CN1798968B - 用于获得增强的荧光检测能力的光学基片 - Google Patents

Abstract

一种样品基片，适于使用具有第一波长的荧光激励光。在基底上设置反射器。所述反射器包括具有至少两层的反射多层干涉涂层。并非所有层L都满足四分之一波条件：d_L·n_L＝(2N+1)·λ/4，其中d_L为层L的物理厚度，n_L为层L在第一波长下的折射率，N为等于或大于零的整数，λ为第一波长。层的厚度可保证设置在所述多层干涉涂层顶部的任何荧光样品材料都处于入射在所述基片上的具有第一波长的激励光所形成的驻波波腹附近。

Description

用于获得增强的荧光检测能力的光学基片

技术领域

本发明涉及一种适于使用荧光激励光的样品基片。这种基片在为板、载片(slides)和元件时，用于例如检查、显示、分析或识别荧光、磷光或发光样品材料，例如带标记的分子生物样本。

背景技术

荧光显微镜法常常用在分子生物学、生物化学以及其他生命科学领域中，用于分析生物分子，所述生物分子包括已经用荧光探针标签或标记的核酸(DNA，RNA)和蛋白质(酶，抗原等)。一种用途是DNA诊断，如用于基因检测，其中将DNA样品沉积和凝固(bound)到玻璃基片上。然后可通过荧光来成像基片上凝固的DNA。最初通过常规的显微镜通过视觉检查来评估样品的荧光性，不过证明这种手工方法费时且昂贵。现在已经可得到多种不同的高速自动荧光成像系统。

荧光检测和测量仪器的一个重要特征是灵敏性，而灵敏性主要由仪器光学成像系统的信噪比(SNR)决定。设计良好的成像系统的信噪比受其光采集能力的限制，不受内部噪声源的限制。当使用光电倍增管(PMT)时，用阴极处的光电子数表示这种系统的理论SNR，而光电子数主要取决于从样品基片上感兴趣的区域到达检测器的光子数量、检测器的量子效率以及检测器产生的暗电子数量。

一种易于想到的增大SNR、从而提高灵敏性的方法，是减小背景噪声。背景噪声源包括来自样品的荧光激励激光的镜面或漫反射、保持该样品的基片的自身荧光、光学成像系统光路中的光学装置的自身荧光、杂散光以及检测器的暗电流。通过成像系统中适当尺寸和放置的；孔径，可显著地减小到达检测器的杂散光。系统中通过使用二向色滤光片以及其他光谱过滤器和分束器，可除去杂散光和大部分反射激光，而使荧光透过。光路中通过避免使用透镜粘接剂、尽可能地使用玻璃取代聚合物透镜或者使用曲面镜取代透镜，可减小光学元件的自身荧光。

通过使用低荧光材料，如超薄或不透明玻璃基片，可减小基片的自身荧光。例如，在美国专利No.5,095,213中，Strongin披露了一种塑料载片，通过塑料中一定量的碳黑粉末(black carbon powder)，使塑料载片不透明并且基本上没有荧光性。另一种解决自身荧光的方法，是使用脉冲或调制激励，利用背景荧光与样本荧光之间发射衰减速率的差异，如美国专利No.4,877,965(Dandliker等人)和5,091,653(Creager等人)中所述。

在美国专利No.5,552,272中，Bogart披露了一种用于检测感兴趣的被分析物的存在或数量的分析系统和方法。包括具有光学活性表面的试验基片，该光学活性表面增强色对比度，即在表面发出的光的观测波长(或波长组合)在涂敷到试验基片上的样品中存在和不存在被分析物之间的差异。特别是，基片可包括反射性固体光学基底，如硅片或金属(例如铝)基底，其上具有光学薄膜涂层。涂层可包括数层，包括例如处于基底顶面上的附着层，以及处于附着层顶面上的受体层，该受体层包含用于感兴趣的被分析物的特定键合(binding)对象。选择总涂层厚度，使入射光在反射时经历薄膜干涉，从而产生特定颜色。特别是，涂层材料应当具有将被衰减的不希望颜色的四分之一波长的总厚度，从而将发生该颜色的相消干涉。从而基片具有特定背景颜色，因而当存在感兴趣的被分析物时，可用作不同观察颜色的比较参考。提出了定性视觉检查和定量仪器测量。还提出利用偏振光椭圆率测量仪产生的偏振对比度。

由上述专利的受让人Boulder，Colo.公司的Biostar提出使用Bogart方法的一个例子，是用于快速检测(少于30分种)从患者采取的样品中存在传染性病原体的特定抗原的光学免疫测定(OIA)诊断筛查试验。商业产品包括用于A型和B型链球菌和用于衣原体沙眼(chlamydia trachomatis)的试验装备。在Bogart专利中以这些特定分析为例，在用于相应的Biostar产品的包装内容中有描述，并且在医学期刊中的若干出版文章中也有描述。简而言之，这些方法都依赖于对反射离开试验基片的光的颜色改变的直接视觉检测，而颜色改变是由于试验表面上的固定抗体与涂敷到试验表面上的样品液滴中可能存在的特定抗原之间的键合(binding)反应导致的基片表面上分子薄膜涂层的光学厚度的物理改变。原始的裸试验表面具有这样一种薄膜厚度，导致当白光反射离开该表面时，主要的视觉背景为金色。当所涂敷样品中存在感兴趣的特殊抗原时发生的抗原-抗体键合反应，导致薄膜厚度增大，引起试验表面的颜色从金色到紫色的相应改变。如果另一方面，样品中不存在抗原，则不发生键合，原始薄膜厚度保持不变，试验表面保持其原始的金色，表示阴性结果。这种诊断化验方法非常灵敏且易于理解。

Boart在其方法的另一实施例(上述专利的图17)中还披露，使用这些基片获得增强的荧光检测。在感兴趣的被分析物通过与基片涂层的受体层中特定键合对象反应而结合到表面上之后，荧光标签分子可以附着到被分析物上。特别是，荧光分子可以附着到任何适当的选择性和特殊受体材料或试剂上，如二次抗体，并且涂敷到表面上。从而，荧光标签附着到表面上的感兴趣被分析物上(如果存在的话)，并且通过被分析物桥接而固定到表面上。引到到表面上的激励波长的光，从附着到表面上的任何标签激发出荧光，表明存在感兴趣的被分析物。由于最大荧光波长不可能激励激发波长足够远以便加以区分，反射基片可具有抗反射层，选择该抗反射层的厚度，以便抑制激励波长反射，从而减小到达检测器的背景噪声。Bogart指出，荧光信号的产生不依赖于薄膜厚度。虽然可通过增加激光器的输出功率来增大荧光信号S，不过反射激光噪声也将增大，有可能所产生的SNR几乎没有提高。

在US6,008,892中，Kain等人披露了一种样品基片，其对于激励波长是反射性的。该基片上具有受控厚度的透明涂层，选择所述厚度以保证设置在涂层顶部的分子样品处于激励波长的波腹处。特别是，该基片包括具有镜面反射上表面的刚性基底。基底上表面上的透明涂层具有选定的厚度，从而对于垂直入射的特定激励光波长，从涂层顶部到基底反射表面的光程基本上为四分之一激励光波长的奇数倍(1，3，5等)。由光的波长，材料的折射率以及通过材料的传播角度限定材料的光程长度。在反射性样品基片中，基底的反射表面处于清晰的的稍低于基底物理表面的深度，所低于的量等于反射表面材料的透入(或穿透)深度与基底上任何表面氧化物的光学深度之和。通过将样品放置在涂层上，处于激励光的波腹处或附近，发生最大荧光激发。反射基片还增强荧光采集，使之近似为荧光成像显微系统的立体采集角度的两倍。从而，总荧光信号增大，导致更大地提高信噪比。此外，由于涂层非常薄，来自该材料的荧光背景噪声减小。

Kain等人指出，基底可完全由金属制成，或者可由具有顶部金属涂层的刚性低层组成。金属可以为铝、银、金或铑。透明涂层可以为单个介质材料层，如二氧化硅、氧化铝或氟化物材料(如MgF₂)。或者，透明涂层可以为多层涂层，具有与特定生物样品成分键合的化学反应材料顶层。

在反射表面上涂敷透明四分之一波层的Kain原理局限于具有刚性表面的反射器。此时光没有穿透到反射器的物理表面下面，或者穿透局限于表面下面最多若干纳米(集肤深度(skin depth))。实际上这表示局限于金属性表面，如金属基片或金属性涂层。

一旦介质层明显地有助于反射，就难以限定穿透深度，增加四分之一波层的思想不能实现。例如，对于铝反射镜，经常使用附加介质层来增强金属的反射性，导致所谓的“抽运金属性反射镜”。在此情形中，介质层是反射镜的一部分，并且最后的介质层构成反射镜的物理表面。光穿透到该反射镜堆中，干涉作用与金属反射性一起，确定光学性质。为该系统增加一个附加的四分之一波层或其奇数倍，当荧光样品放置在该层上时，常常不能在荧光样品的位置处产生波腹。此外，在大多数情形中，干涉系统受到干扰，有可能导致反射率急剧减小。

不过，对于金属性表面，只要满足奇数倍四分之一波条件，则利用四分之一波层对反射率的贡献，可以增强荧光性。Chaton等人在WO02/48691中给出了一个例子，可以看到这种效果。Chaton等人描述了在硅基片上使用具有反射镜功能的介电性四分之一波堆，以增强荧光性。在550nm下硅的反射率为大约42％。这导致金属性表面上平方电磁场振幅(E²)大约为自由传播波场振幅平方E²(PW)的10％。在刚性金属表面上采用一个SiO₂四分之一波层(根据Kain等人方法的一个实施例)，导致场振幅比E²(PW)高25％，从而产生1.25的增强系数。Chaton等人使用具有550nm设计波长的四分之一波堆，以增强反射率。这意味着使用交替的高和低折射率介质层这样一种系统来增大反射率，每一层具有四分之一设计波长的光学厚度。作为一个例子，Chaton等人在硅上使用具有SiO₂(94nm层厚，3层)和Si₃N₄(69nm层厚，2层)的5层体系，作为涂层材料。这导致反射率稍低于60％。基于四分之一波堆的反射镜被称作布拉格反射镜。通常这种布拉格反射镜基于最外层为高折射率层的四分之一波堆。不过，Chaton等人使用SiO₂层作为最外部四分之一波层，而SiO₂为低折射率材料。已知低折射率层的最外层，导致更低的反射值。去除最外层(低折射率层)将导致更高反射率。Chaton等人描述了他们使用SiO₂作为最外层，以便产生与键合化学学相容的物理表面。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进的样品基片，其产生增大的样品激发和荧光发射。

根据本发明，由适于使用具有第一波长的荧光激励光的样品基片实现这一目的，所述样品基片包括基底和反射器，所述反射器包括具有至少两层的反射多层干涉涂层，其中并非所有的层L都满足四分之一波条件d_Ln_L＝(2N+1)·λ/4，其中d_L为层L的物理厚度，n_L为层L在第一波长下的折射率，N为等于或大于零的整数，λ为第一波长，其中层的厚度保证设置在多层干涉涂层顶部的任何荧光样品材料都处于入射在所述基片上的具有第一波长的激励光所形成的驻波波腹附近。

在根据本发明的基片的一个实施例中，还适于使用具有不同于第一波长的至少第二波长的荧光激励光，其中层厚度保证设置在所述多层干涉涂层顶部的任何荧光样品材料都处于入射在所述基片上的具有第二波长的激励光所形成的驻波波腹附近。

在另一实施例中，所述样品基片适于处于532nm到548nm波长范围内的第一波长和大约633nm的第二波长。

在另一实施例中，根据本发明的样品基片具有不含金属的反射器。

在另一实施例中，样品基片具有设有金属性反射表面的基底。

在根据本发明的样品基片的另一实施例中，反射多层干涉涂层的最外层为SiO₂层。

在根据本发明的基片的另一实施例中，多层干涉涂层包括具有多层的第一层体系和具有多层的中间层体系，所述中间层体系设置在基底与第一层体系之间。

从而，根据另一实施例，第一层体系透过一个波长的光。

从而，根据另一实施例，中间层体系包括设置在基底上的金属层和设置在所述金属层上的介质层。

在另一实施例中，选定的金属层为以下金属组中的至少一种金属，该金属组包括银、金、铝、铬、铂和这些金属的任何合金。

在根据本发明的基片的另一实施例中，所述多层干涉涂层包括交替地具有相对较高和较低折射率的介质层，从而使最外层为具有相对较低折射率的层。

从而根据另一实施例，所述层包括Nb₂O₅，SiO₂，氧化铝，氧化镁其中至少一种；IVb，Vb，VIb族，钪，钇，钙，锶，锌，铁，铟，锡，铈或钬的氧化物；钪，钇，钙，锶，锌，铁，铟，锡，铈或钬的混合物或合金的氧化物；以及Ti，Ta，Zr，Si，Hf或Al的氧氮化物；镁，钡，锶，钙，稀土和铅的氟化物。

从而，在根据本发明的基片的另一实施例中，其中所述多层干涉涂层包括交替地具有相对较高和较低折射率的介质层，从而最外层为具有相对较低折射率的层，所述层包括Nb₂O₅和SiO₂。

在根据本发明的基片的另一实施例中，包括设置在反射器最外层上的键合涂层(linking coating)。

从而，在另一实施例中，键合涂层是生物活性的。

在根据本发明的基片的另一实施例中，所述基底是刚性的。

在根据本发明的基片的另一实施例中，所述基底包括玻璃，塑料，金属或半导体材料中的一种。

本发明还涉及样品基片的一种制造方法，当样品受到光激发时，所述样品基片适于使设置在该基片上的样品的荧光发射最大化，所述方法包括以下步骤：

·选择多层涂层的第一层体系的各层，用于反射第一光波长；

·确定所述第一层体系中各层的厚度，以保证样品处于第一波长光的波腹平面中；

·选择所述多层涂层的中间层体系的各层，用于反射第二光波长；

·确定所述中间层体系中各层的厚度，以保证样品处于第二波长光的波腹平面中；

·将所述中间层体系沉积到基底上，以及

·将所述第一层体系沉积到所述中间层体系上面。

从而，在根据本发明方法的一个实施例中，所述方法还包括确定层厚度以及层折射率的步骤，以便使电磁场分布中的最小值处于基片物理表面下面大约四分之一波处。

在根据本发明方法的另一实施例中，选择所述第一层体系的各层，使之透过第二波长光。

在根据本发明方法的另一实施例中，所述确定第一层体系的各层厚度的步骤包括，选择最外层的厚度，以便在第一波长处提供预期的增强系数。

根据本发明方法的一个实施例，其中选择所述第一层体系的各层，使之透过第二波长光，所述确定中间层体系的各层厚度的步骤包括，选择最外层的厚度，以便在第二波长处提供预期的增强系数。

在根据本发明方法另一实施例中，所述的沉积中间层体系的步骤包括，在所述基底上沉积金属层，并在所述金属层上沉积介质层。

在根据本发明方法的另一实施例中，包括在所述第一层体系上沉积键合涂层的步骤。

从而，上面提到的样品基片最好用于生物分析系统中。

本发明还涉及一种荧光成像系统，包括如上所述的样品基片和指向该样品基片上的样品材料的光源，所述光包括荧光激励波长，并且是样品材料的特殊荧光成分所特有的。

本发明还涉及一种激光扫描仪，包括上面提到的荧光成像系统。

返回Chaton方法，其具有作者没有提到的一种积极的效果：我们的研究表明，使用低折射率层作为最外层，导致对于550nm在表面上最大的场振幅，比E²(PW)大220％，导致增强系数为2.2。如果使用高折射率作为最外层，则电磁场振幅将最小。

另外，利用Chaton等人使用的涂层设计，反射带以550nm设计波长为中心，且为220nm宽。在反射带内，反射率被增大到稍低于60％。由于Chaton等人没有考虑波腹条件，他们推断出针对450nm到650nm之间的波长，四分之一波堆会有效地增强荧光信号。该波长范围包括通常用作荧光标签的荧光材料，如CY3和CY5的波长。遗憾的是，仅对于设计波长才很好地满足波腹条件。对于与550nm极为不同的激励波长，不满足这一条件。对于450nm，增强系数低至0.2，对于650nm，增强系数减小到1.2以下。

从而，Chaton留下以下问题，即希望制造出一种对于彼此足够分离的不止一个激励波长，提供最佳增强的样品。特别是对于大约532nm-548nm(Cy3)和大约633nm(Cy5)的激励波长，依然存在如何实现这种样品基片的问题。

通常对于Cy3和Cy5，信号的强度存在例如与键合化学物(linkerchemistry)的亲合力差异有关的固有差异，导致不同的信号强度。对于两个或多个激励波长如何实现大致相等信号强度的问题没有得到解决。在考虑针对两个或更多激励波长独立地调节增强系数时依然如此。

除上述之外，现有技术解决方案通常涉及与金属层或基片的界面。例如，Chaton限于讨论硅基片。在Kains文献中用于刚性反射表面的例子通常包括金属性表面。从而依然成为问题且希望制造这样一种基片样品，其不使用象Kain等人以及Chaton等人使用金属性界面，就可以提供增强的荧光信号。

从而，根据本发明的样品基片具有适于增强荧光检测和成像的光学结构。适于将根据本发明的样品基片的形式设定为通常用于被访问区域(addressed field)中，如标准形式的微滴定板。

根据本发明，在部分实施例中至少提供一种样品基片，其不再具有激励波长的反射率完全基于金属表面反射率的缺点。

从而，可实现一种样品基片，其对于两个或多于两个不同的激励波长，提供荧光信号的最大增强。从而，在本发明的样品基片处，提供针对两个或多个激励波长，可根据用途调节的增强系数，从而本发明的这种样品基片最好通过上述不同实施例的方法来制造。

根据本发明，反射性样品基片的一个实施例具有基于介质多层涂层的干涉反射器。激励光被100％或接近100％地反射。从而，在覆盖区域中样品基片外部，所产生的与激励波长有关的电磁场分布为具有波节平面和波腹平面的驻波或者接近驻波。根据本发明，干涉反射器的各层可具有最优化的厚度分布，选择厚度分布以保证放置在顶部涂层顶部上的面荧光样品(areal fluorescent sample)，都处于激励光的波腹平面中。

在此情形中，介质层不必满足四分之一波厚度要求。这样就使设计具有附加的自由度，并且即便对于两个或多个激励波长，在物理表面上也能实现最大或期望的电磁场。更具体而言，略去使用四分之一波层或四分之一波奇数倍介质层的条件，导致附加的设计自由度，针对两个或多个激励波长，可利用其来满足波腹条件，不需要如现有技术解决方案的情形作出折衷。对于包括金属性反射界面以及纯介质反射器的样品，可利用这种自由度。

这种干涉反射器内的电场分布与已知的金属表面镜面反射的电场分布极为不同。干涉反射器顶部上增加的附加层，引起反射率减小。此外，对于这种干涉反射器，不可能限定反射表面的位置，因为大部分涂层对于反射都有作用。

不过，本发明者在研究和试验中发现，尽管难以限定反射表面，不过可按照这样一种方式设计干涉反射器，使得在放置面荧光样品的反射性样品基片的物理表面处具有最大场。可借助标准薄膜优化方法进行设计，不过稍稍地改变为优化最大反射率，并且使最大场振幅处于反射性样品基片的表面处。

在此情形中，不需要附加的透明层，对于介质层不必满足四分之一波厚度要求，从而即便对于两个或多个激励波长也能实现最大场。此外，根本不使用金属层或金属基片就能实现这种系统。

如上所述，可使用通常用于光学薄膜设计的统计技术来实现这种系统，作为优化目标的一部分，修改考虑改变物理表面上的波腹条件。不过，本发明者研究了基片样品内的电磁场分布，借助于这种优化方法进行优化。对于包括如Kain等人以及Chaton等人披露的现有技术解决方案在内的多种设计，研究在样品的物理表面处提供增强的最大电磁场强度的样品基片。发现电磁场分布的最小值处于物理表面下面四分之一波处。这与电磁场实际传播到样品中的深度无关。结论是，他们想出一条法则，即电磁场的最小值必须近似处于物理表面下面四分之一波处。这反映出本发明的一个方面：只要基片样品在物理表面下面近似四分之一波长处产生电磁场分布的最小值，则将增强物理表面上的电磁场。

附图说明

现在将通过例子并基于附图进一步描述本发明。

其中：

图1为通常使用的荧光成像系统的示意图。

图2为本发明样品基片的封闭侧剖面图。

图3所示的曲线表示以距图2中所示样品基片的基底的距离为函数的归一化的电场分布平方(E²)/I₀ ²。此外表示多层涂层的折射率分布。

具体实施方式

本发明的样品基片可用于多种可能的荧光显微系统的任何一个中，包括例如Sawamura等人的美国专利No.4,284,897，Mathies等人的5,091,652，Kumagai的5,296,700，Dixon等人的5,381,224和Noguchi的5,504,336，以及美国专利申请序列号No.08/595,355，08/616,174和08/791,684中所述的荧光显微系统。

在图1中说明了使用本发明的一种优选的荧光成像系统：光源10(例如激光器)产生激励光束11。激励光束11最好是单色相干光的准直光束。不过，可使用非相干光源，如发光二极管(LED)，并且可将非准直光源与准直光学装置耦合，以产生准直光束。如果激励光束11不是单色的，则可使其通过滤色片，以便减小任何不需要的波长。

然后激励光束11通过透镜系统12，12’和分束器15，被引导到样品基片20的表面上。可使用能产生二维扫描的任何扫描机制，在样品基片表面的平面内沿正交轴移动基片。

透镜系统12使激励光束11同轴照射样品基片。激励光束11为从所照射光斑处的样品基片20激发出荧光发射的激励光束：如果在样品基片的被照射表面上具有面荧光样品23，23’，则导致激发出可检测的荧光。透镜系统12还提供所产生荧光的同轴采集，并形成荧光光束29。为了使采集效率最大，最好透镜系统12具有大数值孔径。然后荧光通过透镜系统12(起聚光镜的作用)采集，并且作为后向光束沿入射光路向回引导(不过沿相反方向)。由于荧光通常由与入射激励光束的波长不同的宽波长带组成，并且由于应当将系统设计成可对多种荧光物质起作用，该系统最好被最大程度地消色差，并校正波长范围上的色像差。通过透镜系统12的光入射到到光电检测器31，如光电倍增管(PMT)上。

无论使用哪种成像系统，最好应当能够在大扫描场上高速地扫描，具有高分辨率成像和最小光学像差。应当提供同轴照射和高采集效率的采集。优选具有极好颜色校正的消色差系统，以及为使背景噪声(包括自身荧光)最小而设计的系统。

参照图2，本发明的样品基片41包括基底43以及处于所述基底43顶部上的干涉反射器45。面荧光样品23，23’涂覆到所述干涉反射器45的顶部上。

基底43可由可涂覆的任何材料制成。例如，基底材料可以是透明的，如玻璃或塑料，或者可以为金属性的，如铝。可使用任何其他刚性底层。

干涉反射器45包括具有至少一个高折射率涂层47和至少一个低折射率涂层49的介质多层涂层。

可使用例如Nb₂O₅，SiO₂，氧化铝，氧化镁，IVb，Vb，VIb族以及钪，钇，钙，锶，锌，铁，铟，锡，铈，钬的氧化物；这些元素的混合物或合金的氧化物；元素Ti，Ta，Zr，Si，Hf，Al的氧氮化物；以及元素镁，钡，锶，钙，稀土和铅的氟化物，作为涂层材料。

可通过以下方法中的一种涂覆各层：热和/或电子束汽相沉积，复印，转印，薄膜沉积，通过CVD类(LPCVD，PBCVD等)或者PVD类，如溅射(即DC磁控溅射)方法。可使用离子辅助沉积方法以及溶胶-凝胶(sol-gel)方法。可通过以下方法：键合和分子附着中的一种将各层转印到基底上。

干涉反射器45的顶层并非必须是惰性材料，而可以是生物活性的，以便与样品材料或样品的特定组分键合(bind)。

为了使荧光发射最大化，通过使面荧光样品位置处的电场最大，优化干涉反射器45中所包含的多层涂层的层厚度分布。

可通过采用一种已知的光学薄膜计算和优化技术，来优化多层涂层设计。在大部分情形中，这些技术基于使优质函数最小，其测量实际薄膜设计的光谱性质与目标性质之间的距离。在稍稍改变标准工艺时，可通过这样一种方式改变优质函数，所述方式包括找出电场的平方与期望值之间的距离，在本发明的情形中等于驻波的最大值。

为了正确地确定适当的涂层厚度分布和/或折射率，必须考虑激励光的入射角、偏振态以及涂层材料覆盖介质和基片的折射率。

通过这种优化方法，也可以设计出满足以下要求的薄膜堆，即为了使用相同的多层涂层，对于两个或多个激励波长进行激励，使最大场处于面荧光样品23，23’的位置。从而，为了与期望波长相匹配，不必对厚度作出折衷考虑。

样品基片41被设计成可使用任何荧光成像系统，例如图1中所示。将根据本发明的样品基片41构造成，除基片41本身之外，不必增大激光束的功率并且不必改变系统中的物镜或其他光学装置，就可使荧光发射和采集最大化。

给出包括22层的多层涂层的一个例子。表1中列出了涂层材料、层厚度分布以及折射率。对于该示例，使用Nb₂O₅(n＝2.3)作为具有高光学折射率的材料，使用SiO₂(n＝1.48)作为具有低折射率的材料，设计每个单层厚度。可使用其他涂层材料。也可使用包括超过两种材料的多层涂层。在本示例中，对于532nm的激励波长优化设计。

图3示意地表示以距基底43的距离为函数，所产生的电场振幅的归一化平方。还表示出以距基底43的距离为函数的折射率分布。从图3可以看出，干涉反射器45内电场的平方从零振荡到局部最大值，并返回零。干涉反射器内局部最大值的包络线随着距基底的距离增大而增大。从而不可能识别出反射表面。由于激励光透入干涉反射器内几个波长的距离，不能使用透入深度的定义来定义反射表面。

如图3中所示，如果提供适当的涂层厚度，则当激励光束被反射时，面荧光样品23，23’处于干涉反射器45上形成的驻波的波腹处或附近。特别是用箭头以及虚线表示出面荧光样品的位置。在受大最大激励时，产生最大荧光。即使对于激励波长并未精确地校正涂层厚度，如果强度仅为峰值强度的90％或95％，则荧光信号依然将显著地胜过现有技术样品基片。由于样品与样品的改变以及涂层改变，有可能改变理想厚度。

另外，如果相同基片样品使用两个或多个不同的激励波长，则可选择多层涂层的优化策略，以便对于所有所需激励波长，使最大场都处于面荧光样品的位置处。从而，对于任何所需激励波长，可避免使用任何不期望的低电场位置。

对于不同的荧光样品成分，图1的荧光成像系统可同时或者有选择地具有一个光源或多个提供多个荧光激励波长的光源。对于相同的多层涂层，需要并且能够对于不同并行激励波长中的每一个优化多层涂层的标称光学厚度分布。

在下面的示例中将对此进行更详细地说明：

此处，对于633nm的Cy5和532nm的Cy3这两个不同的激励波长，样品基片应当在物理表面上提供增强的电磁场。为了实现这一目的，本发明者执行以下步骤：

-设计第一层体系，反射第一波长范围(620nm-650nm)并透过第二波长范围(520nm-550nm)，从而注意使最外层为SiO₂层。

-按照这样一种方式调节最外层，使得对于第一激发波长(633nm)，该层体系物理表面上的平方振幅电磁场大约为输入传播平面波的振幅电磁场平方的四倍。

由此，优化表面上针对第一激发波长的电磁场条件。此时不固定第一层体系的层厚度。

-将中间层体系放置于基片之间，并调节层厚度，以便反射第二波长范围。

-按照这样一种方式调节与第一层体系相邻的中间层体系的层厚度，使得对于第二激励波长(532nm)，该层体系物理表面上的平方振幅电磁场大约为输入传播平面波的振幅电磁场平方的四倍。

由此，优化表面上针对第二激励波长以及第一激励波长的电磁场条件。

表格表示出对于两个激励波长：532nm和633nm，为了增强而优化的这种样品基片。

由此，即便在存在清晰的反射表面(例如金属表面)的情形中，也可能具有如上所述的忽略四分之一波条件，并使用介质多层涂层堆和优化过程的优点，以便对于一个或多个激励波长在面荧光样品的位置处获得最大场。

在下面的示例中对此进行更详细地说明：

第一激励波长(633nm)被介质干涉层反射，而第二激励波长被银层反射。使用该涂层体系的最外层，通过调节层厚度，调节物理表面上第一激励波长的电磁场。可使用银涂层上的第一层，通过调节层厚度来调节第二激励波长的电磁场。表3给出了这种层体系的厚度分布的一个例子。

在示例中，总是使用SiO₂作为最外层。这是用于施加键合化学物(linker chemistry)的标准材料。键合化学物对于基片样品物理表面上使用的材料非常敏感。从而，不同的键合化学物有可能需要不同于SiO₂的最外层。显然，本发明的原理不限于使用SiO₂作为最外层。在实际示例中常常使用TiO₂和/或Nb₂O₅。也可以使用任何其他的实用光学涂层材料。

另外，在从基片的背侧检测荧光发射的情形中，可使用本发明的方法，因为不包括任何金属层。在此情形中可另外优化多层涂层，以便有效地透过荧光。

Claims (28)

1.一种样品基片，适于与具有第一波长的荧光激励光一起使用，所述样品基片包括基底和反射器，所述反射器包括具有至少两层的反射多层干涉涂层，所述至少两层的最外层的折射率低于所述至少两层的其余层的折射率，

其特征在于

·并非所有层L都满足四分之一波条件：即d_L·n_L＝(2N+1)·λ/4，其中d_L为层L的物理厚度，n_L为层L在所述第一波长下的折射率，N为等于或大于零的整数，λ为所述第一波长，并且，因此

·其中所述层的厚度和折射率的系列保证设置在所述多层干涉涂层顶部的任何荧光样品材料都处于入射在所述基片上的具有所述第一波长的激励光所形成的驻波波腹附近。

2.根据权利要求1所述的样品基片，还适于与具有不同于第一波长的至少第二波长的荧光激励光一起使用，其中层的厚度和一系列折射率保证设置在所述多层干涉涂层顶部的荧光样品材料也处于入射在所述基片上的具有第二波长的激励光所形成的驻波波腹附近。

3.根据权利要求2所述的样品基片，其中所述第一波长处于532nm到548nm波长范围内，所述第二波长大约为633nm。

4.根据权利要求1到3其中之一所述的样品基片，其中所述反射器不含金属。

5.根据权利要求1到3其中之一所述的样品基片，其中所述基底设有金属性反射表面。

6.根据权利要求1到3其中之一所述的样品基片，其中所述反射多层干涉涂层的最外层为SiO₂层。

7.根据权利要求1到3其中之一所述的基片，其中所述多层干涉涂层包括具有多层的第一层体系和具有多层的中间层体系，所述中间层体系设置在所述基底与所述第一层体系之间。

8.根据权利要求7所述的基片，其中所述第一层体系透过所述波长之一的光。

9.根据权利要求7所述的基片，其中所述中间层体系包括设置在所述基底上的金属层，和设置在所述金属层上的介质层。

10.根据权利要求9所述的基片，其中所述金属层为包括银、金、铝、铬、铂的组中的一种金属以及这些金属的任何合金。

11.根据权利要1到3其中之一所述的基片，其中所述多层干涉涂层包括交替地具有相对较高和相对较低折射率的介质层，使得最外层为具有相对较低折射率的所述层之一。

12.根据权利要求11所述的基片，其中所述的层包括Nb₂O₅，SiO₂，氧化铝，氧化镁；IVb，Vb，VIb族以及钪，钇，钙，锶，锌，铁，铟，锡，铈或钬的氧化物；钪，钇，钙，锶，锌，铁，铟，锡，铈或钬的混合物或合金的氧化物；Ti，Ta，Zr，Si，Hf或Al的氧氮化物；以及镁，钡，锶，钙，稀土和铅的氟化物其中至少之一。

13.根据权利要求11所述的基片，其中所述层包括Nb₂O₅和SiO₂。

14.根据权利要求1到3其中之一所述的基片，还包括设置在所述反射器最外层上的键合涂层。

15.根据权利要求14所述的基片，其中所述键合涂层是生物活性的。

16.根据权利要求1到3其中之一所述的基片，其中所述基底是刚性的。

17.根据权利要求1到3其中之一所述的基片，其中所述基底包括玻璃、塑料、金属或半导体材料其中之一。

18.一种制造适用于与具有第一波长的荧光激励光一起使用的样品基片的方法，所述方法包括以下步骤：

·提供基底；

·将包括具有至少两层的反射多层干涉涂层的反射器施加至所述基底；

·将所述反射多层的最外层的折射率选择为低于所述至少两层的其余层的折射率，

其特征在于通过沉积使并非所有层L都满足四分之一波条件：即d_L·n_L＝(2N+1)·λ/4，其中d_L为层L的物理厚度，n_L为层L在所述第一波长下的折射率，N为等于或大于零的整数，λ为所述第一波长，由此

·对所述至少两层的厚度和折射率的序列进行选择，从而使任何设置在所述多层干涉涂层顶部的荧光样品材料都处于入射在所述基片上的具有所述第一波长的激励光所形成的驻波波腹附近。

19.根据权利要求18所述的方法，还包括：

选择另外的多层涂层的用于反射第二波长光的中间层体系的各层；

在所述基底和所述第一层体系之间沉积所述中间层体系。

20.根据权利要求19所述的方法，还包括确定层厚度和层折射率的步骤，使电磁场分布中的最小值处于基片物理表面下面大致四分之一波长处。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中选择所述第一层体系的各层，使其透过第二波长的光。

22.根据权利要求18到20其中之一所述的方法，其中确定所述第一层体系的层厚度的步骤包括，选择最外层的厚度，以便提供第一波长下的期望增强系数。

23.根据权利要求19所述的方法，其中确定所述中间层体系的层厚度的步骤包括，选择最外层的厚度，以便提供第二波长下的期望增强系数。

24.根据权利要求19到20其中之一所述的方法，其中沉积中间层体系的步骤包括：在基底上沉积金属层，并在所述金属层上沉积介质层。

25.根据权利要求19到20其中之一所述的方法，还包括在所述第一层体系上沉积键合涂层的步骤。

26.根据权利要求1到17之一所述的样品基片，其中所述基片用于生物分析系统中。

27.一种荧光成像系统，包括根据权利要求1到17其中之一的样品基片和指向所述样品基片上的样品材料的光源，所述光包括荧光激励波长，并且对于所述样品材料的特定荧光成分是特定的。

28.一种激光扫描仪，包括根据权利要求27所述的荧光成像系统。

Images