JP2006526768A - 蛍光の検出能を向上させるための光学基板 - Google Patents

Abstract

第１の波長を有する蛍光励起光とともに用いるためのサンプル基板を提供する。レフレクタはベース上に配置される。レフレクタは、少なくとも２つの層を有する反射する多層干渉コーティングを含む。すべての層Ｌが４分の１波長の条件、すなわちｄＬ・ｎＬ＝（２Ｎ＋１）・１／４、（ここでｄＬは層Ｌの物理的な厚さ、ｎＬは第１の波長における層Ｌの屈折率、Ｎは０に等しいまたは０よりも大きい整数、１は第１の波長である）を満たすわけではない。層の厚さは、当該多層干渉コーティングの上部に配置された如何なる蛍光のサンプル材料も、当該基板上で入射する第１の波長を有する励起光によって形成された定在波の波腹の近くに配置されることを保証する。

Description

本発明は、蛍光励起光とともに用いるためのサンプル基板に関する。プレート、スライドおよびセルといった基板は、たとえば蛍光性、リン光性、または発光用のサンプル材料、たとえばタグを付けられた分子生物学的試料を検査、表示、分析、または識別する際に用いられる。

蛍光顕微鏡検査法は、分子生物学、生化学、および蛍光プローブでタグを付けられるかまたは標識を付けられた、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）およびタンパク質（酵素、抗原等）を含む生体分子を分析するための他の生命科学の分野で用いられることが多い。このような１つの用途は、遺伝子検出等のＤＮＡの診断法であり、ＤＮＡのサンプルがガラス基板上に堆積されてそこに結合される。基板上の結合されたＤＮＡは次に蛍光によって映すことができる。サンプルの蛍光は、本来、従来の顕微鏡を通した目視検査によって判定されていたが、この手動の方法は時間がかかり、費用がかかることがわかっている。多くの異なる高速の自動化された蛍光画像処理システムが現在利用可能である。

蛍光の検出および測定機器の長所の重要な形態は感度であり、この感度は主に機器の光学画像処理システムの信号対ノイズの比率（ＳＮＲ）によって決定される。適切に設計された画像処理システムは、内部の騒音源ではなく光収集能力によって制限される信号対ノイズの比率を有する。このようなシステムの理論上のＳＮＲは、光電子倍増管（ＰＭＴ）を用いるときに陰極における光電子の数によって示され、これはさらに、サンプルの基板の関心のある領域から検出器に到達する光粒子の数、検出器の量子効率、および検出器によって生成された暗電子の数に本質的に依存する。

ＳＮＲを増加させることによって、感度を向上させるための１つの明白なアプローチは、暗騒音を減じることである。暗騒音の原因は、サンプルからの蛍光刺激レーザ光の正反射または拡散反射、サンプルを保持する基板の自己蛍光、光学画像処理システムの光路における光学からの自己蛍光、迷光、および検出器の暗電流を含む。検出器に到達する迷光は、画像処理システムにおける凹部の適切なサイズおよび配置によって大幅に減じることができる。システム内のダイクロイックフィルタおよび他のスペクトルフィルタならびにビームスプリッタを用いて、蛍光を通過しながら迷光および反射されたレーザ光線の多くの双方を拒絶することができる。光学要素の自己蛍光は、重合体レンズの代わりにガラスを用いることにより、または可能な限りレンズの代わりにカーブミラーを用いることにより、光路におけるレンズ接着剤の使用を避けることによって減じることができる。

基板の自己蛍光は、極薄のまたは不透明のガラス基板等の低い蛍光材料を用いることによって減じることができる。たとえば、ストロンジン（Strongin)に付与された米国特許第５，０９５，２１３号は、プラスチックにおける多量の黒い炭素粉末で、不透明および実質的に非蛍光性にされるプラスチックスライドを開示している。自己蛍光を扱う別の方法は、ダンドリカー（Dandliker）等に付与された米国特許第４，８７７，９６５号およびクリージャー（Creager）等に付与された第５，０１９，６５３号に開示されるように、パルス励起または変調された励起を用いて、背景蛍光および試料の蛍光の間の放射崩壊率における差を利用することである。

米国特許第５，５５２，２７２号において、ボガートは、関心のある検体の存在または量を検出するための測定装置および測定方法を開示している。これは、光学的に活性の表面を有する試験基板を含み、この表面は、色対比、すなわち試験基板に与えられたサンプ
ルにおける検体が存在するおよび存在しない間に、表面からの光の観察された波長（または波長の組み合わせ）の差を増大する。特に、基板は、その上に光学薄膜コーティングを有する、シリコンウェハまたは金属（たとえばアルミニウム）ベース等の反射性の固体の光学ベースを含み得る。コーティングは、たとえばベースの上面の付着層を含む複数の層と、関心のある検体の特定の結合パートナーを含む付着層の上面の受容層とを含み得る。合計のコーティングの厚さは、入射光線が、反射されると薄膜干渉を受けて特定の色が生成されるように選択される。特に、コーティング材料は、減衰される、望まれない色の４分の１波長の全体的な厚さを有するべきであり、その色の弱め合い干渉が起こるようにする。したがって、基板は特定の背景色を有し、この背景色はさらに、関心のある検体が存在するときに、異なる観察された色に対する比較参照として用いることができる。質的な目視検査および量的な機器を備えた測定の双方が提案される。エリプソメータによる偏光コントラストも提案される。

先述した特許の譲受人である、コロラド州、ボルダーのバイオスター・インコーポレイティド（Biostar, Inc.）が採ったボガートアプローチの一例は、患者から採られたサンプルに感染症の病原体の特定の抗原が存在するかどうかを（３０分未満で）迅速に検出するための光学免疫測定（ＯＩＡ）診断スクリーニング検査である。商品は、Ａ群およびＢ群の連鎖球菌用およびクラミジアトラコーマ用の検査キットを含む。これらの特定の検定は、ボガート特許において例として示され、対応するバイオスター製品の添付文書に記載され、さらに医学雑誌における複数の発表された論文に記載されている。簡単にいうと、これらはすべて試験基板からの光反射の色における変化の直接的な目視検出に依存し、これは、検査表面の固定された抗体と、検査表面に与えられる一滴のサンプル液体に存在し得る特別の抗原との間の結合反応によってもたらされる基板表面の分子の薄膜コーティングの光学的な厚さの物理的な変化によるものである。当初の露出した検査表面は薄膜の厚さであり、この厚さは白色光が表面から反射されるときに主要な視覚的背景の金色を生じる。関心のある特定の抗原が、与えられたサンプルに存在するときに生じる抗原抗体結合反応は、薄膜の厚さを増大させ、これに対応して検査表面の色が金から紫に変化する。一方で抗原がサンプルに存在しない場合には、結合は起こらず、元の薄膜の厚さは変わらないままであり、検査表面はその当初の金色を保ち、負の結果を示す。この診断用の検定道具は非常に敏感であり容易に分析することができる。

ボガートは、さらに、アプローチの別の実施例（先述の特許の図１７）において、蛍光の検出を向上させるためのこれらの基板の使用を開示している。関心のある検体は、基板コーティングの受容層における特定の結合パートナーと反応することによって表面に結合された後で、蛍光標識分子は検体に取付けられ得る。特に、蛍光分子は、二次抗体等の、如何なる好適に選択的なおよび特定の受容材料または試薬にも取付けられ、表面に与えられ得る。したがって、蛍光標識は、存在すれば表面の関心のある検体に結合され、検体ブリッジを通して表面に固定される。励起波長の光を表面へ向けることによって表面に結合された標識のいずれかの蛍光も刺激することにより、関心のある検体の存在が明らかになる。最大の蛍光波長は、区別される励起波長から十分に移動されないかもしれないため、反射基板は、厚さが励起波長の反射を抑えるように選択された反射防止層を有することにより、検出器に到達する暗騒音を減じ得る。ボガートは、蛍光信号の生成は膜の厚さに依存しないと述べている。蛍光信号Ｓはレーザの出力を増加することによって増大され得るが、反射されたレーザノイズも増大し、おそらく結果として生じるＳＮＲには殆ど改善しない。

ケイン等に付与された米国特許第６，００８，８９２号は、励起波長のために反射するサンプル基板を開示している。この基板は、その上に透明なコーティング層を有し、この層はコーティング層の上部に配置された分子サンプルが励起光のために波腹に配置されていることを保証するように選択された、制御された厚さを有する。特に、基板は、正反射
の上面を有する剛性のベースを含む。ベースの上面の透明なコーティングの厚さは、法線入射での光の特定の励起波長のために、コーティングの上部からベースの反射面への光路が、実質的に励起光の４分の１波長の奇数の倍数（１，３，５等）となるように選択される。材料の光路の長さは、光の波長、材料の屈折率、および材料を通した伝播の角度によって規定される。反射サンプル基板において、ベースの反射面は、反射面の浸透厚（または浸入深さ）とベース上の如何なる表面酸化の光学的深さとの合計に等しい量だけベースの物理的表面よりも僅かに下の十分に規定された深さである。サンプルを励起光のコーティング層にまたは励起光の波腹の近くに配置することによって、最大の蛍光励起を生じる。反射基板は、蛍光画像顕微鏡システムの蛍光の固体の集束角をほぼ２倍にすることによって蛍光の集束を増大させる。したがって、合計の蛍光信号が増加され、これは信号対騒音の比率をかなり向上させる。さらに、コーティング層は非常に薄いために、この材料からの蛍光の暗騒音が減じられる。

ケイン等が述べているように、このベースは、完全に金属から製造することができるか、または上部の金属コーティングを有する剛性の底層からなってもよい。金属は、アルミニウム、銀、金またはロジウムとすることができる。透明のコーティングは、シリカ、アルミナまたは（ＭｇＦ₂等の）フッ化物等の誘電体材料の単一の層であってもよい。代わりに、透明のコーティングは、上部層が指定された生物学的なサンプルの構成要素を結合するために化学反応性の高い、多層コーティングとすることができる。

透明の４分の１波長層を反射面に与えるというケインの考えは、剛性の表面を有するレフレクタに限定される。ここで、光はレフレクタの物理的表面よりも下に浸透せず、または浸透はせいぜい表面よりも数ナノメータ下（浸透厚）に限定される。実際に、これは金属基板または金属コーティング等の金属表面への限定を表わす。

誘電体層が反射にかなり寄与し次第、浸入深さを規定することが難しく、４分の１波長の層を追加するという考えは失敗する。たとえばアルミニウムミラーについて、いわゆる「ポンピングされた金属ミラー」をもたらす金属の反射率を高めるために追加の誘電体層を用いることが非常に多い。この場合、誘電体層はミラーの一部であり、最後の誘電体層はミラーの物理的表面を形成する。光がこのようなミラースタックに浸透し、干渉効果は金属的反射率とともに光学的特徴を構築する。追加の４分の１波長層または奇数の倍数をこのようなシステムに追加することによって、この層の上に配置するときに蛍光サンプルの位置で波腹を生じることができないことが多い。さらに、大半の場合において干渉システムは妨害され、これは反射率の大幅な減少をもたらし得る。

しかしながら、奇数の倍数の４分の１波長の条件が金属表面に対して満たされる限り、４分の１波長層の反射性の寄与を用いて蛍光を高めることさえもできる。シャトン（Chaton）等は、ＷＯ０２／４８６９１号で一例を挙げており、この効果を見ることができる。シャトン等は、蛍光を高めるために、シリコン基板上でミラーファンクションを有する誘電体の４分の１波長のスタックを用いることを記載している。５５０ｎｍにおけるシリコンの反射率は約４２％である。これは、自由な伝搬波のフィールド振幅の二乗Ｅ²（ＰＷ）の約１０％の金属表面上で電磁界の二乗振幅（Ｅ²）をもたらす。（ケイン等のアプローチの一実施例に従い）この剛性の金属表面上に単一の４分の１波長層を与えることによって、Ｅ²（ＰＷ）よりも２５％高いフィールド振幅がもたらされ、したがって１．２５の増大因子を生じる。シャトン等は、反射率を強化するために５５０ｎｍの設計波長を有する４分の１波長のスタックを用いる。これは、反射率を増加させるために、高指数のおよび低指数の交互の誘電体層のシステムが用いられることを意味しており、各々の個々の層は、設計波長の４分の１の光学的厚さを有する。一例として、シャトン等は、コーティング材料としてＳｉＯ₂（９４ｎｍの層の厚さ、３層）およびＳｉ₃Ｎ₄（６９ｎｍの層の厚さ、２層）有するシリコン上で５つの層のシステムを用いる。これは、６０％よりも僅
かに低い反射率をもたらす。４分の１波長のスタックに基づくミラーは、ブラッグミラーとして知られている。典型的に、このようなブラックミラーは４分の１波長スタックに基づき、最外層は高指数の層である。しかしながら、シャトン等は、４分の１波長の最外層として、低い指標の材料であるＳｉＯ₂層を用いる。低い指標の層である最外層は低い反射値をもたらすことが周知である。最外層（低指数の層）を除去することによって高い反射率がもたらされる。シャトン等が説明するように、彼らはリンカケミストリと適合する物理的表面を生成するためにＳｉＯ₂を最外層として用いる。

本発明の目的は、増大されたサンプルの励起および蛍光放射を提供する、改善されたサンプル基板を提供することである。

これは、第１の波長を有する蛍光励起光とともに用いるためのサンプル基板によって本発明に従って実現され、これはベースとレフレクタとを含み、レフレクタは少なくとも２つの層を有する反射多層干渉コーティングを含み、すべての層Ｌが４分の１波長の条件ｄ_L・ｎ_L＝（２Ｎ＋１）・λ／４を満たす訳ではなく、ｄ_Lは層Ｌの物質であり、ｎ_Lは第１の波長における層Ｌの屈折率であり、Ｎは０に等しいかまたは０よりも大きい整数であり、λは第１の波長であり、層の厚さは、多層干渉コーティングの上部に配置された如何なる蛍光サンプル材料も定在波の波腹の近くに置かれ、この定在波は当該基板に入射する第１の波長を有する励起光によって形成される。

本発明に従った基板の一実施例において、これは少なくとも第１の波長とは異なる第２の波長を有する蛍光の励起光とともに用いられるようにさらに適合され、層の厚さは、当該多層干渉コーティングの上部に配置された蛍光サンプル材料が、当該基板に入射する第２の波長を有する励起光によって形成された定在波の波腹の近くに配置されることを保証する。

さらなる実施例において、当該サンプル基板は、第１の波長が５３２ｎｍから５４８ｎｍの波長範囲内であり、第２の波長が約６３３ｎｍとなるように調整される。

さらなる実施例において、本発明に従ったサンプル基板は、金属を有さないレフレクタを有する。

さらなる実施例において、サンプル基板は、金属反射面を与えるベースを有する。

本発明に従ったサンプル基板のさらなる実施例において、反射する多層干渉コーティングの最外層はＳｉＯ₂層である。

本発明に従った基板のさらに他の実施例において、多層干渉コーティングは、多数の層を含む第１の層システムと、多数の層を含む中間層システムとを含み、中間層システムは、ベースと第１の層システムとの間に配置される。

これにより、およびさらなる実施例に従って、第１の層システムは波長のうちの１つに光を伝える。

これにより、さらに他の実施例において、中間層システムは、ベースに配置された金属層と、金属層上に配置された誘電体層とを含む。

これにより、さらに他の実施例において、述べられた金属層は、銀、金、アルミニウム
、クロム、プラチナおよびこれらの金属の如何なる合金を含む金属のグループからの少なくとも１つの金属からなる。

本発明に従った基板のさらに他の実施例において、多層干渉コーティングは、比較的高い屈折率および低い屈折率を交互に有する誘電体層を含み、最外層は比較的低い屈折率を有する層のうちの１つである。

これにより、およびさらに他の実施例において、層は、Ｎｂ₂Ｏ₅、ＳｉＯ₂、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、ＩＶｂ、Ｖｂ、ＶＩｂ族、スカンジウム、イットリウム、カルシウム、ストロンチウム、亜鉛、鉄、インジウム、スズ、セリウム、またはホルミニウムの酸化物、スカンジウム、イットリウム、カルシウム、ストロンチウム、亜鉛、鉄、インジウム、スズ、セリウムまたはホルミウムの混合物または合金の酸化物、ならびにマグネシウム、バリウム、ストロンチウム、カルシウム、レアアースおよび鉛のフッ化物のうちの少なくとも１つを含む。

これにより、および本発明に従った基板のさらに他の実施例において、多層干渉コーティングは、比較的高い屈折率および低い屈折率を交互に有する誘電体層を含み、最外層が、比較的低い屈折率を有する層のうちの１つであり、層はＮｂ₂Ｏ₅およびＳｉＯ₂を含む。

本発明に従った基板のさらに他の実施例において、これは連結コーティングを含み、これはレフレクタの最外層に配置される。

これにより、およびさらに他の実施例において、連結コーティング層は生物学的に活性である。

本発明に従った基板のさらに他の実施例においてベースは剛性である。

本発明に従った基板のさらに他の実施例において、ベースはガラス、プラスチック、金属または半導体の材料のうちの１つを含む。

本発明は、サンプルが光によって励起されるときに、基板上で配置されるサンプルからの蛍光放射を最大にするようにされたサンプル基板を製造する方法についてさらに記載し、これは、
光の第１の波長を反射するために多層コーティングの第１の層システムの層を選択するステップと、
サンプルが第１の波長における光の波腹の面に配置されることを保証するために、第１の層システムの層の厚さを決定するステップと、
光の第２の波長を反射するために多層コーティングの中間層システムの層を選択するステップと、
サンプルが第２の波長における光の波腹の面に配置されることを保証するために、中間層システムの層の厚さを決定するステップと、
ベース上に中間層システムを堆積するステップと、
中間層システム上に第１の層システムを堆積するステップとを含む。

これにより、本発明に従った方法の一実施例において、このような方法は、基板の物理的表面のおよそ４分の１波長下に配置された電磁界分布における最小値を与えるために、層の厚さおよび層の屈折率を決定するステップをさらに含む。

本発明に従った方法のさらなる実施例において、第１の層システムの層は、第２の波長
における光を伝えるように選択される。

本発明に従った方法のさらに他の実施例において、第１の層システムの層の厚さを決定するステップは、第１の波長における所望の増大因子を与えるために最外層の厚さを選択するステップを含む。

本発明に従った方法の一実施例に従うと、第１の層システムの層は、第２の波長で光を伝えるように選択され、中間層システムの層の厚さを決定するステップは、第２の波長における所望の増大因子を与えるために最外層の厚さを選択するステップを含む。

本発明に従った方法のさらに他の実施例において、中間層システムを堆積するステップは、ベース上に金属層を堆積するステップと、金属層上に誘電体層を堆積するステップとを含む。

本発明に従った方法のさらに他の実施例において、これは第１の層システムに連結コーティングを堆積するステップを含む。

これにより、上述したサンプル基板は、好ましくは生物分析システムで用いられる。

本発明は、上述のようなサンプル基板と、サンプル基板上のサンプル材料に向けられた光源とを含む蛍光画像処理システムにさらに向けられ、光は、蛍光励起波長を含み、サンプル材料の特定の蛍光構成要素に特定的なものである。

本発明は、レーザスキャナにさらに向けられ、このレーザスキャナは上述したような蛍光画像処理システムを含む。

シャトンアプローチを振り返ると、その著者が述べなかった１つの正の効果がある。すなわち、我々の調査では、低指数層を最外層として用いることによって、２．２の増大因子をもたらすＥ²（ＰＷ）よりも２２０％多い、幸いにも最大である、表面上で５５０ｎｍのフィールド振幅をもたらすということがわかった。著者が最外層として高指数層を用いた場合、電磁界振幅は最小になる。

さらに、シャトン等によって用いられたコーティングの設計を用いると、反射バンドは５５０ｎｍの設計波長の中心に置かれ、２００ｎｍの広さになる。反射バンド内で、反射率は６０％よりも僅かに低いところまで増大される。シャトン等は、波腹条件を考慮に入れなかったために、４分の１波長のスタックが、４５０ｎｍから６５０ｎｍの間の波長のための蛍光信号を効果的に増大させると結論付けた。この波長範囲は、ＣＹ３およびＣＹ５等の蛍光標識のために典型的に用いられる蛍光材料の波長を含む。残念ながら設計波長のみのために、波腹条件は十分に満たされる。５５０ｎｍとは大きく異なる励起波長について、この条件は満たされない。４５０ｎｍについて増大因子は０．２ほど低く、６５０ｎｍにつき増大因子は１．２まで低下する。

したがって、シャトンによって問題は未解決のままにされているため、互いから分離された１つよりも多い励起波長のための最適の増大を与えるサンプルを生成することが望ましい。特に約５３２ｎｍから５４８ｎｍ（Ｃｙ３）および約６３３ｎｍ（Ｃｙ５）の励起波長について、このようなサンプル基板を実現する方法についての問題が未解決のままである。

典型的に、たとえばリンカケミストリの親和力の差に関連したＣｙ３およびＣｙ５の信号強度の内在的な差があり、これは信号強度の差をもたらす。２つ以上の励起波長のため
におよそ同じ程度の信号強度を実現する方法の問題は解決されていなかった。２つ以上の励起波長の増大因子を独立して調整する可能性を考慮したときに同じことが言えた。

さらに、上述したように、先行技術の解決法は、金属層または基板への一般的なインターフェイスに関わるものであった。シャトンは、たとえば説明をシリコン基板に限定している。ケインの開示における剛性の反射面の例は、常に金属表面を含む。したがって、ケイン等およびシャトン等が行なったように金属インターフェイスを用いることなく、増大された蛍光信号を与える基板サンプルを生成することが課題であり、そうすることが望ましかった。

したがって、本発明に従ったサンプル基板は、蛍光の検出および画像化を向上するようにされた光学構造を有する。本発明に従ったサンプル基板のフォーマットは、たとえばマイクロタイタープレートの標準フォーマット等の上述の分野で典型的に用いられるフォーマットに適合させることができる。

本発明に従うと、少なくともいくつかの実施例において、励起波長の反射のベースを金属表面の反射率に完全に形成するという不利な点を有さないサンプル基板が提供される。

これにより、２つ以上の異なる励起波長の蛍光信号の最大の増大をもたらすサンプル基板を実現し得る。これによりおよび本発明に従ったサンプル基板において、２以上の励起波長のための適用例に合わせて調整された増大因子が提供されることにより、本発明におけるこのようなサンプル基板は、好ましくはその異なる実施例とともに上述したような方法によって製造される。

本発明に従った反射性のサンプル基板の一実施例は、誘電体多層コーティングに基づく干渉レフレクタを有する。励起光は、１００％または１００％に近い状態で反射される。したがって、カバー領域におけるサンプル基板外部の励起波長に接続された結果としてもたらされる電磁界の分布は、定在波であるか、またはノードの面および波腹の面を有する定在波に近い。本発明に従うと、干渉レフレクタの層は、最適化された厚さ分布を有し、この厚さ分布は、上部のコーティング層の上部に配置された領域蛍光サンプルが励起光の波腹の面に配置されることを保証するように選択される。

この場合に、誘電体層のための４分の１波長の厚さの要件が満たされなければならない。これは、設計および最大値のためのさらなる自由度を与えるか、または所望の電磁界が２つまたは多数の励起波長の物理的表面で実現することができる。より具体的には、４分の１波長の層または４分の１波長の誘電体層の奇数の倍数を用いるという条件を省くと、設計におけるさらなる自由度がもたらされ、この自由度を用いて、先行技術の解決法の場合のような妥協をする必要なく、２つ以上の励起波長の波腹条件を満たすことができる。この自由度は、金属反射インターフェイスが純粋な誘電体レフレクタのためにも含まれるサンプルのために使用することができる。

このような干渉レフレクタ内の電磁界の分布は、金属表面の正反射から周知のフィールド分布とは非常に異なる。干渉レフレクタの上部に追加された追加層は、反射率における減少を引起すことができる。さらに、このような干渉レフレクタのために、反射面の位置を規定することはできない。なぜならコーティング層の大半が反射に寄与するからである。

しかしながら、発明者は、調査および実験の間に、反射面を規定することは難しいにも拘らず、領域蛍光サンプルが配置される反射サンプル基板の物理的表面に最大のフィールドがあるように干渉レフレクタを設計することができることを発見した。この設計は、標
準の薄膜最適化道具を用いて見出すことができ、反射サンプル基板の表面における最大のフィールド振幅とともに最大の反射率のために最適化するように僅かに修正される。

この場合、追加の透明の層は必要とされず、誘電体層のための４分の１波長の厚さの要件を満たす必要がないため、最大のフィールドを２つまたは多数の励起波長のために実現することができる。さらに、このようなシステムは、金属層または金属基板を全く用いることなく実現することができる。

既に述べたように、このようなシステムは、典型的に光学薄膜設計のために用いられるような統計的方法を用いて見出され、最適化目標の一部として物理的表面の波腹の条件を考慮に入れるように修正することができる。しかしながら、発明者は、このような最適化の手順を用いて最適化された基板サンプル内の電磁界の分布について検査した。発明者は、ケイン等およびシャトン等によって開示された先行技術の解決法を含むさまざまな設計のための、サンプルの物理的表面において、増大された最大電磁界強度を与えるサンプル基板を検査した。発明者は、電磁界の分布が、物理的表面よりも１つの４分の１波長下に配置された最小値を提供することを発見した。これは、実際に電磁界がサンプルに伝播する深さには依存しなかった。結論として、発明者は、電磁界が物理的表面よりも約１つの４分の１波長下に配置される最小値を与える必要があるという規則を考えた。これは本発明の１つの局面、すなわちサンプル基板が物理的表面よりも約１つの４分の１波長下に配置された電磁界の分布の最小値を提供する限り、物理的表面上の電磁界が向上されるということを反映している。

ここで本発明が例および図面に基づいてさらに説明される。

本発明のサンプル基板は、多数の可能な蛍光顕微鏡システムのいずれかにおいて使用することができ、これらの蛍光顕微鏡は、たとえば、サワムラ等に付与された米国特許第４，２８４，８９７号、マティス（Mathies）等に付与された第５，０９１，６５２号、クマガイに付与された第５，２９６，７００号、ディクソン（Dixon）等に付与された第５，３８１，２２４号、およびノグチに付与された第５，５０４，３３６号、ならびに米国特許出願連続番号第０８／５９５，３５５号、第０８／６１６，１７４号および第０８／７９１，６８４号に記載されたものを含む。

本発明とともに用いるための好ましい蛍光画像処理システム１が図１に示されている。光源１０、たとえばレーザは刺激ビーム１１を生じる。刺激ビーム１１は、好ましくは単色コヒーレント光の平行ビームである。しかしながら、発光ダイオード（ＬＥＤ）等のノンコヒーレントソースを用いることができ、視準化されていないソースは平行光学系に結合されて平行ビームを生成する。刺激ビーム１１が単色でない場合に、これはフィルタを通して導かれて如何なる望まれない波長も減じ得る。

刺激ビーム１１は、レンズ系１２，１２′およびビームスプリッタ１５を通してサンプル基板２０の表面に導かれる。二次元スキャンを生成する如何なるスキャン機構を用いて、サンプル基板の表面を有する平面の直交軸に沿って基板を動し得る。

レンズ系１２は、刺激ビーム１１を用いてサンプル基板の同軸照明を提供する。刺激ビーム１１は、照明されたスポットにおけるサンプル基板２０からの蛍光放出を刺激する励起ビームである。サンプル基板の照明された表面上で領域蛍光サンプル２３，２３′が存在する場合に、検出可能な蛍光の刺激がもたらされる。レンズ系１２は、結果として生じる蛍光の同軸集束を与え、蛍光ビーム２９が形成される。収集の効率を最大にするために、レンズ系１２は大きな複数の孔を有することが好ましい。蛍光は次にレンズ系１２によ
って収集され、コンデンサとして作用し、入射する光路に沿った（しかしながら反対方向の）レトロビームとして導かれる。蛍光は一般的に入射する刺激ビームの波長とは異なる広い帯域の波長からなり、システムはさまざまな蛍光色素とともに作動するように設計されなければならないために、システムは好ましくは主として無色であり、波長の範囲に亘る色収差の修正を与える。レンズ系１２を通過する光は、光電子倍増管（ＰＭＴ）等の光検出器３１に影響を与える。

どんな画像処理システムが用いられたとしても、それは好ましくは、高い解像度の画像および最小の光学収差で広い走査範囲に亘って高速でスキャンすることができるべきである。これは同軸の照明および集束を、高い集束効率に与えるべきである。優れた光修正を有する色収差システムおよび（自己蛍光を含む）暗騒音を最小にするように設計されたシステムが好まれる。

図２を参照すると、本発明のサンプル基板４１は、ベース４３と当該ベース４３の上部の干渉レフレクタ４５とを含む。領域蛍光サンプル２３，２３′は、当該干渉レフレクタ４５の上部に与えられる。

ベース４３は、コーティングすることができる如何なる材料からも製造することができる。たとえば、ガラスまたはプラスチック等のベース材料は透明とすることができ、またはアルミニウム等の金属製とすることができる。如何なる他の剛性の底層の使用も可能である。

干渉レフレクタ４５は、少なくとも１つの高指数コーティング層４７と、少なくとも１つの低指数コーティング層４９とを有する誘電体多層コーティングを含む。

コーティング材料としては、たとえばＮｂ₂Ｏ₅、ＳｉＯ₂、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、ＶＩｂ、Ｖｂ、ＩＶｂ族の酸化物、ならびにスカンジウム、イットリウム、カルシウム、ストロンチウム、亜鉛、鉄、インジウム、スズ、セリウム、ホルミニウム、ならびにこれらの要素の混合物または合金の酸化物、要素Ｔｉ、Ｔａ、Ｚｒ、Ｓｉ、Ｈｆ、Ａｌのさらなる酸窒化物、ならびにマグネシウム、バリウム、ストロンチウム、カルシウム、レアアースおよび鉛の要素のフッ化物を用いることができる。

層は、以下の方法、すなわち熱ビームおよび／または電子ビーム、蒸着、複製、移送、膜蒸着のうちの１によって、ＣＶＤタイプ（ＬＰＣＶＤ、ＰＥＣＶＤ等）のプロセスまたはスパッタリングすなわちマグネトロンスパッタリング等のＰＶＤタイプのプロセスによってコーティングされ得る。イオン補助蒸着プロセスをソルゲルプロセスと同様に用いることができる。層は以下の方法、すなわち結合および分子付着のうちの１つによってベースに移送され得る。

干渉レフレクタ４５の上部層は、必ずしも不活性物質ではなく、サンプル材料またはサンプルの特定の構成要素と結合するために生物学的に活性とすることができる。

領域蛍光サンプルの場所における電界を最大にすることによって蛍光放射を最大にするために、干渉レフレクタ４５に含まれる多層コーティングの層の厚さ分布を最適にすべきである。

多層コーティングの設計の最適化は、公知の光学薄膜計算および最適化技術のうちの１つを与えることによって行なうことができる。大半の場合に、これらの技術は、メリット関数を最小にすることに基づき、このメリット関数は目標の特徴に対する実際の薄膜設計の空間的特徴の距離を測定する。標準プロセスの僅かな修正内で、メリット関数は、それ
が先述の例において定在波の最大値に等しい所望の値に対する電界の二乗の距離について述べる条件を含むように修正することができる。

適切なコーティングの厚さ分布および／または指数分布を適切に決定するために、励起光の入射角、カバー媒体の、コーティング材料の、および基板の偏光および屈折率を考慮に入れなければならない。

このような最適化の方法を用いて、同じ多層コーティングを有する２つ以上の励起波長での励起のために領域蛍光サンプル２３，２３′の位置における最大フィールドの要件を満たす薄膜スタックを設計することもできる。したがって、所望の波長に適合させるために厚さを妥協する必要はない。

サンプル基板４１は、たとえば図１に示されたような如何なる蛍光画像処理システムと作動するように設計される。本発明に従ったサンプル基板４１は、レーザ光の電力を増加させることなく、および基板４１自体以外のシステムにおける目的のまたは他の光学を変更することなく、蛍光の放射および集束を最大にするように構成される。

一例として、２２の層を含む多層コーティングが提供される。コーティング層の材料、層の厚さ分布および屈折率は表１に示されている。この例について、個々の層の厚さは、Ｎｂ₂Ｏ₅（ｎ＝２、３）を高い光学屈折率を有する材料として、およびＳｉＯ₂（ｎ＝１．４８）を低い光学屈折率を有する材料として用いて設計される。他のコーティング材料を用いることができる。２つよりも多い材料を含む多層コーティングを用いることもできる。この例において、設計は５３２ｎｍの励起波長のために最適化される。

図３は、ベース４３からの距離の関数として電界振幅の結果として生じる正規化された二乗を概略的に示している。同様に示されているのは、ベース４３からの距離の関数としての屈折率の分布である。図３で見ることができるように、干渉レフレクタ４５内の電界の二乗は、０から極大値へと振動して０に戻る。干渉レフレクタ内の極大値のエンベロープは、ベースへの距離とともに増大する。したがって、反射面を識別することができない。励起光は干渉反射に複数の波長を浸透させるために、浸透の深さの規定は反射面を規定するのに有益ではない。

図３に見られるように、適切なコーティングの厚さが与えられる場合に、領域蛍光サンプル２３，２３′は、刺激ビームが反射されるときに干渉レフレクタ４３よりも上に確立される定在波の波腹でまたはその近くに配置される。領域蛍光サンプルの場所は、特に矢印および破線で示されている。最大の励起を用いると最大の蛍光が生じる。コーティングの厚さが励起波長のために厳密に修正されなくても、強度がピーク強度の９０％または９５％のみである場合、蛍光信号は先行技術よりも大幅に向上される。理想的な厚さからの変動が、サンプル毎の変動およびコーティングの変動によって生じるおそれがある。

さらに、２つ以上の異なる励起波長が同じ基板サンプルとともに用いられる場合に、多層コーティングの最適化の戦略を、必要とされるすべての励起波長の領域蛍光サンプルの場所で最大フィールドに到達するように選択することができる。したがって、如何なる必要とされる励起波長のための低い電界の望まれない場所の使用も回避される。

図１の蛍光画像処理システムは、異なる蛍光サンプルの構成要素のための多数の蛍光励起波長を与える１つ以上の光源を同時にまたは選択可能に有する可能性がある。多層コーティングの公称の光学的な厚さ分布が必要とされ、さらに同じ多層コーティングにつき平行な異なる励起波長の各々についても最適化することができる。

これは以下の例においてより詳細に示される。

ここで６３３ｎｍのＣｙ５および５３２ｎｍのＣｙ３の２つの励起波長につき、サンプル基板が物理的表面上で向上された電磁界を与えるべきである。これを達成するためには、発明者は以下のステップに従って進まなければならない。以下のステップは、
第１の層システムを設計して、第１の波長範囲（６２０ｎｍ−６５０ｎｍ）を反射し、第２の波長範囲（５２０ｎｍ−５５０ｎｍ）を伝送することにより、最外層がＳｉＯ₂層であるように注意するステップと、
層システムの物理的表面の第１の励起波長（６３３ｎｍ）の二乗の振幅電磁界が、入射し伝播する平面波の振幅電磁界の二乗のほぼ４倍の大きさとなるように最外層を調整するステップとを含む。

これによって第１の励起波長のための電磁界の条件は表面上の最適値である。この第１の層システムのための層の厚さがここで固定される。以下のステップはさらに、
第２の波長範囲を反射するために、基板の間の中間層システムを配置して層の厚さを調整するステップと、
層システムの物理的表面の第２の励起波長（５３２ｎｍ）の二乗の振幅電磁界が、入射する伝播平面波の振幅電磁界の二乗のほぼ４倍の大きさとなるように、第１の層に隣接する中間層システムの層の厚さを調整するステップとを含む。

これによって、第１の励起波長と同様に第２の励起波長のための電磁界の条件は表面上で最適となる。

表２は、２つの励起波長、５３２ｎｍおよび６３３ｎｍの増大のために最適化されたこのようなサンプル基板の一例を示している。

この可能性のために、十分に規定された反射面（たとえば金属表面）が存在する場合でも、４分の１波長の条件を省いて誘電体多層コーティングスタックおよび上述の最適化プロセスを用いて、１つよりも多い励起波長のための領域蛍光サンプルの場所で最大のフィールドを実現することが有利であるかもしれない。

これは、以下の例においてより詳細に示される。

第１の励起波長（６３３ｎｍ）が、誘電体干渉層によって反射されるのに対して、第２の励起波長は、銀の層によって反射される。このコーティング層システムの最外層を用いて層の厚さを調整することによって、物理的表面上の第１の励起波長の電磁界を調整することができる。銀のコーティング上の第１の層を用いて層の厚さを調整することによって、第２の励起波長の電磁界を調整することができる。表３は、このような層システムの厚さ分布の例を示している。

この例では、常にＳｉＯ₂が最外層として用いられた。これは、リンカケミストリを与えるための標準の材料である。リンカケミストリは、基板サンプルの物理的表面上で用いられる材料に非常に敏感である。したがって、異なるリンカケミストリは、ＳｉＯ₂とは異なる最外層を必要とし得る。本発明の概念は、最外層としてＳｉＯ₂を用いることに制限されるべきではないことが明らかである。実際的な例において、既にＴｉＯ₂および／またはＮｂ₂Ｏ₅が用いられた。如何なる他の実際的な光学コーティング材料も用いることができる。

さらに、蛍光放射が基板の後部から検出される場合に、組み込まれた如何なる金属層も存在しないため、本発明のアプローチを用いることができる。この場合、蛍光等を効果的
に伝送するために多層コーティングをさらに最適化することができる。

典型的に用いられる蛍光画像処理システムの概略図である。 本発明のサンプル基板の側方拡大断面図である。 電磁界分布（Ｅ²）／Ｉ₀ ²の正規化された二乗対図２に示されたサンプル基板のベースからの距離対を示すグラフであり、さらに示されているのは多層コーティングの屈折率の分布である。

Claims (27)

1. 第１の波長を有する蛍光励起光とともに用いるように適合されたサンプル基板であって、ベースとレフレクタとを含み、レフレクタは少なくとも２つの層を有する、反射する多層干渉コーティングを含み、層Ｌのうちのすべてが４分の１波長の条件、すなわちｄ_L・ｎ_L＝（２Ｎ＋１）・λ／４、（ここでｄ_Lは層Ｌの物理的な厚さ、ｎ_Lは第１の波長における層Ｌの屈折率、Ｎは０に等しいまたは０よりも大きい整数、λは第１の波長である）を満たすわけではなく、層の厚さは、前記多層干渉コーティングの上部に配置された如何なる蛍光のサンプル材料も、前記基板に入射する第１の波長を有する励起光によって形成された定在波の波腹の近くに配置されることを保証する、サンプル基板。
2. 第１の波長とは異なる少なくとも１つの第２の波長を有する蛍光励起光とともに用いるためにさらに適合され、層の厚さは、前記多層干渉コーティングの上部に配置された蛍光サンプル材料が、前記基板に入射する第２の波長を有する励起光によって形成される定在波の波腹の近くに配置されることを保証する、請求項１に記載のサンプル基板。
3. 前記第１の波長は５３２ｎｍから５４８ｎｍの波長範囲内にあり、前記第２の波長は約６３３ｎｍである、請求項２に記載のサンプル基板。
4. レフレクタは無金属である、請求項１から３の１つに記載のサンプル基板。
5. ベースは金属反射面を与える、請求項１から４の１つに記載のサンプル基板。
6. 反射する多層干渉コーティングの最外層はＳｉＯ₂層である、請求項１から５の１つに記載のサンプル基板。
7. 多層干渉コーティングは、多数の層を含む第１の層システムと、多数の層を含む中間層システムとを含み、中間層システムは、ベースと第１の層システムとの間に配置される、請求項１から６の１つに記載の基板。
8. 第１の層システムは波長のうちの１つで光を伝送する、請求項７に記載の基板。
9. 中間層システムは、ベース上に配置された金属層と、金属層上に配置された誘電体層とを含む、請求項７に記載の基板。
10. 金属層は、銀、金、アルミニウム、クロム、プラチナおよびこれらの金属のうちの如何なる合金を含むグループの１つの金属である、請求項９に記載の基板。
11. 多層干渉コーティングは、比較的に高い屈折率および比較的低い屈折率を交互に有する誘電体層を含み、最外層が比較的低い屈折率を有する層のうちの１つである、請求項１から１０の１つに記載の基板。
12. 層は、Ｎｂ２Ｏ５、ＳｉＯ２、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、ＶＩｂ、Ｖｂ、ＩＶｂ族、スカンジウム、イットリウム、カルシウム、ストロンチウム、亜鉛、鉄、インジウム、スズ、セリウム、またはホルミニウムの酸化物、スカンジウム、イットリウム、カルシウム、ストロンチウム、亜鉛、鉄、インジウム、スズ、セリウムまたはホルミウムの混合物または合金の酸化物、Ｔｉ、Ｔａ、Ｚｒ、Ｓｉ、ＨｆまたはＡｌの酸窒化物、ならびにマグネシウム、バリウム、ストロンチウム、カルシウム、レアアースおよび鉛のフッ化物のうちの少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の基板。
13. 層はＮｂ２Ｏ５およびＳｉＯ２を含む、請求項１１に記載の基板。
14. レフレクタの最外層上に配置された連結コーティングをさらに含む、請求項１から１３の１つに記載の基板。
15. 連結コーティング層は生物学的に活性である、請求項１４に記載の基板。
16. ベースは剛性である、請求項１から１５の１つに記載の基板。
17. ベースは、ガラス、プラスチック、金属または半導体材料のうちの１つを含む、請求項１から１６の１つに記載の基板。
18. サンプルが光によって励起されるときに、基板上に配置されたサンプルからの蛍光放射を最大にするようにされたサンプル基板を製造する方法であって、
    光の第１の波長を反射するために多層コーティングの第１の層システムの層を選択するステップと、
    サンプルが第１の波長における光の波腹の面に配置されるのを保証するために第１の層システムの層の厚さを決定するステップと、
    光の第２の波長を反射するために多層コーティングの中間層システムの層を選択するステップと、
    サンプルが第２の波長における光の波腹の面に配置されるのを保証するために中間層システムの層の厚さを決定するステップと、
    ベース上に中間層システムを堆積するステップと、
    中間層システム上に第１の層システムを堆積するステップとを含む、方法。
19. 層の厚さおよび層の屈折率が、基板の物理的表面の下のおよそ１つの４分の１波長に配置された電磁界分布において最小値を与えることを決定するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
20. 第１の層システムの層は、第２の波長において光を伝送するように選択される、請求項１８または１９の１つに記載の方法。
21. 第１の層システムの層の厚さを決定するステップは、第１の波長で所望の増大因子を与えるために最外層の厚さを選択するステップを含む、請求項１８から２０の１つに記載の方法。
22. 中間層システムの層の厚さを決定するステップは、第２の波長における所望の増大因子を与えるために最外層の厚さを選択するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
23. 中間層システムを堆積するステップは、ベース上に金属層を堆積し、金属層上に誘電体層を堆積するステップを含む、請求項１８から２２の１つに記載の方法。
24. 第１の層システム上に連結コーティングを堆積するステップをさらに含む、請求項１８から２３の１つに記載の方法。
25. 生物分析システムにおける請求項１から１７の１つに記載のサンプル基板の使用。
26. 請求項１から１７の１つに記載のサンプル基板と、前記サンプル基板上のサンプル材料に向けられた光源とを含む蛍光画像処理システムであって、前記光は蛍光励起波長を含み、前記サンプル材料の構成要素の指定された蛍光に特定的である、蛍光画像処理システム
    。
27. 請求項２６に記載の蛍光画像処理システムを含む、レーザスキャナ。

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