TWI316959B - - Google Patents

Description

A7 B7 1316959 五、發明説明（1 ) 技術領域 本發明係關於一種對於癌分類有用之記號基因的篩選方 法、利用該基因癌之分類方法、癌之檢測方法，以及用於 該分類方法或檢測方法之套组。 技術背景 近年來，已經明確證實正常細胞轉變成癌細胞的過程， 係存在多個階段發癌機構[Fearon，E. R_等，Cell，第61 卷，第 759-767 頁（1990)、Sugimura，T.，Science，第 258 卷，第603-607頁（1992)]。具體言之，含有DNA修復基 因、抑癌基因及癌基因之複數基因之異常累積，係造成正 常細胞癌化之必要機制。通常癌的發生係由於基因之不安 定性及抑癌基因之未活化。此外，癌基因之活化，以及/ 或增殖因子之過度表現，亦被認爲與癌之進展及惡性化有 關。再者，编碼細胞外基質分子分解酵素之基因，及編碼 可調節細胞運動能或接著性之蛋白質之基因，係與轉移、 浸潤有關。 如此一來，癌之發生、增殖、轉移與數量爲多的基因表 現之促進或抑制有關。 目前，在各基因層次上，與癌的發生、進展有關之基因 以及與該基因異常有關之情報日益增加，然而，發癌機構 係屬多個階段，累積複數個異變爲必要過程，對於根據單 一基因判斷，或根據由少數基因之隨意組合判斷，目前尚 未發展出實用性高且具癌之確定診斷或癒後判定之方法。 事實上，現階段癌之診斷及進行度、分化度之判定幾乎 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A7 B7 1316959 五、發明説明（2 ) 皆根據病理診斷進行，然而，在病理學大體上，即使存在 所顯示出相同之癌進行度、分化度，其癒後情況良好者， 另一方面，也存在早期階段再發、轉移惡化程度高之病 例。再者，目前多數存在之現象，係一部份的病例中，雖 然對於抗癌劑及放射線照射顯示具有感受度者，對於其他 的病患卻顯示具有抵抗性的案例，因此，現階段對於無法 在治療前或手術後預測這些現象。 在癌之化學療法中，已經了解到對於各個癌之種類，其 化學療法繼之有效性各不相同，以5FU (5-氟尿嘧啶）或 CDDP (cisplatin)爲例，雖然對於類似胃癌、大腸癌、肝癌 之癌症，幾乎沒有效果，另一方面，對於早期子宫頸癌病 例則大多有效；50%食道癌之病例，對於5FU、CDDP顯示 具有感受性。因此，若能了解各個病例之藥劑感受性，則 可能再提高化學療法之效果，爲此，在基因層次思考有效 的進行癌之診斷、類型分類。 爲了進行如上述在基因層次上類型分類，在特定類型之 癌組織中，有探索、定量表現之變動具特異性基因之必 要。然而，通常在癌组織中，爲了可觀察到與細胞增殖有 關之多數基因之表現變動，找出適當之記號基因爲困難所 在。 若可做到迅速、簡便的根據癌之進行度、分化度、類型 進行分類，使得可避免不必要之治療，並選擇適當之治療 法，讓病患之負擔減至最小，且針對各個病患訂定合適之 治療方針，實屬莫大之貢獻，尚可降低醫療費用。 -5- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1316959

發明之揭示 本' '明裳 —目的，係根據所取得之正確結果，提佴一 種找出輿某^ ^ 、&因層次之癌分類有關之可能基因的 外，本發明夕@ 为 、 昂—目的，係提供利用由上述方法所找出之 因進行癌分類之方法。本發明之第三目ό 〈檢測方法爲目的。 杈供癌 本發明者爲達成上述之㈣，找出在細胞增殖時不受具 特異表現之變動基因影響，對於癌之分類、惡性程度的評 估有用〈基因的篩選方法。此外，使用藉由該手法所找到 之基因建構癌之分類方法、檢測方法，以完成本發明。 亦即，本發明之要旨爲： [1] 一種癌分類指標基因之篩選方法，根據下列步驟， 其步驟包含： (1)又檢測之癌樣品中，測定至少一種在細胞增殖時具 特異表現之變動基因表現量、該表現量與對照組間相同基 因表現量之比較、及根據該比較結果評估該基因表現量變 動之步驟’其中對照组爲正常組織或惡性程度低之癌樣 (2) 根據利用前述步驟（1)所評估出來基因表現量之變 動，及受檢測癌樣品於目前病理學所見之特性，將受檢測 癌樣品分類成複數個類型之步驟，及 (3) 關於利用前述步驟（2)所分類出來之各受檢測癌樣 品’檢查該受檢測樣品中複數基因之表現變動、獨立細胞 增殖時具特異表現之變動基因後，再於每個癌樣品類型中 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1316959 A7 -------- 五、發明説明（4 ) 表現量具特異變動基因之篩選步驟； [2] —種癌之分類方法，其特徵爲根據受檢測癌樣品 中’藉由前述[1]所選出之癌分類指標基因之表現量進行 癌分類，其步骤包含： (a) 於受檢測癌樣品中，至少一種由前述⑴中記载之 篩選方法所選出來之癌分類指標基因表現量之測定步驟，及 (b) 將藉由步驟（a)所測定出之基因表現量，與對照组中 該基因表現量作比較後’於該受檢測樣品中進行癌分類； [3] —種癌之檢測方法，將癌分類指標基因中至少—種 基因之對應核酸’或該基因所編碼之多肽的表現，與對照 组比較其變動，係前述受檢測樣品中癌細胞存在之指標， 其步驟包含： (1) 於受檢樣品中，根據前述[1]所記載之篩選方法所 篩選出來之癌分類之指標基因中，至少一種基因表現量的 測定步驟，及 (2) 將藉由步驟（1)所測定出來受檢測樣品中基因之表 現量’與對照组中該基因之表現量作比較； [4] 針對癌之分類及/或檢測所使用之套组，其係含有 後述I基因群中所篩選出至少5種基因之111^^八量，及/或針 對後述之I基因群中所篩選出至少5種基因之mRNA量之測 定所使用之引子，及/或探針之套組； [5] 針對癌之分類及/或檢測所使用之套組，係含有可 與後述基因群I中所選出至少5種基因所编碼之多肽作特異 性結合之柷體，及/或可與後述基因群n中所選出至少5種

1316959

本說明書中’所謂「成爲本發明中癌分類指標之基因」 乂下亦以標記-基因表不）’係指對於癌類型分類有用之基 因中，具有任意特徵、可作爲癌標記基因使用可能之基 =二更具體言之，「成爲本發明中癌分類指標之基因」係 指-種基因，其可與細胞增殖時具有特異表現變動之基因 獨立’依照癌之進行度、分化度、類型等，表現量有特異 變動者。前述「作爲癌分類指標之基因」係指成爲癌之診 斷（癌與正常組織之辨別）、癌類型之分類、癌之惡性程度 評估指標之基因，根據癌之類型、惡性程度其表現量有變 化之者，換言之，即該基因表現係可被有意義謗導或被抑 制基因β 1.本發明中成爲癌分類指標基因之筛選方法 本發明中成爲癌分類指標基因之筛選方法，其特徵之一 爲包含下述之篩選步驟： (1)受檢測癌樣品中之細胞增殖時，具特異性表現變動 之基因中，至少一種基因表現量，與對照組樣品中該基因 表現量做比較，據此評估該基因表現量之變動的步驟，在 此’該對照組樣品係如正常組織或惡性程度低之癌樣品； -8 - 本紙强：尺度適用中菌S家揉準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1316959 1316959 A7

(2)根據⑴中所評估出來之基因表現量之變動，與受 檢測癌樣品之病理學之所見，將受檢測癌樣品分類成複數 個類型之步驟；及 (3)根據（2)中所分類出來之各個受檢測癌樣品，觀察 琢受檢測癌樣品中複數之基因表現變動，獨立細胞增殖時 具：特異性表現變動之基因，且在各受檢測癌樣品之類型 中師選其表現量具特異性變動之基因的步骤。 本發明之㈣方法中，發揮了以下卓越的效果：根據樣 品中癌之類型，提供作爲適當之分類指標之基因，與習知 之基因之癌檢測、診斷方法比較，可得到具更高可信度之 資訊。另夕卜’根據纟發明之篩選方法’可冑立細胞增殖時 具特異性表現變動之基因，且提供受檢測癌樣品各類型中 表現量具特異性之變動基因。 本發明之筛選方法中，首先，來自病患所採取之癌病變 组織（癌组織）中，測定細胞增殖時具特異性表現變動之基 因之表現狀態’並根據該表現量分類癌組織。 具體而Τ，於受檢測癌樣品中，細胞增殖時具特異性表 現變動之基因中至少一種之表現量，與對照組樣品中該基 因之表現量做比較，據此評估該基因表現量之變動[即步 驟⑴]。 本説明書内提及之受檢測癌樣品中，不只癌病變組織， 尚包含疑似有癌細胞存在來自病患之樣品。 前述作爲受檢測癌樣品者，係血液、尿液、糞便或經由 外科手法取得之組織等來自生物體樣品者，形成本發明癌 -9- 本紙張尺度適用中固國家標準(CNS) Α4規格(210Χ 297公釐) A7 B7 1316959 五、發明説明（7 ) 指標基因之篩選方法中，根據手術前診斷的觀點，以生物 檢測用鉗子採取之病變組織爲佳。 前述步驟（1)中之對照组樣品，例如經由外科手法取出組 織中之正常部位或惡性程度低之癌组織。 前述「細胞增殖時具特異性表現變動之基因」，例如細 胞週其中相關之基因，如可使用DNA合成期（S期）之細胞 内已知具特異性表現之基因。本發明之篩選方法中，可使 用如CDC6基因或屬於E2F家族者，以E2F-1基因特別適合 使用。 細胞增殖時具特異性表現變動之基因，其表現量之測定 方法中並無特別之限定，例如以前述基因之轉錄產物 (mRNA等），或翻譯之產物（多肽等）作爲指標之測定方法。 前述步驟（1)中，隨著基因操作技術的進步，發展出各式 各樣以mRNA爲指標之分析手法，以有效率的測定基因之 表現量。 轉錄產物，特別是以mRNA作爲指標之基因表現量的測 定方法中，有點墨雜交法、北方雜交法、RT-PCR法、削 減法、差異顯示法等。 另外，亦可根據使用DNA陣列（DNA晶片）進行之雜交分 析法測定基因之表現量。 以翻譯產物爲指標測定基因表現量之方法，例如使用該 翻譯產物之相對抗體之慣用免疫測定法等。 本發明之筛選方法中，其次爲根據在前述步驟（1)中所評 估出來之基因表現量之變動，與受檢測癌樣品之病理學所 -10- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1316959 五、發明説明（8 ) 見，將受檢測癌樣品分類爲複數個類型[即步驟（2)]。 具體而言，前述步驟（1)知受檢測癌樣品中，例如根據癌 組織中之「細胞增殖時具特異性表現變動之基因」之表現 量，與對照組樣品中該基因之表現量作比較，以所評估出 來之該基因表現量之變動爲指標，進行癌組織之分類。前 述步驟（1)中，與正常組織比較後，「細胞增殖時具特異 性表現變動之基因」之表現量（絕對値），至少2倍，較佳 者爲3倍以上，特別佳者爲5倍以上，則癌组織中該基因之 表現量係視爲有意義之變動。 具體言之，例如根據E2F-1基因之表現量與對照組樣品 中該基因之表現量作比較，以所評估出來之該基因表現量 之變動爲指標，進行癌組織之分類，與正常細胞作比較 後，E2F-1基因之表現量增加至少2倍，較佳者爲3倍以 上，特別佳者爲5倍以上之组織，即爲E2F-1陽性组織。 其次，受檢測癌樣品，例如根據上述癌组織之病理學所 見，如細胞型態、對周邊組織之浸潤狀態、對藥劑之感受 性、對淋巴結之轉移狀態等分類。此類病理學知所見在如 治療法之篩選之際極爲重要，因此，若根據本發明之癌分 類指標基因之篩選方法，對於如治療開始前患者之癌相關 之外科處理而言，提供了使如上述之病理學分類可能之手 段。 其次，關於以前述步驟（2)分類之各受檢測癌樣品，觀察 該受檢測癌樣品中之複數基因表現之變動，獨立細胞增殖 時具特異性表現變動之基因，並篩選受檢測癌樣品之各類 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1316959 五、發明説明（9 ) 型中表現量具特異性變動之基因[即步驟（3)]。 前述「作爲癌分類之指標基因」，係對照組樣品與受檢 測癌樣品間，特別指定表現量具有差異之基因，例如，對 照组細胞中基因產物之表現量與來自癌細胞組織中基因產 物之表現量作比較，可根據特別指定兩細胞間具差異者篩 選之。 此外，步驟（3)之對照组樣品，例如，正常组織或惡性程 度低之癌组織。 惡性程度低之癌組織，例如，無淋巴結轉移之類之惡性 程度低之樣品，無前述「細胞增殖時具特異性表現變動之 基因」之表現量變動之樣品等者。 前述之基因產物，例如，由基因轉錄之mRNA或其翻譯 產物蛋白質。 本發明所使用之基因篩選中，係伴随基因操作技術之進 步，發展出各式各樣以mRNA爲指標之有效率的分析手 法。 以mRNA爲指標確認基因表現之變化之手法，有點墨雜 交法、北方雜交法、RT-PCR法、削減法、差異顯示法 等，選擇其中適合使用者，可找出本發明中所使用之基 因。再者，同時檢測數百、數千中之多數基因表現變化之 方法，使用DNA陣列（DNA晶片）進行雜交分析法係爲已知 且適合本發明使用之技術。 本説明書中，前述所謂「DNA陣列」，係指固定基因或 來自基因之DNA片段於支撑物上既定區域之陣列（晶片）， -12- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A7 B7 1316959 五、發明説明（1〇 ) 如包含被稱之爲DNA晶片者。此外，基因或來自基因之 DNA片段高密度於支撑物上，如以密度1 cm2内固定100基 因以上者亦稱之爲DNA微陣列。 DNA陣列之支撑物，係以在雜交反應中可能使用者即 可，通常使用載玻片、矽晶片、硝酸纖維膜、耐龍膜等。 此外，固定於支撑物上之基因或其片段者並無特別之限 定，例如，基因組DNA庫或cDNA庫，或以之爲模板進行 PCR等增幅之DNA者。 根據使用此類DNA陣列，可同時測定核酸樣品中所含多 種類之核酸分子之量。再者，其優點爲即使是少量核酸樣 品亦可測定。例如標識樣品中之mRNA，或配製以mRNA 爲模板之具標識cDNA，根據其與DNA陣列間實施之雜交 反應，可同時檢測樣品中表現之mRNA，並進一步測定該 表現量。 本發明中，「作爲癌分類之指標基因」係指如可篩選使 用將來自人類基因所對應之核酸或其片段固定化之DNA陣 列，目前市面上已經販售將癌或與其他生理現象有關，可 暗示某些關聯性或有疑似之基因片段固定化之DNA陣列 (如 IntelliGene Human Cancer CHIP 或 IntelliGene Apoptosis CHIP皆由寶酒造公司製造），使用這些陣列可進行前述之 步驟（1)〜（3)。 如此一來分類成數種類型之癌組織，根據測定各種基因 表現與對照組中之表現量作比較，可找出各類型中表現狀 態具特異性變化之基因。 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐）

裝 訂

k- A7 B7 1316959 五、發明説明（11 ) 基因表現量之測定法中並無特別之限制，上述之基因表 現變化之確認手法中皆可適用，其中，由於可能同時測定 多數基因之表現，DNA陣列爲特別適合使用之方法。 舉例來説，配製來自各類型之癌組織之mRNA，以該 mRNA爲模版進行反轉錄反應，此時，根據使用如具有適 當標識之引子或標識之核甞酸，即可得到具標識之 cDNA 〇 用作標識之標識物質，可使用放射線同位素、螢光物 質、化學發光物質、具有發光團之物質等物質，以螢光物 質爲例，Cy2、FluorX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、 異硫氰酸螢光素（FITC)、堪色斯紅、若丹明等。另外，從 可同時檢測點觀之，使用2種以上的螢光物質，分別以不 同之螢光物質標識進行受檢測樣品（本篩選方法中之受檢 測樣品）及對照組樣品之標識爲理想狀態。此處樣品之標 識，係根據標識樣品中之mRNA、來自該mRNA之cDNA或 由該cDNA轉錄或增幅之核酸實施之。 其次，上述之標識cDNA陣列與適當之基因所相對應之 核酸或其片段固定化之DNA陣列間進行雜交反應，雜交反 應以眾所皆知的方法進行者即可，爲使用該條件之DNA陣 列或標識cDNA選擇適用者即可，例如可以分子選殖，實 驗室手册（Molecular cloning, A laboratory manual)，第 2 版，第9.52-9.55頁（1989)中所記載之條件進行之。 前述之雜交反應條件下，進行來自樣品之核酸與DNA陣 列進行之雜交反應，從採取該樣品到基因表現量之測定所 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1316959 五、發明説明（12 ) 耗費之時間，根據RNA分解酵素之作用之mRNA有受到分 解之可能，爲了測定受檢測樣品（本篩選方法中之受檢測 樣品）與對照組樣品之基因表現差異，最好使用比較上表 現變動較少之標準基因，並修正兩者間mRNA之量。再 者，使用以下所述之2種螢光在一片DNA陣列上進行競爭 雜交反應的情況下，基於修正2種螢光物質間之強度差， 可得到更正確之數據。以如此修正之目的所使用之核酸， 係來自非病變部位樣品之核酸；家務基因（housekeeping gene)如[3-磷酸甘油脱氫酶（GAPD)基因、環非林 (cyclophilin)基因、/?-肌動蛋白（/?-actin)基因、α-微管蛋 白（a-tubulin)基因、續:脂酶 A2 (phospholipase Α2)基因等]所 相對應之核酸等，另外，爲確認不是非特異性之雜交反應 之陰性對照，係與樣品完全無關之核酸，如質體pUC18 等。 其次，基於受檢測樣品（本篩選方法中之受檢測樣品）之 雜交反應結果，及對照組樣品之雜交反應結果之比較，可 檢測兩者間表現量相異之基因。具體而言，關於以上述方 法標識之核酸樣品與進行雜交反應之陣列，根據所使用之 標識方法進行適當之訊號檢測，對於陣列上之各基因，可 比較受檢測樣品（本篩選方法中之受檢測樣品）中表現量與 對照組樣品中表現量，最好以複數標識，以可檢測出2種 以上螢光之多波長檢測分析儀爲例，在相同之DNA陣列 上，可利用競爭雜交反應比較受檢測樣品（本篩選方法中 之受檢測樣品）中基因表現量與對照組樣品中之基因表現 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1316959 五、發明説明（13 ) 量之差異。例如來自癌病變部份樣品中，以Cy5-dUTP進 行螢光標識，對照组樣品中則以Cy3-dUTP螢光標識，兩 者以等量混合後，與DNA陣列進行雜交反應，兩者基因表 現料之差異，可依據訊號之顏色及螢光強度不同檢測之。 標識核酸之檢測法，係根據所使用之標識物質之種類， 適當篩選之即可。以前述Cy3及Cy5爲標識物質爲例，可 以Cy3爲波長532 nm，Cy5爲波長635 nm掃描檢測之。此 外，標識之強度亦可爲基因表現量之指標。 上述之基因表現量變化之測定中，對照組樣品雖無特別 之限定，仍須以來自正常组織之樣品、上述癌樣品中惡性 程度低者爲考慮，例如使用E2F-1基因之表現低且未見轉 移至淋巴結或程度輕者等。 如此所得之訊號強度具有意義差異之基因，係爲各類型 之癌組織中表現量具特異性變動之基因。其中部分係與上 述細胞增殖時具特異性表現變動之基因同時進行，或具負 相關變動者，係反應單獨於樣品中細胞增殖狀態下之表現 量具變動之可能性高，不一定適用作爲癌樣品分類之記號 基因。本發明之特徵爲，此類基因以外，根據找出各類型 癌樣品中表現變動具特異性之基因，找出對於更正確之癌 類型分類、惡性程度之評估有用之記號基因。 再者，如此找出之記號基因雖無特別之限定，與其他類 型之癌樣品比較，仍以其表現量之差異性大者作爲分類之 指標爲理想。 利用本發明癌分類指標基因之篩選方法，可得到對於癌 -16- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1316959 A7 B7 五、發明説明（14 ) 類型分類有用之基因，例如與食道癌之淋巴結轉移有關， 以下列表1中所列舉之基因作爲記號基因， 可評估受檢測 樣品是否爲淋巴結轉移風險高之癌。 表1 Genes GenBank Accession # 類胰島素生長因子結合蛋白質2 (IGFBP2) X16302 BIGH3 M77349 類胰島素生長因子結合蛋白質6 (IGFBP6) M62402 明膠酶A (MMP-2) M55593 II型細胞骨架角蛋白 7 (cytokeratin 7 (K7;CK 7)) M13955 結缔組織生成素I M77830 穀胱甘肽S-轉移酶A1 M16594 穀胱甘肽S-轉移酶Pi (GSTP1) U12472 膠原酶-3 (MMP-13) X75308 II型細胞骨架角蛋白 5 (cytokeratin 5 (K5;CK5)) M21389 P-黏連素 X63629 I型細胞骨架角蛋白 14 (cytokeratin 14 (K14;CK14)) J〇〇124 Π型細胞骨架角蛋白6 (cytokeratin 6B (CK6B)) L42610 母系離氨酸(MMP-7) X07819 類叉狀頭7 AF048693 結缔组織生長因子（CTGF) M92934 成長赫爾蒙依穀性類胰島素成長因子結合蛋白質 M35878 Rho8蛋白質 X95282 -17- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1316959 A7 B7 五、發明説明（15 ) 另外’以下列表2所列舉之基因爲記號基因，可評估受 檢測癌樣品是否爲淋巴結轉移風險高之癌中，風險特別高 者之癌β 表2

Genes GenBank Accession # RBA/p48 X74262 細胞分裂把制蛋白質之同系物(EC 2 7Λ _)(cdc2) X05360 複製因子C 38-kDa次單元(RFC38) L07541 apopain前驅物 U13737 色素乾皮症c群修復互補蛋白質p58/HHR23B 環狀素G2 D21090 U47414 環狀素A X51688 凋零相關蛋白質TFAR15 AF022385 TRKB絡胺酸激酶接受器 U12140 訊號傳達轉錄活化因子^^/卢（STAT1) M97935 K-ras致癌基因 M54968 視網膜瘤感受性蛋白質 BCL2/腺病毒ElB 19kD-交互作用蛋白質1 (BNIP1) L41870 o^RNA, complete cds AF083957 凋零蛋白質1抑制因子(hiap-i) U45878 -18- A7 B7 1316959 五、發明説明（16 ) 2.本發明癌之分類方法 本發明癌之分類方法其特徵之一爲包含下述之步驟： (a) 於受檢測樣品中，根據本發明之篩選方法，測定所 選出之癌分類之指標基因中至少一種表現量之步驟； (b) 步驟（a)所測定出來之表現量與對照組樣品中之該基 因表現量作比較，於該受檢測癌樣品進行癌之分類之步 驟。 本發明之分類方法中，獨立細胞增殖時具有特異表現變 動之基因，且依照癌之進行度、分化度、類型等，表現量 有特異變動者，以用作癌分類指標爲目的，如關於治療前 病患之癌，可發揮依據其細胞之型態、對於周邊组織之浸 潤狀態、對於藥劑之感受性、對淋巴結轉移之狀態等分類 之優良效果。另外，若根據相關之癌分類方法，如治療法 之篩選等之際，可快速且簡便的提供信賴性高、有用之情 報。 若根據本發明癌之分類方法，可分類來自疑似含有癌特 別是食道癌個體之樣品。 本發明癌之分類中，首先，關於受檢測樣品中，測定經 由本發明之篩選方法所篩選出作爲癌之分類指標基因中最 少一種表現量[即步驟（a)]。 前述受檢測樣品，係如血液；尿液；糞便；經由外科手 法索取出來自生物體組織之樣品，疑似含有癌特別是食道 癌個體之樣品。 前述步驟（a)中，從精確度高之癌分類的觀點觀之，可測 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1316959 五、發明説明（17 ) 定複數基因之表現量者爲佳，雖無特別之限定，仍以測定 至少5種記號基因之表現量爲佳。 本發明之分類方法中所用之「作爲癌分類之指標基 因」，若經由本發明之篩選方法所得到者爲佳，例如可根 據上述表1及/或表2中所記載之基因，選擇適用者使用 之。 前述之「作爲癌分類之指標基因」之表現量，係根據經 由該基因轉錄之mRNA量或經由該基因翻譯之多肽量所測 定者。 mRNA量之測定方法可使用雜交反應法、核酸增幅法 等，具體言之，點墨雜交法、北方雜交法、RT-PCR法等 眾所皆知之方法。從可使用少量之樣品同時測定、比較多 數基因之表現的觀點觀之，雖無特別之限定，仍以DNA陣 列，尤其是使用DNA微陣列之雜交法對於本發明特別適 用。使用DNA陣列之雜交法，可經由上述之操作實施之。 前述基因所編碼之多肽量，係利用該多肽或其片段所對 應之抗體，可經由酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、發 光免疫測定法等測定之。具體言之，例如可利用標識抗 體，經由慣用之ELISA法等進行之。 前述之抗體，係針對前述之多肽具有特異性結合之能力 者，並無特別之限定，多株抗體、單株抗體皆可適用。再 者，前述抗體，係將前述抗體片段化所得之抗體片段、經 由眾所皆知之技術修飾之抗體或抗體之衍生物，例如人類 化抗體、Fab片段、單鏈抗體等皆包含在内。前述抗體係 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1316959 五、發明説明（18 ) 經由如 John Wiely & Sons, Inc所發行，John E. Coligan所編 輯之Current Protocols in Immunology中記載之方法，經由 利用前述多肽之全部或一部份於免子、鼠類、小白鼠產生 免疫之方法容易得之。如此所得到之抗體經純化後，經由 生肽酶處理可得抗體之片段。此外，亦可以基因工程的方 式製作抗體。再者，前述之抗體，爲了可經由酵素免疫測 定法、螢光免疫測定法、發光免疫測定法等容易測定，具 有各種修飾者亦佳。 其次，前述之步驟（a)中所測定之基因表現量與對照組樣 品中該基因表現量作比較，基於前述受檢測樣品進行癌之 分類[即步驟（b)]。 前述步驟（b)中，步驟（a)所測定出之受檢測樣品中記號 基因之表現量與對照组樣品中之記號基因之表現量作比 較，經由分析該表現量之變動型態，可分類受檢測樣品中 所存在之癌。上述1.中所述之記號基因篩選之際，癌各類 型之各基因表現量變動之型態顯然爲之，根據參照該型態 可分類受檢測樣品。即於本發明之分類方法中，經由本發 明之篩選方法所得之依賴癌之進行度、分化度、類型等其 表現量具特異性變動之基因，以用作癌之分類指標爲目 的，與各基因、癌之類型等有明顯關聯性者，可經由參照 該基因表現量之變動分類受檢測樣品。 前述對照组樣品，係如來自正常組織之樣品。 另外，雖然進行步驟（b)中不使用對照组樣品，受檢測樣 品中表現量變動少之基因，根據與如上述之家務基因之表 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1316959

五、發明説明（19 =作比較’亦可得知作爲癌之分類指襟基因之表現量變 利’使用DNA微陣列知本發明之癌分類方法，其有 變動。使用Γ對於從極少量之樣品中觀察多數基因之表現 他：法ΪΓΝΑ微陣列之癌分類方法，係如以内視鏡或其 變部患者病變邵位之"'部份’以分類存在該病 …《癌組織爲目的，對於 之指標極爲有用I 4 m療法㈣ 所n 2 w來自食道癌組織之樣品爲例，前述表1中 基因表現量與來自正常食道組織之樣品作比較， n動型！I ’可評估該食相之淋⑽轉移風險。 :者’表2中所記載之基因表現量與來自正常食道組織 〈裘品作比較’從該變動型態’可評估受檢測樣品係具淋 巴W#轉移風險中風險特別高者。 本發明之分類方法中，受檢測樣品於表i中所列舉之基 因若干之表現減少，卻於表2所列舉之基因關表現増加的 情況下’則該受檢測樣品可以淋巴結轉移風險高爲預測之 樣品作爲分類。 如上述之分析所得之結果，可以如印表機、顯示器或如 顯示器專狀軟體之其&套裝軟體績圖軟體可獲得相對應 輸出者得之Μ目關之輸出，係經由本發明之檢測方法所得 之結果，對於進行診斷、治療法之筛選有用者特別有利。 3.本發明癌之檢測方法 經由本發明之筛選方法所得《「作爲癌分類之指標基 22 1316959 A7 B7 五、發明説明（2〇 ) 因」，係作爲癌，特別是食道癌之檢測指標亦有用。因 此，根據本發明可提供癌，特別是食道癌之檢測方法，相 關癌之檢測方法亦包含在本發明之範園内。 本發明癌之檢測方法中，獨立細胞增殖時具特異性表現 變動之基因，且因以針對各癌類型之表現量具特異性變動 之「癌分類指標基因」作爲癌指標，可使得癌與正常細胞 間之區別化容易，且可信度高，發揮了可檢測癌之優良效 果°另外，前述「癌分類指標基因」之表現量變動，係因 可反映出癌，特別是食道癌之進行度、惡性程度、類型， 因此在檢測該基因的同時，亦有可判斷癌，特別是食道癌 之進行度、惡性程度、類型之優良效果。 本發明癌之檢測方法，具體言之’對於受檢測樣品與對 照组樣品而言’觀察經由前述篩選方法所得之「癌分類指 標基因」中，至少1種所相對應之核酸或該基因所编碼之 多肽表現’該受檢測樣品與對照组樣品間該基因或多肽有 表現差異時，該受檢測樣品作爲含有癌細胞之指標檢測 癌，特別是食道癌，乃爲一大特徵。 本發明癌之檢測方法，以下述步驟具體進行之： (1) 關於受檢測樣品，經由本發明之篩選方法所筛選出 之癌分類之指標基因中，測定至少1種基因表現量之步 驟；及 (2) 在步驟（1)所測定之受檢測樣品中，基因表現量與 對照組樣品中該基因表現量作比較後，檢測癌之步驟。 本發明癌之檢測方法中，作爲受檢測之樣品，係如血 -23-

1316959

液、尿液、糞便或經由外科手法取得之組織等來自生物體 樣品者》 對照組樣品係來自健康人體之樣品、非病變部位，及來 自正常組織之細胞。 此外，雖然進行步驟（b)中不使用對照組樣品，仍須使用 癌檢測指標基因之表現量，與受檢測樣品中表現量變動少 之基因，例如根據與上述家務基因表現量作比較，亦可得 知「癌分類指標基因」表現量之變動。 本發明之檢測方法中，前述「癌分類指標基因」中至少 1種所對應之核酸，或該基因所編碼之多肽之表現，係可 經由核酸増幅之方法、雜交法、酵素免疫測定法、螢光免 疫測定法、發光免疫測定法等測定之。本發明中核酸表現 測定時，可同時觀察多種「癌分類指標基因」，對於縮短 檢測所需時間之觀點而言，前述DNA陣列之使用，對於觀 察基因之表現更爲適合。 本發明之檢測方法中，「癌分類指標基因」中至少1種 所對應之核酸，或該基因所編碼之多肽之表現，與對照組 樣品作比較具有變動者，可作爲前述受檢測樣品中癌細胞 存在之指標’據此，不但可檢測出癌，特別是食道癌，並 可判定癌、食道癌之進行度、惡化程度、類型。 如上述之分析所得之結果，可以如印表機、顯示器或如 顯示器專用之軟體之其他軟體繪圖軟體可獲得相對應輸出 者得之。相關之輸出，係經由本發明之檢測方法所得之結 果’對於進行診斷、治療法之篩選有用者特別有利。 _____ - 24 - 本纸張尺度適种g g家料(CNS) A4规格(2綱297公董) 1316959 A7 ----------B7 五、發明説明（22 ) •作爲本發明癌之分類及/或檢測使用之套组 作爲本發明癌之分類及/或檢測使用之套組，係爲觀察 上iC「癌分類指標基因」之受檢測樣品中表現量之變動所 用之套組。即爲了測定經由本發明癌分類之指標基因的篩 選方法所得到之至少i種基因表現量之套組。從更正確分 類癌的觀點雖無特別之限制，仍以至少可測定5種「癌分 類指標基因J之表現量者爲佳。 本發明t套組，係可足量來自前述之「癌分類指標基 因」所轉綠之mRNA量，含有以該基0mRNA量之測定爲 目的所使用之引子及/或探針爲一大特徵。 本發明之套組，係前述之「癌分類指標基因」，更具體 的説在表1及表2中所載之基因可反應出癌，特別是食道 癌之進/于度、惡化程度、類型，係爲本發明者們意外之發 見右根據本發明之套組，係前述之「癌分類指標基 因」，更具體的説，與表i及表2中所載之基因所相對應之 核酸或其互補鏈（抗意識鏈）特異性相結合，即根據在極嚴 苛的條件下進行雜交之寡㈣酸，可檢測出可信度高之 癌’特別是食道癌，且亦可根據其進行度、惡化程度、類 型進行分類。 、k之引子’以。通之核酸増幅法，如於中所 使用之反應條件下，所爲來自由上述基因轉錄之劍八之 核酸序列作特異性之增幅者爲佳，例如可根據該基因之驗 基序列所設計、合成。再者，引子之鏈長雖無特別之限 L仍以15_4Q個❹長爲@ ’特別以17·3〇個驗基長更 -25-

1316959 A7 B7 五、發明説明（23 ) 佳。 另外，本發明之套組，理想狀況下，以含有可特異性增 幅來自上述基因所轉錄mRNA之核酸序列之對應引子爲 佳。 核酸增幅法，特別是測定經由RT-PCR法之mRNA量的情 況下，例如可經由競爭PCR法、TaqMan法[例如參考Linda G. Lee 等人之 Nucleic Acids Research，第 21 卷，第 3761-3766 頁（1993)]等測定 mRNA量。 此外，前述之探針或引子係「癌分類指標基因」所對應 之核酸（意識鏈）或與含有該基因互補之鹼基序列（抗意識 鏈），於極嚴苛的條件下·進行+雜交即可。此處之「極嚴苛 條件」，並無特別之限制，如6 X SSC (此處1 X SSC係表示 0.15 M Naa、0.015 Μ檸檬酸鈉、pH 7.0)、0.5% SDS、5 X 于·· >，、yl/卜、含有1 00 ju g/ml變性鯡精子DNA之溶液[前述引 子及/或探針之Tm-25 °C ]之溫度一晚保溫之條件等。此 外，探針之Tm係以如下式所求得：

Tm= 81.5-16.6 (log,〇[Na+]) + 0.41 (%G + C)-(600/N) (式中，N爲探針之鏈長，％G+C爲探針或引子中鳥糞嘌呤 及胞嘧啶殘基之含量） 另外，探針之鏈長在18個鹼基以下時，Tm可根據A + T(腺嘌呤+胸腺嘧啶）殘基之含量與2°C之積，與G + C殘基 之含量與4°C之基之和[(A + T) X 2 + (G + C) X 4]推定之。 前述探針之鏈長雖無特別之限定，從防止非特異性雜交 反應的觀點來看，15個鹼基以上特別是1 8個鹼基以上者較 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 裝 訂

1316959 A7 _______ ___ B7__ 五、發明説明（24 ) 爲理想。 再者，本發明之套組，係含有上述之引子及/或探針之 其他可用於核酸增幅法用試劑（如DNA聚合酶（PCR，特別 是LA-PCR中具有耐熱性之dnA聚合酶）、dNTP、MgCl2、 聚合酶反應之‘進物質等），檢測用試劑者。 5.本發明之DNA陣列 本發明癌之分類及/或檢測所使用之DNA陣列，係上述 癌分類之指標基因之相對應核酸或其片段個別於支撑物上 之既定區域固定化之陣列，即以上述i .中所記載之方法所 筛選之至少1種基因相對應之核酸（意識核酸或抗意識核酸） 或其片段排列固定化之DNA陣列。經由使用該陣列，具有 可簡便且精密度高的測定受檢測樣品中，上述基因之表現 變動之優良性質。 此處「個別於既定區域固定化」，係各基因相對應之核 酸（意識核酸或抗意識核酸）或其片段之固定化之位置，已 於支撑物上事先決定之意。及使用此類陣列時，從檢測訊 號之位置可得知該訊號由來自哪一個基因之核酸或其片 段。 從更正確分類癌之觀點觀之，雖無特別之限定，本發明 之DNA陣列，仍以從上述表1中所記載之記號基因中篩選 出，至少5種基因或其片段，及/或表2中所載之記號基因 中篩選出，至少5種基因或其片段固定化者爲佳。 用於本發明DNA陣列之支撑物，若爲雜交反應中所使用 者，則並洪特別之限制，通常使用載玻片、矽晶片硝酸 _ ____-27- 本紙依尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) A7 B7 1316959 五、發明説明（25 ) 纖維膜、耐龍膜等。更佳者係使用具有非多孔性表面平滑 構造之材質，雖無特別之限定，仍以載玻片等玻璃最爲適 用。支撑物之表面係以可固定化經由共價結合或非共價結 合之一股DNA者皆可，雖無特別之限定，仍以含有羥基、 胺基、硫醇基、醛基、羧酸基、烴基等者較適合使用。這 些官能基係作爲支撑物本身之表面特性而存在者亦佳，經 由表面處理導入亦可。此類表面處理物，係如以胺矽烷等 市售之矽烷偶合劑處理之玻璃，或聚賴氨酸或聚乙烯亞胺 等聚陽離子處理者。另外，施以這些處理之載玻片之一部 份係市售可得。 本發明之DNA陣列中，基因或其片段係單股或雙股固定 皆可。例如，該核酸或其片段變性之雙股於支撑物上排列 固定之DNA陣列，或固定化之DNA中至少一部份爲單股 DNA之DNA陣列亦可。此外，本發明之陣列，於變性之雙 股DNA下，可爲相同支撑物上排列支持之DNA陣列。 支撑物上固定化之核酸或其片段並無特別之限定，若可 能測定經由記號基因轉錄之mRNA量，聚核苷酸、寡核苷 酸皆可。再者，該製造方法亦無特別之限定，化學合成 者、從天然核酸分離、純化者、以酵素方式合成者，更進 一步可將這些組合使用。 固定於支撑物上之核酸或其片段，本發明中可適用根據 如PCR (polymerase chain reaction)法，以酵素方式增幅配 製鏈長50個鹼基以上之雙股聚核苷酸或其衍生物。該衍生 物係以於支撑物表面之固定化儘可能具修飾者爲例，雖無 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1316959 五、發明説明（26 ) 特別之限定，如於DNA之5'端導入胺基或硫醇基等官能基 之DNA。於支撑物上固定化相當於將上述之雙股聚核甞酸 或其衍生物變性，亦可作爲單股聚核苷酸或其衍生物。

裝 於陣列上固定聚核铝酸時，其鏈長並無特別之限定，例 如約50個鹼基長〜約1000個鹼基長者皆可適用於本發明之 使用。另外，即使比該鏈長長或短者，若可與來自受檢測 樣品之核酸進行雜交反應時，具特異性雜交者亦可。 例如可使用以基因组DNA庫或cDNA庫爲模版進行PCR所 增幅之DNA。上述之基因相對應之核酸或其片段可以眾所 皆知的方法，例如經由導入胺基之支撑物上固定製作其陣 列。另外，上述固定化之操作，可使用DNA陣列製作裝 置，如GMS公司製造之DNA晶片製作裝置進行之，製作該 基因相對應核酸係排列、固定化之本發明之陣列。

具體言之，舉例來説，從上述表1中所記載之記號基因 中篩選出，至少5種基因或其片段，及/或表2中所載之記 號基因中篩選出，至少5種基因或其片段固定化之DNA陣 列0 再者，本發明之陣列，係固定化基因之核酸或其片段於 支撑物上之密度雖無特別之限制，例如，即使具有高密度 DNA所固定之陣列亦可，具有100點/cm2以上之密度DNA 所固定之陣列較爲適用，如此高密度之陣列通常稱之爲 DNA微陣列》 從可能可使用少量之樣品測定高敏感度、高精密度的觀 點觀之，高密度之陣列對於本發明較爲有利。 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐） A7 B7 1316959 五、發明説明（27 ) 本發明之DNA陣列，係有可製作將樣品分類爲複數之群 組之可能，此時，對各群組之分類指標基因群分別於支撑 物上接近，並經由與其他基因群分開固定化，可簡便且迅 速的分析測定結果。 以下雖係本發明經由實施例更具體説明之，然本發明並 不僅限定於這些實施例。

實施例1 抽取RNA 選擇來自食道偏平上皮癌患者之病理組織學上無淋巴結 轉移的10個病例（樣品號碼D232、D242、D250、D272、 D278、D288 ' D292、D294、D301' D308)(A群），與具有 5 個以上淋巴結轉移之10個病例（樣品號碼D230、D238、 D244、D260 ' D285、D299、D300 ' D302 ' D304、D305)(B 群），使用RNA抽取用試劑ISOGEN(NIPONGENE公司製 造），並根據該試劑所附説明書之記載，抽取來自各病例 外科切除標本之原發巢中之全RNA。 實施例2 北方點墨分析 由實施例1中所得之全RNA中，各病例各取5yg全 RNA，與編碼E2F-1之核酸級北方墨跡分析用探針進行北 方墨跡分析。 此外，前述北方點墨分析用探針係以下列方法製得。 即，以0.1 "g來自人類之RNA資料庫（ORIGENE公司製造） 作爲模板，使用序列號碼：1所載序列之引子，與序列號 碼：2所載序列之引子進行RT-PCR (逆轉錄PCR)。所得之 增幅產物以1%之洋菜膠片進行電泳，將電泳後之膠片上 * 30 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1316959 A7 _ B7 五、發明説明（28 ) 520 bp條紋之相對應部分切下，以常用之方法純化之。所 純化出之DNA片段約100 ng，使用隨意引子DNA標定套组 (Balinga Manhim公司製造）經由32P-dCTP標識，可得北方點 墨分析用之標識E2F-1探針。 北方雜交法以下列方法進行之。首先，實施例1所得各 樣品之全RNA，以每個位置5 y g等量福馬林變性1°/。之洋 菜膠片進行電泳，其次，電泳過後之膠片於硝纖維濾紙-Nitro PlusTM (Milipore公司製造）上進行點染，將膠片上之 RNA轉錄至該硝纖維濾紙上。 轉錄後之濾紙於前雜交反應緩衝液中（50%曱醯胺、5 X SSC、5 X歹 > 广4/卜液、〇.1〇/〇 SDS) 42°C放置2小時，進行 前雜交反應。其次，前雜交反應後之濾紙，在添加最终濃 度爲4ng/ml之前述標識E2F-1探針之雜交反應緩衝液（40% 甲醯胺、4 X SSC、4 X亍、> ”少卜液、0.08% SDS、10%聚葡 糖）中，42°C放置一夜以進行雜交反應。雜交反應後所得 之濾紙以清洗液（0.1 XSSC、0.1% SDS) 65eC、30分鐘清洗2 次，清洗後之濾紙以高感度X光片（柯達公司製造）曝光一 夜。於所得放射自顯影照片中之訊號強度，以目視比較研 究之。 其結果爲：淋巴結轉移在5個以上之1 〇個病例中，有4個病 例（樣品號碼D238、D260、D299、D304)，其^2F-^之表現高 (B-H群），其餘6個病例（樣品號碼D230、D244、D285、D300 、D3〇2、D3〇5)之E2F-1表現低（B-L群）。另外，無淋巴結轉 移之10個病例中，有1個病例（病例號碼D242)之E2F-1之表 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

裝 訂

A7 B7 1316959 五、發明説明（29 ) 現高（A-Η群）？其餘9個病例（樣品號碼D232、D250、 D272、D278、D288、D292、D294、D301、D308)之 E2F-1 表現低（A-L群）。 實施例3 淋巴結轉移在5個以上且E2F-1表現高的4個病例（D260、 D299、D304、D238)，淋巴結轉移在5個以上且E2F-1表現 低的4個病例（D285、D300、D230、D244)，淋巴結轉移在 1〜3個有5個病例[D256 (淋巴結轉移1個）、D258 (淋巴結轉 移1個）、D295 (淋巴結轉移1個）、D296 (淋巴結轉移2個）、 D298(淋巴結轉移3個）]，共計13個病例作爲樣品，與無淋 巴結轉移且E2F-1表現低之A-L群之對照組樣品作比較，以 下列Human Cancer CHIP (寶酒造公司製造）、Human Apoptosis CHIP (寶酒造公司製造）進行基因表現分析。 對於前述各病例以與實施例1相同之方式抽取全RNA， 以5 // g所得之全RNA作模板，以序列號碼：3中所示序列 之T7-dT24引子作爲引子，使用 Time SaverTM cDNA Synthesis Kit (Amersham Pharmacia公司製造），並根據該套組所附之 實驗手册合成cDNA。 所得之cDNA各以10 a 1之TE緩衝液解之，以相當於所得 之 5 // 1 cDNA溶液作爲模板，使用 MEGAscriptTM in vitro Transcription Kit for Large Scale Synthesis of RNAs(Ambion 公司製造），並根據該套組所附之實驗手册合成cRNA。 以2 " g所得之crnA爲模板，經由使用下列之Cy3-dUTP 進行反轉錄反應，製得以Cy3螢光標識之DNA。即，配製 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準扣贴）A4规格(210 X 297公釐） 1316959 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) 將2 " g之cRNA、7ng之；I polyA+ RNA-A (寶酒造公司製 造）、0.75" g之隨意引子六去氧核糖核茫酸混合物（寶酒造 公司製造）混合之反應液20 ，以65°C加熱10分鐘後，冰 浴冷卻之。冰浴後之溶液中加入61.5U之RNase inhibitor、 4 1 之 10 x low dTNTP mix、1 mM 4 1 之 Cy3-dUTP、8 # 1 之 5 x AMV用反應緩衝液及 50U之 AMV reverse transcriptase XL (Life Science公司製造），以42°C閉光1小時進行反轉錄 反應。其次，於所得之反應產物中，再次添加50 U之AMV reverse transcriptase XL，42 °C閉光1小時進行反轉錄反 應。反應終了後，所得之反應產物以線多立謝普管柱 (Apraido biosystem公司製造）純化之，所得之純化產物以 酒精沉澱之。回收之沉澱物以5 # 1雜交反應緩衝液（6 X SSC、0.2%SDS、卜溶液、100 " g/ml熱變性娃 魚精子 DNA、1.25 "g///l人類 Cotl DNA、0.8 聚去氧 腺甘、1 "g//zl酵母tRNA)溶解之，即可得Cy3標識之樣品 DNA。 對於A-L群亦以相同方式抽取RNA、合成cDNA、合成 cRNA，以2" g所得之CRNA爲模板，經由使用Cy5-dUTP進 行反轉錄反應，以Cy5螢光標識之，可得Cy5標識之A-L群 DNA。 各Cy3標識之樣品DNA與Cy5標識之A-L群DNA以等量混 合之，再以Human Cancer CHIP (寶酒造公司製造）、Human Apoptosis CHIP (寶酒造公司製造）進行基因表現分析，根 據CHIP之分析以下列方式進行之。 •33- Λ張尺度適时® S家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱)

裝

k A7 B7 1316959 五、發明説明（31 ) 於蓋玻片上滴下10 前雜交反應缓衝液（6 X SSC、0.2% SDS、5 X X >广小卜溶液、1 // g/ml熱變性鮭魚精子DNA)， 於所滴下之溶液上蓋上Human Cancer CHIP (寶酒造公司製 造）或Human Apoptosis CHIP (寶酒造公司製造），以紙帶密 閉周圍。所得之CHIP置於65eC 2小時。之後取下蓋玻片， 以2 X SSC清洗CHIP，其次以0.2 X SSC清洗後風乾。據此， 進行前雜交反應。 10 //1之Cy3標識之樣品DNA與Cy5標識之A-L群DNA以等 量混合之溶液，以100°C處理2分鐘後冰浴。所得之溶液滴 於蓋玻片上，於滴下之溶液上蓋上Human Cancer CHIP (寶 酒造公司製造）或Human Apoptosis CHIP (寶酒造公司製 造），以紙帶密閉周圍。所得之CHIP以65°C保持一夜進行 雜交反應。之後取下蓋玻片，以2x SSC、0.2% SDS、65°C 清洗CHIP 5分鐘後，再以2 X SSC、0.2 X SDS、55°C 30分鐘 清洗2次，再以0.05 X SSC潤濕5分鐘後風乾。 所得之完成雜交反應之CHIP供以微掃描器（GMS公司製 造），測定各點之螢光訊號。所測定之訊號以表現數據分 析軟體ImaGene (Biodiscovery公司製造）分析之。 其結果爲，下列基因群係具有轉移之樣品中其表現量減 少者： •類胰島素生長因子結合蛋白質2 [insulin-like growth factor binding protein 2 (IGFBP2)、（基因庫註册號碼： X16302)]基因、 • BIGH3 (基因庫註册號碼：M77349)基因、 -34- 本紙張尺度逋用中國國家操準(CNS) A4规格(210X297公爱) 1316959 A7 B7 五、發明説明（32 ) •類胰島素生長因子結合蛋白質6 [insulin-like growth factor binding protein 6 (IGFBP6)、（基因庫註册號碼： M624〇2)]基因、 •明膠酶A [gelatinase A (MMP-2)、（基因庫註册號碼： M55593)]基因、 • II 型細胞骨架角蛋白.7 [type II cytoskeletal 7 keratin (cytokeratin 7 (K7 ; CK 7))、（基因庫註册號碼：M13955)] 基因、 •結缔組織生成素I [desmoplakin I、（基因庫註册號碼： M77830)]基因、 •穀胱甘肽 S-轉移酶 A1 [glutathione S-transferase A1、（基 因庫註册號碼：M16594)]基因、 •穀胱甘肽 S-轉移酶 Pi [glutathione S-transferase Pi (GSTP1) 、（基因庫註册號碼：U12472)]基因、 •膠原酶-3 [collagenase-3 (MMP-3)、（基因庫註册號碼： X75308)]基因、 •II型細胞骨架角蛋白 5 [type II cytoskeletal 5 keratin (cytokeratin 5(K5 ; CK 5))、（基因庫註册號碼：M21389)]基 因、 • p-c粘連素[P-cadherin、（基因庫註册號碼：X63629)]基 因、 • I 型細胞骨架角蛋白 14 [type I cytoskeletal 14 keratin (cytokeratin 14 (K14 ; CK 14))、（基因庫註册號碼：J00124)] 基因、

裝 訂

-35- 本纸張尺度逋用中ii^(CNS) A4規格(謂97公釐) 1316959 A7 _____^B7_ 五、發明説明（33 ) • II型細胞骨.架角蛋白 6 [type II cytoskeletal 6 keratin (cytokeratin 6B (CK 6B)) ' (基因庫註册號碼：L42610)]基 因。 另外，下列基因群係具有轉移之樣品中若干表現量減少 者： •母系離氨酸[matrilysin .(MMP-7)、（基因庫註册號碼： X07819)]基因、 •類又狀頭7 [forkhead-like 7、（基因庫註册號碼： AF048693)]基因、 •結缔組織生長因子[connective tissue growth factor (CTGF) 、（基因庫註册號碼：M92934’)]基因、 •成長赫爾蒙依賴性類胰島素成長因子結合蛋白質 [growth hormone-dependent insulin-like growth factor-binding protein、（基因庫註册號碼：M35878)]基因、 • Rho 8蛋白質[Rh〇 8 protein、（基因庫註册號碼：X95282)] 基因。 另一方面，下列基因群係淋巴結轉移爲1〜3個之樣品 中’雖與對照組樣品中之表現量無差異，但淋巴結轉移爲 5個之樣品中則其表現量增加者： • RB A/p48 (基因庫註册號碼：X74262)基因、 •細胞分裂控制蛋白質2同系物[cell division control protein 2 homolog、（EC 2.7. l-)(cdc2)、（基因庫註册號碼： X05360)]基因、 •複製因子 C 38kDa 次單元[replication factor C 38-kDa _ -36- 本紙張尺度逋用中國國家標準(CNS) A4规格(21〇x297公釐) A7 B7 1316959 五、發明説明（34 ) subunit (RFC38)、（基因庫註册號碼：L07541)]基因、 • apopain前驅物[apopain precursor、（基因庫註册號碼： U13737)]基因、 •色素乾皮症C群修復互補蛋白質p58/HHR23B [xeroderma pigmen tosum group C repair complementing protein p58/HHR23B、（基因庫註册號碼：D21090)]基因、 •環狀素G2 [cyclin G2、（基因庫註册號碼：U47414)]基 因、 •環狀素A [cyclin A、（基因庫註册號碼：X51688)]基因、 •调零相關蛋白質 TFAR15 [apoptosis-related protein TFAR 15、（基因庫註册號碼：AF022385)]基因、 • TRKB酪胺酸激酶接受器[TRKB tyrosine kinase receptor、（基因庫註册號碼：Ul2140)]基因、 •訊號傳達轉錄活化因子Ι-α/f [signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta (STAT1)、（基因庫註 册鈇碼：M97935)]基因。 此外，下列基因係若干淋巴結轉移在5個以上之樣品中 表現量增加者： • K-ras致癌基因[K-ras oncogene、（基因庫註册號碼： M54968)]基因、 •視網膜瘤感受性蛋白質[retinoblastoma susceptibility protein (RB1)、（基因庫註册號碼：L41870)]基因、 • BCL2/腺病毒E1B 19kD交互作用蛋白質1 (BNIP1) Mrna [BCL2/ adenovirus E1B 19kD-interacting protein 1 (BNIP1) -37- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A7 B7 1316959 五、發明説明（35 ) mRNA，complete cds、（基因庫註册號碼：AF083957)]基 因、 •调零蛋白質 1抑制因子[inhibitor of apoptosis protein 1 (HIAP-1)、（基因庫註册號碼：U45878)]基因。 下列基因群爲其表現量之增加，係於轉移在5個以上之 樣品中所找出，可觀察到這8種基因表現增加之樣品中， 其E2F-1之表現皆低者： • G1/S特異性環狀素C [cyclin C Gl/S-specific、（基因庫註 册號碼：M74091)]基因、 • BRCA1關連環狀功能部位蛋白質[BRCAl-associated ring domain protein、（基因庫註册競碼：U76638)]基因、 • APC [(基因庫註册號碼：M73548)]基因、 •整合素 α-Ε前驅物[integrin alpha-E precursor (ITGAE)、 (基因庫註册號碼：L25851)]基因、 • Ezrin [ezrin (cytovillin 2)、（基因庫註册號碼：X51521)] 基因、 •類 recA蛋白質 HsRad51 [recA-like protein HsRad51、（基 因庫註册號碼：L07493)]基因、 •血管内皮生長因子C前驅物[vascular endothelial growth factor C precursor (VEGF-C)、（基因庫註册號碼：U43 142)] 基因、 •環狀素E [cyclinE、（基因庫註册號碼：M73812)]基因。 此外，下列基因其表現量之增加，係於轉移在5個以上 之樣品中所找出，可觀察到這2種基因表現增加之樣品 -38 - 本紙張尺度適用中國囷家標準(CNS) Α4规格(210X297公釐) A7 B7 1316959 五、發明説明（36 ) 中，其E2F-1之表現皆高者： • CDK6 抑制因子 2c (pl8) mRNA，complete cds [CDK6 inhibitor 2c (pi8) mRNA，complete cds、（基因庫註册號碼： U17074)]基因，及 • PCNA [(基因庫註册號碼：M15796)]基因。 因此，這10種基因係根據E2F-1之表現多少視爲表現量 具增減之基因，尚無法根據這些基因表現的多少進行轉移 能之評估。 經由上述之結果，下列基因顯然可作爲淋巴結轉移之指 標： •類胰島素生長因子結合蛋白質2 [insulin-like growth factor binding protein 2 (IGFBP2)、（基因庫註册號碼： X16302)]基因、 • BIGH3 (基因庫註册號碼：M77349)基因、 •類胰島素生長因子結合蛋白質6 [insulin-like growth factor binding protein 6 (IGFBP6)、（基因庫註册號碼： M62402)]基因、 •明膠酶A [gelatinase A (MMP-2)、（基因庫註册號碼： M55593)]基因、 • II型細胞骨架角蛋白 7 [type II cytoskeletal 7 keratin (cytokeratin 7 (K7 ; CK 7))、（基因庫註册號碼：M13955)] 基因、 •結缔組織生成素I [desmoplakin I、（基因庫註册號碼： M77830)]基因、 -39- 本紙張尺度逍用中困國家操準(CNS) A4规格(210X297公釐) A7 B7 1316959 五、發明説明（37 ) •榖胱甘肽 S-轉移酶 A1 [glutathiorie S-transferase A1、（基 因庫註册號碼：M16594)]基因、 •毅胱甘肽 S-轉移酶 Pi [glutathione S-transferase Pi (GSTP1) 、（基因庫註册號碼：U12472)]基因、 •膠原酶-3 [collagenase-3 (MMP-3)、（基因庫註册號碼： X75308)]基因、 • II 型細胞骨架角蛋白 5 [type II cytoskeletal 5 keratin (cytokeratin 5 (K5 ; CK 5))、（基因庫註册號碼：M21389)] 基因、 • P-c粘連素[P-cadherin、（基因庫註册號碼：X63629)]基 因、 • I型細胞骨架角蛋白 14 [type I cytoskeletal 14 keratin (cytokeratin 14 (K14 ; CK 14))、（基因庫註册號碼：J00124)] 基因、 • II 型細胞骨架角蛋白 6 [type II cytoskeletal 6 keratin (cytokeratin 6B (CK 6B))、（基因庫註册號碼：L42610)]基 因、 •母系離氨酸[matrilysin (MMP-7)、（基因庫註册號碼： X07819)]基因、 •類又狀頭7 [forkhead-like 7、（基因庫註册號碼·· AF048693)]基因、 •結缔组織生長因子.[connective tissue growth factor (CTGF) 、（基因庫註册號碼：M92934)]基因、 •成長赫爾蒙依賴性類胰島素成長因子結合蛋白質 -40 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1316959 A7 B7 五、發明説明（38 ) [growth hormone-dependent insulin-like growth factor-binding protein、（基因庫註册號碼：M35878)]基因、 • Rho 8蛋白質[Rho 8 protein、（基因庫註册號碼：X95282)] 基因。 其中特別理想者爲： •類跋島素生長因子結合蛋白質2 [insulin-like growth factor binding protein 2 (IGFBP2)、（基因庫註册號碼： X16302)]基因、 • BIGH3 (基因庫註册號碼：M77349)基因、 •類胰島素生長因子結合蛋白質6 [insulin-like growth factor binding protein 6 (IGFBP6)、（基因庫註册號碼： M624〇2)]基因、 •明膠酶A [gelatinase A (MMP-2)、（基因庫註册號碼： M55593)]基因、 • II 型細胞骨架角蛋白 7 [type II cytoskeletal 7 keratin (cytokeratin 7 (K7 ; CK 7))、（基因庫註册號碼：M13955)] 基因、 •結缔组織生成素I [desmoplakin I、（基因庫註册號碼： M77830)]基因、 • 毅胱甘肽 S-轉移酶 A1 [glutathione S-transferase A1、（基 因庫註册號碼：M16594)]基因、 •毅胱甘肽 S-轉移酶 Pi [glutathione S-transferase Pi (GSTP1)、（基因庫註册號碼：U12472)]基因、 •膠原酶-3 [collagenase-3 (MMP-13)、（基因庫註册號碼： -41 - 本紙張尺度適用中國國家樣準(CNS) A4規格(210X297公釐）

裝 訂

k A7 B7 1316959 五、發明説明（39 ) X75308)]基因、 • II 型細胞骨架角蛋白 5 [type II cytoskeletal 5 keratin (cytokeratin 5 (K5 ; CK 5))、（基因庫註册號碼：M21389)] 基因、 • P-c枯連素[P-cadherin、（基因庫註册號碼：X63629)]基 因、 •I 型細胞骨架角蛋白 14 [type I cytoskeletal 14 keratin (cytokeratin 14 (K14 ; CK 14))、（基因庫註册號碼：J00124)] 基因、 •II 型細胞骨架角蛋白 6 [type II cytoskeletal 6 keratin (cytokeratin 6B (CK 6B))、（基因庫註册號碼：L42610)]基 因。 另外，下列基因明顯的可作爲淋巴結高轉移指標： • RBA/p48 (基因庫註册號碼：X74262)基因、 •細胞分裂控制蛋白質2同系物[cell division control protein 2 homolog、（EC 2.7.l-)(cdc2)、（基因庫註册號碼： X05360)]基因、 •複製因子 C 38kDa 次單元[replication factor C 38-kDa subunit (RFC38)、（基因庫註册號碼：L07541)]基因、 • apopain前驅物[apopain precursor、（基因庫註册號碼： U13737)]基因、 •色素乾皮症C群修復互補蛋白質p58/HHR23B [xeroderma pigmen tosum group C repair complementing protein P58/HHR23B、（基因庫註册號碼：D21090)]基因、 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐） 1316959 A7 B7 五、發明説明（4〇 ) •環狀素G2 [cyclin G2、（基因庫註册號碼：U47414)]基 因、 •環狀素八[〇丫山11八、（基因庫註册號碼：乂51688)]基因、 •调零相關蛋白質 TFAR15 [apoptosis-related protein TFAR 15、（基因庫註册號碼：AF0223 85)]基因、 • TRKB 路胺酸激酶接受器[TRKB tyrosine kinase receptor 、（基因庫註册號碼：U12140)]基因、 •訊號傳達轉綠活化因子l-a//3 [signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta (STAT1)、（基因庫註 册號碼：M97935)]基因、 • K-ras致癌基因[K-ras oncogene、（基因庫註册號碼： M54968)]基因、 •視網膜瘤感受性蛋白質[retinoblastoma susceptibility protein (RB1)、（基因庫註册號碼：L41870)]基因、 • BCL2/腺病毒E1B 19kD交互作用蛋白質1 (BNIP1) mRNA [BCL2/adenovirus E1B 19kD-interacting protein 1 (BNIP1) mRNA, complete cds、（基因庫註册號碼：AF083957)]基 因。 其中特別理想者爲： • RBA/p48 (基因庫註册號碼：X74262)基因、 •細胞分裂控制蛋白質2同系物[cell division control protein 2 homolog、（EC 2.7.1-)(cdc2)、（基因庫註册號碼： X05360)]基因、 •複製因子 C 38kDa 次單元[replication factor C 38-kDa -43- 本紙張尺度逋用十國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐）

裝 訂

A7 B7 1316959 五、發明説明（41 ) subunit (RFC38)、（基因庫註册號碼：L07541)]基因、 • apopain前驅物[apopain precursor、（基因庫註册號碼： U13737)]基因、 •色素乾皮症C群修復互補蛋白質p58/HHR23B [xeroderma pigmen tosum group C repair complementing protein p58/HHR23B、（基因庫註册號碼：D21090)]基因、 •環狀素G2 [cyclin G2、（基因庫註册號碼：U47414)]基 因、 •環狀素A [cyclin A、（基因庫註册號碼：X51688)]基因、 •凋零相關蛋白質 TFAR15 [apoptosis-related protein TFAR 15、（基因庫註册號碼：AF022385)]基因、 • TRKB 路胺酸激酶接受器[TRKB tyrosine kinase receptor 、（基因庫註册號碼：U12140)]基因、 •訊號傳達轉錄活化因子1-a//? [signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta (STAT1)、（基因庫註 册號碼：M97935)]基因。 實施例4 從實施例3中明顯的可作爲淋巴結高轉移指標之基因群 中所篩選出下列5種： •I 型細胞骨架角蛋白 14 [type I cytoskeletal 14 keratin (cytokeratin 14 (K14 ; CK 14))、（基因庫註册號碼：J00124)] 基因、 • II 型細胞骨架角蛋白 6 [type II cytoskeletal 6 keratin (cytokeratin 6B (CK 6B))、（基因庫註册號碼：L42610)]基 -44 - 本紙張尺度適用中國固家標準(CNS) A4規格(2i〇X297公釐） A7 B7 1316959 五、發明説明（42 ) 因、 • II 型細胞骨架角蛋白 5 [type II cytoskeletal 5 keratin (cytokeratin 5 (K5 ; CK 5))、（基因庫註册號碼：M21389)] 基因、 •明膠酶A [gelatinase A (MMP-2)、（基因庫註册號碼： M55593)]基因、 •II 型細胞骨架角蛋白 7 [type II cytoskeletal 7 keratin (cytokeratin 7 (K7 ; CK 7))、（基因庫註册號碼：M13955)] 基因。 其基因相對應之cDNA固定化之DNA微陣列，係以下列 方法製得： 以實施例3中所配製之A-L群RNA爲模板，對於各基因以 RT-PCR法增幅cDNA片段。於I型細胞骨架角蛋白14 [type I cytoskeletal 14 keratin(cytokeratin 14 (K14 ; CK 14))、（基因 庫註册號碼：J00124)]之cDNA增幅中，使用具有序列號 碼：4或5中所載序列之引子所成之引子對；於II型細胞骨 架角蛋白 6 [type II cytoskeletal 6 keratin (cytokeratin 6B (CK 6B))、（基因庫註册號碼：L42610)]之cDNA增幅中，使用 具有序列號碼：6及7中所載序列之引子所成之引子對；於 II 型細胞骨架角蛋白 5 [type II cytoskeletal 5 keratin (cytokeratin 5 (K5 ; CK 5))、（基因庫註册號碼：M21389)] 之cDNA增幅中，使用具有序列號碼：8及9中所載序列之 引子所成之引子對；於明膠酶A [gelatinase A (MMP-2)、 (基因庫註册號碼：M55593)]之cDNA增幅中，使用具有序 -45- 本紙張尺度適用t國固家襟準(CNS) A4规格(210X297公釐）

裝 訂

k- 1316959 A7 B7 五、發明説明（43 列號碼：10及11中所載序列之引子所成之引子對；於Π型 細胞骨架角蛋白 7 [type II cytoskeletal 7 keratin (cytokeratin 7 (K7 ; CK 7))、（基因庫註册號碼：M13955)]之cDNA增幅 中，使用具有序列號碼：12及13中所載序列之引子所成之 引子對。進行增幅之cDNA之鹼基序列分析，並確認存在 目的片段。另外，已確認存在之目的cDNA片段以酒精沉 澱法回收後，以10 mM碳酸緩衝液（pH 9.5)溶解成濃度爲1 jU Μ 〇 E1F-2基因之cDNA作爲家務基因，/?-肌動蛋白基因之 cDNA作爲負控制變因，於質體pUCl 8進行相同之配製。 將這些DNA，使用DNA晶片製作裝置（GMS公司製造）， 點於胺基導入載玻片上，經由UV照射固定於該載玻片 上。所得之載玻片以0.2% SDS溶液清洗後，再以蒸餾水清 洗，乾燥後可得DNA陣列。 實施例5 達構下列套組。 (1) 套組1 ①爲測定從實施例3中明顯的可作爲淋巴結高轉移指標之 基因群中所篩選出下列5種基因之各mRN A量之引子及引 子： • I 型細胞骨架角蛋白 14 [type I cytoskeletal 14 keratin (cytokeratin 14 (K14 ; CK 14))、（基因庫註册號碼：J00124)] 基因、 • II 型細胞骨架角蛋白 6 .[type II cytoskeletal 6 keratin -46- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A7 B7 1316959 五、發明説明（44 ) (cytokeratin 6B (CK 6B))、（基因庫註册说碼：L42610)]基 因、 •II型細胞骨架角蛋白 5 [type Π cytoskeletal 5 keratin (cytokeratin 5 (K5 ; CK 5))、（基因庫註册號碼.M21389)] 基因、 •明膠酶A [gelatinase A (MMP·2)、（基因庫註册號碼： M55593)]基因、 • II 型細胞骨架角蛋白 7 [type II cytoskeletal 7 keratin (cytokeratin 7 (K7 ; CK 7))、（基因庫註册號碼.M13955)] 基因。 ② AMV Reverse Transcriptase XL (5U/# 1) 50 "1 ③ RNase Inhibitor (40U/# 1) 25 μ 1 ④ Random 9 mers (50U/" m) 50 "1 ⑤ oligo dT (2.5 "M) 50 "1 ⑥ TaKaRaTaq(5U/"l) 25 #1 ⑦ 10 xRNA PCR buffer (100 mM Tris-HCl，500 mM 1 ml KC1, pH 8.3) ⑧ dNTP mixture (各 10 mM) 150 "1 ⑨ MgCl2 (25 mM) 1 ml (2) 套組2 ①與實施例3中明顯的可作爲淋巴結高轉移指標之基因群 中所篩選出下列5種基因編碼之多肽可特異性結合之抗體 (標識抗體）： • I型細胞骨架角蛋白 14 type I cytoskeletal 14 keratin -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1316959 A7 ____B7_^___ 五、發明説明（45 ) cytokeratin 14 (K14 ; CK 14))、（基因庫註册號碼：J00124)] 基因、 • II 型細胞骨架角蛋白 6 [type II cytoskeletal 6 keratin (cytokeratin 6B (CK 6B))、（基因庫註册號碼：L42610)]基 因、 • II 型細胞骨架角蛋白.5 [type II cytoskeletal 5 keratin (cytokeratin 5 (K5 ; CK 5))、（基因庫註册號碼：M21389)] 基因、 •明膠酶A [gelatinase A (MMP-2)、（基因庫註册號碼： M55593)]基因、 ♦II型細胞骨架角蛋白 7 [type II cytoskeletal 7 keratin (cytokeratin 7 (K7 ; CK 7))、（基因庫註册號碼：M13955)] 基因。 序列表簡要説明 序列號碼：1係爲爲增幅E2F-1基因之一部分之PCR引子 序列。 序列號碼：2係爲爲增幅E2F-1基因之一部分之PCR引子 序列。 序列號碼：3係爲逆轉錄反應用引子序列。 序列號碼：4係爲爲增幅I型細胞骨架角蛋白14基因之一 邵分之PCR引子序列。 序列號碼：5係爲爲增幅I型細胞骨架角蛋白14基因之一 部分之PCR引子序列。 序列號碼：6係爲爲增幅II型細胞骨架角蛋白6基因之一 邵分之PCR引子序列。 -48- 本紙張尺度逋用中國國家標準(CNS) Α4规格(210X 297公釐) A7 B7 1316959 五、發明説明（46 ) 序列號碼：7.係爲爲增幅II型細胞骨架角蛋白6基因之一 部分之PCR引子序列。 序列號碼：8係爲爲增幅II型細胞骨架角蛋白5基因之一 部分之PCR引子序列。 序列號碼：9係爲爲增幅II型細胞骨架角蛋白5基因之一 部分之PCR引子序列。 序列號碼：10係爲爲增幅明膠酶A基因之一部分之PCR 引子序列。 序列號碼：11係爲爲增幅明膠酶A基因之一部分之PCR 引子序列。 序列號碼：12係爲爲增幅II型細胞骨架角蛋白17基因之 一部分之PCR引子序列。 序列號碼：13係爲爲增幅II型細胞骨架角蛋白17基因之 一部分之PCR引子序列。 ^產業上利用之可能性 若根據本發明癌分類之指標基因之篩選方法，可於各種 癌中簡便迅速的篩選出依據其進行度、分化度、類型等分 類之可能基因，使得能爲癌的診斷、治療之目的提供情 報。此外，若根據本發明癌之分類方法，癌之分類如進行 度、分化度、類型等可簡便迅速的分類，從該分類結果， 可於各個病例中選擇適當之治療方法。再者，所根據本發 明癌之檢測方法，可簡便迅速的檢測出各種進行度之癌、 各種分化度之癌、各種類型之癌，並可於各個病例中選擇 適當之治療方法。因此，本發明係對於癌之診斷、治療十j 分有用。) ， / / -49- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4规格(210X297公釐） 1316959 A7 B7 五、發明説明（47 ) 序列表 <110> 寶酒造股份有限公司 <120> 一種核酸之高感度檢測方法 <130> 01-051TW <150> JP 2000-219807 <151> 2000-07-19 <160> 13 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 人造序列之敘述：一 PCR引子序列 ，其係可增幅一 部份之E2F-1基因。 <400> 1 ggccgtcctc ccagcctgtt 20 <210> 2 -50- 本紙張尺度適用令國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1316959 A7 B7 五、發明説明（48 ) <211> 20 <212> DNA <213〉 人造序列 <220> <223> 人造序列之敘述·· 一 PCR引子序列，其係可增幅一 部份之E2F-1基因。 <400> 2 aggctcacca aagaggcctc 20 <210> 3 <211> 63 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 人造序列之敘述： 一轉錄引子序列 <400> 3 ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcggt tttttttttt tttttttttt 60 ttt 63 <210> 4 <211> 30 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1316959 A7 B7 五、發明説明（49 ) <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 人造序列之敘述：一PCR引子序列 ，其係可增幅一 部份之I型細胞骨架角蛋白14基因。 <400> 4 tatgagacag agttgaacct gcgcatgagt 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 人造序列之敘述：一 PCR引子序列 ，其係可增幅一 部份之I型細胞骨架角蛋白14基因。 <400> 5 atgaagctgt attgattgcc aggagggggt 30 <210〉 6 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列 <220〉 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1316959 A7 B7 五、發明説明（5〇 ) <223>人造序列之敘述：一PCR引子序列 部份之II型細胞骨架角蛋白6基因。 其係可增幅一 <400> 6 ctggacgtgg agatcgccac ctaccgcaag 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之敘述：一 PCR引子序列 部份之II型細胞骨架角蛋白6基因。 其係可增幅一 <400> 7 caggctttgt acatcatagg actagtcact 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之敘述：一PCR引子序列 部份之II型細胞骨架角蛋白5基因。 其係可增幅一 <400> 8 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1316959 A7 B7 五、發明説明（51 ) tccagcgtca aatttgtctc caccacctcc 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之敘述：一 PCR引子序列 部份之II型細胞骨架角蛋白5基因。 ，其係可增幅一 <400> 9 atttgggatt ggggtgggga ttctgttttg 30 <210> 10 <211〉 30 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之敘述：一 PCR引子序列 部份之明膠酶A基因。 ，其係可增幅一 <400> 10 ccaaagtctg aagagcgtga agtttggaag 30 <210> 11 <211> 30 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇X 297公釐) 1316959 A7 B7 五、發明説明（52 ) <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 人造序列之敘述：一 PCR引子序列 ，其係可增幅一 部份之明膠酶A基因。 <400> 11 catacttgtt gacatttccc atgggaatcg 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 人造序列之敘述：一PCR引子序列 ，其係可增幅一 部份之II型細胞骨架角蛋白7基因。 <400> 12 agttggaggc cgccattgcc gaggctgagg 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 人造序列之敘述：一PCR引子序列 ，其係可增幅一 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A7 B7 1316959 五、發明説明（53 ) 部份之II型細胞骨架角蛋白7基因。 <400> 13 tggaagctat tctgacatca ctttccagac 30 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

Claims (1)

13 1 17722號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(98年9月） A8 B8 C8 D8 9a to1?修王年月'補充

七、申請專利範園 1. 一種依據淋巴結轉移風險進行食道癌之分類方法’其特 徵為根據檢測樣品中基因之表現量分類食道癌’其係包 含下列步驟： (a) —測定基因表現量之步驟，其係就受檢測樣品， 測定由下述I群基因群所篩選出的至少1種基因之表現 量，及/或由下述II群基因群中選出的至少1種基因之表 現量；及 (b) 一進行食道癌分類之步驟，其係將步驟（a)所測定 基因之表現量，與對照組樣品中該基因之表現量做比 較，對該受檢測樣品進行食道癌之分類： I群 類跋島素生長因子結合蛋白質2 [insulin-like growth factor binding protein 2 (IGFBP2)、（基因庫註冊號碼： X16302)]基因、 BIGH3 (基因庫註冊號碼：M77349)基因、 類跋島素生長因子結合蛋白質6 [insulin-like growth factor binding protein 6 (IGFBP6)、（基因庫註冊號碼： M62402)]基因、 明膠酶A [gelatinase A (MMP-2)、（基因庫註冊號碼： M55593)]基因、 II型細胞骨架角蛋白 7 [type II cytoskeletal 7 keratin (cytokeratin 7 (K7 ; CK 7))、（基因庫註冊號碼：M13955)] 基因、 結締組織生成素I [desmoplakin I、（基因庫註冊號碼： 72627-980907.doc -1 - 本紙張尺度適用中歯國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1316959 b C8 D8____ 六、申請專利範園 M77830)]基因、 穀耽甘肽 S-轉移酶 A1 [glutathione S-transferase A1、 (基因庫註冊號碼·· Ml6594)]基因、 穀胱甘肽 S-轉移酶 Pi [glutathione S-transferase Pi (GSTP1)、（基因庫註冊號碼：U12472)]基因、 膠原酶-3 [collagenase-3 (MMP-3) ' (基因庫註冊號 碼：X75308)]基因、 II型細胞骨架角蛋白 5 [type II cytoskeletal 5 keratin (cytokeratin 5 (K5 ; CK 5))、（基因庫註冊號碼：M21389)] 基因、 P-粘連素[P-cadherin、（基因庫註冊號碼：X63629)]基 因、 I 型細胞骨架角蛋白 14 [type I cytoskeletal 14 keratin (cytokeratin 14 (K14 ; CK 14))、（基因庫註冊號碼： J00124)]基因、 II型細胞骨架角蛋白 6 [type II cytoskeletal 6 keratin (cytokeratin 6B (CK 6B))、（基因庫註冊號碼：[42610)] 基因、 母系離胺酸[matrilysin (MMP-7)、（基因庫註冊號碼：. X07819)]基因、 類叉狀頭7 [forkhead-like 7、（基因庫註冊號瑪： AF048693)]基因、 結締組織生長因子[connective tissue gr〇wth fact〇r (CTGF)、（基因庫註冊號碼：M92934)]基因、 72627-980907.doc _ 2 - 本叛*琅尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) ^- 1316959 b88 C8 D8 六、申請專利範園 成長赫爾蒙依賴性類胰島素成長因子結合蛋白質 [growth hormone-depen dent insulin-like growth factor-binding protein、（基因庫註冊號碼：M35878)]基因、 Rho 8蛋白質[Rho 8 protein、（基因庫註冊號碼： X95282)]基因、 II群 RBA/p48 (基因庫註冊號碼：X74262)基因、 細胞分裂控制蛋白質2同系物[cell division control protein 2 homolog、（EC 2.7.1-)(cdc2)、（基因庫註冊號 碼：X05360)]基因、 · 複製因子 C 38kDa次單元[replication factor C 38-kDa subunit (RFC38)、(基因庫註冊號碼：L07541)]基因、 細胞凋零素前驅物[apopain precursor、（基因庫註冊號 碼：U13737)]基因、 色素乾皮症C群修復互補蛋白質p58/HHR23B [xeroderma pigmen tosum group C repair complementing protein p58/HHR23B、（基因庫註冊號碼：D21090)]基因、 環狀素G2 [cyclin G2、（基因庫註冊號碼：U47414)]基 因、 環狀素A [cyclin A、（基因庫註冊號碼：X5 1688)]基 因、 細胞凋零相關蛋白質TFAR15 [apoptosis-related protein TFAR 15、（基因庫註冊號碼：AF022385)]基因、 TRKB酪胺酸激酶接受器[TRKB tyrosine kinase 72627-980907.doc .3. 本纸張尺度適用中國國家楼準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1316959 έ88 C8 D8 六、申請專利範圍 receptor、（基因庫註冊號碼：U12140)]基因、 訊號傳達轉錄活化因子Ι-α/召 [signal transducer and activator of transcription l-alpha/beta(STATl)、（基因庫 註冊號碼：M97935)]基因、 K-ras致癌基因[K-ras oncogene、（基因庫註冊號碼： M54968)]基因、 視網膜瘤感受性蛋白質[retinoblastoma susceptibility protein (RBI)、（基因庫註冊號碼：L41870)]基因、 BCL2/腺病毒E1B 19kD交互作用蛋白質1 (BNIP1) mRNA [BCL2/adenovirus E1B 19kD-interacting protein 1 (BNIP1) mRNA，complete cds、（基因庫註冊號碼： AF083957)]基因、 細胞调零蛋白質1抑制因子[inhibitor of apoptosis protein 1 (HIAP-1)、（基因庫註冊號碼：U45878)]基因。 2.根據申請專利範圍第1項之癌之分類方法，其中步驟（a) 中，測定至少5種基因之表現量。 3·根據申請專利範圍第1或2項之癌之分類方法，其中基因 之表現量，係根據自該基因所轉錄之mRNA量或自該基 因所轉譯之多肽量測定之。 4. 根據申請專利範圍第3項之癌之分類方法，其中mRNA量 係藉由雜交反應法或核酸增幅法測定之。 5. 根據申請專利範圍第4項之癌之分類方法，其中mRNA量 係藉由使用DNA微陣列之雜交反應法測定。 6. 根據申請專利範圍第3項之癌之分類方法，其中多肽量 72627-980907.doc 本紙張尺度適用中國國家檁竿(CNS) A4规格(210X297公釐) A BCD 1316959 々、申請專利範圍 係使用對該多肽或其片段特異性結合之抗體測定。 7. —種食道癌之檢測方法，其中由與癌分類之指標基因中 至少1種基因相對應的核酸或該基因所編碼之多肽之表 現，係以與對照組樣品作比較，其變動可作為前述受檢 測樣品中存在癌細胞之指標，其包含下列步驟： (1) 一基因表現量之測定步驟，其係測定由下述I群 基因群所篩選出的至少1種基因之表現量，及/或由下述 II群基因群中選出的至少1種基因之表現量；及 (2) 一食道癌之檢測步驟，其係將步驟（1)所測定基因 之表現量，與對照組樣品中該基因之表現量做比較，進 行食道癌之檢測： I群 類胰島素生長因子結合蛋白質2 [insulin-like growth factor binding protein 2 (IGFBP2)、（基因庫註冊號碼： X16302)]基因、 BIGH3 (基因庫註冊號瑪：M77349)基因、 類胰島素生長因子結合蛋白質6 [insulin-like .growth factor binding protein 6 (IGFBP6)、（基因庫註冊號碼： M62402)]基因、 明膠酶A [gelatinase A (MMP-2)、（基因庫註冊號碼： M55593)]基因、 II 型細胞骨架角蛋白 7 [type II cytoskeletal 7 keratin (cytokeratin 7 (K7 ; CK 7))、（基因庫註冊號碼：M13955)] 基因、 72627-980907.doc - 5 - 本纸張尺度適用中國國家棣準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1316959 έ88 C8 D8 ___ 六、申請專利範園 結締組織生成素I [desmoplakin I、（基因庫註冊號碼： M77830)]基因、 穀胱甘肽S-轉移酶A1 [glutathione S-transferase A1、 (基因庫註冊號碼：M16594)]基因、 榖胱甘肽 S-轉移酶 Pi [glutathione S-transferase Pi· (GSTP1)、（基因庫註冊號碼：U12472)]基因、 膠原酶-3 [collagenase-3 (MMP-3)、（基因庫註冊號 碼：X75308)]基因、 II 型細胞骨架角蛋白 5 [type II cytoskeletal 5 keratin (cytokeratin 5 (K5 ; CK 5))、（基因庫註冊號碼：M21389)] 基因、 P-枯連素[P-cadherin、（基因庫註冊號碼：X63629)]基 因、 I型細胞骨架角蛋白 14 [type I cytoskeletal 14 keratin (cytokeratin 14 (K14 ; CK 14))、（基因庫註冊號碼： J00124)]基因、 II型細胞骨架角蛋白6 [type II cytoskeletal 6 keratin (cytokeratin 6B (CK 6.B))、（基因庫註冊號碼： L42610)]基因、 母系離胺酸[matrilysin (MMP-7)、（基因庫註冊號瑪： X07819)]基因、 類叉狀頭7 [forkhead-like 7、（基因庫註冊號碼： AF048693)]基因、 結締組織生長因子[connective tissue growth· factor 72627-980907.doc -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1316959 έ88 C8 D8 六、申請專利範圍 (CTGF)、（基因庫註冊號碼：M92934)]基因、 成長赫爾蒙依賴性類胰島素成長因子結合蛋白質 [growth hormone-depen dent insulin-like growth factor-binding protein、（基因庫註冊號碼：M35878)]基因、 Rho 8蛋白質[Rho 8 protein、（基因庫註冊號瑪： X95282)]基因、 II群 RBA/p48 (基因庫註冊號碼：X74262)基因、 細胞分裂控制蛋白質2同系物[cell division control protein 2 homolog、（EC 2.7.l-)(cdc2)、（基因庫註冊號 碼：X05360)]基因、 複製因子 C 38kDa次單元.[replication factor C 38-kDa subunit (RFC38)' (基因庫註冊號碼：L07541)]基因、 細胞凋零素前驅物[apopain precursor、（基因庫註冊號 碼：U13737)]基因、 色素乾皮症C群修復互補蛋白質p58/HHR23B [xeroderma pigmen tosum group C repair complementing protein p5 8/HHR23B、（基因庫註冊號碼：D21090)]基因、 環狀素G2 [cyclin G2、（基因庫註冊號碼：U47414)]基 因、 環狀素A [cyclin A、（基因庫註冊號碼：X51688)]基 因、 細胞凋零相關蛋白質TFAR15 [apoptosis-related protein TFAR 15、（基因庫註冊號碼：AF022385)]基因、 72627-980907.doc _ 7 _ 本紙張尺度逋用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐〉 1316959 C8 D8 六、申請專利範圍 TRKB酪胺酸激酶接受器[TRKB tyrosine kinase receptor、（基因庫註冊號碼：U12140)]基因、 訊號傳達轉錄活化因子Ι-α/yS [signal transducer and activator of transcription l-alpha/beta(STATl)、（基因庫 註冊號碼：M97935)]基因、 K-ras致癌基因[K-ras oncogene、（基因庫註冊號瑪： M54968)]基因、 視網膜瘤感受性蛋白質[retinoblastoma susceptibility protein (RB1)、（基因庫註冊號碼：L41870)]基因、 BCL2/腺病毒E1B 19kD交互作用蛋白質1 (BNIP1) mRNA [BCL2/adenovirus E1B 19kD-interacting protein 1 (BNIP1) mRNA, complete cds、（基因庫往冊號瑪 AF083957)]基因、 細胞凋零蛋白質1抑制因子[inhibitor of apoptosis protein 1 (HIAP-1)、（基因庫註冊號碼：U45878)]基因。 8. 根據申請專利範圍第7項之癌之檢測方法，其中步驟（1) 中，係測定至少5種基因之表現量。 9. 根據申請專利範圍第7或8項之癌之檢測方法，其中基因 之表現量，係根據該基因所轉錄之mRNA量或該基因所 轉譯之多肽量測定之。 10. 根據申請專利範圍第9項之癌之檢測方法，其中mRNA量 係藉由雜交反應法或核酸增幅法測定之。 11. 根據申請專利範圍第1〇項之癌之檢測方法，其中mRNA 量傣藉由使用DNA微陣列之雜交反應法測定之。 72627-980907.doc ,8. 本纸張尺度適用中國國家槺準(CNS) A4規格(210X297公釐） 9 5 9 6 1X 3 8 8 8 8 ABCD 、申請專利範園 12.根據申請專利範圍第9項之癌之檢測方法，其中多肽量 係使用對該多肽或其片段具特異性結合之抗體測定之。 72627-980907.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)