〇.45 ml 之ZnCl2溶液（3.023 mg/ml ;參見上述2」b⑴）混合而製備 使冷凍-乾燥之胜肽以及溶液舆室溫平衡。將指定體積 之〜⑶溶液注人至含有冷;東·乾燥胜肽之小瓶中且使1% 或2%之胜肽组合物進行約2分鐘之水合作用以及使“％之 胜肽組合物進行約60分鐘之水合作用，或直到所有冷凍_ 乾燥胜肽完全水合且該溶液中不含胜肽團塊。水合作用 後’將重建之胜肽搖動約1分鐘。 取適量之經溶解之胜肽進行投藥，例如，1〇〇 μ1之上 迷Α所製備之！/❶的胜肽溶液等於i mg劑量，5〇 μ之上述 所製備之2%的胜肽溶液等於丨mg劑量，丨5 〇卜丨之上述c 所製備之1 〇%的胜肽溶液等於1 5 mg劑量，等。 利用本案之教示，熟於此技藝者可改變該胜肽以及 ZnCl2之量而得到除了下述1%、2%及1〇%之組合物以外之 組合物以及所欲之劑量。 具有1-10%冷凌-乾燥之胜肽及znC丨，，且經調整 合物 具有約1% ’或約2%高達約1 0%胜肽之調配物係如下 27 丄 述製備。將前述製備之（Ai 8,35 )HCjLP-1(7_36)NH2 之冷凍-乾燥樣本與9G%之總賦形劑體積之PH3之ZnCl2fst備溶液 徹底混合。藉“加稀釋之NaQH^液得到所欲之溶液的 pH值。 A) 1 /〇之組合物係藉由將2〇 冷凍乾燥之 (Aib8’35)HGUM(7·36)叫（參見上述 2」B (iv)m u ml 之ZnCl2溶液（參見上述2.1 B (i))混合而製備 B) 2%之組合物係藉由將2〇 mg冷凍乾燥之 (Aib )HGLP-1(7-36)NH2(參見上述 2.1 b (iv))與 〇.9 ml 之ZnCl2溶液（參見上述2.1 B (i))混合而製備 C) 10/〇之組合物係藉由將5〇 mg冷象·乾燥之 (八化8’35)冊1^-1(7-36)1^2(參見上述2^卜））與0_4〇1111 之ZnCl2溶液（參見上述2·1 B (i))混合而製備 於上述溶液中，添加所需體積（賦形劑之總體積之10%) 之經稀釋之NaOH溶液以達到目標濃度及pH值。例如， 於各： 1 %之級合物：添加〇 2 mL之NaOH溶液以得到適當之 >1 Μ 2〇/〇之組合物：添加0.1 mL之NaOH溶液以得到適當之 濃度 10%之組合物：添加〇.〇5 mL之NaOH溶液以得到適當 之濃度 利用本案之教示，熟於此技藝者可改變該胜肽以及 ZnCl2之量而得到除了下述1%、2%及10%之組合物以外之 28 J364292 Μ 組合物。 ^•4^^&^^10。/〇之胜肽及乙11(：丨，，且未調替1>11之洚機 ^Μ- -- 具有約1G/。’或約2%高達約10%胜肽之液體調配物係 - 如下述製備。枰取（Aib8,35)HGLP-l(7-36)NH2之樣本以及與 pH 3之ZnCh儲備溶液混合而得目標濃度為1%、2g/o、高 遠10%之胜肽。混合後’將該組合物過濾除菌及儲存直到 取用。 籲 2·^_ΑΑ·1ιΑ—1-10%之胜肽及ZnCl,，且經調# nH之液雜 如.合物 具有約1°/。，或約2%高達約1 0%胜肽之液體調配物係 如下述製備。秤取（Aib8,35)HGLP-l(7-36)NH2之樣本以及與 80%之總賦形劑體積之pH 3之ZnCh儲備溶液徹底混合。

該鋅溶液可為ZnCh或ΖηΑ〇2·2Η2〇。藉由添加稀釋之Na〇H 溶液得到所欲之溶液的pH值。利用此方法製備製備物C5 φ 至 C13。 利用本案之教示’熟於此技藝者可改變該胜肽以及 ZnCl2之量而得到除了本文所述之ι%、2%及以外之組 合物。 25%之胜肽及ZnCh，且夫調答pH之丰-固艚 /凝膠紐么4*7 具有約25%胜肽之半-固體或凝膠調配物係如下述製 備。秤取（Aib8’35)HGLP-l(7-36)NH2 之樣本以及與 66.66% / 之總賦形劑體積之pH 2之ZnCl2儲備溶液徹底混合。該鋅 29 1364292 溶液可為ZnCl2或ZnAc2.2H2〇i用此方法製備製備物ci 及C2 〇 更具體地，該半-固體或凝膠組合物係利用「推-拉」 式混合法製備： a) 秤取所欲用f之職並將其裝載至預先安裝特定之 雙向手動閥（hand valve，HV)(I.D.=〇 5 _之拋棄式注射器 S1之筒中以及將管子置於該注射器Luer孔内； b) 將注射器之活塞以不鑛鋼棒sr關緊； C) S1之HV係連接至真空源且Hv為開啟的。1〇分鐘 後關閉HV ; d) 精確地秤取鋅溶液並將其裝載至第二拋棄式注射器 S2之筒中； e) 然後將S2與HV之可用部分連接； f) 開啟HV以及藉由真空將溶劑引至含有胜肽粉末之 S1之筒中； g) 關閉HV以及取出溶劑注射器S2，因而使S1中之胜 肽粉末水合； h) 移除SR且緩慢地鬆脫該注射器活塞； 0移動該注射器活塞（推及拉），並未開啟HV ,使得該 粉末物質完全浸於溶劑中； j) 將雙向不鏽鋼連接器sc (I.D =1 〇 mm)置於注射器 S2(其具有置於該注射器Luer孔内之管子）中，以及將其活 塞推至末端； k) 開啟S1之HV以排除真空然後移除HV。移動該注 30 1364292 射器活塞使該注射器筒中之空氣減至最少；以及 1)將S1及S2藉由sc連接以及該組合物經由SC自S1 捏製至S2。 利用本案之教示，熟於此技藝者可改變該胜肽以及 ZnCl2之量而得到除了本文所述之25%以外之組合物。 備具有25%之胜肽及ZnCl,，且經調整dH之车-囡截 /凝勝组合物 φ 具有約胜肽之半-固體或凝膠調配物係如下述製 備。秤取（Aib8’35)HGLP-l(7-36)NH2 之樣本以及與 66.66% 之總賦形劑體積之pH 2之ZnCh儲備溶液徹底混合。該鋅 溶液可為ZnCh或ΖηΑ(^·2Η2〇。藉由添加稀釋之Na〇H溶 液得到所欲之溶液的pH值。此實施例中，於粉末中所添加 之液體的總體積應分成辞及NaOH溶液。因此，調整辞溶 液之濃度，俾使所需之辞溶液之總體積減少至添加於該胜 肽粉末（步驟d)之總液體體積之50%。其餘5〇%之添加於該 • 胜肽粉末之總液體體積如下述係以NaOH溶液添加。利用 此方法製備製備物C3及C4。 該PH值經調整之半-固體或凝膠組合物係利用「推-拉 式混合法製備： a)秤取所欲用量之胜肽並將其裝載至預先安裝特定之 雙向:動閥HV(I.D. = 0.5mm)之拋棄式注射器“之筒中以 及將g子置於該注射器Luer孔内； b)將左射器之活塞以不鑛鋼棒sr關緊. O S1之HV係連接至真空源且Hv為開啟的 31 1364292 後關閉HV ; d) 精確地秤取辞溶液並將其裝載至第二抛棄式注射器 S2之筒中； ' e) 然後將S2與HV之可用部分連接； f) 開啟HV以及藉由真空將溶劑引至含有胜肽粉末之 S1之筒中； g) 關閉HV以及取出溶劑注射器S2，因而使S1中之胜 ^ 肽粉末水合； h) 移除SR且緩慢地鬆脫該注射器活塞； 0移動該注射器活塞（推及拉），並未開啟Hv，使得該 粉末物質完全浸於溶劑中； j) 將雙向不鏽鋼連接器SC(I.D.= 1〇mm)置於注射器 S2(其具有置於該，主射器Luer孔内之管子）中，以及將其活 塞推至末端； k) 開啟S1之HV以排除真空然後移除ηv。移動該注 Φ 射器活塞使該注射器筒中之空氣減至最少； l) 將S1及S2藉由SC連接以及該組合物經由SC自S1 捏製至S2 ; m) 均質化後’取出該混合產物之等份以測定該胜肽之 濃度； η)精確地秤量其餘中間整體產物以及計算為達到所欲 ΡΗ值所需之NaOH溶液量； 〇)精確地秤取NaOH溶液並將其裝載至第三拋棄式注 射器S3中；以及 32 1364292 P)緩慢地壓下該注射器活塞使該注射器腔室中之空氣 減至最少。兩注射器係藉由SC連接以及該組合物係經由 SC捏製。 利用本案之教示，熟於此技藝者可改變該胜肽以及 ZnCl2之量而得到除了本文所述之25%以外之組合物。 表1

實施例 *胜 溶液 料胜肽： 編號 肽％ Zn之比例 劑量 C1 10 Zn〇2 0.846 mg/ml 5.4 : 1 lmg C2 5 0.40mgZnCl2/mL 5.4 ： 1 lmg C3 10 50%ZnCl2 1.69mg/mL > 50%NaOH 1 m^mL 5.4 ： 1 lmg C4 10 50%ZnCl22.28mg/mL > 50%NaOH 1 mg/mL 4:1 lmg C5 5 80% ZnCl2 0.674 mg/mL > 20% NaOH 3.81 mg/mL 4:1 lmg C6 2 80% ZnCl2 0.26 mg/mL , 20% NaOH 2.15 mg/mL 5.4 ： 1 lmg C7 10 80% ZnCl2 3.81 mg/mL > 20%NaOH 4.47 m^mL 1.5 ： 1 lmg C8 10 1 80% ΖηΑ〇2.2Η20 2.3 mg/mL > 20% NaOH 6.1 mg/mL 4:1 lmg C9 2 80% ZnCl2 0.695 mg/mL，20% NaOH 1.75 mg/mL 1.5 : 1 lmg C10 2 80%ZnAc22H201.12mg/mL »20%NaOH 1.44mgtoL 1.5 : 1 lmg C11 2 80%ZnCl2 0.695 m^mL > 20% NaOH 1.75 mg/mL 1.5 ： 1 lmg C12 1 80% ZnCl2 0.384 mg/mL > 20% NaOH 0.875 mg/mL 1.5 ： 1 lmg C13 10 80% ZnCl2 3.85 mg/mL, 20% NaOH 4.47 mg/mL 1.5 ： 1 15 mg 33 1364292 細胞培養： 將RIN 5F大鼠胰島素瘤細胞(ATCC-# CRL-2058， American Type Culture Collection, Manassas, VA)，可表現 GLP-1受體，培養於含有1 0%胎牛血清之杜貝可改良之依 格培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium)，且於 5% CO2/95°/0空氣之潮濕氛圍下維持於約37°C。 放射性配位體之結合： 為進行放射性配位體結合研究，將存在於20 ml之冰 冷的 50mM Tris-HCl 中之 RIN 細胞以 Brinkman Polytron (Westbury，NY)(設定6，1 5秒）均質化而製備膜。藉由離 心（3 9,000 g / 10分鐘）洗滌該均質物兩次，以及將最終之 粒狀物再懸浮於50 mM Tris-HCl，其含有2.5 mM MgCl2、 0.1 mg/ml 之桿菌肽（Sigma Chemical，St· Louis, MO)、以及 0.1% BSA。關於試驗，於含有或不含0.05 mi之未標記之 競爭測試胜肽下，將等份（0.4 ml)與0.05 nM之 (125I)GLP-1 (7-36) (-2200 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA)培養。培養loo分鐘後（25〇C)，藉由GF/C濾膜 (Brandel，Gaithersburg，MD)之快速過濾而自游離者中分離 出經結合之（125I)GLP-l(7-36)，該濾膜事先已浸潰於0.5% 聚乙亞胺中。然後將該濾膜以5 ml等份之冰冷的5 0 mM Tris-HCl洗滌三次，以及經由γ度譜術（Wallac LKB， Gaithersburg，MD)計算經捕捉於濾膜上之經結合之故射活 性。專一性結合係界定為總（l25I)GLP-l(7-36)結合量減去 於 1000 nM GLPl(7-36) (Bachem，Torrence, CA)存在時之結 34 1364292 合量。 4·測定溶解唐vs ρΐτ芦 衝鹽木中測定化合物溶解唐vs pH佶 利用下述程序可有益地測定該用於實行本發明之化合 物於不同pH值及溫度下於PBS中之溶解度。 將一包預-混合之粉末（SIGMA, Product No.: P-38 13)溶 於1公升去離子水中以製造PBS緩衝之儲備溶液，而得ι〇 mM磷酸鹽-緩衝之鹽水具有138 NaCl、2.7 mM KC1、 及pH為7.4。具有不同pH值之PBS緩衝液可經由以磷酸 及/或氫氣化鈉調整此儲備溶液之pH值而製造。 於玻璃小瓶中秤取2 mg之欲測試之化合物樣本，例 如’ 2 mg之實施例i之化合物。於各小瓶中添加5 〇 μ1等 份之特定pH值之PBS緩衝液。使該溶液產生渦動，以及 若需要予以超音波震盪，直到澄清。於各pH測試項中，記 錄溶解2 mg化合物所需之緩衝液的總體積且’計算該溶解 度。 將於室溫（20-25。〇下澄清之胜肽溶液置於冷藏室（4°c) 中一整夜然後檢測該胜肽於4°c之溶解度。 1^2.於鹽水中測定化合物滚解唐vs pH ft 利用下述程序可有益地測定該用於實行本發明之化合 物於不同pH值及溫度下於鹽水中之溶解度。 將9克之NaCl溶於1公升之去離子水以製備鹽水儲備 溶液。具有不同pH值之鹽水溶液可經由以HC1及/或Na〇H 調整此儲備溶液之pH值而製造。 35 1364292 於玻璃小瓶中秤取2 mg之欲測試之化合物樣本，例 如’ 2 mg之實施例1之化合物。於各小瓶中添加5〇 μι .等 份之特定pH值之鹽水液。使該小瓶中之溶液產生渦動，以 及若需要予以超音波震盪’直到澄清。於各測試之p Η值 中，記錄溶解2 mg化合物所需之鹽水的總體積且計算該溶 解度。 將於室溫（20-25°C )下澄清之溶液置於冷藏室（4〇c )中一 整夜然後檢測4。(：下之溶解度。 1.3 ·測定於dH 7 · 0鹽水中之化厶物之溶鲜疮 利用下述程序可有益地測定該用於實行本發明之化合 物於室溫及pH=7之鹽水中之溶解度。 將9克之NaC1溶於i公升之去離子水以製備鹽水溶 液。於玻璃小槪中秤取2 mg之欲測試之化合物樣本，例如， 實施例1之化合物，以及添加丨mL等份之鹽水，使溶液產 生滿動以及予以超音波震盪’直到澄清。記錄溶解2叫胜 肽所使用之鹽水的總體積且計算室溫下之溶解度。 4.4.測支於各種· 利用下述程序可有益地測定剌於實行本發^ 物於室溫及各種pH值之鹽水中之溶解度。 口 將9克之NaCl溶於！公升 . .曰士々你 去離子水以製備鹽水儲備 溶液。、有各種pH值之鹽水溶液可經由將此 之等份以11(：1及Na〇H處理而得。 欺=備溶液 於玻璃小版中粹取2mg之欲測試之化合 如’實施例1之化合物。添加5。,1等份之特定pH本信例 u \ Ρϋ值之® 36 U64292 水緩衝液。使該溶液產生渦動以及予以超音波震盪，直到 澄清。記錄溶解2 mg胜肽所使用之緩;衝液的總體積且計算 溶解度。 化合物^丞溶液溶解唐vs辞澧唐 利用下述程序可有益地測定該用於實行本發明之化合 物於具有不同鋅濃度之pH 7之水中之溶解度。 將ZnCl2溶於去離子水中使濃度為100 mg/ml且利用 HC1調整PH為2.7而製備辞儲備溶液。藉由製造㈣備溶 液之適當稀釋液而製備具有各種ZnCl2濃度之溶液（「zn測 試溶液」）。 將1 mg之欲測試之化合物，例如，i 實施例丄 化合物’溶解於25〇M之各Zn測試溶液中而產生且有4 mg/ml之化合物之溶液。然後利用㈣Η調整:匕溶液 之ΡΗ直到觀察到形成白色沉澱物。將該沉澱溶液離心以及 利用肌C分析該母液。測量測試化合物高峰之UV吸收

面積以及經由盘括左曲妗+ 处， ” 曲線之比對測定該母液中測試化合物 之濃度。 至於可❹實行本㈣之化合物的代表 例1之化合物係於前述試驗中進行測試且得到下二果(, 水，pH 7.0,室溫）： 卜列結果（- 37 1364292 表2 溶解度 (mg/ητΓ^ 5.788 0.0770 0.0579 0.0487 0.0668 0.1131 Z n C12濃度 (ug/mL) 0 80 500 1000 1500 2500

6.利用IEF凝膠測試dI

可使用Invitrogen之Novex IEF pH3-l〇凝膠測量 GLP-1胜肽之pi ^將欲測試之胜肽化合物溶於水中達濃度 為〇.5mg/ml。至於各化合物，將5μ1所得之溶液與5μ1之 N〇Vex® Sample Buffer 2Χ (由 20 mM 精胺酸游離鹼、2〇 mM 離胺酸游離鹼及1 5%甘油組成）混合，以及將所得之丨〇 μ1 樣本溶液與蛋白質標準樣本载入至凝膠中。 鲁 電泳緩衝液亦得自Invitrogen以及根據製造商之指示 進行凝膠電泳，一般電泳條件如下：1 〇〇 V持續}小時，接 著以200 v持續1小時，接著以500 V持續30分鐘。 然後將該凝膠於含有3.5%磺基水楊酸之12% TCA中 固定30分鐘’之後根據N〇vex® c〇u〇idal Blue Kit之指示 以Colloidal Coomassie Blue染色2小時，然後於水中去染 —整夜。 藉由程式Fragment Analysis 1.2掃描且分析該凝膠。 相對於具有 P1 值為：10.7、9_5、8.3、8.0、7.8、7.4、6.9、 38 1364292 6.0、5.3、5.2、4.5、4·2、及3·5之標準化合物之pI，計算 未知胜肽之pi。 -7·大鼠之鱼A内試驗 利用下列試驗測試本發明之组合物以測定其於活體内 促進及加強作用之能力。 7.1.實驗辞年： 實驗前，於氫氯酸鹽麻醉下將重量約3〇〇_35〇 g之成年

Sprague-Dawley 大鼠（Tac0nic, Germantown, NY)植入右心 房頸靜脈套管。於注射適當之測試化合物或載劑對照（訂為 時間〇)之前將該大鼠禁食18小時。於整個實驗期間持續使 該大鼠禁食。 將100 mg/rnl ZnCh之溶液稀釋於pH2 7之HC1水溶液 中而製備〇.5mg/mlZnCl2溶液。將lmg之式⑴化合物 ((AibU’hGLPlQdS^HJ溶於250 μι之此溶液中而產生 於ΡΗ 4具有4 mg/ml之化合物及〇 5mg/ml &之澄清溶液。 於時間0時對大鼠皮下注射（sc)前述 (Aib8,35)hGLP-l(7_36)NH2)之溶液，或注射載劑對照。此兩 個實例中，注射體積非常小（4-6 μί)以及投予至該對象之 GLP-1化合物劑量為75 gg/kg。於sc注射後之適當時間， 經由靜脈（iv)套管抽取500 μι血液樣本以及對該大鼠進行 IV葡萄糖刺激（glucose challenge)以測試胰島素分泌是否掸 加。葡萄糖刺激之時間為注射化合物後之〇 25、i6 9 及24小時。抽取初始血液樣本後，經由iv注射葡萄糖（丨以“) 以及以500 μΐ之肝素鹽水（丨〇 u/mL)沖洗。之接 心俊，於注射葡 39 丄場292 .、5、10及20分鐘抽取500 μΐ血液樣本。個別 立即通過套管經由iv注射5〇〇μ1之肝素鹽水（i〇u/mL)。 將血液樣本離心，自各樣本收集血漿且將樣本儲存於_2〇。匸 直到分析其胰島素含量。各樣本中之胰島素含量係使用大 鼠姨島素酵素_連接免疫吸附試驗（ELISA)套組（American Laboratory pr0duets c〇，Windham，NH)進行測定。 7.1.1.結爭： 觀察到持續性之騰島素-增強活性，於該實驗之完整的 24小時内該活性係由葡萄糖注射所誘導。 g·狗之活體内試路 許多此技藝中已知之活體内試驗可供熟於.此技藝者用 於測定組合物於活體内促進延長釋放活性化合物之能力。 8.1 · 1 %胜肽組合铷： 經由範例’製備水性測試調配物其於ZnCl2之缓衝溶 液中包括l%(w/w)之式⑴化合物（胜肽：Zn之比例=1 5 : 1.0)。 共6隻雄性米格魯犬，42_78月齡以及體重為14_21公 斤，飼養方式為任其飲水且每曰餵飼一次（約4〇〇 g標準乾 飼料（SAFE 125))。投予測試組合物前使該狗禁食18小時。 以皮下途控於肩胛間附近投予測試組合物。由0.33_12 111111@3 = 3〇]\42913)之〇.3111[泰爾茂（1;^11111〇)注 射器製造投 藥體積（每動物約20微升）❺因此得到約〇 2 胜肽之理論 劑量。 定期抽取血液樣本’抽取時間大約為投藥後=〇，8，1 5， 丄364292 30 ’ 45分鐘’以及1，2，4，8，及12小時，以及1，2， 3 ’ 4 ’ 5，及6天。取樣後將該血液快速冷凍直到進行離心 作用’以及將血漿移入其他容器且快速冷凍直到進行試 驗。進行離線（off line)固相萃取後測定胜肽血漿濃度，接 著進行結合LC-MS/MS之在線（on-line)相萃取’以及將所 知之數據藉由Analyst v 1.2軟體處理。 該組合物證實該活性胜肽之延長釋放達至少2天。 m°/〇 (Aib8’35)hGLPU7-36)NH〇溶液： 使用實質上與上述8.1節所述相同之活體内試驗程 序’檢驗下列組合物於延長期間内釋放該主題胜肽之能 力。下列各四種組合物中胜肽之濃度為約1 % (wt/wt)，胜 肽對鋅之比例為約1.5 : 1，以及所投予之胜肽劑量為約！ mg 〇 溶液 8.2.A : (Aib8’35)hGLPl(7-36)NH2 溶於含有⑴ 90% ZnCl2 (0.298 mg/mL)及(ii) 1〇〇/0 NaOH (0.975 mg/mL)之溶 液； 溶液 8_2.B:(Aib8’35)hGLPl(7-36)NH2 溶於 ZnCl2 (0.286 mg/mL)溶液； ί·谷液8.2.C.貫質上類似溶液8.2.B，且使用AcOH/AcO — 緩衝； 溶液8.2.D :實質上類似溶液8.2.A。 如第1圖所示’該組合物提供延長釋放之 (Aib8’35)hGLPl(7-36)NH2。 U. 1 %__dib ’35)hGLP 1 (7-36)NH，）溶液： 41 1364292 使用實質上與上述8.i節所述相同之活體内試驗程 序，檢驗下列組合物於延長期間内釋放該主題胜肽之能 力。下列組合物中胜肽之濃度為約2% (wt/wt)，胜肽對鋅 之比例為約1.5 : 1，以及所投予之胜肽劑量為約1 mg。 溶液 8.3. : (Aib8’35)hGLPl(7-36)NH2 溶於含有⑴ 80〇/〇 ZnCl2 (0.695 mg/mL)及（ii) 20% NaOH (1.75 mg/mL)之溶 液； 如第5.圖所示’該組合物提供延長釋放之 (Aib8 3 5 )hGLPl(7-36)NH2。 8.4. 10%胜肽溶液： 使用實質上與上述8.1節所述相同之活體内試驗程 序，檢驗下列組合物於延長期間内釋放該主題胜肽之能 力。下列各四種組合物中胜肽之濃度為約1〇0/〇 (wt/wt)，胜 肽對鋅之比例為約1.5 : 1，以及所投予之胜肽劑量為約丄5 mg。 溶液 8.4.A : (Aib8,35)hGLPl(7-36)NH2 溶於含有⑴ 90% ZnCl2 (3.367 mg/mL)及（ii) 1〇% Na0H (5 〇i mg/mL)之溶 液； 溶液8.4.：^(八化8,35)11〇1^1(7-36)^^2溶於211(：：12 (2 993 mg/mL)溶液； 溶液8,4.C:實質上類似溶液8 4 B，且使用Ac〇h/Ac〇-緩衝； 溶液8.4.D :實質上類似溶液8.4.A。 如第2圖所示’該組合物提供延長釋玫之 42 1364292 (Aib8’35)hGLPl(7-36)NH2。 8.5.半固體鈕合物： 使用實質上與上述8]節所述相同之活體内試驗程 序，檢驗下列半-固體組合物於延長期間内釋放該主題胜肽 之能力。關於組合物“.A·，該胜肽濃度為約5%，而組合 物8.5.Β、8.5.C、及8.5.D，胜肽濃度為約1〇%㈣叫。組 合物8.5.Α、8.5.Β、及8.5.C中胜肽對鋅之比例為約5 4:工， 而組合物8.5.D令該比例為約4_〇:玉。至於所有四種組合 物其所投予之胜肽劑量為約1 mg。 組合物 8.5.A: (Aib8,35)hGLPl(7-36)NH2 於含有溶於 WFI之ZnCh (0.40 mg/mL)之半固體組合物； 組合物8.5.B :實質上類似組合物8 5 A，其中該ZnCl2 濃度已調向俾將胜肽：Zn之比例維持於約5.4 : 1。 組合物 8.5.C : (Aib8,35)hGLPl(7-36)NH2 於含有⑴ 50% ZnCl2 (1.69 mg/mL)及（ii) 50% NaOH (lmg/mL)之半固體； 組合物 8.5.D : (Aib8,35)hGLPl(7-36)NH2 於含有⑴ 50〇/〇 Z11CI2 (2.28 mg/mL)及（ii).50% NaOH (lmg/mL)之半固體.； 如第3圖所示，該組合物提供延長釋放之 (Aib8 3 5)hGLPl(7-36)NH2。 8.6 ·半固體組合物： 使用實質上與上述8.1節所述相同之活體内試驗程 序，檢驗下列半-固體組合物於延長期間内釋放該主題胜肽 之能力。此組合物係利用5.22 mg/ml ZnCl2溶液，ΡΗ=2·0 調配。提供足夠之胜肽而得胜肽對鋅之比例為約4 : 1之 43 1364292

, 25%胜肽半固體組合物。如本文所提供利用l〇mg/mlNa〇H 調整該組合物之pH。所投予之胜肽劑量為約15 。 如第6圖所示’該組合物提供延長釋放之 (Aib8’35)hGLPl(7-36)NH2。 g_· 7 ·丰固贈如合物： 使用貫質上與上述8.1節所述相同之活體内試驗程 序，檢驗下列半·固體組合物於延長期間内釋放該主題胜肽 • 之月b力。此組合物係利用8.5 mg/ml ZnCl2溶液，pH=2.0 調配。提供足夠之胜肽而得胜肽對鋅之比例為約15 : i之 23%胜肽半固體組合物。該組合物係依上述2 6節所述之方 法調配。所投予之胜肽劑量為約1 5 mg (相當於約65微升 之組合物）。 如第7圖所示，該組合物提供延長釋放之 (Aib8 3 5 )hGLPl(7-36)NH2。 同樣地所揭示之調配物之具有各種變更之進一步試驗 • 已進行活體内試驗且證實本發明之组合物可提供式（I)化合 物有用的藥物遞送平台。利用本案之教示，熟於此技藝者 可改變該胜肽、ZnCh之量以及pH而製備如本文所述之本 發明組合物。 【圖式之簡單說明】 第1圖描述對狗單一皮下（sc)投予約1 mg之 [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH2後，所得之血漿側繪（中數值）。 各例中該胜肽係呈辞水溶液組合物投予，該組合物包括約 1% (wt/vol)之胜肽以及胜肽：zn之莫耳比為約1.5。實心 44 1364292 方塊及空心方塊代表其中pH值如本文所述經Na〇H調整之 組合物；實心三角形代表其中pH值未經Na〇H調整之組合 物；實心圓形代表以AcOH/AcO —緩衝之組合物。 第2圖描述對狗單一皮下（s c )投予約出呂之 [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH2後，所得之血漿側繪（中數值）。 各例中該胜肽係呈鋅水溶液組合物投予，該組合物包括約 10¼ (wt/vol)之胜肽以及胜肽：Zn之莫耳比為約1 5。實心 鲁方塊及空心方塊代表其中pH值如本文所述經Na〇H調整之 組合物；實心三角形代表其中pH值未經Na〇H調整之組合 物；實心圓形代表以AcOH/AcO·緩衝之組合物。

第3圖指述對狗單一皮下（s c )投予約1 之 [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH2後，所得之血漿側繪（中數值）。 各例中該胜肽係呈半固體水性辞組合物投予，如下：實心 圓：約5%(Wt/V〇l)胜肽，胜肽：Zn之莫耳比為約5 4: ι， 未經pH調整，空心圓：約i〇〇/0 (wt/v〇1)胜肽，胜肽：zn # 之莫耳比為約5 ·4 : 1，未經pH調整；空心方塊：約丨〇% (wt/vol)胜肽，胜肽：Zn之莫耳比為約5 4:卜阳經Na〇H 調整；實心方塊：約10% (wt/vol)胜肽，胜肽：Zn之莫耳 比為約4 : 1，pH經NaOH調整。 第4圖提供用於製備本發明之特定調配物之各種裝置 之示意圖。 第5圖描述對狗單一皮下（s e_)投予約i瓜经之 [Aib8’35]hGLP-l(7-3 6)NH2後，所得之血漿側繪（中數值）。 該胜肽係呈鋅水溶液組合物投予，該組合物具有約2%之胜 45

Claims (1)

1364292 、申請專利範圍： I (1bi丨 種用於在一對象體内自GLP-1受體引起激動作用 之醫藥組合物，其包括下式（I)之化合物： [Aib1 2 3'35]hGLP-l(7-36)NH2 (I)； 鋅以及一稀釋劑，其特徵在於該式⑴化合物係以濃度為 〇.5%-30%(w/w)存在，且於該醫藥組合物中該式⑴化合物 對鋅之莫耳比的範圍係自54:1至15:卜其中該式⑴化合 物於該對象體内釋放至少約5天至約7天。 2,如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該稀釋 劑包括無菌水。 3, 如申請專利範圍第1或2項之醫藥組合物，其中該 水溶液中該式（I)化合物之濃度為1%、2%、5%、1〇%、23% 或 25 % (w/w) 〇 4. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該比例 為 5.4 : 1 ， 4.0 : 1 或 1.5 : 1 。 5· 如申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該比例 47 1 · 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該辞係 以氣化鋅或乙酸鋅提供。 2 . 如申請專利範圍第1或2項之醫藥組合物，其中該 醫藥組合物之pH係使用NaOH調整。 3 · 如申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中該醫藥 組合物之pH係使用NaOH調整，使得以0.9。/。NaCn稀釋至 1/2起始濃度時，可得到5.0-5.5之pH值。 1364292 i (2012年1月修正) 9. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該 GLP-1 (7-36)NHs配位體之受體係存在於動物對象體内。 10. 如申請專利範圍第9項之醫藥組合物，其中該對象 為人類。 ' n. 如申請專利範圍第10項之醫藥組合物，其中該人類 * 對象係患有’或具有發展出選自由I型糖尿病、II型糖尿 病、妊娠期糖尿病、肥胖、食欲亢進、飽足感不足、及代 謝失調所組成之疾病或病症之風險。 鲁 12. 如申請專利範圍第Π項之醫藥組合物，其中該疾病 為I型糖尿病或II型糖尿病。 13. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該組合物中 [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH22濃度為 1% (重量 /體積）。 14. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該組合物中 [Aib8’35]hGLP-l(7-3 6)NH2 之濃度為 2% (重量 /體積）。 15. 如申明專利範圍第5項之組合物，其中該組合物中 參 [AibUMhGLP-UlWNHz之濃度為1〇% (重量/體積）。 16. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該組合物中 [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH2 之濃度為 25% (重量 /體積）。 17. 如申請專利範圍第4項之組合物，其中該組合物中 [Aib8’35]hGLP· 1 (7-36)NH2之濃度為5% (重量/體積）以及該 比例為5.4 : 1。 18. 如申請專利範圍第4項之組合物，其中該組合物中 之濃度為5% (重量/體積）以及該 比例為4.0 : 1。 48 1364292 19. 如申請專利範圍第4項之組合物， [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH2 之濃度為 10% 該比例為5.4 : 1。 20. 如申請專利範圍第4項之組合物， ·. [Aib8,35]hGLP-l(7-36)NH2 之濃度為 1〇〇/0 . 該比例為4.0 : 1。 21. 如申請專利範圍第5項之組合物 [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH2 之濃度為 23% 鲁 22.如申請專利範圍第1項之組合物 物於該對象體内釋放至少約14天。 23. 如申請專利範圍第1項之組合物 物於該對象體内釋放至少約4週。 (2012年1月修正) 其中該組合物中 (重量/體積）以及 其中該組合物中 (重量/體積）以及 其中該組合物中 (重量/體積）。 其中該式⑴化合 其中該式（I)化合

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