TWI329208B - Optical substrate for enhanced detectability of fluorescence - Google Patents

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1329208 > 九、發明說明： (一） 發明所屬之技術領域 本發明係有關一種用於螢光、磷光及發光材料例如含 標籤的分子生物標本之檢驗'標示'分析或辨識的諸如載 板、蓋片及樣本盤之類樣本基板，且更特別的是有關採用 這類樣本的支持器以提昇螢光檢測及造影。本發明之樣本 基板的格式採用的是諸如微滴定板的標準格式之類通常用 在這個領域的格式。 (二） 先前技術 螢光顯微技術經常用在分子生物學、生物化學及其他 生命科學領域以便分析包含核酸類（DNA、RNA)及蛋白質（ 酵素及抗原等）之類已含標籤或標示有螢光探針的生物分 子。這類應用之一是諸如用於基因檢測之類的DNA診斷術 ，其中係將D N A樣本澱積並裝訂在玻璃基板上。然後藉由 螢光爲基板上所裝訂的DNA造影。初始係透過習知顯微鏡 以視覺檢驗評估樣本的螢光，但是已證明這種手動方法既 費時成本又高。現在可使用很多不同的高速自動螢光造影 系統。 用於螢光檢測及量測儀器的重要表徵是基本上由儀器 之光學造影系統的訊噪比（SNR)定出的靈敏度。設計良好之 造影系統的訊噪比係受限於其集光能力而不是其內部雜訊 源。這系統的理論S N R値係表爲使用光電倍增管（ρ μ T)時 在陰極上的光電子數目：而此光電子數目基本上轉而取決 '於自樣本基板上感興趣區域抵達偵測器的光子數目 '偵測 1329208 器的量子效率以及由偵測器產生的暗電子數目》 —種用以增高SNR且因此改良其靈敏度的明顯趨近法 是降低其背景雜訊。背景雜訊的來源包含來自樣本之螢光 刺激性雷射光的空間或漫射性反射作用、樣本支持用基板 的自動螢光作用、位於光學造影系統光徑內之光學元件的 自動螢光作用、雜散光及偵測器的暗電流。可藉由適當地 放置造影系統內的孔徑並訂定其尺寸顯著地降低抵達偵測 器的雜散光。可藉由於系統中使用雙色性以及其他光譜濾 光片和分光器，同時拒絕雜散光及大部分受到反射的雷射 光而使螢光通過。可藉由避免在光徑中使用透鏡元件、以 玻璃取代聚合物透鏡或是在任何可能時候以曲面鏡取代透 鏡，以降低各光學元件的自動螢光作用。可藉由使用諸如 超薄或是不透明玻璃之類的低螢光材料以降低基板的自動 螢光作用。例如Strongin在美國專利第5,095,2 1 3號文件 中揭示了 一種塑膠蓋片會在塑膠內含有相當數量之碳黑粉 末下變得不透明且實質上呈非螢光的。另一種處理自動螢 光作用的方法是使用脈波式或是調制式激發作用並利用背 景螢光作用與標本螢光作用之間在放射衰減速率上的差異 ，如同授予Dandliker等人的美國專利第4,877,965號文件 以及授予Creager等人的美國專利第5,091，653號文件中所 掲示的。

Bogart在美國專利第5,5 5 2:2 72號文件中揭示了一種 用於檢測感興趣分析物之存在及量額的化驗系統及方法。 該化驗系統包含的測試基板具有一光學活性表面，可提昇 -6* 1329208 塗覆於測試基板之樣本內存在有分析物與不存在有分析物 之間的彩色反差亦即所觀測到來自表面之光在波長上的差 異》特別是，該基板可包括一種其上具有光學薄膜塗層的 諸如矽晶圓或金屬（例如鋁）基體之類反射性固態光學基體 。該塗層可包括數個層，例如包括一落在該基體上表面之 上的附著層以及一落在該附著層上表面之上含有用於感興 趣分析物之特定接合搭擋的接收層。可選擇總塗層厚度以 造成入射光在受到反射時進行薄膜干涉以致產生了特定的 色彩。明確地說，該塗層材料的整體厚度應該等於待消散 之不想要色光的W4波長以致該色光發生破壞性干涉。因 此，該基板具有特殊的背景色彩，然後以該背景色彩當作 在存在有分析物時所觀測到之不同色彩的比較參考色彩。 吾人建議同時使用定性的視覺觀測以及定量的儀器量測。 吾人也建議使用橢圓計量測其偏光反差。 實例是美國科羅拉多州波德城B i 〇 S t a r公司亦即上述 專利的委託人已應用Bogart的發明進行一種光學免疫化驗 (Ο I A )診斷性篩選測試，以便快速檢測出取自病人之樣本中 \ 是否存在有感染性病菌的特定抗原。商業產品包含用於A 及B群鏈球菌以及用於衣原體顆粒性結膜炎的測試套件。 Bogart專利中以這類特殊化驗當作實例的說明已附在 BioStar公司產品包裝內的說明書中且已發表於數篇醫學 期刊的論文中。簡言之，它們全部仰賴直接的視覺檢測反 射自測試基板之光在色彩上的改變，而這類改變係肇因於 基板表面上分子薄膜塗層的光學厚度因測表面上不動的抗 -7- t 1329208 體與存在於加到測試表面上之樣本液滴內的特定抗原之間 的結合反應造成的物理變化。原始之裸露測試表面的薄膜 厚度會在白光受到表面反射時造成優勢的金色視背景。該 抗原-抗體的結合反應係發生在所塗覆樣本內存在有感興 趣之特定抗原時，結果增加了薄膜厚度而造成該測試表面 出現從金色變爲紫色的對應變化。另一方面假如樣本內不 存在有該抗原則不致發生任何結合反應，其原始薄膜厚度 保持不變而該測試表面則保持原始的金色代表測試結果是 否定的。這種診斷性化驗工具是非常靈敏而容易解讀的。

Bogart在其專利文件的另一實施例（前述專利文件的 第17圖）中進一步揭示了將這類基板用於已提昇之螢光檢 測的應用。在藉由與基板塗層之接受層內特定結合搭擋發 生反應將感興趣的分析物結合到表面上之後，可使螢光性 標籤分子附著到分析物上。特別是，可使螢光分子附著到 任何經適當選擇之特定接受材料或諸如二元抗體之類試劑 上並塗覆到表面上。如是可透過分析物的橋使螢光分子結 合到表面上所存在對表面而言不動的感興趣分析物之上。 將具有激發波長的光引導到表面上會激發結合於表面上的 任何標籤產生螢光，因此透露出感興趣分析物的存在。因 爲可能未將最大螢光波長平移到離開待分辨之激發波長足 夠遠處，故可使反射性基板具有一抗反射層並選擇其厚度 以抑制該激發波長的反射作用，因此可降低抵達偵測器的 背景雜訊。Bogan宣稱螢光信號的產生與薄膜厚度無關。 雖則可藉由增加雷射的輸出功率以提高螢光信號S的強度 1329208 ，然而這同時提高了反射的雷射雜訊因此只能對最終的 SNR產生很少的改良。

Kain等人於美國專利第6,008,892號文件中揭示了一 種對激發波長具有反射性的樣本基板。這種基板上具有一 厚度受控制的透明塗層，其中已選擇其塗層厚度以確保放 在該層頂上的分子樣本係落在激發光的反節點上。特別是 ’該基板包含一具有空間反射性上表面的剛性基體。選擇 落在該基體上表面之上透明塗層的厚度，使得具有特殊激 發波長之垂直入射光從塗層頂部到基體反射表面的光徑實 質上等於該激發光之1/4波長的奇數（1，3，5等）倍。材料 的光徑長度係由光的波長、材料的折射率以及光行經該材 料的角色定義出。反射性樣本基板中，基體的反射性表面 係稍微洛在該基體的貫體表面以下具明確定義的深度處， 此深度的量額等於該反射性表面材料的集膚（skin)(或是穿 透）深度及該基體上任何表面氧化物之光學深度的總和。可 藉由將樣本放在塗層上該激發光的反節點或鄰近處之上以 產生最大的螢光激發作用。一反射性基板也可藉由使螢光 造影顯微系統的立體聚集角近乎加倍以提昇螢光聚集作用 。如是，提高了整體的螢光信號而引致對訊噪比的大幅改 良。同時’因爲該塗層是很薄的故降低了來自這種材料的 螢光背景雜訊。 如同Kain等人所述，該基體可以是完全由金屬製成的 或是由一剛件底層和一頂部金屬塗層組成的。該金屬可以 7E銘、銀、金或錯。該透明塗層可以是單一的一層諸如砂 石、礬土或氟化物材料（如氟化鎂）之類介電材料層。或者 -9- 1329208 是’該透明塗層可以是一多重塗層而具有一由化學反應性 材料製成的頂層以便將特定的生物樣本組成結合到其上。

Kain等人將透明之1M波層塗覆於反射性表面上的槪 念係受限於具有剛性表面的反射器。這裡光並未穿透到該 反射器的實體表面底下或者其穿透作用受限於最多到達表 面底下幾奈米處（集膚深度）。實際上這代表的是對諸如金 屬基板或是金屬塗層之類金屬表面的限制。 一旦各介電層對反射作出顯著的貢獻，則很難定義& 穿透深度而添加1 Μ波層的槪念無法運作。例如對鋁製面 鏡而言經常是使用額外的介電層以提昇金屬的反射率而造 成所謂的「泵抽式金屬面鏡」。此例中，各介電層都是面 鏡的一部分且最後一層形成了該面鏡的實體表面。光會穿 透到此面鏡堆疊內且其干涉作用會連同金屬的反射率一起 建立光學性質。在這種系統上添加一層或奇數層的額外〗/4 波層經常無法在此層上放置有螢光樣本的位置上產生反節 點。除此之外，大多數情況下干涉系統都會受到干擾而造 成其反射率驟減。 不過只要相對於該金屬表面滿足奇數個1/4波層的條 件則能夠利用各1 /4波層的反射率貢獻提昇其螢光作用^ Chaton等人於國際專利第02M8691號文件中給出的實例中 可以看到這種效應。Chaton等人說明的方法係在矽基板上 使用具有面鏡功能的介電式1/4波（層）堆疊以提昇其螢光 作甩。對波長5 5 0奈米的光而言矽元素的反射率大約是4 2 % 。這會在金屣表面上造成其電磁場振辐平方（E2)大約等於 -10- 1329208 自由行進波之場振幅平方E2(PW)的10%。在剛性金屬表面 上塗覆二氧化矽之單一 1/4波層（遵循Kain等人之專利文 件中的一個實施例）會造成比E2(PW)高了 2 5%的場振幅，因 此得到一等於1 .25的提昇係數。Chaton等人使用的則是針 對波長5 5 0奈米之光所設計的1 /4波堆疊以強化其反射率 。這意指使用由交替配置具有高及低折射率之介電層構成 的系統以提高其反射率，其中每一個單獨的層都具有等於 1/4設計波長的厚度。Chaton等人使用的實例是一形成於矽 上以二氧化矽（厚度爲94奈米，共三層）四氮化三矽（Si3N4 ’厚度爲69奈米，共兩層）及爲材料的五層系統。這造成 了稍微低於6 0 %的反射率。以1 /4波堆疊爲基礎的面鏡係 稱作布雷格（Bragg)面鏡。通常這種布雷格面鏡係以最外層 係一高折射率層之1 Μ波堆疊爲基礎形成的。不過，Chaton 等人係以低折射率的二氧化矽材料層當作堆疊最外一層的 1 /4波層。已知低折射率的最外層會造成低反射率。移除該 最外層（低折射率）甚至會造成更高的反射率。如同Chaton 等人所述，他們使用二氧化矽層當作最外層以便產生能與 聯結性化學物質相容的實驗表面。不過，Chaton等人未提 及的另一種正面效應是：我們的硏究結果顯示以低折射率 層當作最外層幸運地造成波長550奈米之光在表面上的場 振幅具有最大値’比E2 (P W )高了 2 2 0 %得到一等於2 · 2的提 昇係數。假如Chaton等人係以高折射率層當作最外層則其 電磁場振幅具有最小値。 有了 Chaton等人所用的塗層設計，反射能帶的中心會 4 41329208 落在5 5 0奈米的設計波長上且寬度爲200奈米。在反射能 帶內可將其反射率提高到稍微低於60%。因爲Chaton等人 並未將反節點條件列入考量，他們所下的結論是1 /4波堆 疊有效地提昇了波長落在450與650奈米之間的螢光信號 。這個波長範圍包括通常用作螢光標籤的諸如CY3和CY5 之類螢光材料的放射波長。不幸地，只有在使用設計波長 時精準地滿足反節點條件。對與5 5 0奈米差異很大的激發 波長而言是無法滿足這個條件的。對450奈米的光而言其 提昇係數只有0.2那麼低，對650奈米的光而言其提昇係 數則降到1 . 2。 因此仍然存在的難題是必需製作能夠爲相互間淸楚分 離之一個以上的激發波長提供最佳化提昇係數的樣本。特 別是’對落在532到548奈米左右（CY3)及633奈米左右 (CY5)的激發波長而言如何·實現這種樣本基板仍是待解的 問題。 通常’ CY3及CY5的信號強度和例如與聯結性化學物 質之親和性的差異上存在著固有差異，而造成了不同的信 號強度。因此，重要的是如何使兩個或更多個激發波長產 生程度大槪相同的信號強度。令人感興趣甚至更一般化的 槪念是考量獨立地調整兩個或更多個激發波長之提昇係數 的可能性。 除了上述討論之外，習知設計的解決方法會牽涉到各 金濕層或基板間之一投界面的問題。例如Chaton等人係局 限在矽基板上進行討論。K a i η等人則在剛性反射表面的實 1329208 例中的揭示內容牽涉到的都金屬表面。因此仍然存在的難 題必需製作能夠在未使用Kain等人以及Chaton等人提出 的金屬界面下提供已提昇之螢光信號的樣本基板。 (三）發明內容 因此本發明的目的是提供一種改良式樣本基板，以便 在不致產生激發波長之反射率完全取決於金屬表面之反射 率的缺點下提供已提昇之樣本激發作用及螢光放射。本發 明的另一個重要槪念是揭不一種樣本基板，以便爲兩個或 更多個不同激發波長的螢光信號提供最大的提昇作用。本 發明的又一槪念是揭示一種樣本基板，以便爲兩個或更多 個激發波長提供可調整其提昇係數的應用。 上述目的可藉由一種包括以介電式多重塗層爲基礎之 干涉式反射器的反射性樣本基板獲致滿足。此中激發光會 受到100%或接近100%的反射。因此和激發波長在覆蓋範 圍內之樣本基板外側有關聯的最終電磁場分布是一駐波或 是一具有各節點面及反節點面而接近駐波的形式。本發明 中’該干涉式反射器的各層都具有最佳化的厚度分布，其 中係選擇其厚度分布以確保放在該頂部塗層上的面狀螢光 樣本係落在該激發光之反節點面內。 此例中各介電層不須要滿足任何1/4波-厚度的要求。 這在設計上給予了一個額外的自由度且即使在具有兩個或 更多個激發波長的情況也能在該實體表面上實現最大或是 必要的電磁場。更明確地說，跳過使用各]/4波層或是奇 數個W4波介電層的條件可在設計上引致一個額外的自由 1329208 度，可在不需要施行習知解決方法的折衷措施下使兩個或 更多個激發波長滿足反節點條件。可將這個自由度用於在 牽涉到金屬之反射性界面的樣本以及純粹的介電式反射器 上，所引致的結果是我們無法在習知解決方法中找到的。 這種干涉式反射器內的電場分布是與可從金屬表面之 空間反射作用得知的場分布非常不同的。加到介電式反射 器頂部上的額外層可造成反射率的降低。除此之外，對這 種介電式反射器而言由於大多數的塗層都對反射率有貢獻 故無法定義出反射表面的位置。 不過本發明的發明人從硏究及實驗中發現，儘管很難 定義出反射表面然而可依下列方式定義出介電式反射器， 亦即使反射性樣本基板的實體表面在放置有面狀螢光樣本 處具有最大的（電磁）場。可在標準的薄膜最佳化工具的輔 助下找出該設計，並稍作修正以便在反射性樣本基板的表 面上獲致最大反射率連同最大場振幅的最佳化結果。 此例中，不需要任何額外的透明層且各介電層不須要 滿足任何1/4波·厚度的要求，因此即使在具有兩個或更多 個激發波長的情況也能實現最大的（電磁）場。除此之外， 較佳的是可在完全不使用金屬層或金基板下實現這種系統 〇 如上所述，可利用通常用於光學薄膜設計的統計技術 找出這種系統，再進行修正以便將實體表面上的反節點條 怦考量成最佳化目標的一部分。不過，本發明發明人的硏 究已在這種最佳化程序的輔助下對各基板樣品內的電磁場 -14- 1329208 分布進行最佳化。本發明的發明人已針對包含Kain等人以 及Chaton等人所揭示之習知解決方法的各種設計進行硏究 1而揭示了可在樣本之實體表面上提供已提昇之最大電磁 場強度的樣本基板。本發明的發明人發現該電磁場分布提 供的最小値係落在實體表面底下一個1 /4波處。這和電磁 場行進到樣本內的實際深度無關。結論是本發明的發明人 認爲Kain等人之1/4波準則的產生是必需使電磁場能在實 體表面底下一個1 /4波處提供一最小値。這反映了本發明 的一種槪念：只要樣本基板提供的電磁場分布中的最小値 係落在實體表面底下大槪一個1 /4波處則可強化實體表面 上的電磁場強度。 (四）實施方式 本發明之樣本基板可用在爲數廣泛之任何可能的螢光 顯微系統上，這類系統包含例如授予Sawamura等人之美國 專利第4,2 84,8 97號文件、授予Mathies等人之美國專利第 5,091，65 2號文件、授予 Kumagai等人之美國專利第 5,2 96,700號文件、授予Dixon等人之美國專利第5,381，224 號文件、授予Noguchi等人之美國專利第5,5 04,3 3 6號文件 以及美國專利申請案第08/595,355號、第08/616,174號及 第0 8/7 9 1，6 8 4號文件中所揭示的》 第1圖顯示的是一種根據本發明之較佳螢光造影系統 1。由例如雷射之類的光源10產生受激光束Π。較佳的是 ，該受激光束11係一種由單色相干光搆成的準直光束。不 過’也可以使用諸如發光二極體（LED)之類的非相干光源， 1329208 且可使非準直光源耦合於準直性光學元件上以產生準直光 束。假如該受激光束1丨不是單色的，則可透過濾光片進行 引導以減少具有不必要波長的光。 然後透過各透鏡系統12,121及一分光器15將受激光束 1 1引導到樣本基板2 0的表面上。可使用任何能施行二維 掃瞄的掃瞄機構以便沿著含樣本基板表面的平面內的各正 交軸移動樣本。 透鏡系統1 2係以受激光束1 1爲樣本基板提供同軸照 明。該受激光束Π指的是由樣本基板2 0在照射點上受到 刺激所產生的螢光放射；假如該樣本基板之照射點上具有 各面狀螢光樣本23，23'，結果是激發出可偵測的螢光。透 鏡系統1 2也能夠爲最終的螢光提供同軸的集光作用並形 成一螢光光束29。爲了使集光效率變得最大，較佳的是該 透鏡系統12具有大的數値孔徑。然後藉由扮演著聚光器角 色的透鏡系統12收集螢光，並回頭沿著入射光的路徑（但 是方向上是相反的）引導成爲回溯光束。由於該螢光一般而 言係由具有不同於入射之受激光之（各）波長的寬能帶波長 的光構成的，且由於該系統應該設計成可用在各種氟化鉻 上，故較佳的是該系統大致上是無色的且能跨越某一範圍 的波長提供色差的校正。穿透該透鏡系統1 2的光則撞擊在 諸如光電倍增管（PMT)之類的光電偵測器3 1上。 無論使用的是那一種造影系統’較佳的是該造影系統 應該能夠在高解析度造影及最小光學像差下跨越很大的掃 瞄領域進行高速掃瞄。此造影系統應該能夠提供同軸照明 -16- 1329208 並在高集光效率下進行集光。較佳的是使用具有絕佳色彩 校正的消色差系統以及其設計能產生最小背景雜訊（包含 自動螢光作用）的系統。 參照第2圖，根據本發明的樣本基板41包楛一基體 43以及一落在該基體43頂部之上的干涉式反射器45。各 面狀螢光樣本23，23'則係塗覆於該干涉式反射器45頂部之 上。 該基體4 3可以是由任何可塗覆的材料製成的。例如， 該基體材料是可以是諸如玻璃或塑膠之類的透明材料或是 g者如錦之類的金屬材料。也可使用任何其他剛性底層當作 基體。 該干涉式反射器45包括一介電式多重塗層，其中含有 至少一高折射率塗層4 7及至少一低折射率塗層4 9。 可使用的塗層材料有例如：五氧化二鈮（Nb205)、二氧 化矽（Si〇2)、氧化鋁及氧化鎂；IVb，vb，VIb族之氧化物及 銃、釔 '鈣、緦、鋅、鐵、銦、錫、鈽及鈥之類元素的氧 化物；以及這類元素之混合物或是合金的氧化物；以及鈦 、鉬、銷、矽、飴及鋁之類元素的氮氧化物；以及鎂、鋇 、鉬、鈣、稀土族及鉛之類元素的氟化物等。 例如可藉由下列方法之一進行各層的塗覆作業：熱學 及/或電子束氣相澱積法；以及由諸如濺射法亦即直流磁控 管激射法之類CVD(LPCVD，PECVD等）或PVD式處理法施 行的複製、轉移及薄膜澱積法。也可以使用離子輔助式澱 積處理法以及溶膠-凝膠處理法。也可藉由下列方法之一將 1329208 各層轉移到基體上：結合法以及分子黏貼法。 該干涉式反射器45的頂層不需要是一種惰性材料層 ，而是一種具有生物活性以便與樣本材料或是該樣本之特 定成分結合的材料層。 爲了藉由使面狀螢光樣本之座落位置具有最大電場以 產生最大的螢光放射，必須使該干涉式反射器4 5內所包括 之多重塗層具有最佳化的層膜厚度分布。 可藉由應用吾人所熟知的光學薄膜計算及最佳化技術 之一完成最佳化的多重塗層設計。在大多數例子裡，這類 技術都是以使用以量測實際薄膜設計之空間特徵到標的特 徵之距離的價値函數最小化爲基礎的。可在標準程序稍作 修正下修正該價値函數，其方式是使該函數包括用以說明 電場平方與必要値（此例中等於駐波的最大値）之距離一項 〇 爲了正確地定出適當的塗層厚度分布及/或折射率分 布，必須將激發光的入射角、外罩媒介、塗層材料及基板 的偏極性及折射率列入考量。 應該注意的是有了這種最佳化方法，吾人也能夠以相 同的多重塗層設計出各薄膜堆疊，而能滿足使具有兩個或 更多個激發波長的激發光在面狀螢光樣本23,23'之座落位 置上具有最大電場的要求。因此有了本發明，吾人不再需 要犧牲厚度以符合必要的波長。 樣本基板41係設計成可運用在任何螢光造影系統例 如第1圖所示之螢光造影系統1上。根據本發明之樣本基 1329208 板4 1的建造方式是使之能在不需要增加雷射光束之功率 且除了樣本基板41本身之外不需要改變系統內的物鏡或 其他光學元件下產生最大的螢光放射及集光作用。 此中給出的多重塗層實例包括22個層。表1列舉了塗 層材料 '層膜厚度分布以及折射率。對這個實例而言，係 以五氧化二鈮（Nb2〇5 ’ n = 2_3)當作高折射率材料而以二氧 化矽（S i 0 2，η = 1 · 4 8 )當作低折射率材料設計出每一個單獨的 層膜厚度。也可使用其他塗層材料。也可使用包括兩種以 上材料的多重塗層。此例中1係針對波長爲5 3 2奈米之激 發光對設計進行最佳化。 第3圖係將電場振幅的最終正規化平方値表爲與基體 43之距離的函數所繪製的分布圖。圖中也顯示了將折射率 分布表爲與基體43之距離的函數所繪製的分布圖。從第3 圖可以看出，該干涉式反射器45內電場的平方値進行著從 零到區域性最大値再回到零的震盪。該干涉式反射器內電 場的平方値之區域性最大値的封套係隨著與基體之距離而 增大。因此無法辨識出其反射表面。由於激發光會穿透到 該干涉式反射器內數個波長處，故其穿透深度的定義對定 義反射表面而言是沒有用的。 從第3圖可以看出，在提供有適當塗層厚度的例子裡 ，各面狀螢光樣本23，2 3'係座落於當受激光束受到反射時 在該干涉式反射器45上方所建立之駐波的反節點上或是 其近旁。圖中特別以箭號及虛線標示出各面狀螢光樣本的 座落位置。具有最大之激發時，則會發生最大之螢光。即 -19- 1329208 使當塗層厚度對激發波長而言並非恰好正確時，假如其強 度只是峰値強度的90%或95%，其螢光信號仍將超越習知 樣本基板獲致顯著的改良。也可能肇因於樣本-到-樣本的 不同以及塗層的不同層而出現偏離其理想厚度的變化。 此外，假如要將具兩個或更多個激發波長的激發光用 在相同的樣本基板上，可選擇多重塗層的最佳化策略以便 達成使全部激發波長在各面狀螢光樣本的座落位置上具有 最大場的要求。如是，可使所要求的任何激發波長避免用 到具有較低電場強度的不必要位置。 如第1圖所示之螢光造影系統可具有一個或更多個光 源以便使不同的螢光樣本成分能同時或選擇性地提供多重 的螢光激發波長。必需對多重塗層名義上的光學厚度分布 進行最佳化其方式是針對相同的多重塗層平行地爲每一個 不同的激發波長進行最佳化。 這可由下列實例更淸楚地顯示出：這裡對CY5落在633 奈米以及CY3落在5 3 2奈米的激發波長而言，該樣本基板 應該在實體表面上提供已強化的電磁場。爲了達成這個目 的，本發明的發明人進行了下列步驟： -設計一第一層系統使之能夠反射第一波長範圍（620奈米 到650奈米）的光並透射第二波長範圍（52〇奈米到550奈 米）的光，因此兼顧了其最外層係—二氧化砂（Si〇2)層的 要求。 -調整該最外層其方式是使具有第一激發波長（633奈米） 的光在該層系統之實體表面上的電磁場振幅平方値是進 -20- 1329208 入行進平面波之電磁場振幅平方値的四倍高° 有了這些電磁場的條件，可使具有第一激發波長的光 在表面上具有最佳化狀況。現在可固定這個第一層系統的 層膜厚度。 -將一中間層系統置於各基板之間並調整其層膜厚度以便 反射第二波長範圍的光。 -調整與該第一層系統相鄰之中間層系統的厚度’其方式 是使具有第二激發波長（5 3 2奈米）的光在該層系統之實 體表面上的電磁場振幅平方値是進入行進平面波之電磁 場振幅平方値的四倍高。 有了這些電磁場的條件，可同時使具有第一激發波長 以及第二激發波長的光在表面上具有最佳化狀況。 表2顯示的實例是一種已最佳化且能同時強化波長爲 532奈米及633奈米之激發光的樣本基板。 因爲這種可能性，其優點是即使於存在有如Kai η等人 所述之具明確定義的反射表面（例如金屬表面）時，也能夠 跳過1/4波條件並使用如上所述的一種介電式多重塗層堆 疊及各最佳化程序以實現具有兩個或更多個激發波長的會 發光在各面狀螢光樣本的座落位置上具有最大場的要求。 這可由下列實例更淸楚地顯示出：具有第一激發波長 (633奈米）的光會受到各介電式千涉層的反射而具有第二 激發波長的光則受到銀層的反射。可使用此塗層系統的最 外層以便藉由改變其層膜厚度調整具有第一激發波長之光 在實體表面上的電磁場強度。可使用落在銀塗層上的第一 1329208 層以便藉由改變其層膜厚度調整具有第二激發波長之光的 電磁場強度。表3顯示的是這類層膜系統實例的厚度分布 〇 本發明的實例中總是以二氧化矽（Si〇2)層當作最外層 。這是一種用於塗覆聯結性化學物質的標準材料。聯結性 化學物質對樣本基板之實體表面上所用的材料相當敏感。 因此，不同的聯結性化學物質可能需要不同於二氧化矽 (Si〇2)的最外層。很淸楚的是本發明的槪念不應該受限於 以二氧化矽（Si〇2)層當作最外層。在實用的實例中，本發 明的發明人已使用了二氧化鈦及/或五氧化二鈮（Nb205)。 同時也可使用任何其他實用的光學塗層材料。 除此之外’在將要從基板背面偵測螢光放射的例子裡 ’可肇因於未結合任何金屬層而使用本發明的趨近法。此 例中可進一步爲多重塗層進行最佳化以有效地透射螢光。 (五）圖式簡單說明 第1圖係用以顯示一種常用以螢光造影系統的示意圖 〇 第2圖係用以顯示一種根據本發明之樣本基板的閉合 截面圖示。 第3圖顯示的以電場分布之正規化平方値（e2)/Ig2對與 如第2圖所示之基體的距離作圖得到的曲線圖，其中也顯 示了該多重塗層的折射率分布。 主要元件符號說明 1 螢光造影系統 -22- 1329208 10 光 源 11 受 激 光 束 12,12' 透 鏡 系 統 15 分 光 器 20 樣 本 基 板 23,23' 面 狀 螢 光 樣 本 29 螢 光 光 束 3 1 光 電 偵 測 器 4 1 樣 本 基 板 43 基 體 45 干 涉 式 反 射 器 47 尚 折 射 率 塗 層 49 低 折 射 率 塗 層 -2

Claims (1)

1. 光激發光， 有至少兩層 層L都滿足 ，指的是層L 射率，Ν係 波長，且其 層頂部之上 波長的光入 點處。 適用於具有 發光，其中 頂部之上的 波長的光入 點處。 第一波長係 二波長係落 反射器不含 基體設置有 反射性多重 1329208 十、申請專利範圍： 1. 一種樣本基板，係適用於具有第一波長的螢 包括一基體及一反射器，該反射器包含一具 的反射性多重干涉式塗層，其中並非所有的 1/4 波條件：dL. nL = (2N+l)·又/4;其中 dL 的實體厚度，nL指的是層L在第一波長的折 一等於或大於零的整數，而λ指的是該第一 中各層的厚度可確保配置在該多重干涉式塗 的任何螢光樣本材料會落在靠近當具有第一 射到該基板上時由激發光形成之駐波的反節 2 ·如申請專利範圍第1項之樣本基板，進一步 至少一不同於第一波長之第二波長的螢光激 各層的厚度可確保配置在該多重干涉式塗層 任何螢光樣本材料會落在靠近當具有該第二 射到該基板上時由激發光形成之駐波的反節 3 .如申請專利範圍第2項之樣本基板，其中該 落在532奈米到548奈米的範圍之內而該第 在63 3奈米左右。 4.如申請專利範圍第1項之樣本基板，其中該 任何金屬。 5 .如申請專利範圍第1項之樣本基板，其中該 金屬的反射性表面。 6 .如申請專利範圍第1項之樣本基板，其中該 干涉式塗層的最外層係一二氧化效（S i 0 2 )層。 1329208 7 .如申請專利範圍第1項之基板，其中該多重干涉式塗層 包括—含有多重層之第一層系統以及一含有多重層的中 間層系統，其中該中間層系統係配置在該基體與第—層 系統之間。 8 ·如申請專利範圍第7項之基板’其中該第一層系統可透 射至少一個波長。 9 .如申請專利範圍第7項之基板，其中該中間層系統包括 一配置在該基體上的金屬層以及一配置在該金屬層上的 介電層。 10.如申請專利範圍第9項之基板’其中該金屬層係由選自 銀、金 '鋁、鉻、鉑及任何這類金屬之合金構成族群中 的一種金屬製成的。 1 1 _如申請專利範圍第1項之基板，其中該多重干涉式塗層 所包括的各介電層交替地具有相對較高及較低的折射率 ’使得其最外層係一具有相對較低折射率的介電層之一 〇 1 2 ·如申請專利範圍第！丨項之基板，其中各層至少包括下列 材料之一：五氧化二鈮（Nb 2 0 5 )、二氧化矽（Si02)、氧化 鋁及氧化鎂；IVb, Vb，VIb族及銃 '釔、鈣、緦、鋅、 鐵、銦、錫、铈及鈥之類元素的氧化物；以及銃、釔、 銘 '緦 '鋅 '鐵、銦、錫、铈及鈥類元素之混合物或是 合金的氧化物；以及鈦 '鉬、錆、矽、給及鋁之類元素 的氮氧化物；以及鎂、鋇、鉅 '鈣、稀土族及鉛之類元 素的氟化物等。 -25- 1329208 1 3 ·如申請專利範圍第1 1項之基板，其中各層使用的材料是 五氧化二鈮（Nb205)及二氧化矽（Si〇2)。 1 4 _如申請專利範圍第1項之基板，進一步包括一配置在該 反射器之最外層上的聯結性塗層。 1 5 _如申請專利範圍第1 4項之基板，其中該聯結性塗層係具 有生物活性的。 1 6 ·如申請專利範圍第1項之基板，其中該基體係呈剛性的 〇 17. 如申請專利範圍第1項之基板，其中該基體使用的是下 列材料之一：玻璃、塑膠、金屬或半導體材料。 18. —種樣本基板之製造方法，其中一樣本基板係適用於來 自配置在各基板間之一樣本在受到一光之激發時產生的 最大螢光放射，該方法包括下列步驟： -選擇一多重塗層之第一層系統的各層使之能夠反射該 光之一第一波長； -定出該第一層系統中各層厚度以確保該樣本係落在具 有該第一波長之該光的反節點平面內； -選擇一多重塗層之中間層系統的各層使之能夠反射該 光之一第二波長； -定出該中間層系統中各層厚度以確保該樣本係落在具 有該第二波長之該光的反節點平面內； -於一基體上澱積該中間層系統；以及 -於該中間層系統上澱積該第一層系統。 1 9 _如申請專利範圍第]8項之方法，進一步包括定出各層之 -26- 1329208 厚度及折射率’使得其電磁場分布的最小値落在該基板 之一實體表面以下大槪1/4波處的步驟。 20·如申請專利範圍第18項之方法，其中係選擇該第一層系 統的各層使之能夠透射具有該第二波長的光。 21.如申請專利範圍第18項之方法，其中定出該第一層系統 中各層厚度的步驟包括選擇該最外層的厚度以便爲具有 該第一波長的光提供必要的強化係數的步驟。 2 2 ·如申請專利範圍第2 0項之方法，其中定出該中間層系統 中各層厚度的步驟包括選擇該最外層的厚度以便爲具有 該第二波長的光提供必要的強化係數的步驟。 2 3 ·如申請專利範圍第1 8項之方法，其中澱積該中間層系統 的步驟包括於基體上澱積一金屬層以及於該金屬層上澱 積一介電層的步驟。 24.如申請專利範圍第18項之方法’進一步包括於該第一層 系統上灑積一聯結性塗層的步驟。 2 5 .—種生物分析系統中使用了如申請專利範圍第〗項之樣 本基板。 2 6 . —種螢光造影系統，包括一如申請專利範圍第1項之樣 本基板以及一指向該樣本基板上之樣本材料的光源’該 光源可發射包含該樣本材料之特定螢光成分特有的螢光 激發波長的光。 27· —種雷射掃瞄器包括如申請專利範圍第26項之螢光造影 系統。 -27-