TWI342781B - Blood sugar-modulating polypeptides - Google Patents

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1342781 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種用於調整血糖之多胜肽及其用途，尤其係關 於一種具下列胺基酸序列或其進行一或多個胺基酸之取代、刪除 及/或添加所衍生之同源性胺基酸序列之多胜肽： RVRVWVTERGIVARPPTIG 〇 【先前技術】 糖尿病為慢性的代謝異常之疾病，主要原因係由於體内胰島素 缺乏或功能不全，亦或者是先天的基因加上後天環境造成周邊組 織的胰島素抗性，以致於對醣類的利用能力減低，甚至完全無法 利用，進而造成體内血糖過高及蛋白質與脂肪代謝的異常。此外， 糖尿病另會衍生慢性併發症，包括：眼底病變、神經病變（包含 運動神經、感覺神經、及自主神經）、腎臟病變、糖尿病足、以 及大血管病變（包含腦血管障礙、冠狀動脈病變、及週邊血管阻 塞）等。 根據世界衛生組織（World Health Organization，WHO)的相關 統計顯示，糖尿病患者的總數一直呈現驚人的成長。從1985年的 三千萬人，1995年的一億三千五百萬人，時至今日，全球糖尿病 患者的總數已超過一億七千七百萬人。WHO更進一步指出，預估 到2030年時，全球罹患糖尿病的總人口將突破三億三千六百萬人 (http://www.who.int/dietphysicalactivity/publications/facts/diabete s/en/) °且根據統計，美國於糖尿病及其併發症所耗的醫療保健 費用’由1997年的四百四十億美金攀升至2000年的一千三百二 1342781 • 十億美金。由此可知，糖尿病係一影響全球人類健康甚矩之疾病， 是故，研發可有效調整血糖的物質或藥劑乃維繫人類健康之一重 要課題。 ，有關糖尿病之治療，自1922年後，主要係利用胰島素來進行， 然而，胰島素的缺乏僅是胰臟功能異常之部分現象，並非糖尿病 之完整病因。因此，僅使用胰島素來治療糖尿病，所達成之療效 係有限的。 φ 除胰島素之外，根據藥物的作用機制，習知降血糖藥物可分為 五大類：一、續醢尿素（sulfonylureas，SU)類，可促進騰臟分泌 胰島素及增加組織細胞之胰島素的接受器；二、安息香酸衍生物， 可刺激胰島素之分泌；三、雙胍（biguanides)類，可抑制胃腸吸 收糖分、抑制肝臟製造糖分、及促進組織利用糖分；四、α-葡萄 糖酶抑制劑（α-glucosidase inhibitors)，可抑制雙糖分解為腸道可 吸收之單糖；五、胰島素敏感劑，可降低周邊組織與肝臟細胞對 胰島素的阻抗性。然而，上述藥物各具不同副作用，舉例而言， • 磺醯尿素類藥物會使病患發生皮疹及低血糖之現象；安息香酸衍 生物會導致低血糖；雙胍類藥物會造成胃腸不適及乳酸中毒；（X-葡萄糖酶抑制劑會使病患胃腸不適；而胰島素敏感劑則會導致肝 功能異常及肝細胞傷害。綜上所述，開發具降血糖療效且低副作 用之藥物係急迫須要的。 與一般化合物相較，由於多胜肽具較佳之生物可代謝性及生物 可接受性，故可較符合低副作用之需求。是以，數十年來，全世 界已研究許多不同的多胜肽，並運用於臨床治療中。例如台灣專 1342781 - 利第1283684號，其中揭露類昇糖素胜肽-1 ( Glucagon Like Peptide-1 )之類似物具有降血糖之療效：以及美國專利第 7,393,919號，其係利用人類胰島胜肽（Human prolslet Peptide， HIP )作為降血糖之藥物，其中HIP係胰臟炎相關蛋白前驅物 « (pancreatitis-associated protein precursor)之活性片段。 此外，具降血糖活性之多胜肽亦發現可自植物萃取物中取得* 例如美國專利第6，127,338號，其係自苦瓜中取得具降血糖活性 之多胜肽。根據該專利文獻，具有降血糖活性之多胜肽其胺基酸 ® 序列為KTNMKHMAGAAAAGAVVG，且分子量小於10千達爾頓β 综上所述，儘管已有多種調節血糖之藥物*至今對於可成功地 治療不同致病機制之糖尿病的單一或組合之治療方式或醫藥組成 物，仍存在迫切的需求° 本發明係針對上述需求所為之研究’提供一種新穎多胜肽，其 具調整血糖之功能，尤其可調整正常狀態與糖尿病狀態之動物的 血糖值。 【發明内容】 本發明之一目的在於提供一種用於調整血糖之多胜肽，其係具 下列胺基酸序列或其進行一或多個胺基酸之取代、刪除及/或添加 所衍生之同源性胺基酸序列：

RVRVWVTERGIVARPPTIG 。較佳地，本發明多胜肽係含有一或多個選自下列群組之胺基酸 1342781 序列：SEQ ID Μ〇·卜 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、

SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID N0:7 ' SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9、SEQ id NO:10、SEQ ID NO:ll、SEQ ID NO:12、及前 ，述胺基酸序列進行_或多個胺基酸之取代、刪除及/或添加所衍生 . 之同源性胺基酸序列。 ^ 本發明之另一目的在於提供一種用於調整血糖之醫藥組成物， 其包含本發明之多胜狀。 • 本發明之又—目的在於提供一種使用本發明之多胜肽於製造可 調整血糖之藥劑之用途。 本心明亦提供一種經單離之核酸分子，其編碼自本發明之多胜 肽。 本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下内容中，以 供本七明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。 【實施方式】 ♦ &非文中有另外說明，於本發明說明書中（尤其是在後述專利 t 圍中）所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單 - 數及複數形式。 本t月所述之「同源性多胜肽」，係指於一多胜肽之胺基酸序列 中進订—或多個胺基酸之取代、刪除及/或添加所衍生之胺基酸 序列，即該多胜肽之同源物（homologues)。 口 ^發明用於調整血糖之多胜肽係具下列胺基酸序列或其進行一 或夕個胺基酸之取代、刪除及/或添加所衍生之同源性胺基酸序列： 1342781 RVRVWVTERGIVARPPTIG 。 較佳地，本發明多胜肽係包含一或多個選自下列群組之胺基酸 序列：SEQ ID NO:卜 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NChlO、SEQ ID NO:U、SEQ ID N0:12、及前 述胺基酸序列進行一或多個胺基酸之取代、刪除及/或添加所衍生 之同源性胺基酸序列。 更佳地，本發明多胜肽係含有一或多個選自下列群級之胺基酸 序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ Π) NO10、 SEQIDNO:U、SEQIDNO:12、及前述胺基酸序列進行一或多個 胺基酸之取代、刪除及/或添加所衍生之同源性胺基酸序列；尤其 係由前述胺基酸序列所組成之多胜肽。 本發明多胜肽可自植物萃取而得，或經由人工合成方式或透過 生物體之基因重組方式取得，或者經由前述操作之結合而獲得。 所謂人工合成方式’係視所欲之多胜肽，透過人工方式使胺基酸 依序連接，包括化學合成法或透過利用化學合成原理之胜肽合成 儀所進行之合成。因此，人工合成法通常具有以下優點：可方便 地於合成過程中改變多胜肽之一級結構、加入特殊的胺基酸、以 及對多胜肽之末端進行修飾等。 可用以合成本發明多胜肽之化學合成法可分為固相合成法及液 相合成法。一般而言，液相合成法必須於完成每一胺基酸之連接 後，進行萃取操作。此外，由於萃取所得之多胜肽中間物通常為 混合物，因此，尚須進行層析純化步驟。換言之，以液相人成法 1342781 進行多胜肽之合成，必須涉及繁瑣的萃取及層析純化步驟，才能 得到高純度的產物。相對於此，固相合成法係於溶劑中，在固體 聚合物顆粒（或聚合支撐物）上進行胜肽之鍵結反應。於此方法 中，係先將所欲多胜肽之N端胺基酸共價鍵結至聚合物顆粒上， 其後再透過專一性鍵結之方式將後續胺基酸依序連接上，最後合 成該多胜肽。由於該聚合物顆粒並不溶於溶劑中，故僅需於反應 終了透過清洗及過濾操作，即可將該聚合物顆粒（以及連接在該 聚合物顆粒上之所欲之多胜肽）與反應試劑及副產物分開。此即， ® 固相合成法只須於整個合成過程中的最終步驟進行純化操作，故 相較於液相合成法，不僅相對方便，且可大幅縮短反應時間，於 長鏈多胜肽之合成上亦較具優勢。 目前，業已開發出多種可自動合成多胜肽之裝置，例如：固相 胜肽合成儀、液相胜肽合成儀、及微波胜肽合成儀等，皆可視需 要選用以合成本發明多胜肽。 亦可以『基因重組』方式，合成本發明多胜肽。於此，係經由 ® 將包含編碼自該多胜肽之核酸的表現載體置於宿主細胞中，並使 該核酸表現的方式取得。其中，該宿主細胞可為大腸桿菌或酵母 菌，且該表現載體可選自市面上常見之載體，例如：pQStrep2、 pQStrep4、pGEX-6pl、或 pQTEV 等。 此外，亦可自植物萃取液中取得本發明多胜肽。經發現，可自 葫蘆科植物萃取液中得到可調整血糖之多種多胜肽，例如：苦瓜、 山苦瓜 '胡瓜、南瓜、葫蘆、西瓜、栝蔞仁、天花粉、及其組合。 其中，以蛋白質電泳證實，葫蘆科植物之萃取液中所含可調整血 1342781 糖之多胜肽，屬同源性蛋白質（如第丨圖所示然而，本發明之 多胜肽亦可自葫蘆科植物以外之植物取得，例如：百曰菊（zinnia elegans)、苜蓿（Medicago truncatula)、葡萄、葡萄柚、迷迭香 (Sambucus nigra)、阿拉伯芥（Arabid〇psis 让州咖）、稻、及其 組合。此即，本發明多胜肽的來源並不侷限於葫蘆科植物。 以苦瓜為例，可先以如下步驟取得植物萃取液，再自萃取液純 化（例如.以蛋白質電泳純化法或層析純化步驟）取得本發明多 胜肽首先，於^谷劑中將苦瓜離解（maceration )以得到一粗懸浮 液，該溶劑可為磷酸鹽緩衝液、檸樣酸鹽緩衝液、或水等且可 利用攪拌器或研磨器以離解苦瓜。接著，以12,〇〇〇轉數/分鐘 (revo丨ution per minute , rpm)至丨5 〇〇〇轉數/分鐘之離心轉速， 將粗懸浮液中的顆粒自液相中移除，並以孔徑為〇丨微米至〇5微 米之濾材來過濾上清液。然後，將所得之濾液依序通過1千達爾 頓（kDa)之濾膜，並取其上清液部分，以及1〇千達爾頓之濾膜， 並取其濾液部分，即可獲得含有本發明之多胜肽的水溶性苦瓜萃 取液”中，該;慮膜可選自習知遽材產品，例如：Amicon渡膜及 Milhpore濾膜等。其後，再以如蛋白質電泳或層析純化方法以 分離出所欲之多胜肽β最後，可視需要添加防腐劑（例如：笨甲 酸鈉或水楊酸等），並於、8〇〇c下保存該多胜肽。 有關上述透過蛋白質電泳分離純化法以取得本發明多胜肽之操 作，包含可利用如二維凝膠電泳分離出蛋白質的方式。首先，將 上述之水溶性苦瓜萃取液進行蛋白質沉澱，將收集的蛋白質沉澱 物進行，‘隹等電點聚焦（iso-electric focusing，IEF) «第二天， 1342781 配置--h二基硫酸鈉-聚丙稀酿胺膠體電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)之膝體， 再將該膠體注入一膠槽中，並以乙醇壓平該膠體。20分鐘後，將 乙醇倒出。接著，將經等電點聚焦的膠條與蛋白質分子量標準 (marker )樣品分別注入樣品槽，並以110伏特之電流進行電泳。 待染劑移動至該膠體底部後，結束電泳，並將膠體取出並予以染 色。接著，以清洗液（wash buffer )清洗染色劑，並以褪染劑（destain buffer)進行脫色。最後，將該膠體上之等電點為9至10且分子 ® 量約為1千達爾頓至7千達爾頓之蛋白質色帶切出後，即可取得 本發明多胜肽。 另外，亦可以上述方式之組合態樣來取得本發明多胜肽。舉例 而言，可先以基因重組或植物萃取之方式取得所欲多胜肽之片 段，再以人工合成之方式得到完整之多胜肽。 本發明多胜肽可用於製造降血糖之藥劑。因此，本發明另提供 一用於調整血糖之醫藥組成物，其係包含有效量之本發明多胜肽 • 及一醫藥上可接受之載劑。該醫藥組成物可具任何合宜之形式， 例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿 劑、懸液劑、乳劑、ST劑、靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射 劑及乾粉懸液注射劑等。 此外，可視需要於本發明醫藥組成物中另含有其他佐劑，例如： 溶劑、分散介質、衣料、穩定劑、稀釋劑、保存劑、防腐劑、抗 菌劑、抗真菌劑、安定劑、等張劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化 劑、黏合劑、潤滑劑、及色素等。前述佐劑之選用並無特殊限制 1342781 條件，只要其不會破壞多胜肽之活性即可。舉例而言，溶劑可為 水或蔗糖溶液；稀釋劑可為乳糖或澱粉；防腐劑可為苯甲醇；吸 收延遲劑可為幾丁聚醣或葡萄胺基聚醣；潤滑劑可為碳酸鎂；色 素可為酒石黃。 為避免多胜肽被消化道中的酵素分解，可以注射方式進行本發 明醫藥組成物之投藥，以經由血液直接將藥物帶至釋放處。當以 口服之方式進行投藥時，則可於醫藥組成物中包含吸收延遲劑， 以克服胃中強酸及小腸前半部之酵素的破壞，以將藥物順利帶至 釋放處。 使用含本發明多胜肽之醫藥組成物以調整人類或動物血糖時， 其投藥量為，以多胜肽用量計，每日口服投予50毫克/公斤體重。 若以注射之方式投藥，則其調整血糖之有效劑量為每日注射 2.5XHT9莫耳/公斤體重。 本發明另提供一經單離之核酸分子，其編碼自本發明多胜肽。 其中，該核酸分子可以習知之選殖方式獲得。舉例言之，可自植 物細胞中取得基因組去氧核糖核酸（genomic deoxyribonucleic acid)後，以其作為聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction， PCR)之模板，並於PCR反應結束後，純化所得之產物，以提供 本發明之經單離之核酸分子。 第2圖係繪示說明本發明多胜肽之取得方式、用於醫藥組成物 的可行劑型、及用途。 以下將以具體之實施例進一步詳細描述本發明，在參閱隨後描 11 1342781 述之實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕 易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之 技術手段與較佳實施態樣。然而，以下實施例僅供例示說明本發 明，而本發明之範疇並不限於此。 材料 於實施例中採用如下材料： (A)實驗對象：使用BALB/c (血糖代謝正常）和〇b/ob (自發性 第二型糖尿病）之兩種品系的小鼠以進行實驗，此等小鼠係 均由國家實驗動物中心（National Laboratory Animal Center ) 所提供。 (B)多胜肽：使用由固相合成法之方式所製得，具表1所示胺基 酸序列之多胜肽。 表1

序列編號 序列 SEQ ID ΝΟ:1 RVRIWVNKRGLWSPPRIG SEQ ID N0:2 RVWVWVNSKGIVIRTPIIT SEQ ID N0:3 RVWVWINKDEIVYQVPTIG SEQ ID NO:4 RVRVWVDSYGIVSMVPKIG SEQ ID NO:5 RVRVWVDENGTVISVPT1G SEQ ID NO:6 RVRVWVNKKGKVIRVPRIG SEQ ID NO:7 RVRVWVDENGIVTRVPVIG SEQ ID N0:8 RVRVWVDEIRIVVRNPTAG SEQ ID NO:9 DENRVRIWVDTVAKTPTIG SEQ ID NO: 10 RVRVWVTERGrVAR SEQ ID NO: 11 RVRVWVTERGIVARPPTIG SEQ ID NO: 12 SRCQGKSSWPQLVGSTGAAAKAVIERE NPRVRAVIIKVGSGATKDFRCDRVRVWV TERGIVARPPTIG 12 1342781 〔實施例1〕 將每組5隻的正常小鼠（BALB/c)禁食18小時後及糖尿病狀態 之小鼠（ob/ob)禁食4小時後，以腹腔注射之方式，給予實驗組 的小鼠每隻含有2.5xl0·9莫耳/公斤體重之SEQ ID NO: 12的多胜肽 溶液（100微升），而對照組中，則給予每隻小鼠100微升的水。 15分鐘後，正常小鼠（BALB/c)以腹腔注射的方式投予4公克/ 公斤體重的葡萄糖溶液，而糖尿病狀態之小鼠（ob/ob)以腹腔注 射的方式投予1公克/公斤體重的葡萄糖溶液，以造成小鼠的血糖 值快速上升的現象。180分鐘後，於小鼠的尾部取血_，並以優勢血· 糖機（Accu-Check Advantage，Roche，Germany)測量其血糖值。 比較並分析實驗組與對照組中小鼠的血糖值，SEQ ID NO: 12之多 胜肽對血糖值上升之相對抑制效果係顯示於表2。 表2 組別 抑制比率（％) SEQ ID NO: 12 BALB/c 68.6±5.4* SEQ ID NO: 12 ob/ob 51.0±14.2* # (以 Student’s Mest 進行統計分析，〇$ ) 自表2可看出’於此實驗中’無論是正常小鼠或是糖尿病狀態 之小鼠’ SEQ ID NO: 12之多胜肽皆可以有效地降低其血糖值。SEq ID NO:12之多胜狀可使正常小鼠之A糖值達到約7〇%的抑制比 率’亦可使糖尿病狀態之小鼠的血糖值達到約5〇%的抑制比率。 13 1342781 〔實施例2〕 將每組5隻的正常小l(BALB/c)禁食18小時後及糖尿病狀態 之小鼠（ob/ob )禁食4小時後，以腹腔注射之方式，給予實驗組 的小鼠每隻含有2.5x10·9莫耳/公斤體重之SEQIDN0:11的多胜肽 溶液（100微升），而對照組中，則給予每隻小鼠1〇〇微升的水。 15分鐘後，正常小鼠（BALB/c)以腹腔注射的方式投予4公克/ 公斤體重的葡萄糖溶液，而糖尿病狀態之小鼠（ob/ob)以腹腔注 射的方式投予1公克/公斤體重的葡萄糖溶液，以造成小鼠的血糖 值快速上升的現象。180分鐘後，於小鼠的尾部取血，並以優勢血 糖機（Accu-Check Advantage，Roche，Germany)測量其 A糖值。 比較並分析實驗組與對照組中小鼠的血糖值，SEQ ID N0:11之多胜 肽對血糖值上升之相對抑制效果係顯示於表3。 組別 抑制比率（％) SEQ ID NO: 11 BALB/c 54·1±13·1*** SEQIDNO:ll ob/ob 38.3±13·5* (以 Student’s Mest 進行統計分析，*/><〇.〇5, ***ρ<〇.〇〇1)

自表3可看出’於此實驗中，無論是正常小鼠或是糖尿病狀態 之小鼠，SEQ ID NO: 11之多胜肽皆可以有效地降低其血糖值。SEQ ID ΝΟ:11之多胜肽可使正常小鼠之血糖值達到約5〇%的抑制比 率’亦可使糖尿病狀態之小鼠的血糖值達到約4〇%的抑制比率。 〔實施例3〕 1342781 將每組五隻的正常小鼠（BALB/c)禁食18小時後，以口服投藥 之方式，分別給予實驗組的小鼠每隻20微升之含有50毫克/公斤 體重之SEQ ID ΝΟ:1的多胜肽溶液、50毫克/公斤體重之SEQ ID NO:2的多胜肽溶液、50毫克/公斤體重之SEQ ID NO:3的多胜肽 溶液、50毫克/公斤體重之SEQ ID NO:4的多胜肽溶液、50毫克/ 公斤體重之SEQIDNOJ的多胜肽溶液、50毫克/公斤體重之SEQ IDNO:6的多胜肽溶液、50毫克/公斤體重之SEQIDNO:7的多胜 肽溶液、50毫克/公斤體重之SEQ ID NO:8的多胜肽溶液、或50 ® 毫克/公斤體重之SEQ ID NO:9的多胜肽溶液；而對照組中，則給 予每隻小鼠20微升的水》15分鐘後，以腹腔注射的方式投予4 公克/公斤體重的葡萄糖溶液’以造成小鼠的血糖值快速上升的現 象。180分鐘後’於小鼠的尾部取jk，並以優勢血糖機（Accu-Check Advantage ’ Roche，Germany )測量其血糖值。比較並分析實驗組 與對照組中小鼠的血糖值，各多胜肽對血糖值上升的相對抑制比 率係顯示於表4。

序列編號 序列 --- 抑制比率（％) SEQ ID ΝΟ:1 RVRIWVNKRGLWSPPRIG 15·7 士 6·9 SEQ ID NO：2 RVWVWVNSKGIVIRTPIIT __Η5±2.3 SEQ ID NO:3 RVWVWINKDEIVYQVPTIG 52.5±14.9 SEQ ID NO:4 RVRVWVDSYGIVSMVPKIG 67,8土9-1 SEQ ID NO:5 RVRVWVDENGIVISVPTIG —— ,Λ SEQ ID NO:6 RVRVWVNKKGKVIRVPRIG 26.2±3.1 SEQ ID NO:7 RVRVWVDENGIVTRVPVIG ^--- ___56J±2.6 SEQ ID NO:8 RVRVWVDEIRiyVRNPTAG SEQ ID NO:9 DENRVRIWVDTVAKTPTIG 15 1342781 自表4可看出，包含序列seq id NO:4、SEQ ID N0:7、及SEQ ID N0:9之多胜肽具較佳之降低血糖值的效果，其係分別來自植 物界不同科別之多胜肽。此顯示來自植物之多胜肽具降低體内血 糖值之功效。 〔實施例4〕 將母組五隻的正常小鼠（BALB/c )禁食18小時後，以口服投藥 φ之方式’分別給予實驗組的小鼠每隻20微升之含有50毫克/公斤 體重之SEQ ID NO:10的多胜肽溶液、5〇毫克/公斤體重之SEq ID NO: 11的多胜肽溶液；而對照組中，則給予每隻小鼠2〇微升的水。 15分鐘後’以腹腔注射的方式投予4公克/公斤體重的葡萄糖溶 液，以造成小鼠的血糖值快速上升的現象。18〇分鐘後，於小鼠的 尾 取血，並以優勢灰糖機（Accu_check Advantage，Roche， Germany)測量其血糖值。比較並分析實驗組與對照組中小鼠的血 糖值’ SEQ ID NO:1〇及SEQ ID ΝΟ:11之多胜肽對血糖值上升的 #相對抑制效果係顯示於表5。 表5 序列編號 序列 抑制％ SEQ ID NO: 10 RVRVWVTERGIVAR 34.5±8.8** SEQ ID NO: 11 RVRVWVTERGIVARPPTIG 51.9±19.4** (以Student’s Mest進行統計分析，**尸<〇 〇ι) 自表5可看出’於此實驗中’ SEQ Π) NO:10及SEQ ID ΝΟ:11之多 胜肽皆可以有效地降低正常小鼠之血糖值。尤其是SEQ ID N〇:1 i 1342781 之多胜肽更可使其血糖值達到約50%的抑制比率。 〔實施例5〕 將每組五隻的正常小鼠（BALB/c)禁食18小時後，以口服投藥 之方式，分別給予實驗組的小鼠每隻20微升之含有丨公克/公斤體 重之BSM同源性多胜肽的苦瓜（月華）萃取液、丨公克/公斤體重 之BSM同源性多胜肽的苦瓜（翠妃）萃取液、丨公克/公斤體重之 φ BSM同源性多胜肽的苦瓜（秀華）萃取液、〗公克/公斤體重之bsm 同源性多胜肽的山苦瓜（0P)萃取液、1公克/公斤體重之BSM同 源性多胜肽的山苦瓜（WB15)萃取液、1公克/公斤體重之BSM 同源性多胜肽的山苦瓜（自交系）萃取液、丨公克/公斤體重之BSM 同源性多胜肽的山苦瓜（Hu2)萃取液')公克/公斤體重之BSM 同源性多胜肽的胡瓜（萬綠）萃取液、i公克/公斤體重之BSM同 源性多胜狀的胡瓜（喜燕）萃取液、丨公克/公斤體重之BSM同源 性多胜狀的南瓜（一品）萃取液、i公克/公斤體重之B s M同源性 春多胜肽的南瓜（木瓜型）萃取液、丨公克/公斤體重之臟同源性 多胜狀的销產（扁蒲）萃取液、丨公克/公斤體重之BSM同源性多 胜肽的西瓜（富寶）萃取液 ' 丨公克/公斤财之讓同源性多胜 肽的西瓜（特小风）萃取液、1公克/公斤體重之BSM同源性多胜 狀的栝蔞仁萃取液；而對照組中，則給予每隻小氣〇5毫升的水。 15分鐘後’賴驗㈣方式投予4公克/公㈣㈣㈣糖溶 液’以造成小鼠的血糖值快速上升的現象。18〇分鐘後，於小鼠的 尾部取血，並以優勢血糖機（Accu_Check场卿，滅， 1342781

Germany)測量其血糖值。比較並分析實驗組與對照組中小鼠的血 糖值，該些植物萃取液對血糖值上升的相對抑制效果係顯示於表 表6 植物名（栽培品種） 抑制％ 苦瓜（月華） 31.6土 16.6 苦瓜（翠妃） 43.9±12.9* 苦瓜（秀華） 37.6±24.3 山苦瓜（0P) 30±11.9* 山苦瓜（WB15) 21.7 土 32.6 山苦瓜（自交系） 13.1 土 21.8 山苦瓜（Hu2) 12.9±22.7 胡瓜（萬綠） 24.3±39.5 胡瓜（喜燕） 10.1±17.4 南瓜（一品） 50.5±20·4* 南瓜（木瓜型） 33.8±2·9** 葫蘆（扁蒲） 51.5±17.5* 西瓜（富寶） 20±4,9 西瓜（特小鳳） 37.1±20.7 栝蔞仁 6.5±34.4 (以 Student’s /-test 進行統計分析，*尸<0.05, **;?<0.01) 自表6可看出，包含本發明多胜肽之葫蘆科植物萃取液皆具降 血糖之療效，其中，尤其以苦瓜（翠妃）萃取液、南瓜（一品） 萃取液、及萌蘆（扁蒲）萃取液具較佳之降低血糖值效果。 由以上實施例1至5可知，將本發明多胜肽經由口服或腹腔注 射方式投予正常（BALB/c)小鼠或糖尿病狀態（ob/ob)小鼠，皆 18 1342781 可抑制因高濃度葡萄糖攻擊所造成之持續高血糖的現象。 上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於 限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技 術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此， 本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所列者。 【圖式簡單說明】 第1圖為本發明之多胜肽的二維凝膠電泳圖。 第2圖為本發明之多胜肽之取得方式、用於醫藥組成物之 可行劑型、及用途的示意圖。 【主要元件符號說明】 (無） 1342781 序列表 <110>中國醫藥大學 <120>具血糖調控功能之多胜肽 <160> 12 <170> Patentln version 3.4

<210〉1 <211> 19 <212> PRT

<213> 栗南瓜（Cucurbitamaxima) <400> 1

Arg Val Arg lie Trp Val Asn Lys Arg Gly Leu Val Val Ser 1 5 10

Pro Pro Arg lie Gly 15 <210〉2 <211> 19 <212> PRT <213>百曰菊（Zinniaelegans) <400〉2

Arg Val Trp Val Trp Val Asn Ser Lys Gly lie Val lie Arg 1 5 10

Thr Pro lie lie Thr 15 <210>3 <211> 19 <212〉PRT <213> 苜宿（Medicago truncatula ) <400> 3

Arg Val Trp Val Trp lie Asn Lys Asp Glu lie Val Tyr Gin 1 5 10

Val Pro Thr lie Gly 15 <210>4 <211> 19 1342781

<212> PRT <213> 葡萄（Vitis vinifera ) <400〉4

Arg Val Arg Val Trp Val Asp Ser Tyr Gly lie Val Ser Met 1 5 10

Val Pro Lys lie Gly 15 <210〉5 <211> 19 <212> PRT <213> 葡萄（Vitis vinifera )

<400> 5

Arg Val Arg Val Trp Val Asp Glu Asn Gly lie Val lie Ser 1 5 10

Val Pro Thr lie Gly 15 <210>6 <211> 19 <212〉PRT <213> 葡萄柚（Citrus paradisi) <400> 6

Arg Val Arg Val Trp Val Asn Lys Lys Gly Lys Val lie Arg 1 5 10 • Val Pro Arg lie Gly 15

<210>7 <211> 19 <212> PRT <213>迷迭香（Sambucus nigra) <400> 7

Arg Val Arg Val Trp Val Asp Glu Asn Gly lie Val Thr Arg 1 5 10

Val Pro Val lie Gly 15 <210>8 <211> 19 1342781

<212> PRT <213>阿拉伯芥（Arabidopsisthaliana) <400> 8

Arg Val Arg Val Trp Val Asp Glu lie Arg lie Val Val Arg 1 5 10

Asn Pro Thr Ala Gly 15 <210〉9 <211〉19 <212> PRT <213〉稻（Oryzasativa)

<400> 9

Asp Glu Asn Arg Val Arg lie Trp Val Asp Thr Val Ala Lys 1 5 10

Thr Pro Thr lie Gly 15

<210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> 苦瓜（Momordica charantia ) <400> 10

Arg Val Arg Val Trp Val Thr Glu Arg Gly lie Val Ala Arg 1 5 10

<210> 11 <211> 19 <212> PRT <213>苦瓜（Momordicacharantia) <400〉11

Arg Val Arg Val Trp Val Thr Glu Arg Gly lie Val Ala Arg 1 5 10

Pro Pro Thr lie Gly 15

<210〉12 <211>68 <212> PRT <213>苦瓜（Momordica charantia ) 1342781

<400〉12

Ser Arg Cys Gin Gly Lys Ser Ser Trp Pro Gin Leu Val Gly Ser Thr 15 10 15

Gly Ala Ala Ala Lys Ala Val lie Glu Arg Glu Asn Pro Arg Val Arg 20 25 30

Ala Val lie lie Lys Val Gly Ser Gly Ala Thr Lys Asp Phe Arg Cys 35 40 45

Asp Arg Val Arg Val Trp Val Thr Glu Arg Gly lie Val Ala Arg Pro 50 55 60

Pro The lie Gly 65 4

Claims (1)

1342781 . 農卫22_丨46586號.專;iN申靖苹 中j奮專利範圍替換本(100年2月） 七、申請專利範圍： 正召1公告本 h —種用於降血糖之醫藥組成物’其係包含一具SEQ ID Ν&ΓΠ- 所示之胺基酸序列的多胜肽及一醫藥上可接受之載劑。 2.如請求項1之醫藥組成物’其更包含一或多個具有選自下列群 組之胺基酸序列的多胜肽：SEQ ID NO:卜SEQ ID NO:2、SEQ ID 耻3、SEq ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID N〇:7、SEQIDNO:8、SEQ IDN〇:9、SEQ IDNO:1〇、以及 SEq ID N〇:i2。 • 3.如請求項1之醫藥組成物，其更包含一或多個具有選自下列群 組之胺基酸序列的多胜肽：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID N〇:9、及 SEQ ID NO:12。 4. 如請求項1之醫藥組合物，其係由該醫藥上可接受之載劑及具 有選自下列群組之胺基酸序列的多胜肽所組成：SEQIDN〇:4、 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NOill、以及 SEQ ID NO:l2 〇 5. 如請求項1之醫藥組成物，其中該多胜肽係藉由選自下列群组 Ψ 之方式所取得：植物萃取、人工合成、基因重組、及其組合。 6. 如請求項5之醫藥組成物，其中該多胜肽係藉由萃取選自下列 群組之植物所取得：苦瓜、山苦瓜、胡瓜、南瓜、葫蘆、西瓜、 ， 栝蔞仁、及天花粉。 7. 如請求項5之醫藥組成物，其中該多胜肽係藉由萃取選自下列 群組之植物所取得：百曰菊（Zinnia elegans)、苜蓿（Medicago truncatula )、葡萄、葡萄柚、迷迭香（Sambucus nigra )、阿拉伯 芥（Arabidopsisthaliana)、及稻。 1342781 宿主細胞表 8.如清求項5之醫藥組成物，其中該基因重组係利用 現之方式，該宿主細胞為大腸桿菌或酵母菌。 月求項1至8中任—項之醫藥組成物’其具有選自以下群组 之劑型：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、、 糖梨劑、懸液劑、乳劑、釘劑、靜脈輪注液、注射劑、乾粉注 射劑、懸液注射劑、乾粉懸液注射劑、及其組合。 1342781 097146586號專利申請案 圖式替換本(1⑽年2月） 八、圖式 千達爾頓 (kDa) 66 _ 45 - 等電點

+ 10 31 21 14 具血糠調控功能 之多胜肽 7 Ί342781 具血糖調控功能之多胜肽 人工方式合成

利用電泳方式從自 然界物種萃取同源 蛋白 利用基因工程方式 生產 生產方式

用途

血糖調整 I I Ϊ I ▼ 糖尿病 > 台療 I I I 代謝症候群'治療 第2圖