1323744 玖、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種鑑定比對植物藥材基因之方 法’尤指一種適用於以葉綠體DNA序列鑑定比對特定 品種植物藥材之方法。 【先前技術】 中藥材的基源鑑定一直以來源、性狀、顯微鏡檢及 理化方法來檢測’此.在礦物藥或動物入藥有相當的可信 度,但對於一些特殊部位如組織或器官、或經過加工已 失去原本性狀的藥材則無從判別。台灣市售中藥材多由 大陸進口’正品不易取得’很多中藥材外觀相近、同名 異物或同物異名,造成誤用、混用的情形报常見,加上 某些高貴藥材被冒用的現象嚴重,造成藥效低下無法掌 控的問題’因此急需開發更有效的鑑定技術來鑑定基源 以保證中藥材的品質。 隨著分子生物技術的進展,利用植物染色體DNA多 型性(polymorphism)的特性,以PCR技術放大生物遺傳 物質及自動序列分析的技術,可快速且準確地在DNA層 次找出特異的序列供作種源鑑定用。因此,應用pCR及 自動序列分析的技術,將可作為種源鑑定的DNA序列建 構成資料庫’可供業界掌控藥材品質的依據。未來隨著 植物物種專利(Plant Breeding Right,PBR )的推行,以 分子鑑定來保護種源專利權將更形重要。 目前台灣中藥材的市場經學者專家實地調查結 果’發現多種藥材有誤用、混用及冒用的情形。以黃耆 為例,40件黃耆商品中紅耆占37件,而白皮耆僅有3件, 1323744 育耆、紅耆為同科不同屬之兩種藥材,不論在外觀、成 分、=理活性、臨床療效等方面有很大的差距。因此, 開發常見易混用中藥材分子鑑定技術以掌控中藥材的 基源實刻不容緩! 市面上黃芩除了一般黃芩外,尚有滇黃芩、粘毛黃 芩及連翹葉黃芩等易混用的藥材。利用分子鑑定技術, 選取葉綠體上的DNA片段進行序列分析比對,可將市售 的黃芩歸類為五種型式的序列資料庫。未來藉由序列資 料庫的比對,可快速精準地區分出各種黃芩,提供中藥 界判斷正品的依據,確實掌握產品品質。 【發明内容】 本發明之主要目的係在提供一種植物藥材之鑑定 比對方法,俾能以萃取並比對葉綠體DNA序列之方式鑑 定待測樣本之品種。 本發明之另一目的係在於提供一種植物藥材之鑑 定比對方法,俾能提高鑑定準確度,降低背景干擾。 本發明之又一目的係在於提供一種植物藥材之鑑 定比對方法,俾能節省鑑定比對時間,並簡化鑑定步驟。 為達成上述之目的,本發明提供一種鑑定黃芩混用 品的方法,包括以下步驟:先提供一第一樣本植物藥材 之第一葉綠體片段DNA序列;再提供一第二樣本植物藥 材丨接著抽取該第二樣本植物藥材之葉綠體Dn A片段; 然後以心合§§連鎖反應(p〇lymerase chain reaction)倍 增該所抽取之第二樣本葉綠體DNA片段,其中該第二樣 本葉綠體DNA片段内含至少一無義介子(n〇n_c〇ding spacer);接著針對該第二樣本葉綠體片段dnA進行定序 1323744 (sequencing ),獲得一第二樣本葉綠體片段DNa序列; 以及比對該第一樣本葉綠體片段DN A與第二樣本葉綠 體片段DNA之序列,以確認該二者之無義介子序列是否 一致。 本發明之詳細說明 葉綠體普遍存在於植物的各器官組織中,包括根、 莖、葉' tb、種子,並且每一個植物細胞中會有百個以 上的葉綠體’因此葉綠體DNA之複本(copy)數量相較於 體染色DNA(genome DNA)多出許多,因此對於乾燥後的 植物性藥材植株而言是相當良好的DNA取樣來源。 本發明所比對之D N A序列係針對於各品種之葉綠 體DNA序列中之無義介子(non_c〇ding spacer)之差異, 例如一段DNA序列的刪除(deletion)或核甘酸的不同。選 擇無義介子作為差異比對的原因在於,有義的基因片段 經過轉錄 '轉譯之後的產物(例如RN A或蛋白質)在生 物功能上具有重要意義’在遺傳複製時若出現大幅差異 則該物種存活的機率會降低,因此有義基因片段之物種 邊異性並不會太高;反之,無義介子其生物功能並不顯 著即使在遺傳複製時出現大幅變異,該物種仍可繼續 活存,因此在不同物種之間的變異性較之基因序列的變 異性來得大。本發明即著眼於此,藉由比對無義介子而 能清楚地分辨出植物藥材品種間的差異。 本發明之方法除了取植株之葉綠體DNA以增加實 驗之準確性之外,所使用之萃取條件亦能夠大幅減低背 景訊號,得到較純之DN A萃取物。 1323744 請先參見圖1,此係一般植物葉綠體中之DNA結構 圖。在本發明之倍增葉綠體DNA之步驟中,經過多組引 子篩選後,證明psbA基因至trnH基因之間的無義介子倍 增對黃芩最具鑑定上的意義。 接著請參見圖2,此係本發明之鑑定方法與習知之 鑑定方法之比較。如圖中所示,習知之鑑定方法包括軟 化、固定、脫水、染劑、滲臘、包埋、切片、以及顯微 鏡檢查等步驟,一般而言將會進行約十個工作天;而以 本發明之方法進行物種鑑定,可將鑑定程序縮短至六個 工作天以内,在時間就是金錢的時代,本發明之重要性 不言而喻。 接著請參見表1,此係本發明之鑑定方法之鑑定結 果與習知鑑定方法之鑑定結果之比較。習知的鑑定方法 係以外觀形態分類或以顯微鏡鑑定細胞内含物的特徵 判定品系,然而細胞或是植株的外表有可能非常類似, 唯有DNA序列才是一個物種獨一無二的身分證明。因此 從圖中可見,鏡檢之鑑定結果與本發明以DNA鑑定結果 有所出入,證明本發明之方法更為準確。 表1 黃芩藥材鑑定結果 黃芩種類與待測樣本編號 一般型態與 鏡檢結果 一般黃芩 ST15 ST16 STR 滇黃芩 ST14 粘毛黃芩 ST11 ST12 ST13 連翹葉黃芩 ST17 ST18 ST19 分子鑑定結 果 一般黃芩 ST2 ST16 STR 滇黃芩 ST14 ST13 ST15 粘毛黃芩 ST11 連翹葉黃芩 ST12 ST13 ST19 1323744 另外,本發明亦提供一種建立一植物性藥材品種之 葉綠體DNA資料庫之方法,包括:先提供數個植物藥材 之樣本;再針對每一植物藥材之樣本抽取其總DNA ;接 著針對所抽取得之每一植物藥材之葉綠體DNA,以聚合 酶連鎖反應倍增所獲得之葉綠體DNA特定的無義介子 之片段,然後針對倍增後所獲得之每一植物藥材之葉綠 體DNA之片段進行定序,獲得每一植物藥材之葉綠體 DNA片段之序列;以及比對所獲得之每一植物藥材之葉 綠體DNA片段之序列,並將其差異序列建構成一比對資 料庫。 建立比對資料庫之用意在於,同一品系植物性藥材 可能為同科不同屬、或同屬不同種,造成其雖然外觀近 似然而藥效有所差距,而一旦建立藥材之DNA資料庫之 後,當取得一待鑑定藥材之後,即可以此待鑑定藥材之 DNA序列與資料庫中之序列比對,若已有其資料,則可 快速得知其確切基源。 【實施方式】 本發明之方法中所使用之無義介子可為葉綠體DNA 圖譜中任意之無義介子,應用於黃芩屬植物較佳為位於 psb A基因與trnH基因之間之無義介子;本發明之方法所 適用之植物藥材並無限制;本發明之方法中較佳係以如 下之引子對: 5’-TGATCCACTTGGCTACATCCGCC-3’ 5,-GCTAACCTTGGTATGGAAGT-3’ 1323744 而針對黃芩所抽取到之葉綠體DNA片段中介於 psbA基因與trnH基因之間之無義介子進行聚合酶連鎖 反應。 為能讓貴審查委員能更瞭解本發明之技術内容,特 舉一較佳具體實施例說明如下》 本實施例中所使用的黃芩藥材由各處收集而來。 (1) 藥材經過清洗,刮去外皮以減少微生物污染, 而後切細片,以液態氮凍脆後研磨成粉; (2) DNA抽取方法主要採用CTAB、PVPP及不同鹽濃 度處理,經過沉澱、離心、Chloroform萃取及酒精沉殿 而得; (3) 設計複製葉綠體的psbA及trnH 間 non-coding spacer的引子對如下: 5'-TGATCCACTTGGCTACATCCGCC-3· 5'-GCTAACCTTGGTATGGAAGT-3' 以Tm = 60°C進行聚合酶鏈反應; (4) 複製出的DNA片段經自動序列分析儀(ABI 3 1 00 )分析出序列後以DNAMAN®軟體進行序列相似度 比對: (5) 將黃答樣本依序列間差異的規律性予區分為5 組’如表二所示,並將其差異序列建構成比對資料庫。 其中該步驟(2)之萃取步驟如下: (2-1)萃取緩衝液: 100mM Tris. HC1 20mM EDTA 1 M NaCl 1323744 1% CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) 1% PVPP (polyvinyl po 1 ypyrro 1 idοne ,在使用前 加入) (2-2)3-100mg樣本 +0.5ml萃取緩衝液; (2-3)在70°C反應30分鐘; (2-4)以 chloroform:IAA = 24:l萃取,以 l〇〇〇〇g離心 5分 鐘, (2-5)取上清液,加入二倍體積之沈澱緩衝液: 50mM Tris. HC1 10mM EDTA 40mM NaCl 1% CTAB 倒轉2分鐘; (2-6) 以13000g離心15分鐘; (2-7)以350//1的1.21^仏(:1將步驟(2-6)之沈澱物溶解; (2-8)以RNase A在37°C反應30分鐘; (2-9)以 chloroform:IAA = 24:l萃取,以 l〇〇〇〇g 離〜亏分 hiL · ^s., (2-10)加入0.6倍體積之isopropan〇l,在-20°C靜置15分
AjL · , (2-11)在4°C下以1 3000g離心20分鐘; (2-12)以lml 70%之EtOH清洗沈澱物;以及 (2-13)將沈澱物溶解在TE缓衝液中(海20mg的起始物 使用10-25 y 1的緩衝液); 12 1323744
表2 黃答trnH-psbA序列比對結果 黃等trnH-P region比對結果(共407bp) 47 Del A(128) DelB(lO) DelC(24) 282 332 ST2 A Y c G STR A Y c G ST16 A Y c G ST3 T Y c G ST14 T Y c G ST15 Τ Y c G ST12 A Y Y A G ST13 A Y Y A G ST19 A Y Y A G ST11 A C G ST17 A Y Y Y A A 比較一般形態及鏡檢與分子鑑定的差異結果如下: 一般形態及鏡檢結果:一般黃芩 (ST15,ST16,STR );滇黃芩(ST14 );粘毛黃芩 (ST11,ST12,ST13);連翹葉黃芩(ST17,ST18,ST19)。 分子鑑定結果:一般黃芩(ST2,ST16,STR);滇黃 答(ST14,ST13,ST15);枯毛黃答(ST11);連翹葉黃 答(ST12,ST1:3,ST19),也由此可推論藥材混用之嚴重。 上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已’本發明 所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準,而非 僅限於上述實施例。 【圖式簡單說明】 圖1係植物葉綠體DNA結構圖。 圖2係本發明與習用鑑定方法之流程圖比較。 13