TWI364292B

TWI364292B - Glp-1 pharmaceutical compositions

Info

Publication number: TWI364292B
Application number: TW095124004A
Authority: TW
Inventors: Miravete Resurreccion Alloza; Roland Cherif-Cheikh; Rigol Jose-Antonio Cordero; Zheng Xin Dong; Frederic Lacombe; Maestre Maria Dolores Tobalina
Original assignee: Ipsen Pharma Sas
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2006-06-30
Publication date: 2012-05-21
Also published as: US20120277151A1; AU2006265814B2; WO2007005738A3; CN101258163B; MX2008001468A; NZ565535A; TW200740456A; AU2006265814A1; EA200800181A1; US20070021339A1; WO2007005738A2; EA012287B1; KR20080028981A; NO20080552L; EP2441460A1; US8236759B2; CN101258163A; EP1904525A2; EP1904525A4; AR055346A1

Description

1364292 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於類升糖素胜肽-1之胜肽類似物，其醫藥可接受之鹽類，利用此類似物治療哺乳動物之方法以及關於含有該類似物之醫藥組合物用途。【先前技術】類升糖素肽-1(7-36)醯胺（GLP-1)是在腸道l細胞中藉由對升糖素前體前升糖素（preproglucagon)進行組織特異性後-轉譯處理而合成的 ’（Varndell，J.M.,etal.,J.Histochem Cytochem，1985 :33 :1080-6)且因進食而釋放進入血液循環。GLP-1的血漿濃度從空腹時約15 prno丨/L上升至餐後 40 pmol/L的高峰值。已證實，當血漿葡萄糖濃度在—定範圍内升高時，口服葡萄糖導致的企漿胰島素水平升高比由靜脈投予葡萄糖高三倍（Kreymann, B.，et al., Lancet 1987:2，1300-4)。這種由進食而造成騰島素釋放之增加，已知為腸促騰島素（incretin effect)效應，主要係由體液調節，而現在認為GLP-1是人體中最有效的生理性腸促胰島素。除了促胰島素作用，GLP-1還可以抑制升，糖素的分泌，延遲胃的排空（Wettergren A.，et al.，Dig Dis Sci 1993 :38:665-73)以及可能會增加周圍組織對葡萄糖的處理 (D Alessio，D.A. et al.，J. Clin Invest 1994:93:2293-6)。 1994年，有人觀察到單一皮下注射（s/c)GLP-l便可以使非胰島素依賴型糖尿病（NIDDM)患者的餐後血糖完全降至正常$&圍’便提出GLP-1之治療功效（Gutniak，M.K.，et 1364292 al·’ Diabetes Care 1994:17:1039_44)。這種作用經認為是通過增加胰島素釋放以及減少升糖素的分泌兩者而予以調節。再者，亦顯示靜脈注射GLP-1可延遲NIDDM患者的 •餐後胃排空（Williams，B.，et al.’ J. Clin Endo Metab 1996:81:327-3 2)。與磺醯尿素類藥物不同，glP-1的促騰島素作用係根據血糖濃度（Holz，G.G. 4th，et al，Nature 1993:361:362-5)。因此，在低血糖濃度情況下減低GLP-1-φ 調節之胰島素釋放可保護對抗嚴重的低血糖。此作用的結合使GLP-1擁有比目前用於治療nidDM的其他藥物獨特的治療優勢。許多研究顯示’當給健康人GLP- 1時，能顯著影響血糖水平以及胰島素和升糖素的濃度（〇rskov, C，

Diabetologia 35:701-71 1, 1992; Holst, J.J., et al.5 Potential of GLP-1 in diabetes management in Glucagon τττ Handbook of Experimental Pharmacology, Lefevbre PJ, Ed. Berlin, _ Springer Verlag，1996, p. 311-326)，而且這些作用都具有葡萄糖相關性（Kreymann，B.，et al·，Lancet ii:1300-1304，1987; Weir，G.C·，et al·，Diabetes 38:338-342，1989)。再者，對糖尿病患者同樣有效（Gutniak，M.， N. Engl J Med 226:13 16-1322, 1992; Nathan, D.M., et al., Diabetes Care 15:270-276，1992)’其可將II型糖尿病患者的血糖水平控制在正常範圍内（Nauck，M.A., et al., Diagbetologia 36:741-744, 1993)，並可以改善I型糖尿病患者對血糖的控制（Creutzfeldt，W.O·，et al.，Diabetes Care 19:580-586, V L· 可尤八’證實其增加胰島素敏感性/降低騰島素抗性之胰L二已提出將GUM及其激動劑用於具有發展出非- 好、、賴型糖尿病風險之對象中（參iwo⑼/_7)以用於治療姓娘期糖尿病(美國專利公開案第2〇〇4〇26667〇號）〇矛、前述外，已提出GLIM及其激動劑於嗜乳動物例如：人類，中尚有許多治療用途，包含，但非限於：改善學習，加強神經保護’以及/或減輕中樞神經系統之疾病或病症之症[例如，經由神經生成之調控，以及例如帕金森氏症、阿滋海莫症、亨丁頓舞蹈症（Huntingt〇n，s

Disease)、ALS、中風、ADD、及神經精神症候群 (neuropsychiatric syndromes)(美國專利公開案第 20050009742及200201156〇5號）；將肝臟幹細胞/原始細胞轉變為功能性胰臟細胞（WO03/033697);防止p細胞惡化（美國專利公開案第2004005381.9及20030220251號）以及刺激 β細胞增生（美國專利公開案第20030224983號）；治療肥胖 (美國專利公開案第20040018975號；W098/19698);抑制食慾及引起飽足感（美國專利公開案第20030232754號）；治療大腸激躁症（WO 99/64060);降低與心肌梗塞有關之發病率及/或死亡率（美國專利公開案第20040162241號， WO98/0853 1)以及中風（參見WO 00/16797);治療以缺乏q 波心肌梗塞為特徵之急性冠心症（美國專利公開案第 20040002454號）；減少手術後分解代謝的改變（美國專利第 6,006,753 號）；治療冬眠心肌（hibernating myocardium)或糖 1364292 尿病心肌病（美國專利公開案第20050096276號）；抑制正腎上腺素的血漿濃度（美國專利公開案第20050096276 號）；增加尿鈉排泄，降低尿鉀濃度（美國專利公開案第 20050037958號）；治療與毒性高血容量症有關之症狀或病症，例如，腎衰竭、充血性心衰竭 '腎病症候群、硬化、肺水腫以及高血壓（美國專利公開案第20050037958號）；引起肌力反應（inotropic response)以及增加心肌收縮能力 φ (美國專利公開案第20050037958號）；治療多囊性即巢症候群（美國專利公開案第20040266678及20040029784 號）’’/台療呼吸窘迫（美國專利公開案第20040235726號）；經由非-消化途徑（alimentaryroute)’亦即，經由靜脈、皮下、肌肉、腹膜或其他注射或滴注改善營養（美國專利公開案第20040209814號）；治療腎病（美國專利公開案第 20040209803號）；治療左心室收縮功能障礙，例如，具有異常之左心室射出率（ejection fracti〇n)(美國專利公開案第 _ 2004009741 1號）；抑制十二指腸腔能動性（antr〇 du〇denai motility)，例如，用於治療或預防腸胃病如腹瀉、術後胃傾倒症及腸激躁症，以及作為内視鏡程序之前置給藥（美國專 •利公開案第2〇〇30216292號广治療嚴重疾病多發性神經病 (critical illness p〇lyneuropathy，CIPN)以及全身性發炎反應症候群（SIRS)(美國專利公開案第2〇〇3〇199445號）；調節三酸甘油酯濃度及治療異常血脂症（美國專利公開案第 20030036504及20030143183號）；治療由局部缺血後血流之再灌注所造成之器官組織損傷（美國專利公開案第 1364292 20020147131號）；治療冠心病風險因子（CHDRF)症候群（美國專利公開案第20020045636號）；及其他。然而，GLP-1於代謝上不穩定，在體内血漿半衰期（t^) 僅1至2分鐘。經投予之外源性GLp_丨亦快速地遭分解 (Deacon, C.F.，et al., Diabetes 44:1126-1 131，1995)。此種代謝上之不穩定限制了天然的GLP-1之治療潛力。曾試圖通過改善藥物配方來增強GLP-1及其類似物的治療潛力。例如，國際專利公開案W0 01/57084便描述了生産類似物晶體之方法，宣稱此種晶體可用於製備醫藥組合物，例如注射藥物，包括該晶體及醫藥可接受之載體。 GLP 1(7-37)OH之異源性微晶體竊已經可從鹽溶液中培養出來，並可以鋅及/或間-甲酚進行晶體浸濕處理後對其進行檢查（Kim and Haren, Pharma. Res. Vol. 12 No. 1 1 (1995))。含有針狀晶體及非晶態沉澱之GLP(7_36)NH2粗製晶體懸浮液已由含有辞或魚精蛋白的鱗酸鹽溶液製備（PHdal，e[ al·, International Journal of Pharmaceutics Vol. 136, PP.53-59 (1996))。歐洲專利公開案Ep 〇619322A2中描述了藉由將蛋白質溶液在pH 7至8.5的緩衝液中與鹽和低分子量之聚乙二醇（PEG)之特定組合混合來製備微晶體型 GLP-1(7-37)QH的方法。尤其，美國專利第6 566 49〇號描述了 GLP-1的微晶體種植，宣稱其有助於純化胜肽産物的製備。美國專利第6,555,521號（US，521)揭示-種具有四角形扁平杆或平板狀之GLP-i晶體，宣稱其具有經改善之純度且展現出經延長之體内活性eUS，521認為此等晶體的 1364292 形態相對統一，在懸浮液中停留的時間比之前的晶體簇和非晶態晶體懸浮液長，宣稱該晶體會快速沉降、聚集或凝集，阻塞注射器針頭，使劑量更無法確定。已提出一種生物可分解之聚[(dl-乳酸-共-甘醇酸）-β-乙二醇-β-(-乳酸-共-甘醇酸）]之三段式共聚物其可用於 GLP-1之經控制之釋放調配物。然而與其他聚合物系統相似，三段式共聚物之製造涉及複雜之程序以及會形成不均勻之粒子。同樣地，亦已提出一種生物可分解.之聚合物，例如，聚（乳酸-共-甘醇酸）（PLGA)，用於胜肽之持續性遞送調配物。然而此技藝中已不贊成使用此等生物可分解之聚合物，因為這些聚合物於製造時通常難溶於水且需要水-不混溶之有機溶劑，例如二氣甲烷，以及/或嚴格的製備條件。此等有機溶劑以及/或嚴格的製備條件經視為可能會對有興趣之胜肽或蛋白質增加誘發構型改變之風險，造成結構元整性之降低且危及生物活性（Choi et al.，Pharm. Research V〇l· 21，No· 5,（2004))。聚二醇醚共聚物具有同樣的缺點。 (同上）。前述參考文獻中所描述的GLP-1組合物，於製備GLP 類醫藥調配物時不夠理想，因為其易於含有雜質以及/或另一方面不易重複性生產以及給藥。此外，已知GLP類似物在高濃度時會令人感覺噁心，所以需要提供持久的藥效，同時降低初始的藥物血漿濃度。因此’需要一種Glp _ 1調配物’其可以更簡單且可靠地生產製造、更簡單且可重複 1364292 地給藥，以及可提供經降低非所欲之副作用。的初始 ▲•漿濃度以減少或消除【發明内容；3 因此，如式（I) 本發明經㈣於下列段落以及中請專利範圍。發月之帛個目的為提供一種醫藥組合物其包括之GLP -1類似物： (Aib 8’35)hGLP -1(7-3 6)NH2 (I) 或其醫藥可接受之鹽’其中該組合物之調配物可提供優異之製造、投藥、藥物動力學及藥力學特性，以及經減弱之不良副作用。於該第-目的之第-方面，本發明提供一種醫藥組合物’其具有經改善之藥物釋放側繪，較佳為具有經降低之初始突釋（initial burst)。於該第一目的之第二方面，本發明提供一種醫藥組合物’其包括具有經延長作用時間之式（1)化合物。於該第一目的之第三方面，本發明提供一種醫藥組合物，其包括式⑴化合物或其醫藥可接受之鹽以及醫藥可接受之載劑或稀釋劑。較佳地該載劑或稀釋劑包括水。於該第一目的之第三方面之第一較佳具體實施例中，該醫藥組合物進一步包括鋅。更佳地，該醫藥組合物中鋅之濃度係自約0.0005 mg/mL至約50mg/mL。甚至更佳地，該醫藥組合物中鋅之濃度係自約〇.〇i mg/mL至約〇.50 11 1364292 mg/mL。更佳地，該醫藥組合物包括稀釋劑，其中該稀釋劑包括醫藥可接受之水溶液。該稀釋劑包括無菌水。更佳地，該醫藥組合物包括水性混合物、懸浮液或溶液，其中該式（I)化合物之濃度為約〇.5%-30% (w/w)。更佳地，該水性混合物、懸浮液或溶液中該式（I)化合物之濃度為約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、 20% ^ 21% ' 22% ' 23% ' 24% ' 25% > 26% ' 27% ' 28% ' 29%、或30°/〇 (w/w)。更佳地，該水溶液中該式（I)化合物之濃度為約 1 %、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、1 0%、 11%、14%、15%、16%、19%、20% ' 21%、22%、23%、 24%、25%、26%、29%、或 30% (w/w)。更佳地，該水溶液中該式（I)化合物之濃度為約1 %、2%、3%、4%、5%、6%、 9%、10%、11%、22%、23%、24%、25%、或 26% (w/w)。甚至更佳地，該水溶液中該式（I)化合物之濃度為約1 %、 2%、3%、4%、5%、6%、10%、22%、23%、24%、25%、或26% (w/w)。又更佳地，該水溶液中該式⑴化合物之濃度為約 1%、2%、5%、10%、23%或 25% (w/w)。「約」係指下列：於濃度方面約0.5%至約4%，目標值之士 0.5%為所欲之範圍（例如，0.5%至1.5%為約1%);於目標濃度方面約 5%及更咼，目標值之20%為所欲之範圍（例如，8%至丨2〇/〇為約10%) 於該第一目的之第三方面之第二較佳具體實施例中，該醫藥組合物進一步包括鋅，其中該醫藥組合物中該式⑴ 12 1364292 化σ物對鋅之莫耳比範圍係自約6 : 1至約1 : 1。更佳地，該比例範圍係自約5.5 : i至約i :】。又更佳地該比例範 •圍係自約5.4 . 1至約1.5 : !。甚至更佳地，該比例係自約 • 4 1 4.〇 . 1，或1 5 : 1。最佳地，該比例為約1.5 : 1。於本發明之此方面中約係指15: i之各目標值土1〇%之比例因此所預期之比例包括，例如1.3 5 -1.6 5 : 0.8 5 -1.1 5。較佳地，於本發明之第一目的之第三方面之第二較佳 • 具體實施例中，該醫藥組合物中[Α^8,35]1^υΜ(7-36)ΝΗ2 •之濃度為約（重量/體積）以及[Aib8,35]hGLP-l(7-36)NH2 對鋅之莫耳比為約1.5 : 1。亦較佳地，於本發明之第一目的之第三方面之第二較佳具體實施例中’該醫藥組合物中 [AW’WjhGLP-lCWN^之濃度為約2% (重量/體積）以及 [八11)8’35]11〇1^-1(7-36州112對辞之莫耳比為約15:1。又較佳地，於本發明之第一目的之第三方面之第二較佳具體實施例中’該醫藥組合物中[Aib8,35]hGLp i(7_36)NH2之濃度 i 為約ίο% (重量/體積）以及[Aib8,35]hGLp_1(7 36_2對辞之莫耳比為約1.5 : 1。再又較佳地、於本發明之第一目的之第三方面之第二較佳具體實施例中，該醫藥組合物中 [Aib8’35]hGLp-!(7-36)NH2 之濃度為約 23% 或約 25%(重量 / 體積）以及[Aib8’35]hGLP_l(7-36)NH2對辞之莫耳比為約 1.5:1。

較佳地，於本發明之第一目的之第三方面之第二較佳具體實施例令，該醫藥組合物中[Aibm]hGLIM(7_36)NH 之濃度為約5 °/。（重量/體積）以及該比例為約5.4 : 13 1364292 地，於本發明之第一目的之第三方面之第二較佳具體實施例中，該組合物中[Aib8,35]hGLP-l(7-36)NH2之濃度為約 5%(重量/體積）以及該比例為約4.(^ 1。亦較佳地，於本發明之第一目的之第三方面之第二較佳具體實施例中該組合物中[AiP’^hGLP-lQdG^H2之濃度為約1〇%(重量/體積）以及該比例為約5.4 : 1。再又較佳地’於本發明之第一目的之第三方面之第二較佳具體實施例中，該組合物中 [Ail/’^hGLP· 1(7_36)NH2之濃度為約1〇% (重量/體積）以及該比例為約4.0 : 1。較佳地，於該第-目的之第三方面之第二較佳具體t 施例中，該鋅係以氯化鋅或乙、釀辞提供。更佳地，該乙酸鋅係以ZnAc2.2H20提供。較佳地，於該第一目的之第三方面之第一及第二較佳具體實施例兩者中’該醫藥組合物之pH係使用鹼予以調

升:更佳地’該pH調整係使用Na〇H進行。又更佳地，該醫藥組合物之PH係、以Na〇H調整，使得使用〇 9%1^ 稀釋成約1,2之起始濃度時，利用直接電位測定所得之奸值為約5.0-5.5。、如熟於醫藥調配之技藝者所了解，本發明組合物之pH 可利用適當之„可接受之酸類及_進行比上述更廣範調聲最、、組合物之pH之進一步調整可調控參數例如，胜肽濃度、鋅濃度、及體内之釋放側繪。於該第一目本發明以該第三的之第二方面之第—較佳具體實施例中，方面之醫藥組合物為特徵’包含，獨立於

14 1364292 各事件’該第三方面之各較佳具體實施例，其中該組合物係經調配俾使式（I)之化合物可於有需要之對象體内（例 .. 如，哺乳動物，較佳為人類）長時間釋放。較佳地該化合物 • 之釋放可延長至少一小時’更佳為至少4、6、12、或24 小時。又更佳地，該組合物係經調配俾使式⑴之化合物可於—對象體内釋放至少36、48、60、72、84、或96小時。又更佳地，該組合物係經調配俾使式⑴之化合物可於一對 • 象體内釋放至少約5、6、7、8、9、、10、n、12、13、或 1 4天。又更佳地，該組合物係經調配俾使式⑴之化合物可於—對象體内釋放至少約2、3或4週。甚至更佳地，該組合物係經調配俾使式⑴之化合物可於一對象體内釋放至少約1、1.5、2、或3個月，或更久。本發明之第二目的為提供一種引起GLp_丨激動作用之方法，該方法包括將GLP· 1(7-3 6)NH2配位體之受體與式（I) 化合物接觸，式（I)之化合物可經由該第三方面之組合物直接或間接地提供給該受體，包含，獨立於各事件，該第三方面之各較佳具體實施例。 . 本發明之第二目的之第一較佳具體實施例中， ' LP 1(7_36)NH2配位體之受體係存在於動物對象體内，該對象較佳為靈長類，更佳為人類。因此，此具體實施例中本發明提供一種於有需要之對象體内自GLP-1受體引起激動作用之方法，其包括對該對象投予本發明之組合物，其中該組合物包括有效量之式（I)化合物或其醫藥可接受之鹽。 15 本"發"日月$楚_ 卑二目的之更佳的具體實施例中，該對象係患有’或具有發展出選自由j型糖尿病、Μ糖尿病、姓糖尿病、肥胖、食欲亢進、飽足感不足、及代謝失調所組成之在，戌+十+ 戌届或病症之風險之人類。較佳地該疾病為I型糖尿病或II型糖尿病。 ^ 弟—目的之另一更佳的具體實施例中，該對

象係患有下列疾病或病，症’或具有發展出下列疾病或病症八險之人類，該疾病或病症係選自由I型糖尿病、II型尿病肥胖、胰高血糖素瘤（giucagonomas)、氣管之分泌失調關節炎'骨質疏鬆症、中樞神經系統疾病、再狹窄、神里退化’疾病、腎衰竭、充血性心臟衰竭、腎病症候群、硬化肺水腫、高血麗、A其中需要減少食物攝取之病症、拖神、、’1系統之疾病或病症（例如，經由神經生成之調控，乂及例如帕金森氏症、阿滋海莫症、亨丁頓舞蹈症、、

以及神經精神症候群）、腸激躁症、心肌梗塞 (例如，降低與其有關之發.病率及/或死亡率）、中風、急性冠心症（例如，以缺乏Q波為特徵）心肌梗塞、手術後分解代謝的改變、冬眠心肌或糖尿病心肌病、尿鈉排泄不足、尿鉀濃度過量、與毒性高血容量症有關之症狀或病症（例如腎哀竭充血性心衰竭、腎病症候群、硬化、肺水腫以及同血壓）、多囊性卵巢症候群、呼吸窘迫、腎病、左心至收縮功能障礙，（例如’具有異常之左心室射出率）、腸胃病如腹瀉、術後胃傾倒症及腸激躁症，（亦即，經由抑制十一指腸腔能動性）、嚴重疾病多發性神經病（CIPN)、全身 16 1364292 •性發炎反應症候群（SIRS)、異常血脂症、由局部缺血後血流之再灌注所造成之器官組織損傷、以及冠心病風險因子 (CHDRF)症候群所組成之群組。該第二目的之另一方面中，本發明係以於有此需要之對象體内將肝臟幹細胞/原始細胞轉變為功能性胰臟細胞，防止β細胞惡化以及刺激p細胞增生，抑制正腎上腺素的血漿濃度，引起肌力反應以及增加心肌收縮能力，經 φ 由非-消化途徑（例如，經由靜脈、皮下、肌肉、腹膜或其他注射或滴注途徑）改善營養，對欲進行内視鏡程序之對象進行前處理，以及調節三酸甘油酯濃度之方法為特徵，該方法包括對該對象投予本發明之調配物，該調配物包括= 效量之式⑴化合物或其醫藥可接受之鹽。該對象較佳為哺乳動物’更佳為靈長類，又更佳為人類。【實施方式】本文中本發明之胜肽於係由下列格式表示，例如， (ΑΜ，35)1^ρ_1(7_36)ΝΗ2，第一組括弧中之原序列具有缓取代之胺基酸（例如，Aib8,35代表於hGUM中係以取代Ala8& Gly35)eAib為α_胺基異丁酸之縮寫。縮寫Gw] 係指類升糖素肽·丨；hGLPd係指人類類升糖素肽_丨。第二組括弧中的數字係指胜肽中存在之胺基酸數（例如， hGLP_1(7-36)係指人類GLP-1胜肽序列中的第7到％個胺基酸）°hGLP-l(7-37)之序列係列於 Mojsov, S.，Int 了

Peptide Protein Res” 4〇，1992, pp. 333-342。 17 1364292 hGLP-l(7_36)NH2巾「而2」代表胜肽之c端已酿胺化。 hGLP-1(7-36)表示C端為游離酸。除非另行說明， hGLIM(7-38)中，位置37及38之殘基分別為吻及化。 . 有利地’本發明中所使用之胜肽可呈醫藥可接受之鹽類的形式提供。此等鹽類之實例包含，但非限於與有機 ^⑴如乙I、乳酸、順丁埽二酸、擰檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥辑酸'苯甲酸、曱烷磺酸、甲笨磺酸、或雙羥 _ 萘酸（pam〇icaCid))，無機酸（例如，鹽酸、硫酸、或磷酸），以及多元酸（例如，單寧酸、羧曱基纖維素、聚乳酸、聚羥基乙酸、或聚乳酸·羥基乙酸之共聚物）所形成之鹽類。製造本發明胜肽之鹽類的典型的方法為熟於此技藝者所知悉，其可藉由鹽之置換反應標準方法而得到。因此，本發明胜肽之TFA鹽（該TFA鹽係經由使用製備性HpLC，以含 TFA之緩衝液進行洗提純化該胜肽而得）可轉變為另一種鹽，例如藉由將該胜肽溶解於少量之〇.25n之乙酸水溶液鲁而可得乙酸鹽。將所得之溶液施用於半-製備性HpLC管柱 (semi-prep HPLC column ’ Zorbax，300 SB, C-8)。將管柱以 (1) 0.1N乙酸錢水溶液洗提〇·5小時，（2) 〇 25N乙酸水溶液洗提〇·5小時，以及（3)以4 ml/min流速之線性梯度（2〇% 至1 00%之溶液B洗提3 0分鐘以上）洗提（溶液A為〇 25N 之乙酸水溶液；溶液B為0.2 5N之乙酸，其係溶於乙睛/ 水’ 80: 20)。收集含有該胜肽之分液且冷束至乾。如熟於此技藝者所知，GLP-1已知之用途和潛在用途為多種多樣的（參見 Todd，J.F.，et al., Clinical Science 1998 18 1364292 95, pp.325-329 , A Todd, J.F. et al.} European Journal of

CnnicalInvestigation，1997,27 pp 533-536)。因此，為了引起激動效應之目的’投予本發明化合物可產生盘使用

本身一樣的效果eGUM之各種用途總結如下，其係用於治療：I型糖尿病、Π型糖尿病、肥胖、騰高灰糖素瘤、呼吸道分泌失調、代謝失調、關節炎、骨質疏鬆症中樞神經线疾病' 再狹窄、神經退化性疾病、腎衰竭、充血性心臟表竭、腎病症候群、硬化、肺水腫、高灰壓、需要減少食物攝入之病症、以及本文所討論之各種其他症狀及病症。因此’本發明之範圍包含本文所界定之醫藥組合物，該組合物係以式⑴化合物作為活性成分。本發明之調配物中活性成分之劑量係可變的；然而，其含量必須達到適當之劑量。所選擇之劑量係取決於欲達到的療效、投藥途徑、及治療時間，料常由主治醫生決定。一般，本發明之活性作用的有效劑量係在1χ1〇_7至2〇〇 mg/kg/日’較佳為1χ1〇-4至1〇〇日之範圍，其可以單一劑量投予，或分成多個劑量投予。本發明之調配物較佳係由非腸胃途徑投予，例如，肌肉庄射、腹膜注射、靜脈注射、皮下注射等。本發明之非腸胃途徑投予之製劑包含無菌之水性或非水性溶液、懸浮液、凝膠、或乳液，惟其於體内可連到所欲之釋放側緣。非水性溶劑或載劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油，例如撖欖油及玉米油、明膠及可注射之有機醋類’例如油酸乙酯。這些劑型亦可包含佐劑，例如防 19 U64292 腐劑㈤/‘#、劑、礼化劑、及分散劑。其可經以下方式滅菌，例如，經由細菌-阻隔過濾器（bacteria retaining fmer)之過 /慮作用’於該組合物中加入消毒劑，以放射線照射該組合物，或將組合物加熱。纟亦可製成無菌之固體組合物形式，於使用刖使該固體組合物立即溶解於無菌纟或其他某些無菌之注射介質中。胜肽之合成為實行本發明所使用的胜肽可由標準的固相胜肽合成法予以製備。參見’例如，stewart，; M，et al，s〇lid phase

Synthesis (Pierce Chemical Co., 2d ed. 1984) 〇 - 下列實施例中說明可使用之製造胜狀的合成方法而有利於實行本發明’ Λ等合成方法為熟於此技藝者所知悉。熟於此技藝者亦知道其他方法。該等實施例僅用以說明之目的而非欲以任何方式限制本發明之範疇。

Boc-pAla-OH、Boc-D-ArgCTospOH 及 B〇C-D，Asp(0cHex)係購自 N〇va Bi〇chem，^ ❿⑼， California 〇B〇c-Aun_OH 係購自 Bachem King〇fprussia， PA。Boc-Ava-OH 及 B〇c_Ado_〇H 係購自 Chem Impex International，Wood Dale，IL。B〇c 2Nal 〇H 係購自

Synthetech，lnc· Albany, OR。本文中所使用之其他縮寫的全名如下：Boc為第三-丁氧基羰基，HF為氟化氫，Fm為甲醯基，Xan為黃嘌呤酸基，Bzl為苯甲基’ T〇s為苯甲磺醯基，DNp為2,4_二硝基笨基，DMF為二曱基甲醯胺，DCM為二氯曱烷，hbtu為 20 1364292 2-(1Η-苯并三唑-l-yl)-l，l，3,3_四甲基六氟磷酸尿鏽，DIEA 為二異丙基乙胺，HOAc為乙酸，TFA為三氟乙酸，2C1Z • 為2_氣苯甲氡基羰基，2BrZ為2-溴笨甲氧基羰基，〇cHex 為〇-環己基，Fmoc為9-第基甲氧基羰基，HOBt為N-羥基苯并二唑’ PAM樹脂為4-羥基曱基苯基乙醯胺基曱基樹脂’ Tris為三（羥曱基）胺基甲烷，以及Bis_Tris為雙（2_ 羥乙基）胺基·三（羥甲基）曱烷（亦即’ 2-雙（2-羥乙基）胺基 • -2-(羥甲基）-丨，3-丙二醇）。「鹵基」或「鹵素」包括氟基、氣基、溴基、以及碘基。除非另行界定，否則本文中使用之所有技術及科學用网之意義與熟於本發明所屬之領域之人士所理解者相同。再者，本文中提及之所有刊物、專利申請案、專利、及其他參考資料之内容係以參考資料合併於本文。【實施例】實施例1 (Aib8’35)hGLP_l(7-36)NH2 (Aib8’35)hGLP-l(7-3 6)NH2之詳細的合成程序已由國際專利公開案WO 00/3433 1 (PCT/EP99/09660)提供，其全部内容係合併於本文。簡言之，該化合物係以Applied

Biosystems (Foster City，CA) 430A 型胜肽合成儀合成，此儀器已經修改俾用於加速Boc_化學固相胜肽合成。參見 Schnolzer, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 90:180 (1992)。使用0.91 mmol/g之4·曱基二苯曱胺（MBHA)樹脂 (Peninsula，Belmont, CA)進行置換。Boc 胺基酸（Bachem， 21 1364292 CA，Torrance, CA; Nova Biochem·，LaJolla, CA)係與下列側鏈保護基一同使用：Boc-Ala-OH、Boc-Arg(Tos)-OH、 Boc-Asp(OcHex)-OH、Boc-Tyr(2BrZ)-OH、 Boc-His(DNP)-OH ' Boc-Val-OH ' Boc-Leu-OH ' Boc-Gly-OH ' Boc-Gln-OH ' Boc-Ile-OH ' Boc-Lys(2ClZ)-OH、Boc-Thr(Bzl)-OH、Boc-Ser(Bzl)-OH、 Boc-Phe-OH、Boc-Aib-OH、Boc-Glu(OcHex)-OH 及 Boc-Trp(Fm)-OH。Boc 基團係以 100% TFA 處理 2 x 1 分鐘而予以移除。.Boc胺基酸（2·5 mmol)以HBTU (2.0 mmol)及 DIEA (1.0 mL)於4 mL之DMF中預先活化，且偶合前不需對胜肽-樹脂TFA鹽進行中和。偶合時間為 5分鐘，除了 Boc-Aib-OH 殘基及下列殘基，Boc-Lys(2ClZ)-OH 及 Boc-His(DNP)-OH外其中該偶合時間為 2小時。在胜肽鏈裝配結束時，將樹脂以20%酼基乙醇/1 0% DIEA於DMF溶液中處理 2 X 30分鐘以移除His側鏈上之 DNP基團。藉由以1 00% TFA處理2x2分鐘以移除N端之 Boc基團。於以溶於DMF之10%之DIEA中和該胜肽-樹脂後（1 X 1分鐘），Trp側鏈上的曱醯基係以15%乙醇胺/15% 水/70% DMF之溶液處理 2 X 30分鐘予以移除。以〇]^? 及DCM洗滌胜肽-樹脂，並於減壓下乾燥。於0°C下在含有1 ml苯甲醚及二硫蘇糖醇（24 mg)之10 ml HF中攪拌該胜肽-樹脂75分鐘後完成最後的裂解。以氮氣流移除 HF。殘質以乙醚（6 X 10 mL)洗滌且以4N HOAc (6 X 10 mL)萃 22 1364292 水性萃取物中之胜肽混合物係以逆相製備性之高壓液相層析術（HPLC)，使用逆相VYDAC㊣Cl8管柱（Nest Gr〇up， • Southb〇r〇ugh，MA)進行純化。將管柱以1〇mL/min之流速 _ 進行線性梯度之洗提（2〇°/。至50%之溶液B洗提1〇5分鐘以上）（溶液A:含〇. 1% TFA之水；溶液B =含〇丨％ tfa之乙腈）。收集分液且以分析性HPLC進行檢驗，將含有純産物者合併’以及將其凍乾。此化合物之一合成實例中，得到 • 約135mg之白色固體。根據分析性HPLC的分析，純度為 „ 98.6%。由電喷灑質譜儀（MS(ES))S之分析算出分子量為 3339.7 (與之前計算的分子量3339·7 一致）。實施例2

調配程序I ?·1材料，儲借溶液，計糞材料：ZnCl2、NaOH顆粒、及鹽酸，35%，係得自Panreac Quimica，Barcelona，Spain。WFI (無菌注射用水（冗1〇犷 • injection)/沖洗用水）係得自 B. Braun Medical，Barcel()na, Spain ° B)儲備溶液 (Π ZnCli，pH==3 :— 1. 攪拌下，於WFI中添加35% HC1以達到pH=3。 2. 於量瓶中，加入經秤量之ZnC12。攪拌下，加入pH=3 之HC1以達到最終濃度約！至4mg2ZnCl2/mL。 ΠΠ ZnCl，. = 2 : 1.攪拌下，於WFI中添加35% HC1以達到pH=2。 23 1364292 2.於量瓶中，加入經秤量之ZnC11 2 3 4 5 6 7。攪拌下，加入pH=2 之HC1以達到最終濃度約4至12 mg之ZnCl2/mL。 ·· 〇.ii) Na〇l· 0.1 ξ, l〇 mg/ml ： _ _ 1 ·於量瓶中，加入經秤量之NaOH »授拌下，加入 WFI以達到最终濃度約〇」至1〇 mg之Na〇I1/mL。 24 1 也）冷束之 20 mg 等份小瓶： φ 1.製備乙酸與WFI之0.04% (v/v)稀釋液。 2.於量版中，加入經秤量之（Aib8,35)HGLP-l(7-36；)NH2 (乙皱鹽）。攪拌下，加入足量之〇〇4%乙酸使最終濃度為 20 mg (Aib8,35)HGLp_1(7_36)NH2/mL。使用〇 45 微米之過慮器進行過濾除菌後，將1 ml等份之溶液轉移至凍乾小瓶’予以冷凍乾燥及將乾燥之產物儲存於-22°c。 1^)冷表二乾燥之 50 mg 箄份 iAib8,35mrTT P-1 ' — 小瓶： Φ 1.製備乙酸與WFI之0· 1 % (v/v)稀釋液。 2 .於量瓶中，加入經秤量之（Aib8,35)HGLP-1(7-36)NH2 3 (乙酸鹽）。攪拌下，加入足量之0.1%乙酸使最終濃度為50 mg (Aib8,35)HGLP-l(7-36)NH2/mL。過濾除菌後，將 1 ml 4 等份之溶液轉移至凍乾小瓶且予以冷凍乾燥。 5 C)計t 6 (0測定組合物之賦形劑（E)之總重/體積： 7 E = (A X 100/T)-(A/P) 8 其中： 1364292 賦形劑，單位為mg A=純胜肽之含量（mg); Τ'-組合物之目標濃度；例如，若目標為2%時τ為2 . 以及 ’ p==純胜肽之濃度（mg胜肽/1〇〇 mg調配物）相對於賦形劑之總體積，假設1 mL = 1 g。 (ii) 測定於每毫升或公克之組合物溶液中所添加之 ZnCl2之體積/重量（w): a) W= 100%之E時該組合物未進行pH調整； b) W=80%之E時該液體調配物中胜肽為約1 %，或約 2%或高達約10%以及pH係使用鹼調整； c) W=50%之E時該半-固體或凝膠調配物中胜狀為約 1 %，或約2%或高達約1 0%以及pH係使用驗調整； d) W=66.66%之E時該半-固體或凝膠調配物中胜狀為約25%以及pH係使用鹼調整； e) W=90%之E時該調配物中胜肽1係由冷;東乾燥製備物重建以及pH係使用驗調整。. (iii) 測定於各毫升或公克之組合物溶液中所添加之 NaOH之體積/重量（W): .a) W=20%之E時該調配物中胜肽為約1%，或約2〇/〇或高達約1 〇°/〇以及PH係使用鹼調整； b) W=50%之E時該半-固體或凝膠調配物中胜肽為約 1 %，或約2%或高達約10%以及pH係使用鹼調整； c) W=33.3 3 %之E時該半-固體或凝膠調配物中胜肽 25 1364292 為約25%以及pH係使用鹼調整； d) W= 10%之E時該調配物中胜肽係由冷凍乾燥製備 .. 物重建以及pH係使用鹼調整。 _ (iv)測定於各組合物中所使用之ZnCh之濃度（mg/ml或 mg/g) [ZnCl2] = (136.29 x A)/(W x 3339.76 x R) 其中： ^ A=純胜肽之含量（mg); R=胜肽/Zn之莫耳比 R=1.5時調配物中該胜肽為約1%，或約2%或約1〇% 或高達約23% ; R=4.0時調配物中該胜肽為約25% ;以及 W=於每公克或毫升之組合物溶液中所添加之znci2之重量（g)或體積（mL)。製備具有1-10%冷康-乾燥之胜肽及ZnC丨2，Η表調替 • PH之組合物如本文所使用’具有特定百分比胜肽之調配物係表示該組合物之總重中具有特定重量胜肽之調配物，例如，1% 胜肽，表示每100g之總組合物中具有lg胜肽之調配物。具有約1 %，或約2%高達約1 〇。/。胜肽之調配物係如下述製備。將前述製備之（Aib8’35)HGLP-l(7-36)NH2之冷凍-乾燥樣本與100%之總賦形劑體積之pH 3之ZnCl2儲備溶液徹底混合且[胜肽：Zn] = 1.5 : 1。 A) 1°/。之組合物係藉由將2〇 mg冷凍-乾燥之 26 1364292 (Aib⑶）HGUM(7_36)NH2 (參見上述 2」b (iv))與 2 d 之 ZnCh溶液(0.272 mg/ml，·參見上述2」B⑴)混合而製備 B) 2%之組合物係藉由將2〇 mg冷凍乾燥之 (AibU)HGLP-1(7_36)NH2 (參見上述2」b㈣)與工μ之 ZnCl2溶液(0.544 mg/ml，·參見上述2」B⑴)混合而製備 C) 10%之組合物係藉由將50 mg冷凍乾燥之 (Aib8>35)HGLP-l(7-36)NH2(#^_Li4 2.1 B (v))^ 〇.45 ml 之ZnCl2溶液（3.023 mg/ml ;參見上述2」b⑴）混合而製備使冷凍-乾燥之胜肽以及溶液舆室溫平衡。將指定體積之〜⑶溶液注人至含有冷;東·乾燥胜肽之小瓶中且使1% 或2%之胜肽组合物進行約2分鐘之水合作用以及使“％之胜肽組合物進行約60分鐘之水合作用，或直到所有冷凍_ 乾燥胜肽完全水合且該溶液中不含胜肽團塊。水合作用後’將重建之胜肽搖動約1分鐘。取適量之經溶解之胜肽進行投藥，例如，1〇〇 μ1之上迷Α所製備之！/❶的胜肽溶液等於i mg劑量，5〇 μ之上述所製備之2%的胜肽溶液等於丨mg劑量，丨5 〇卜丨之上述c 所製備之1 〇%的胜肽溶液等於1 5 mg劑量，等。利用本案之教示，熟於此技藝者可改變該胜肽以及 ZnCl2之量而得到除了下述1%、2%及1〇%之組合物以外之組合物以及所欲之劑量。具有1-10%冷凌-乾燥之胜肽及znC丨，，且經調整合物具有約1% ’或約2%高達約1 0%胜肽之調配物係如下 27 丄述製備。將前述製備之（Ai 8,35 )HCjLP-1(7_36)NH2 之冷凍-乾燥樣本與9G%之總賦形劑體積之PH3之ZnCl2fst備溶液徹底混合。藉“加稀釋之NaQH^液得到所欲之溶液的 pH值。 A) 1 /〇之組合物係藉由將2〇冷凍乾燥之 (Aib8’35)HGUM(7·36)叫（參見上述 2」B (iv)m u ml 之ZnCl2溶液（參見上述2.1 B (i))混合而製備 B) 2%之組合物係藉由將2〇 mg冷凍乾燥之 (Aib )HGLP-1(7-36)NH2(參見上述 2.1 b (iv))與〇.9 ml 之ZnCl2溶液（參見上述2.1 B (i))混合而製備 C) 10/〇之組合物係藉由將5〇 mg冷象·乾燥之 (八化8’35)冊1^-1(7-36)1^2(參見上述2^卜））與0_4〇1111 之ZnCl2溶液（參見上述2·1 B (i))混合而製備於上述溶液中，添加所需體積（賦形劑之總體積之10%) 之經稀釋之NaOH溶液以達到目標濃度及pH值。例如，於各： 1 %之級合物：添加〇 2 mL之NaOH溶液以得到適當之 >1 Μ 2〇/〇之組合物：添加0.1 mL之NaOH溶液以得到適當之濃度 10%之組合物：添加〇.〇5 mL之NaOH溶液以得到適當之濃度利用本案之教示，熟於此技藝者可改變該胜肽以及 ZnCl2之量而得到除了下述1%、2%及10%之組合物以外之 28 J364292 Μ 組合物。 ^•4^^&^^10。/〇之胜肽及乙11(：丨，，且未調替1>11之洚機 ^Μ- -- 具有約1G/。’或約2%高達約10%胜肽之液體調配物係 - 如下述製備。枰取（Aib8,35)HGLP-l(7-36)NH2之樣本以及與 pH 3之ZnCh儲備溶液混合而得目標濃度為1%、2g/o、高遠10%之胜肽。混合後’將該組合物過濾除菌及儲存直到取用。籲 2·^_ΑΑ·1ιΑ—1-10%之胜肽及ZnCl,，且經調# nH之液雜如.合物具有約1°/。，或約2%高達約1 0%胜肽之液體調配物係如下述製備。秤取（Aib8,35)HGLP-l(7-36)NH2之樣本以及與 80%之總賦形劑體積之pH 3之ZnCh儲備溶液徹底混合。

該鋅溶液可為ZnCh或ΖηΑ〇2·2Η2〇。藉由添加稀釋之Na〇H 溶液得到所欲之溶液的pH值。利用此方法製備製備物C5 φ 至 C13。利用本案之教示’熟於此技藝者可改變該胜肽以及 ZnCl2之量而得到除了本文所述之ι%、2%及以外之組合物。 25%之胜肽及ZnCh，且夫調答pH之丰-固艚 /凝膠紐么4*7 具有約25%胜肽之半-固體或凝膠調配物係如下述製備。秤取（Aib8’35)HGLP-l(7-36)NH2 之樣本以及與 66.66% / 之總賦形劑體積之pH 2之ZnCl2儲備溶液徹底混合。該鋅 29 1364292 溶液可為ZnCl2或ZnAc2.2H2〇i用此方法製備製備物ci 及C2 〇更具體地，該半-固體或凝膠組合物係利用「推-拉」式混合法製備： a) 秤取所欲用f之職並將其裝載至預先安裝特定之雙向手動閥（hand valve，HV)(I.D.=〇 5 _之拋棄式注射器 S1之筒中以及將管子置於該注射器Luer孔内； b) 將注射器之活塞以不鑛鋼棒sr關緊； C) S1之HV係連接至真空源且Hv為開啟的。1〇分鐘後關閉HV ; d) 精確地秤取鋅溶液並將其裝載至第二拋棄式注射器 S2之筒中； e) 然後將S2與HV之可用部分連接； f) 開啟HV以及藉由真空將溶劑引至含有胜肽粉末之 S1之筒中； g) 關閉HV以及取出溶劑注射器S2，因而使S1中之胜肽粉末水合； h) 移除SR且緩慢地鬆脫該注射器活塞； 0移動該注射器活塞（推及拉），並未開啟HV ,使得該粉末物質完全浸於溶劑中； j) 將雙向不鏽鋼連接器sc (I.D =1 〇 mm)置於注射器 S2(其具有置於該注射器Luer孔内之管子）中，以及將其活塞推至末端； k) 開啟S1之HV以排除真空然後移除HV。移動該注 30 1364292 射器活塞使該注射器筒中之空氣減至最少；以及 1)將S1及S2藉由sc連接以及該組合物經由SC自S1 捏製至S2。利用本案之教示，熟於此技藝者可改變該胜肽以及 ZnCl2之量而得到除了本文所述之25%以外之組合物。備具有25%之胜肽及ZnCl,，且經調整dH之车-囡截 /凝勝组合物 φ 具有約胜肽之半-固體或凝膠調配物係如下述製備。秤取（Aib8’35)HGLP-l(7-36)NH2 之樣本以及與 66.66% 之總賦形劑體積之pH 2之ZnCh儲備溶液徹底混合。該鋅溶液可為ZnCh或ΖηΑ(^·2Η2〇。藉由添加稀釋之Na〇H溶液得到所欲之溶液的pH值。此實施例中，於粉末中所添加之液體的總體積應分成辞及NaOH溶液。因此，調整辞溶液之濃度，俾使所需之辞溶液之總體積減少至添加於該胜肽粉末（步驟d)之總液體體積之50%。其餘5〇%之添加於該 • 胜肽粉末之總液體體積如下述係以NaOH溶液添加。利用此方法製備製備物C3及C4。該PH值經調整之半-固體或凝膠組合物係利用「推-拉式混合法製備： a)秤取所欲用量之胜肽並將其裝載至預先安裝特定之雙向:動閥HV(I.D. = 0.5mm)之拋棄式注射器“之筒中以及將g子置於該注射器Luer孔内； b)將左射器之活塞以不鑛鋼棒sr關緊. O S1之HV係連接至真空源且Hv為開啟的 31 1364292 後關閉HV ; d) 精確地秤取辞溶液並將其裝載至第二抛棄式注射器 S2之筒中； ' e) 然後將S2與HV之可用部分連接； f) 開啟HV以及藉由真空將溶劑引至含有胜肽粉末之 S1之筒中； g) 關閉HV以及取出溶劑注射器S2，因而使S1中之胜 ^ 肽粉末水合； h) 移除SR且緩慢地鬆脫該注射器活塞； 0移動該注射器活塞（推及拉），並未開啟Hv，使得該粉末物質完全浸於溶劑中； j) 將雙向不鏽鋼連接器SC(I.D.= 1〇mm)置於注射器 S2(其具有置於該，主射器Luer孔内之管子）中，以及將其活塞推至末端； k) 開啟S1之HV以排除真空然後移除ηv。移動該注 Φ 射器活塞使該注射器筒中之空氣減至最少； l) 將S1及S2藉由SC連接以及該組合物經由SC自S1 捏製至S2 ; m) 均質化後’取出該混合產物之等份以測定該胜肽之濃度； η)精確地秤量其餘中間整體產物以及計算為達到所欲 ΡΗ值所需之NaOH溶液量；〇)精確地秤取NaOH溶液並將其裝載至第三拋棄式注射器S3中；以及 32 1364292 P)緩慢地壓下該注射器活塞使該注射器腔室中之空氣減至最少。兩注射器係藉由SC連接以及該組合物係經由 SC捏製。利用本案之教示，熟於此技藝者可改變該胜肽以及 ZnCl2之量而得到除了本文所述之25%以外之組合物。表1

實施例 *胜溶液料胜肽：編號肽％ Zn之比例劑量 C1 10 Zn〇2 0.846 mg/ml 5.4 : 1 lmg C2 5 0.40mgZnCl2/mL 5.4 ： 1 lmg C3 10 50%ZnCl2 1.69mg/mL > 50%NaOH 1 m^mL 5.4 ： 1 lmg C4 10 50%ZnCl22.28mg/mL > 50%NaOH 1 mg/mL 4:1 lmg C5 5 80% ZnCl2 0.674 mg/mL > 20% NaOH 3.81 mg/mL 4:1 lmg C6 2 80% ZnCl2 0.26 mg/mL , 20% NaOH 2.15 mg/mL 5.4 ： 1 lmg C7 10 80% ZnCl2 3.81 mg/mL > 20%NaOH 4.47 m^mL 1.5 ： 1 lmg C8 10 1 80% ΖηΑ〇2.2Η20 2.3 mg/mL > 20% NaOH 6.1 mg/mL 4:1 lmg C9 2 80% ZnCl2 0.695 mg/mL，20% NaOH 1.75 mg/mL 1.5 : 1 lmg C10 2 80%ZnAc22H201.12mg/mL »20%NaOH 1.44mgtoL 1.5 : 1 lmg C11 2 80%ZnCl2 0.695 m^mL > 20% NaOH 1.75 mg/mL 1.5 ： 1 lmg C12 1 80% ZnCl2 0.384 mg/mL > 20% NaOH 0.875 mg/mL 1.5 ： 1 lmg C13 10 80% ZnCl2 3.85 mg/mL, 20% NaOH 4.47 mg/mL 1.5 ： 1 15 mg 33 1364292 細胞培養：將RIN 5F大鼠胰島素瘤細胞(ATCC-# CRL-2058， American Type Culture Collection, Manassas, VA)，可表現 GLP-1受體，培養於含有1 0%胎牛血清之杜貝可改良之依格培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium)，且於 5% CO2/95°/0空氣之潮濕氛圍下維持於約37°C。放射性配位體之結合：為進行放射性配位體結合研究，將存在於20 ml之冰冷的 50mM Tris-HCl 中之 RIN 細胞以 Brinkman Polytron (Westbury，NY)(設定6，1 5秒）均質化而製備膜。藉由離心（3 9,000 g / 10分鐘）洗滌該均質物兩次，以及將最終之粒狀物再懸浮於50 mM Tris-HCl，其含有2.5 mM MgCl2、 0.1 mg/ml 之桿菌肽（Sigma Chemical，St· Louis, MO)、以及 0.1% BSA。關於試驗，於含有或不含0.05 mi之未標記之競爭測試胜肽下，將等份（0.4 ml)與0.05 nM之 (125I)GLP-1 (7-36) (-2200 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA)培養。培養loo分鐘後（25〇C)，藉由GF/C濾膜 (Brandel，Gaithersburg，MD)之快速過濾而自游離者中分離出經結合之（125I)GLP-l(7-36)，該濾膜事先已浸潰於0.5% 聚乙亞胺中。然後將該濾膜以5 ml等份之冰冷的5 0 mM Tris-HCl洗滌三次，以及經由γ度譜術（Wallac LKB， Gaithersburg，MD)計算經捕捉於濾膜上之經結合之故射活性。專一性結合係界定為總（l25I)GLP-l(7-36)結合量減去於 1000 nM GLPl(7-36) (Bachem，Torrence, CA)存在時之結 34 1364292 合量。 4·測定溶解唐vs ρΐτ芦衝鹽木中測定化合物溶解唐vs pH佶利用下述程序可有益地測定該用於實行本發明之化合物於不同pH值及溫度下於PBS中之溶解度。將一包預-混合之粉末（SIGMA, Product No.: P-38 13)溶於1公升去離子水中以製造PBS緩衝之儲備溶液，而得ι〇 mM磷酸鹽-緩衝之鹽水具有138 NaCl、2.7 mM KC1、及pH為7.4。具有不同pH值之PBS緩衝液可經由以磷酸及/或氫氣化鈉調整此儲備溶液之pH值而製造。於玻璃小瓶中秤取2 mg之欲測試之化合物樣本，例如’ 2 mg之實施例i之化合物。於各小瓶中添加5 〇 μ1等份之特定pH值之PBS緩衝液。使該溶液產生渦動，以及若需要予以超音波震盪，直到澄清。於各pH測試項中，記錄溶解2 mg化合物所需之緩衝液的總體積且’計算該溶解度。將於室溫（20-25。〇下澄清之胜肽溶液置於冷藏室（4°c) 中一整夜然後檢測該胜肽於4°c之溶解度。 1^2.於鹽水中測定化合物滚解唐vs pH ft 利用下述程序可有益地測定該用於實行本發明之化合物於不同pH值及溫度下於鹽水中之溶解度。將9克之NaCl溶於1公升之去離子水以製備鹽水儲備溶液。具有不同pH值之鹽水溶液可經由以HC1及/或Na〇H 調整此儲備溶液之pH值而製造。 35 1364292 於玻璃小瓶中秤取2 mg之欲測試之化合物樣本，例如’ 2 mg之實施例1之化合物。於各小瓶中添加5〇 μι .等份之特定pH值之鹽水液。使該小瓶中之溶液產生渦動，以及若需要予以超音波震盪’直到澄清。於各測試之p Η值中，記錄溶解2 mg化合物所需之鹽水的總體積且計算該溶解度。將於室溫（20-25°C )下澄清之溶液置於冷藏室（4〇c )中一整夜然後檢測4。(：下之溶解度。 1.3 ·測定於dH 7 · 0鹽水中之化厶物之溶鲜疮利用下述程序可有益地測定該用於實行本發明之化合物於室溫及pH=7之鹽水中之溶解度。將9克之NaC1溶於i公升之去離子水以製備鹽水溶液。於玻璃小槪中秤取2 mg之欲測試之化合物樣本，例如，實施例1之化合物，以及添加丨mL等份之鹽水，使溶液產生滿動以及予以超音波震盪’直到澄清。記錄溶解2叫胜肽所使用之鹽水的總體積且計算室溫下之溶解度。 4.4.測支於各種· 利用下述程序可有益地測定剌於實行本發^ 物於室溫及各種pH值之鹽水中之溶解度。口將9克之NaCl溶於！公升 . .曰士々你去離子水以製備鹽水儲備溶液。、有各種pH值之鹽水溶液可經由將此之等份以11(：1及Na〇H處理而得。欺=備溶液於玻璃小版中粹取2mg之欲測試之化合如’實施例1之化合物。添加5。,1等份之特定pH本信例 u \ Ρϋ值之® 36 U64292 水緩衝液。使該溶液產生渦動以及予以超音波震盪，直到澄清。記錄溶解2 mg胜肽所使用之緩;衝液的總體積且計算溶解度。化合物^丞溶液溶解唐vs辞澧唐利用下述程序可有益地測定該用於實行本發明之化合物於具有不同鋅濃度之pH 7之水中之溶解度。將ZnCl2溶於去離子水中使濃度為100 mg/ml且利用 HC1調整PH為2.7而製備辞儲備溶液。藉由製造㈣備溶液之適當稀釋液而製備具有各種ZnCl2濃度之溶液（「zn測試溶液」）。將1 mg之欲測試之化合物，例如，i 實施例丄化合物’溶解於25〇M之各Zn測試溶液中而產生且有4 mg/ml之化合物之溶液。然後利用㈣Η調整:匕溶液之ΡΗ直到觀察到形成白色沉澱物。將該沉澱溶液離心以及利用肌C分析該母液。測量測試化合物高峰之UV吸收

面積以及經由盘括左曲妗+ 处， ” 曲線之比對測定該母液中測試化合物之濃度。至於可❹實行本㈣之化合物的代表例1之化合物係於前述試驗中進行測試且得到下二果(, 水，pH 7.0,室溫）：卜列結果（- 37 1364292 表2 溶解度 (mg/ητΓ^ 5.788 0.0770 0.0579 0.0487 0.0668 0.1131 Z n C12濃度 (ug/mL) 0 80 500 1000 1500 2500

6.利用IEF凝膠測試dI

可使用Invitrogen之Novex IEF pH3-l〇凝膠測量 GLP-1胜肽之pi ^將欲測試之胜肽化合物溶於水中達濃度為〇.5mg/ml。至於各化合物，將5μ1所得之溶液與5μ1之 N〇Vex® Sample Buffer 2Χ (由 20 mM 精胺酸游離鹼、2〇 mM 離胺酸游離鹼及1 5%甘油組成）混合，以及將所得之丨〇 μ1 樣本溶液與蛋白質標準樣本载入至凝膠中。鲁電泳緩衝液亦得自Invitrogen以及根據製造商之指示進行凝膠電泳，一般電泳條件如下：1 〇〇 V持續}小時，接著以200 v持續1小時，接著以500 V持續30分鐘。然後將該凝膠於含有3.5%磺基水楊酸之12% TCA中固定30分鐘’之後根據N〇vex® c〇u〇idal Blue Kit之指示以Colloidal Coomassie Blue染色2小時，然後於水中去染 —整夜。藉由程式Fragment Analysis 1.2掃描且分析該凝膠。相對於具有 P1 值為：10.7、9_5、8.3、8.0、7.8、7.4、6.9、 38 1364292 6.0、5.3、5.2、4.5、4·2、及3·5之標準化合物之pI，計算未知胜肽之pi。 -7·大鼠之鱼A内試驗利用下列試驗測試本發明之组合物以測定其於活體内促進及加強作用之能力。 7.1.實驗辞年：實驗前，於氫氯酸鹽麻醉下將重量約3〇〇_35〇 g之成年

Sprague-Dawley 大鼠（Tac0nic, Germantown, NY)植入右心房頸靜脈套管。於注射適當之測試化合物或載劑對照（訂為時間〇)之前將該大鼠禁食18小時。於整個實驗期間持續使該大鼠禁食。將100 mg/rnl ZnCh之溶液稀釋於pH2 7之HC1水溶液中而製備〇.5mg/mlZnCl2溶液。將lmg之式⑴化合物 ((AibU’hGLPlQdS^HJ溶於250 μι之此溶液中而產生於ΡΗ 4具有4 mg/ml之化合物及〇 5mg/ml &之澄清溶液。於時間0時對大鼠皮下注射（sc)前述 (Aib8,35)hGLP-l(7_36)NH2)之溶液，或注射載劑對照。此兩個實例中，注射體積非常小（4-6 μί)以及投予至該對象之 GLP-1化合物劑量為75 gg/kg。於sc注射後之適當時間，經由靜脈（iv)套管抽取500 μι血液樣本以及對該大鼠進行 IV葡萄糖刺激（glucose challenge)以測試胰島素分泌是否掸加。葡萄糖刺激之時間為注射化合物後之〇 25、i6 9 及24小時。抽取初始血液樣本後，經由iv注射葡萄糖（丨以“) 以及以500 μΐ之肝素鹽水（丨〇 u/mL)沖洗。之接心俊，於注射葡 39 丄場292 .、5、10及20分鐘抽取500 μΐ血液樣本。個別立即通過套管經由iv注射5〇〇μ1之肝素鹽水（i〇u/mL)。將血液樣本離心，自各樣本收集血漿且將樣本儲存於_2〇。匸直到分析其胰島素含量。各樣本中之胰島素含量係使用大鼠姨島素酵素_連接免疫吸附試驗（ELISA)套組（American Laboratory pr0duets c〇，Windham，NH)進行測定。 7.1.1.結爭：觀察到持續性之騰島素-增強活性，於該實驗之完整的 24小時内該活性係由葡萄糖注射所誘導。 g·狗之活體内試路許多此技藝中已知之活體内試驗可供熟於.此技藝者用於測定組合物於活體内促進延長釋放活性化合物之能力。 8.1 · 1 %胜肽組合铷：經由範例’製備水性測試調配物其於ZnCl2之缓衝溶液中包括l%(w/w)之式⑴化合物（胜肽：Zn之比例=1 5 : 1.0)。共6隻雄性米格魯犬，42_78月齡以及體重為14_21公斤，飼養方式為任其飲水且每曰餵飼一次（約4〇〇 g標準乾飼料（SAFE 125))。投予測試組合物前使該狗禁食18小時。以皮下途控於肩胛間附近投予測試組合物。由0.33_12 111111@3 = 3〇]\42913)之〇.3111[泰爾茂（1;^11111〇)注射器製造投藥體積（每動物約20微升）❺因此得到約〇 2 胜肽之理論劑量。定期抽取血液樣本’抽取時間大約為投藥後=〇，8，1 5，丄364292 30 ’ 45分鐘’以及1，2，4，8，及12小時，以及1，2， 3 ’ 4 ’ 5，及6天。取樣後將該血液快速冷凍直到進行離心作用’以及將血漿移入其他容器且快速冷凍直到進行試驗。進行離線（off line)固相萃取後測定胜肽血漿濃度，接著進行結合LC-MS/MS之在線（on-line)相萃取’以及將所知之數據藉由Analyst v 1.2軟體處理。該組合物證實該活性胜肽之延長釋放達至少2天。 m°/〇 (Aib8’35)hGLPU7-36)NH〇溶液：使用實質上與上述8.1節所述相同之活體内試驗程序’檢驗下列組合物於延長期間内釋放該主題胜肽之能力。下列各四種組合物中胜肽之濃度為約1 % (wt/wt)，胜肽對鋅之比例為約1.5 : 1，以及所投予之胜肽劑量為約！ mg 〇溶液 8.2.A : (Aib8’35)hGLPl(7-36)NH2 溶於含有⑴ 90% ZnCl2 (0.298 mg/mL)及(ii) 1〇〇/0 NaOH (0.975 mg/mL)之溶液；溶液 8_2.B:(Aib8’35)hGLPl(7-36)NH2 溶於 ZnCl2 (0.286 mg/mL)溶液； ί·谷液8.2.C.貫質上類似溶液8.2.B，且使用AcOH/AcO — 緩衝；溶液8.2.D :實質上類似溶液8.2.A。如第1圖所示’該組合物提供延長釋放之 (Aib8’35)hGLPl(7-36)NH2。 U. 1 %__dib ’35)hGLP 1 (7-36)NH，）溶液： 41 1364292 使用實質上與上述8.i節所述相同之活體内試驗程序，檢驗下列組合物於延長期間内釋放該主題胜肽之能力。下列組合物中胜肽之濃度為約2% (wt/wt)，胜肽對鋅之比例為約1.5 : 1，以及所投予之胜肽劑量為約1 mg。溶液 8.3. : (Aib8’35)hGLPl(7-36)NH2 溶於含有⑴ 80〇/〇 ZnCl2 (0.695 mg/mL)及（ii) 20% NaOH (1.75 mg/mL)之溶液；如第5.圖所示’該組合物提供延長釋放之 (Aib8 3 5 )hGLPl(7-36)NH2。 8.4. 10%胜肽溶液：使用實質上與上述8.1節所述相同之活體内試驗程序，檢驗下列組合物於延長期間内釋放該主題胜肽之能力。下列各四種組合物中胜肽之濃度為約1〇0/〇 (wt/wt)，胜肽對鋅之比例為約1.5 : 1，以及所投予之胜肽劑量為約丄5 mg。溶液 8.4.A : (Aib8,35)hGLPl(7-36)NH2 溶於含有⑴ 90% ZnCl2 (3.367 mg/mL)及（ii) 1〇% Na0H (5 〇i mg/mL)之溶液；溶液8.4.：^(八化8,35)11〇1^1(7-36)^^2溶於211(：：12 (2 993 mg/mL)溶液；溶液8,4.C:實質上類似溶液8 4 B，且使用Ac〇h/Ac〇-緩衝；溶液8.4.D :實質上類似溶液8.4.A。如第2圖所示’該組合物提供延長釋玫之 42 1364292 (Aib8’35)hGLPl(7-36)NH2。 8.5.半固體鈕合物：使用實質上與上述8]節所述相同之活體内試驗程序，檢驗下列半-固體組合物於延長期間内釋放該主題胜肽之能力。關於組合物“.A·，該胜肽濃度為約5%，而組合物8.5.Β、8.5.C、及8.5.D，胜肽濃度為約1〇%㈣叫。組合物8.5.Α、8.5.Β、及8.5.C中胜肽對鋅之比例為約5 4:工，而組合物8.5.D令該比例為約4_〇:玉。至於所有四種組合物其所投予之胜肽劑量為約1 mg。組合物 8.5.A: (Aib8,35)hGLPl(7-36)NH2 於含有溶於 WFI之ZnCh (0.40 mg/mL)之半固體組合物；組合物8.5.B :實質上類似組合物8 5 A，其中該ZnCl2 濃度已調向俾將胜肽：Zn之比例維持於約5.4 : 1。組合物 8.5.C : (Aib8,35)hGLPl(7-36)NH2 於含有⑴ 50% ZnCl2 (1.69 mg/mL)及（ii) 50% NaOH (lmg/mL)之半固體；組合物 8.5.D : (Aib8,35)hGLPl(7-36)NH2 於含有⑴ 50〇/〇 Z11CI2 (2.28 mg/mL)及（ii).50% NaOH (lmg/mL)之半固體.；如第3圖所示，該組合物提供延長釋放之 (Aib8 3 5)hGLPl(7-36)NH2。 8.6 ·半固體組合物：使用實質上與上述8.1節所述相同之活體内試驗程序，檢驗下列半-固體組合物於延長期間内釋放該主題胜肽之能力。此組合物係利用5.22 mg/ml ZnCl2溶液，ΡΗ=2·0 調配。提供足夠之胜肽而得胜肽對鋅之比例為約4 : 1之 43 1364292

, 25%胜肽半固體組合物。如本文所提供利用l〇mg/mlNa〇H 調整該組合物之pH。所投予之胜肽劑量為約15 。如第6圖所示’該組合物提供延長釋放之 (Aib8’35)hGLPl(7-36)NH2。 g_· 7 ·丰固贈如合物：使用貫質上與上述8.1節所述相同之活體内試驗程序，檢驗下列半·固體組合物於延長期間内釋放該主題胜肽 • 之月b力。此組合物係利用8.5 mg/ml ZnCl2溶液，pH=2.0 調配。提供足夠之胜肽而得胜肽對鋅之比例為約15 : i之 23%胜肽半固體組合物。該組合物係依上述2 6節所述之方法調配。所投予之胜肽劑量為約1 5 mg (相當於約65微升之組合物）。如第7圖所示，該組合物提供延長釋放之 (Aib8 3 5 )hGLPl(7-36)NH2。同樣地所揭示之調配物之具有各種變更之進一步試驗 • 已進行活體内試驗且證實本發明之组合物可提供式（I)化合物有用的藥物遞送平台。利用本案之教示，熟於此技藝者可改變該胜肽、ZnCh之量以及pH而製備如本文所述之本發明組合物。【圖式之簡單說明】第1圖描述對狗單一皮下（sc)投予約1 mg之 [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH2後，所得之血漿側繪（中數值）。各例中該胜肽係呈辞水溶液組合物投予，該組合物包括約 1% (wt/vol)之胜肽以及胜肽：zn之莫耳比為約1.5。實心 44 1364292 方塊及空心方塊代表其中pH值如本文所述經Na〇H調整之組合物；實心三角形代表其中pH值未經Na〇H調整之組合物；實心圓形代表以AcOH/AcO —緩衝之組合物。第2圖描述對狗單一皮下（s c )投予約出呂之 [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH2後，所得之血漿側繪（中數值）。各例中該胜肽係呈鋅水溶液組合物投予，該組合物包括約 10¼ (wt/vol)之胜肽以及胜肽：Zn之莫耳比為約1 5。實心鲁方塊及空心方塊代表其中pH值如本文所述經Na〇H調整之組合物；實心三角形代表其中pH值未經Na〇H調整之組合物；實心圓形代表以AcOH/AcO·緩衝之組合物。

第3圖指述對狗單一皮下（s c )投予約1 之 [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH2後，所得之血漿側繪（中數值）。各例中該胜肽係呈半固體水性辞組合物投予，如下：實心圓：約5%(Wt/V〇l)胜肽，胜肽：Zn之莫耳比為約5 4: ι，未經pH調整，空心圓：約i〇〇/0 (wt/v〇1)胜肽，胜肽：zn # 之莫耳比為約5 ·4 : 1，未經pH調整；空心方塊：約丨〇% (wt/vol)胜肽，胜肽：Zn之莫耳比為約5 4:卜阳經Na〇H 調整；實心方塊：約10% (wt/vol)胜肽，胜肽：Zn之莫耳比為約4 : 1，pH經NaOH調整。第4圖提供用於製備本發明之特定調配物之各種裝置之示意圖。第5圖描述對狗單一皮下（s e_)投予約i瓜经之 [Aib8’35]hGLP-l(7-3 6)NH2後，所得之血漿側繪（中數值）。該胜肽係呈鋅水溶液組合物投予，該組合物具有約2%之胜 45

Claims

1364292 、申請專利範圍： I (1bi丨種用於在一對象體内自GLP-1受體引起激動作用之醫藥組合物，其包括下式（I)之化合物： [Aib1 2 3'35]hGLP-l(7-36)NH2 (I)；鋅以及一稀釋劑，其特徵在於該式⑴化合物係以濃度為〇.5%-30%(w/w)存在，且於該醫藥組合物中該式⑴化合物對鋅之莫耳比的範圍係自54:1至15:卜其中該式⑴化合物於該對象體内釋放至少約5天至約7天。 2,如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該稀釋劑包括無菌水。 3, 如申請專利範圍第1或2項之醫藥組合物，其中該水溶液中該式（I)化合物之濃度為1%、2%、5%、1〇%、23% 或 25 % (w/w) 〇 4. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該比例為 5.4 : 1 ， 4.0 : 1 或 1.5 : 1 。 5· 如申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該比例 47 1 · 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該辞係以氣化鋅或乙酸鋅提供。 2 . 如申請專利範圍第1或2項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物之pH係使用NaOH調整。 3 · 如申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物之pH係使用NaOH調整，使得以0.9。/。NaCn稀釋至 1/2起始濃度時，可得到5.0-5.5之pH值。 1364292 i (2012年1月修正) 9. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該 GLP-1 (7-36)NHs配位體之受體係存在於動物對象體内。 10. 如申請專利範圍第9項之醫藥組合物，其中該對象為人類。 ' n. 如申請專利範圍第10項之醫藥組合物，其中該人類 * 對象係患有’或具有發展出選自由I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠期糖尿病、肥胖、食欲亢進、飽足感不足、及代謝失調所組成之疾病或病症之風險。鲁 12. 如申請專利範圍第Π項之醫藥組合物，其中該疾病為I型糖尿病或II型糖尿病。 13. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該組合物中 [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH22濃度為 1% (重量 /體積）。 14. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該組合物中 [Aib8’35]hGLP-l(7-3 6)NH2 之濃度為 2% (重量 /體積）。 15. 如申明專利範圍第5項之組合物，其中該組合物中參 [AibUMhGLP-UlWNHz之濃度為1〇% (重量/體積）。 16. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該組合物中 [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH2 之濃度為 25% (重量 /體積）。 17. 如申請專利範圍第4項之組合物，其中該組合物中 [Aib8’35]hGLP· 1 (7-36)NH2之濃度為5% (重量/體積）以及該比例為5.4 : 1。 18. 如申請專利範圍第4項之組合物，其中該組合物中之濃度為5% (重量/體積）以及該比例為4.0 : 1。 48 1364292 19. 如申請專利範圍第4項之組合物， [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH2 之濃度為 10% 該比例為5.4 : 1。 20. 如申請專利範圍第4項之組合物， ·. [Aib8,35]hGLP-l(7-36)NH2 之濃度為 1〇〇/0 . 該比例為4.0 : 1。 21. 如申請專利範圍第5項之組合物 [Aib8’35]hGLP-l(7-36)NH2 之濃度為 23% 鲁 22.如申請專利範圍第1項之組合物物於該對象體内釋放至少約14天。 23. 如申請專利範圍第1項之組合物物於該對象體内釋放至少約4週。 (2012年1月修正) 其中該組合物中 (重量/體積）以及其中該組合物中 (重量/體積）以及其中該組合物中 (重量/體積）。其中該式⑴化合其中該式（I)化合

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