JP2007512801A - 結腸直腸癌用のバイオマーカーパネル - Google Patents

Abstract

バイオマーカーのパネルが、結腸直腸癌の分析のために同定された。当該パネル（マウスの結腸癌モデルを使用して最初に同定された）を使用して、正常ヒト対象のバイオマーカーのパネルに対する外科的及び生検試料由来のヒト組織における変化を評価した。当該パネルは結腸直腸癌のリスクアセスメント、早期診断、予後の確立、患者治療の監視、再発の検出及び治療的介入の発見のための対費用効果が高く、迅速かつ非侵襲性の手順を提供するために使用されるだろう。
【選択図】 図４Ａ

Description

発明の詳細な説明

関連出願のリファレンス
本出願は、Nancy M. Lee等により2003年7月18日に出願された「結腸直腸癌判定用の分子マーカーパネル」の名称を有する米国仮出願第60/488,660号（代理人整理番号：CPMC-01000US0）及びNancy M. Lee等により2003年10月22日に出願された「結腸直腸癌用のバイオマーカーパネル」の名称を有する米国出願第10/690,880号（代理人整理番号：CPMC-01000US1）の優先権を主張する。何れの出願の内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。

背景
本明細書の開示の技術分野は、結腸直腸癌（colorectal cancer）（ＣＲＣ）用のバイオマーカーに関する。これらのバイオマーカーは、ＣＲＣのリスクアセスメント、早期検出、予後の確立、介入の評価、再発並びに治療的介入の発見及びその使用方法に有用である。

医学分野では、ＣＲＣのリスクアセスメント及び早期検出を提供する臨床手順が長い間求められてきている。現在、ＣＲＣは西洋世界における癌関連死の原因の第２位である。数十年にわたるＣＲＣ研究により明確に明らかになった一つの事実は、生存率を高めるためには早期検出が重要であるということである。

ＣＲＣのスクリーニングについて現在認められている方法には、便潜血検査（ＦＯＢＴ）、バリウム注腸と空気との間のＸ線二重造影（ＤＣＢＥ）、Ｓ字結腸鏡検査及び結腸鏡検査である。Ｓ字結腸鏡検査は、照明付の可とう性内視鏡を用いて結腸の下部３分の１を視覚的に検査する侵襲性手順である。一方、関連する方法である結腸鏡検査は、結腸全体を検査する手順である。いずれの場合も、手順の間に生検試料を採取することができる。

認められているスクリーニング法に関し、ＣＲＣのスクリーニング検査において要求されるものを明確に有する方法はない。ＦＯＢＴは、迅速ではあるけれども、非常に概略的（general）であるので、非常に非特異的なＣＲＣスクリーニング法である。ＤＣＢＥは、結腸における異常の特異的画像化において有用であることが証明されているけれども、ＤＣＢＥ法は下記の欠点がある。１）検査の準備及び検査の間における患者の不快感が、スクリーニング法としてＤＣＢＥを応諾することに対する嫌気を作り出すこと。２）患者をＸ線照射に曝露することが、スクリーニング法としての頻回使用の点からみてＤＣＢＥを制限すること。３）ＤＣＢＥは大きな腫瘍の検出により効果的であることを示す研究があるが、これは、早期検出のためのＤＣＢＥの使用を禁止していること。４）ＤＣＢＥ手順の間に生検試料を採取することができないこと。５）必要な費用を原因として、全ての保険業者がＤＣＢＥスクリーニング検査に対する支払いを提供するとは限らないこと。Ｓ字結腸鏡検査は多数の医師からの支持を得ているが、下記の欠点がある。１）検査の準備及び検査の間における患者の不快感が、スクリーニング法としてＳ字結腸鏡検査を応諾することに対する嫌気を作り出すこと。２）必要な費用を原因として、全ての保険業者がＳ字結腸鏡スクリーニング検査に対する支払いを提供するとは限らないこと。３）結腸の下部３分の１のみを検査するため、多くの有意な病変が結腸の近位端に存在するとする研究による示唆が、Ｓ字結腸鏡検査を不適切なものとすること。結腸鏡検査は、結腸の完全な検査という問題を取り扱うけれども、スクリーニング法として下記の欠点がある。１）結腸鏡検査は、Ｓ字結腸鏡検査よりも強い患者の不快感を作り出すので、一般的に鎮痛剤を必要とする。これにより、患者の応諾に関する問題が悪化すること。２）必要な費用を原因として、全ての保険業者が結腸鏡スクリーニング検査に対する支払いを提供するとは限らないこと。３）出血及び結腸内層の破裂を含む結腸鏡検査のリスクが存在すること。

新興の分光技術、例えば磁気共鳴映像法及びトモグラフィー映像法は、それぞれ、現在認められているスクリーニング方法論の欠点のリストから引き出される欠点を有する。

したがって、費用効率が高く、迅速であり、かつ、最小の侵襲性又は非侵襲性である、ＣＲＣの早期検出及び治療において価値を有するアプローチに対する必要性が当該技術分野に存在する。更なる有用性は、ＣＲＣの予後の確立、患者の治療の監視及び再発の検出並びに治療的介入の発見の基礎としても役立つアプローチから理解されるだろう。

詳細な説明
現在認められているＣＲＣスクリーニング法は別として、求められている別のアプローチは、ＣＲＣの検出及び治療において価値のあるバイオマーカーの探索であった。４０年を超える期間、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の発見以来、癌の検出及び治療用バイオマーカーの探索は全般的に進展状態であった。癌のバイオマーカーは、患者の治療管理において５つの強力な用途を有する。理想としては、バイオマーカーは、リスク管理、早期診断、予後の確立、治療の監視及び再発の検出に使用されるだろう。更に、そのようなバイオマーカーは治療的介入の開発において大切な役割を果たすことができるだろう。

バイオマーカー分析に連動して用いられるサンプリング法が最小限の侵襲性又は非侵襲性であることは更に有利である。そのようなサンプリング法の例には、血清、便、スワブ（swab）等が含まれる。非侵襲性又は最小限の侵襲性の方法は、患者の応諾を増加させ、かつ、一般的には費用を低減させる。

臨床上、バイオマーカーの有効性を評価するために重要な２つの基準は選択性と感受性である。臨床的に定義されるバイオマーカーの選択性とは、正確に診断される患者の百分率をいう。臨床的状況におけるバイオマーカーの感受性は、疾患が治癒可能な段階で検出される確率（probability）として定義される。理想的には、バイオマーカーは１００％の臨床的選択性及び１００％の臨床的感受性を有するだろう。今まで、患者の治療管理における広範囲のニーズに対して有効であるために要求される、満足のいく高い選択性及び感受性を有する単一のバイオマーカーは同定されていなかった。しかしながら、臨床的見地から、単一の血清バイオマーカー（例えばＡＦＰ及びＣＥＡ）は、患者の治療管理の幾つかの側面において価値を提供することが証明されている。

例えば、１９６５年に、ＣＥＡの上昇した血清レベルが結腸腺癌患者において最初に発見された。上昇したレベルは、結腸癌以外の種々の良性及び悪性状態において見出すことができる。更に、結腸における初期の限局腫瘍によるＣＥＡの産生は正常範囲である。したがって、ＣＥＡは、リスクアセスメント又は早期診断に対して価値があるために要求される感受性及び選択性の双方に欠いている。更に、上昇したＣＥＡレベルは結腸腫瘍の分化及びステージとの相関が不十分であり、このことが結腸癌の予後に対するバイオマーカーとしてのＣＥＡを限られた価値を有するものにしている。ＣＥＡが患者の治療管理において臨床的に有益であるとことが証明されている２つの領域は、治療効果の評価と再発の検出である。実例として、結腸癌再発の臨床的検出に先行するＣＥＡの血清レベルの上昇に高い相関関係があることを多数の研究が見出している。このことは、セカンドルック手術を伴うハイリスク患者の治療をＣＥＡレベルの上昇に基づいて管理することにおいて価値があることを証明している。

現在、多くの分野（ＣＲＣ、卵巣、乳房、頭頸部を含む）の腫瘍学研究にわたる研究報告は、マーカーのパネルにおける上昇した感受性及び選択性を見出している。現在では、癌等の病気を引き起こす正常細胞プロセスの変化が起こる前に多数の突然変異が起こらなければならないと一般的に考えられている。それにもかかわらず、生物系の複雑性を鑑みて、ＣＲＣ対する患者の治療管理において価値を提供するのに役立つパネルの発見は初期の段階にある。

今までに、腺腫性結腸ポリープ症（adenomous polyposis coli）（ＡＰＣ）、ｐ５３及びKi-ras遺伝子並びに対応のタンパク質並びにそれらの調節に関与する関連経路についての研究を通して、ＣＲＣの生物学に対する大きな理解が得られている。しかしながら、特定の遺伝子、その発現、タンパク質産物及び調節についての研究と、ＣＲＣ患者の治療管理に有用なＣＲＣ分析に使用するパネルに含まれることが重要なのはどの遺伝子なのかということについての理解とは明らかに異なる。今までに、ＣＲＣに対して提案されてきたパネルは、ＡＰＣ、ｐ５３及びKi-ras並びにマイクロサテライトの不安定マーカーである遺伝子であるBAT-26の特定の点変異から成っている。

本明細書で開示されるものは、遺伝子の発現レベルが腺腫性ポリープ（adenomous polyp）においてスクリーニングされたマウスの多発性腸腫瘍形成（multiple intestinal neoplasia）（ＭＩＮ）モデルに対して行われた研究に基づいている。マウスＭＩＮ被検体において、化学的に誘導されたＡＰＣ遺伝子の変異がもたらされた。正常な対照は、ＡＰＣ遺伝子の異常がなく、それゆえ野生型と命名される同腹仔により定義される。マウスＭＩＮモデルに基づく研究より、ヒト被験者を研究するための候補遺伝子が選択された。ヒト被験者の研究より、バイオマーカーのパネルが本明細書において開示される。更に、開示されるものは、前記パネルに基づいて遺伝子及びタンパク質の発現レベルを測定する方法である。更に、開示されるものの別の側面は、前記パネルに基づいて遺伝子及びタンパク質の発現レベルを測定するための試薬及び使用説明書（instruction）を提供するキットである。前記のパネル、方法及びキットは、ＣＲＣに対する患者治療の管理において有用である。更に、前記のパネル、方法及びキットは、ＣＲＣの治療的介入の発見に対する基礎として有用であると考えられる。

図１は、開示されるバイオマーカーに対する配列表の概要を与える表である。開示されるバイオマーカーの組合せは、増強した選択性及び感受性をもってＣＲＣを監視し、それゆえＣＲＣに対する患者治療の増強された管理を提供するための基礎を形成する。配列表に記載されるバイオマーカーの断片（fragment）及び変種（variant）もＣＲＣ分析に用いるパネルにおいて有用なバイオマーカーであることは理解されるべきである。断片とは、配列表に記載のポリヌクレオチド又はポリペプチドのあらゆる不完全な部分又は分離された部分をいう。遺伝子変種、特に激しい研究が行われている遺伝子、例えば癌等の疾患関連遺伝子についての新たな発見がほぼ毎日発表されていることが認識される。それゆえ、提供される配列表は、遺伝子について現在報告されているものの例示であり、前記遺伝子の変種及び断片も分析方法論の目的で含まれることが認められる。

開示されるものの一つの態様は、ＣＲＣに対する患者治療管理に要求される選択性及び感受性を有するバイオマーカーのパネルである。表１において、エントリー１〜２２は、バイオマーカーパネルに対するポリヌクレオチドコード配列であり、遺伝子の名称及び略称を含んでいる。表１のエントリー２３〜４４は、エントリー１〜２２のコード配列に対応するタンパク質、ポリペプチド及びアミノ酸配列である。米国立衛生研究所（ＮＩＨ）により定義されるバイオマーカーは、特定の生物学的特性、生化学的特徴又は病気の進行又は治療効果の測定に用いることが出来る一面（facet）に対する分子標識である。バイオマーカーパネルはバイオマーカーの選択物（selection of biomarkers）である。バイオマーカーは種々のクラスの分子に由来してよい。前述の通り、患者治療管理の全ての側面に対して有効であるために要求される選択性及び感受性を有するＣＲＣ用バイオマーカーに対するニーズは未だに存在する。それゆえ、バイオマーカーの有効なセットを選択することは、ＣＲＣの有効な判定に対する基礎を提供する点で差別化される。

本明細書の開示の別の態様では、配列番号１〜２２に示されるバイオマーカーに対するポリヌクレオチドの発現レベルをＣＲＣの判定において使用する。ポリヌクレオチド発現レベルの分析は、当該技術分野においてしばしば遺伝子発現プロファイリング（gene expression profiling）と呼ばれる。遺伝子発現プロファイリングでは、試料中のｍＲＮＡレベルを生物学的状態の先行指標（本件ではＣＲＣの指標）として測定する。遺伝子発現プロファイリングの最も一般的な分析方法は、逆転写として知られる工程を使用して生物試料中のｍＲＮＡから複数のコピーを作成することである。逆転写工程では、試料由来のｍＲＮＡを使用して当該ｍＲＮＡがもともと転写された対応ＤＮＡ配列のコピーを作成する。逆転写増幅工程において、ＤＮＡのコピーは、イントロンとして知られる遺伝子の調節領域なしに作成される。ｍＲＮＡから作成されたこれらの複数のコピーは、それゆえコピーＤＮＡ（copy DNA）又はｃＤＮＡと呼ばれる。エントリー４５〜８８は、エントリー１〜２２に列挙される各遺伝子の逆転写工程において使用するプライマーのセットである。

逆転写手順は、試料中のｍＲＮＡの元々のレベルに比例してｃＤＮＡのコピーを増幅するので、生物試料中に存在する低レベルのｍＲＮＡの分析を許容する標準的方法になる。遺伝子が特定の生物状態において上方制御又は下方制御されると、これに従ってｍＲＮＡレベルが変化する。

本明細書の開示の更に別の態様では、配列番号１〜２２に示される遺伝子に対応する配列番号２３〜２４に列挙されるタンパク質の発現レベルが開示される。用語「ポリペプチド（polypeptide or polypeptides）」は、本明細書のおいて用語「タンパク質（protein or proteins）」と互換的に用いられる。前に検討したように、タンパク質はそのバイオマーカーとしての可能性に関して長期間研究がなされ、限られた成功を得ている。ポリヌクレオチドバイオマーカーと相補的であるので、タンパク質バイオマーカーには価値がある。両タイプのバイオマーカーにより提供される情報を有する理由には、ｍＲＮＡ発現レベルはタンパク質発現レベルの良好な予測判断材料（predictor）ではないという現在の知見、及び、ｍＲＮＡ発現レベルはタンパク質の翻訳後修飾（当該タンパク質の生物活性の鍵となる）について何も語らないという現在の知見が含まれる。それゆえ、タンパク質の発現レベル及び当該タンパク質の完全な構造を理解するためには、タンパク質の直接分析が要求される。

図２Ａ〜２Ｂは、マウスＭＩＮモデル及びヒト被験者において遺伝子発現を比較する２２個のバイオマーカーのリストに由来するバイオマーカーパネルの例示を示している。パネル用の選択物は、２２個のバイオマーカーのリストから選択され、かつ、パネルの有用性を証明するためのデータの容易な視覚的融合（easy visual assimilation of data）のために選択される。典型的には、図２Ｃに証明されるように、バイオマーカーの２２のメンバーパネルにおいて示される複雑なデータセットに対して、多変量解析（MANOVA）が適用される。

図２Ａにおいて、マウスＭＩＮ研究について報告されたデータは、動物被検体数の統計的平均化（statistical averaging）を表しており、標準誤差が報告される。右側のＰ値は、値が有意に異なるという信頼度（the degree of conficence）を示している。一例として、最初に列挙した遺伝子であるＳＤＦ−１はヒトＩＬ−８遺伝子に関連しており、同一のスーパーファミリーに属する。ＳＤＦ−１についての０．００３というｐ値は、野生型対照の値とＭＩＮマウスの腺腫性ポリープの値との差異が偶然のみによって起こる確率がわずか１０００分の３であることを示している。被験マウスの腺腫性ポリープにおける発現レベルのスクリーニングを特定の標的とした。なぜなら、腺腫性ポリープはＣＲＣのリスクアセスメントにおいて有用であることが確立されているからである。図２Ａで証明されることは、６のパネルが、ＭＩＮマウスの結果を野生型対照の結果から明確に区別するということである。

図２Ｂ〜２Ｃはバイオマーカーパネルについての選択性の問題を扱っている。ＣＲＣに対して許容しうるレベルの選択性を有するバイオマーカーに関し、ＣＲＣの病歴がある家族における個人に対するＣＲＣ罹患率は一般集団の罹患率の３〜４倍である。しかしながら、全米国人の６％がＣＲＣを発症し、かつ、その７０〜８０％が平均的リスクを有する人に現れていると推定されている。ＣＲＣの判定における信頼に対して要求される必須の選択性を有するバイオマーカーに対する明らかなニーズが存在する。

図２Ｂでは、図２ＡのマウスＭＩＮモデルで確立された６つのバイオマーカーからなる同一パネルが、ヒト被験者におけるＣＲＣ判定の基礎となる。図２Ｂでは、ＣＲＣを有することが知られている患者から採取されかつ組織学的評価により正常であると判定された生検組織の結果を、正常対照として確証された個体由来の生検試料と比較している。組織学的方法論は癌性結腸病変の同定に対して許容された標準であるあることに注意すべきである。図２Ｂには、更に検討すべき２つの側面がある。第一に、患者対正常対照（the patient vs. normal control）についての遺伝子発現プロファイリングの値は、ＩＬ−８の場合のように上昇するか、又はＰＰＡＲ−δの場合のように下降するだろう。それはバイオマーカーパネルを使用したときに有意である、患者対正常対照についての集団的シフトの判定である。第二に、患者のデータを見たときに、試料対試料の変動に注目できるが、これは、全ての患者対患者の変数を前提として、予測される。たとえ何らかの特定のバイオマーカーが、それ自体で患者試料を正常対照から区別しないとしても、群としてのパネルの発現レベルは、患者試料全体を正常対照群から区別することは一見して明らかである。例えば、Ｈ００８と命名した患者は、正常対照とは区別されないＰＰＡＲ−δ発現レベルを有する。しかしながら、Ｈ００８に対するパネルの結果は正常対照のセットから区別されることは一見して明らかである。このことは、生物学の複雑性及び可変性を前提として、マーカーの確証されたパネルがなぜ判定の選択性を単一マーカーと対比して増強するかということを原則として証明している。

図２Ｃは患者対正常試料間の判定の選択性増強におけるバイオマーカーパネルの価値を強調するのに更に役立っている。２２からなる群より選択された９のバイオマーカーからなるパネルについてのＭＡＮＯＶＡの使用を証明する例が、図２Ｃにおいて証明される。本研究では、１２名の正常患者に由来する７８のＳ字結腸−直腸生検と、Ｓ字結腸−直腸癌を有する６名の患者の非癌性部分に由来する６３のＳ字結腸−直腸生検とを比較した。ウィルクスのラムダ基準を使用し、列挙した９つのバイオマーカーを用いて、患者試料と正常対照試料との間の差を評価した。１．０に近いラムダ値は、患者試料と正常試料との間に有意差が示されている（その差が偶然のみによって起こる確率が約１０００回中９回）ことを表している。

図３Ａ〜３Ｃ及び図４Ａ〜４Ｃは、バイオマーカーパネルについての感受性の問題を扱っている。前述したように、ＣＲＣの早期の表示によって生存率は非常に増強されるので、ＣＲＣのリスクアセスメント及び早期検出のためのバイオマーカーは長い間求められてきた。リスクアセスメントと早期検出との間の差異は、ＣＲＣ捕捉に関する確実性の程度である。リスクアセスメントに用いられるバイオマーカーは時間間隔の範囲内で１００％未満の確実性を与えるが、早期検出に用いられるバイオマーカーは特定の時間間隔の範囲内で疾患発症についてほぼ１００％の確実性を与える。リスクファクターを、癌と診断されていない個体に対する代替エンドポイントとして使用してもよい（但し、代替エンドポイントと最終的な結果との間の関連性が確立されることを条件とする）。確立されたＣＲＣの代替エンドポイントの例は、腺腫性ポリープの例である。確立されたのは、個体がＣＲＣを後期に発症することについて腫瘍性ポリープの発生は必要条件であるが十分条件ではないということである。このことは、全ての侵襲前癌病変の９０％が腺腫性ポリープ又は前駆体であるが、腺腫性ポリープを有する患者の全てがＣＲＣの後期発症へ進行するわけではないという事実により証明されている。

図３Ａ〜３Ｃは、ＣＲＣと診断された典型的な一患者の結腸から採取した複数の生検試料について取得した遺伝子発現レベルのグラフを示している。癌病変、ポリープ及び隣接組織の判定は通常の組織学的方法により行った。３つのバイオマーカーパネルに対する発現レベルが、前記の様式で分類された生検試料について示される。更に、図２Ａ〜２Ｃの例によって証明したように、マーカー単独（ＣＸＣＲ２）ではこの患者について癌病変と正常対照とを区別していないが、サンプリングされた癌病変に対して一纏めとした（taken together）３つのマーカーは、正常対照とは有意に異なっていることは明らかである。この表示で更に示されることは、ポリープの結果と正常対照の結果との間の差異である。ポリープがＣＲＣの代替エンドポイントとして既に認められていることを鑑みると、最小限に侵襲性の方法、例えばスワブ又は非侵襲性のサンプリング法、例えば便試料を用いる確証された分析方法論によってポリープの存在を判定することも、リスクアセスメントに対する代替エンドポイントとして役立つだろう。

図４Ａ〜４Ｃは、ＣＲＣ患者の結腸の５３ｃｍ領域にわたって採取した生検試料における３つのバイオマーカーについての遺伝子発現レベルの結果を示している。不規則な形状の物体は、組織学的方法論により癌病変であると確認された生検試料を表し、卵形の物体は、組織学的方法論により非癌病変であると判定された試料を表している。更に、遺伝子発現プロファイリングを各生検試料について行った。発現プロファイリングの結果（凡例は、患者生検試料における正常対照と比較しての相対レベルを表す）が図４Ａ〜４Ｃに示される。

図４Ａ〜４Ｃの表示は、バイオマーカーが患者の（生検試料は通常の組織学的分析により正常であると示される）結腸組織における差異を識別することができる距離を示している。これらの結果は、癌病変からは遠いが非正常結腸状態を示すことができる領域から、最小限の非侵襲性の塗布収集法（swabbing collection method）により細胞をサンプリングすることができることを証明している。更に、便試料の収集は、判定を行う脱落細胞（sloughed cells）又は細胞残屑を収集するための既に確証されたサンプリング法である。その点で、最小限の侵襲性で又は非侵襲性のいずれかにより採取した試料は、本明細書に開示されるバイオマーカーパネルを使用して分析することができる試料を与えるだろう。そのような非侵襲性手順はＣＲＣ判定の費用を低減するだけでなく、現在の方法論に関連する不快感及び危険性をも低減する。これらの因子は一緒になって定期的検査の魅力を増加させ、故に患者の応諾を増加させる。増加した患者の応諾は、ＣＲＣの有効な判定と結びついて早期検出の期待を高め、そして生存率を高める。

分子マーカーパネルに対するポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現プロファイリングのための方法及びキットも、本明細書の開示の一部として企図される。

一つの態様において、遺伝子発現プロファイリング方法は、特許請求されるパネルにおいて選択されたバイオマーカーのｃＤＮＡレベルを測定する工程を含む。そのような方法は、プライマー、酵素並びにｃＤＮＡを調製、検出及び定量するためのその他の試薬の使用を必要とする。試料中でｍＲＮＡからｃＤＮＡを作成する方法は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）と呼ばれている。配列番号４５〜８８に列挙されるプライマーは、特許請求されるパネルに基づくＲＴ−ＰＣＲを使用した遺伝子発現プロファイリングにおける使用に特に適している。一連のプライマーは、Primer Express Software（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて設計された。特定の候補を選択し試験をして、唯一のｃＤＮＡが増幅されるが、ゲノムＤＮＡは混入しないことを検証した。このようにして、配列番号４５〜８８に列挙されるプライマーを特異的に設計し、選択し、そして試験した。プライマーに加えて、全４種類のジヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を有するジヌクレオチド三リン酸混合物を含むもの、逆転写酵素を有するもの、及び、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを有するもの等の試薬がＲＴ−ＰＣＲに要求される。更に、緩衝液、阻害剤及び活性化剤もＲＴ−ＰＣＲ工程に要求される。一旦、ｃＤＮＡが特定のエンドポイントまで十分に増幅されると、ｃＤＮＡ試料を検出及び定量のために準備しなければならない。多数の検出スキームが企図されるけれども、下記にて詳細に検討するように、ポリヌクレオチド検出を企図する一つの方法は蛍光分光法であり、それゆえ、蛍光分光法に適した発色団がポリヌクレオチドの標識のために望ましい。多数の関連発色団が存在しており、当該技術分野で知られているけれども、そのような蛍光標識の一例はSYBR Greenである。

別の態様において、タンパク質発現プロファイリング法は、生物試料から標的ポリペプチドのレベルを測定するために特許請求されるバイオマーカーパネルに基づいて抗体を使用する工程を含んでいる。前記方法について企図される一つの態様において、パネル用の抗体は固体担体へと結合される。タンパク質発現プロファイリング法は、結合ポリペプチドのある部分に対して特異性を有する第二の抗体を使用してもよい。そのような第二の抗体は、結合ポリペプチドの検出及びに対して有用であり、それゆえ、ポリペプチドへの結合において当該ポリペプチドを検出及び定量するために標識する分子で標識されていてもよい。更に、検出及び定量のために結合ポリペプチドを標識するためのその他の試薬が企図される。そのような試薬は、結合ポリペプチドを直接標識してもよく、又は、第二抗体に類似する、標識を有する結合ポリペプチドに対して特異性を有する部分であってもよい。前記の部分の例には、小分子（例えば補因子、基質、錯化剤）及び巨大分子（例えばレクチン、ペプチド、オリゴヌクレオチド）等が含まれるが、これらに限定されるものではない。前記の分子は天然物又は合成物であってよい。

開示される方法について企図される検出様式の例には、分光技術（例えば蛍光分光法、UV-Vis分光法）、シンチレーション計数及び質量分析が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの検出様式に対して相補的な、これらの方法で使用する検出及び定量を目的とする標識の例には、発色団標識、シンチレーション標識及び質量標識（mass label）が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの方法を用いて測定されるポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現レベルは、標的となる判定を目的として確立された対照に対して正規化（normalize）される。これらの方法は、ＣＲＣ患者治療の効果的な管理の基礎としての判定を提供するうえで有用であると考えられる。これらの方法は、ＣＲＣの治療的介入の発見においても有用であろう。更に、Ｓ字結腸鏡検査、結腸鏡検査又は手術に由来する生検試料がこれらの方法によって分析されるだけでなく、非侵襲性又は最小限の侵襲性の採取方法に由来する生検試料もこれらの方法に対して同様に示される。

更に、前記方法の実行の準備を促進してこれにより一貫性及び品質管理を提供する試薬並びに手順を有するキットを提供することが、開示されるものにおいて企図される。

一つの態様において、遺伝子発現プロファイリング用キットは、特許請求されるパネルの遺伝子発現プロファイリングに必要な試薬及び使用説明書（instruction）を含んでいる。したがって、例えば、前記試薬はプライマー、酵素、並びに、特許請求されるバイオマーカーパネル用ｃＤＮＡの調製、検出及び定量のためのその他の試薬を含むだろう。前述の通り、試料中でｍＲＮＡからｃＤＮＡを作成する方法は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）と呼ばれている。配列番号４５〜８８に列挙したプライマーは、特許請求されるパネルに基づくＲＴ−ＰＣＲを用いた遺伝子発現プロファイリングにおける使用に特に適している。したがって、配列番号４５〜８８に列挙されるプライマーを特異的に設計し、選択し、そして試験した。プライマーに加えて、全４種類のジヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を有するジヌクレオチド三リン酸混合物を含むもの、逆転写酵素を有するもの、及び、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを有するもの等の試薬がＲＴ−ＰＣＲに要求される。更に、ＲＴ−ＰＣＲに用いられる緩衝液、阻害剤及び活性化剤もキットの態様において含まれる適切な試薬である。一旦、ｃＤＮＡが特定のエンドポイントまで十分に増幅されると、ｃＤＮＡ試料を検出及び定量のために準備しなければならない。ポリヌクレオチド検出を企図する一つの方法は蛍光分光法であり、それゆえ、蛍光分光法に適した発色団がポリヌクレオチドの標識のために望ましく、キットの態様の試薬において含まれるだろう。遺伝子発現プロファイリング用のキットの態様に含まれる使用説明書は、好ましくは下記の手順を使用者に教示する：生物試料を得る工程、当該試料から細胞ＲＮＡを単離する工程、パネルの各バイオマーカーについて当該試料からｃＤＮＡのコピーを増幅する工程（当該パネルには試薬が提供される）、及び、試料より増幅したｃＤＮＡのレベルを定量する工程。種々の手順により得られる組織試料を使用してよいが、生物試料を得るための使用説明書が好ましくは存在し、これにより使用者は結腸直腸細胞試料を最小限の侵襲性の様式（例えばスワブの使用又は便試料の収集）で得る。好ましくは、使用説明書は、定量されたｃＤＮＡレベルを対照に対して比較する工程を含んでいる。

別の態様において、タンパク質発現プロファイリング用キットは、特許請求されるパネルのタンパク質発現プロファイリングに必要な試薬及び使用説明書を含んでいる。したがって、本態様において、タンパク質発現プロファイリング用キットは、生物試料から標的ポリペプチドレベルを測定するための特許請求されるバイオマーカーパネルに基づく抗体パネルを供給することを含んでいる。前記のパネルに対して企図される一つの態様には、固体担体へ結合した抗体パネルが含まれる。更に、タンパク質発現プロファイリング用キットに含まれる試薬は、結合ポリペプチドのある部分に対して特異性を有する第二の抗体を使用してもよい。そのような第二の抗体は、結合ポリペプチドの検出及び定量に対して有用であり、それゆえ、ポリペプチドへの結合において当該ポリペプチドを検出及び定量するために標識する分子で標識されていてもよい。更に、検出及び定量のために結合ポリペプチドを標識するためのその他の試薬が企図される。そのような試薬は、結合ポリペプチドを直接標識してもよく、又は、第二抗体に類似する、標識を有する結合ポリペプチドに対して特異性を有する部分であってもよい。前記の部分の例には、小分子（例えば補因子、基質、錯化剤）及び巨大分子（例えばレクチン、ペプチド、オリゴヌクレオチド）等が含まれるが、これらに限定されるものではない。前記の分子は天然物又は合成物であってよい。タンパク質発現プロファイリングキット用の使用説明書は、好ましくは下記の手順を使用者に教示する：生物試料を得る工程、キットにより供給された抗体パネルを、パネル中の各バイオマーカーについて使用して、当該試料からポリペプチドを結合させる工程、及び、当該試料から抗体パネルへと結合したポリペプチドのレベルを定量する工程。好ましくはキットの使用説明書は、ポリペプチドレベルを対照に対して比較する工程を含んでいる。好ましくは、生物試料は、最小限の侵襲性の手順（例えばスワブの使用から便試料経由）により得る。

更に、試料の収集、調製及び分析に必要な消耗実験器具をキットとともに提供してもよい。

本明細書で開示されるものは、例証及び説明を目的として提供されている。網羅的であること、又は、開示されるものを記載されている詳細な形態へと限定することは意図されない。多くの修飾及び変異が当業者にとって明らかであろう。記載された技術の開示された態様の原理及び実用化を最良に説明し、これによって当業者が企図される特定の使用に適した種々の態様及び種々の修飾を理解することを可能にするために、開示されるものは選択されかつ記載されている。記載されるもののの範囲は、後述の特許請求の範囲及びその均等物によって定義されることが意図される。

図１は、配列表の要約である。 図２Ａ〜２Ｃは、腺腫性ポリープと疑わしい組織と正常対照とから採取した試料についてのバイオマーカーパネルを例証するデータである。図２Ａ〜２Ｂは、配列表に列挙した２２のバイオマーカーからなるセットのメンバーの選択物に関してマウスについて行ったモデル研究の結果（２Ａ）と、ヒト被験者に対するバイオマーカーの同等の選択物（２Ｂ）とを比較する表である。 図２Ａ〜２Ｂは、配列表に列挙した２２のバイオマーカーからなるセットのメンバーの選択物に関してマウスについて行ったモデル研究の結果（２Ａ）と、ヒト被験者に対するバイオマーカーの同等の選択物（２Ｂ）とを比較する表である。図２Ｃは、１２の正常患者から採取した７８の生検材料及び６のＣＲＣ患者から採取した６３の生検材料についての９つのマーカーの多変量解析を示している。 図２Ｃは、１２の正常患者から採取した７８の生検材料及び６のＣＲＣ患者から採取した６３の生検材料についての９つのマーカーの多変量解析を示している。 図３Ｂ〜３Ｃは、ヒト被験者から採取した一連の試料に対する代表的なバイオマーカーであるＩＬ−８（３Ａ）、ＣＸＣＲ−２（３Ｂ）及びＣＯＸ−２（３Ｃ）の発現レベルを、組織学的に同定された癌病変と、ポリープと、隣接非癌組織と、正常対照とで比較して示している。 図３Ｂ〜３Ｃは、ヒト被験者から採取した一連の試料に対する代表的なバイオマーカーであるＩＬ−８（３Ａ）、ＣＸＣＲ−２（３Ｂ）及びＣＯＸ−２（３Ｃ）の発現レベルを、組織学的に同定された癌病変と、ポリープと、隣接非癌組織と、正常対照とで比較して示している。 図３Ｂ〜３Ｃは、ヒト被験者から採取した一連の試料に対する代表的なバイオマーカーであるＩＬ−８（３Ａ）、ＣＸＣＲ−２（３Ｂ）及びＣＯＸ−２（３Ｃ）の発現レベルを、組織学的に同定された癌病変と、ポリープと、隣接非癌組織と、正常対照とで比較して示している。 図４Ａ〜４Ｃは、ＣＲＣ患者について結腸の５３ｃｍの距離にわたる複合分析の結果を示している。４ＡはＩＬ−８の発現レベルを示し、４ＢはＣＯＸ−２の発現レベルを示し、４ＣはＣＸＣＲ−２の発現レベルを示している。 図４Ａ〜４Ｃは、ＣＲＣ患者について結腸の５３ｃｍの距離にわたる複合分析の結果を示している。４ＡはＩＬ−８の発現レベルを示し、４ＢはＣＯＸ−２の発現レベルを示し、４ＣはＣＸＣＲ−２の発現レベルを示している。 図４Ａ〜４Ｃは、ＣＲＣ患者について結腸の５３ｃｍの距離にわたる複合分析の結果を示している。４ＡはＩＬ−８の発現レベルを示し、４ＢはＣＯＸ−２の発現レベルを示し、４ＣはＣＸＣＲ−２の発現レベルを示している。

Claims (95)

1. 配列番号１〜５から選ばれる少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープ用のバイオマーカーのパネル。
2. パネルが結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープについてのポリヌクレオチド発現レベルの分析のために選択される、請求項１に記載のパネル。
3. ポリヌクレオチド発現レベルがｍＲＮＡである、請求項２に記載のパネル。
4. ポリヌクレオチド発現レベルがｃＤＮＡである、請求項２に記載のパネル。
5. 少なくとも１つのポリヌクレオチドが断片である、請求項１に記載のパネル。
6. 少なくとも１つのポリヌクレオチドが変種である、請求項１に記載のパネル。
7. パネルを結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープにおける患者治療の管理のために使用する、請求項１に記載のパネル。
8. 患者治療の管理が、リスクアセスメント、早期診断、予後の確立、患者の治療の監視及び再発の検出の１以上を含む、請求項７に記載のパネル。
9. パネルを、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープの治療的介入の発見において使用する、請求項１に記載のパネル。
10. 配列番号１〜５から選ばれる少なくとも２つのポリヌクレオチド及び
    配列番号６〜１４から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチド
    を含む、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープ用のバイオマーカーのパネル。
11. パネルが結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープについてのポリヌクレオチド発現レベルの分析のために選択される、請求項１０に記載のパネル。
12. ポリヌクレオチド発現レベルがｍＲＮＡである、請求項１１に記載のパネル。
13. ポリヌクレオチド発現レベルがｃＤＮＡである、請求項１１に記載のパネル。
14. 少なくとも１つのポリヌクレオチドが断片である、請求項１０に記載のパネル。
15. 少なくとも１つのポリヌクレオチドが変種である、請求項１０に記載のパネル。
16. パネルを、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープに対する患者治療の管理において使用する、請求項１０に記載のパネル。
17. 患者治療の管理が、リスクアセスメント、早期診断、予後の確立、患者の治療の監視及び再発の検出の１以上を含む、請求項１６に記載のパネル。
18. パネルを、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープの治療的介入の発見において使用する、請求項１０に記載のパネル。
19. 配列番号１〜５から選ばれる少なくとも２つのポリヌクレオチド、
    配列番号６〜１４から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチド、及び
    配列番号１５〜２２から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチド、
    を含む、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープ用のバイオマーカーのパネル。
20. パネルが結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープについてのポリヌクレオチド発現レベルの分析のために選択される、請求項１９に記載のパネル。
21. ポリヌクレオチド発現レベルがｍＲＮＡである、請求項２０に記載のパネル。
22. ポリヌクレオチド発現レベルがｃＤＮＡである、請求項２０に記載のパネル。
23. 少なくとも１つのポリヌクレオチドが断片である、請求項１９に記載のパネル。
24. 少なくとも１つのポリヌクレオチドが変種である、請求項１９に記載のパネル。
25. パネルが結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープにおける患者治療の管理の基礎である、請求項２５に記載のパネル。
26. 患者治療の管理が、リスクアセスメント、早期診断、予後の確立、患者の治療の監視及び再発の検出の１以上を含む、請求項１９に記載のパネル。
27. パネルを、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープの治療的介入の発見において使用する、請求項２５に記載のパネル。
28. 配列番号２３〜２７から選ばれる少なくとも２つのポリペプチドを含む、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープ用のバイオマーカーのパネル。
29. パネルが結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープについてのポリペプチド発現レベルの分析のために選択される、請求項２８に記載のパネル。
30. 少なくとも１つのポリペプチドが断片である、請求項２８に記載のパネル。
31. 少なくとも１つのポリペプチドが変種である、請求項２８に記載のパネル。
32. パネルを結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープにおける患者治療の管理において使用する、請求項２８に記載のパネル。
33. 患者治療の管理が、リスクアセスメント、早期診断、予後の確立、患者の治療の監視及び再発の検出の１以上を含む、請求項３２に記載のパネル。
34. パネルを、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープの治療的介入の発見において使用する、請求項２８に記載のパネル。
35. 配列番号２３〜２７から選ばれる少なくとも２つのポリペプチド、及び
    配列番号２８〜３６から選ばれる少なくとも１つのポリペプチド
    を含む、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープ用のバイオマーカーのパネル。
36. パネルが結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープについてのポリペプチド発現レベルの分析のために選択される、請求項３５に記載のパネル。
37. 少なくとも１つのポリペプチドが断片である、請求項３５に記載のパネル。
38. 少なくとも１つのポリペプチドが変種である、請求項３５に記載のパネル。
39. パネルを結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープにおける患者治療の管理において使用する、請求項３５に記載のパネル。
40. 患者治療の管理が、リスクアセスメント、早期診断、予後の確立、患者の治療の監視及び再発の検出の１以上を含む、請求項３９に記載のパネル。
41. パネルを、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープの治療的介入の発見において使用する、請求項３５に記載のパネル。
42. 配列番号２３〜２７から選ばれる少なくとも２つのポリペプチド、
    配列番号２８〜３６から選ばれる少なくとも１つのポリペプチド、及び
    配列番号３７〜４４から選ばれる少なくとも１つのポリペプチド
    を含む、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープ用のバイオマーカーのパネル。
43. パネルが結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープについてのポリペプチド発現レベルの分析のために選択される、請求項４２に記載のパネル。
44. 少なくとも１つのポリペプチドが断片である、請求項４２に記載のパネル。
45. 少なくとも１つのポリペプチドが変種である、請求項４２に記載のパネル。
46. パネルを結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープにおける患者治療の管理において使用する、請求項４２に記載のパネル。
47. 患者治療の管理が、リスクアセスメント、早期診断、予後の確立、患者の治療の監視及び再発の検出の１以上を含む、請求項４６に記載のパネル。
48. パネルを、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープの治療的介入の発見において使用する、請求項４２に記載のパネル。
49. 結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープ用バイオマーカーからのポリヌクレオチドの発現レベルを測定する方法であって、
    配列番号１〜５からの少なくとも２つのポリヌクレオチドを含むバイオマーカーのパネルを選択する工程、
    生物試料を得る工程、
    該試料から細胞ＲＮＡを単離する工程、
    該パネルの各バイオマーカーについて、該試料からのｃＤＮＡのコピーを増幅する工程、及び、
    該試料から増幅したｃＤＮＡのレベルを定量する工程
    を含む方法。
50. バイオマーカーのパネルを選択する工程が、配列番号６〜１４からの少なくとも１つのポリヌクレオチドを更に含む、請求項４９に記載の方法。
51. バイオマーカーのパネルを選択する工程が、配列番号６〜１４からの少なくとも１つのポリヌクレオチド及び配列番号１５〜２２からの少なくとも１つのポリヌクレオチドを更に含む、請求項４９に記載の方法。
52. ｃＤＮＡのコピーを増幅する工程が、配列番号４５〜５０から選ばれるプライマーの少なくとも２セットを更に含む、請求項４９に記載の方法。
53. ｃＤＮＡのコピーを増幅する工程が、ｃＤＮＡ調製用の酵素及び試薬を使用する工程を更に含む、請求項５２に記載の方法。
54. ｃＤＮＡのレベルを定量する工程が、ｃＤＮＡを標識する工程を更に含む、請求項４９に記載の方法。
55. ｃＤＮＡを標識する工程が、少なくとも１つの発色団を含む、請求項５４に記載の方法。
56. 試料についてのｃＤＮＡレベルを対照と比較する、請求項４９に記載の方法。
57. 比較を、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープの患者治療の管理において使用する、請求項５６に記載の方法。
58. 患者治療の管理が、リスクアセスメント、早期診断、予後の確立、患者の治療の監視及び再発の検出の１以上を含む、請求項５７に記載の方法。
59. 比較を、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープの治療的介入の発見において使用する、請求項５６に記載の方法。
60. 生物試料を得る工程が、結腸直腸細胞試料を得ることによるものである、請求項４９に記載の方法。
61. 結腸直腸細胞試料を得る工程が最小限に侵襲性である、請求項６０に記載の方法。
62. 最小限に侵襲性の工程がスワブの使用によるものである、請求項６１に記載の方法。
63. 結腸直腸細胞試料を得る工程が非侵襲性である、請求項６０に記載の方法。
64. 非侵襲性の工程が便試料の収集によるものである、請求項６３に記載の方法。
65. 結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープ用バイオマーカーからのポリペプチドの発現レベルを測定する方法であって、
    配列番号２３〜２７からの少なくとも２つのポリペプチドを含むバイオマーカーのパネルを選択する工程、
    生物試料を得る工程、
    該パネルの各バイオマーカーについての抗体パネルを作成する工程、
    該抗体パネルを使用して該試料からポリペプチドを結合させる工程及び、
    該試料から該抗体パネルへ結合したポリペプチドのレベルを定量する工程
    を含む方法。
66. バイオマーカーのパネルを選択する工程が、配列番号２８〜３６からの少なくとも１つのポリペプチドを更に含む、請求項６５に記載の方法。
67. バイオマーカーのパネルを選択する工程が、配列番号２８〜３６からの少なくとも１つのポリペプチド及び配列番号３７〜４４からの少なくとも１つのポリペプチドを更に含む、請求項６５に記載の方法。
68. 試料についてのポリペプチドレベルを対照と比較する、請求項６５に記載の方法。
69. 比較を、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープの患者治療の管理において使用する、請求項６８に記載の方法。
70. 患者治療の管理が、リスクアセスメント、早期診断、予後の確立、患者の治療の監視及び再発の検出の１以上を含む、請求項６９に記載の方法。
71. 比較を、結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープの治療的介入の発見において使用する、請求項に記載のパネル。
72. 生物試料を得る工程が、結腸直腸細胞試料を得ることによるものである、請求項６５に記載の方法。
73. 結腸直腸細胞試料を得る工程が最小限に侵襲性である、請求項７２に記載の方法。
74. 最小限に侵襲性の工程がスワブの使用によるものである、請求項７３に記載の方法。
75. 結腸直腸細胞試料を得る工程が非侵襲性である、請求項７２に記載の方法。
76. 非侵襲性の工程が便試料の収集によるものである、請求項７５に記載の方法。
77. 結合したポリペプチドを定量する工程が、該ポリペプチドを標識する工程を更に含む、請求項６５に記載の方法。
78. ポリペプチドを標識する工程が、第二抗体を使用する工程を含む、請求項７７に記載の方法。
79. 結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープの判定用のキットであって、
    結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープ用のバイオマーカーのパネルについてポリヌクレオチド発現レベルの分析に使用する少なくとも１つの試薬、及び
    該発現レベルの分析のために該キットを使用するための使用説明書
    を含み、
    該パネルは配列番号１〜５に列挙される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含んでいるキット。
80. バイオマーカーのパネルが、配列番号６〜１４に列挙される少なくとも１つのポリヌクレオチドを更に含む、請求項７９に記載のキット。
81. バイオマーカーのパネルが、配列番号６〜１４から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチド、及び、配列番号１５〜２２から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドを更に含む、請求項７９に記載のキット。
82. ポリヌクレオチド発現レベルがｍＲＮＡである、請求項７９に記載のキット。
83. ポリヌクレオチド発現レベルがｃＤＮＡである、請求項７９に記載のキット。
84. 試薬が、配列番号４５〜５０から選ばれるプライマーの少なくとも２セットを含む、請求項８３に記載のキット。
85. ｃＤＮＡ調製用の試薬を更に含む、請求項８４に記載のキット。
86. ポリヌクレオチドの検出及び定量に使用する試薬を含む、請求項７９に記載のキット。
87. 試薬が、少なくとも１つの発色団を含む、請求項８６に記載のキット。
88. 試料の収集、試料の調製及び試料の分析の少なくとも１つのための消耗実験器具を更に含む、請求項７９に記載のキット。
89. 結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープの判定用のキットであって、
    結腸直腸癌及び結腸直腸ポリープ用のバイオマーカーのパネルについてポリペプチド発現レベルの分析に使用する少なくとも１つの試薬、及び
    該発現レベルの分析のために該キットを使用するための使用説明書
    を含み、
    該パネルは配列番号２３〜２７に列挙される少なくとも２つのポリペプチドを含んでいるキット。
90. バイオマーカーのパネルが、配列番号２８〜３６に列挙される少なくとも１つのポリヌクレオチドを更に含む、請求項８９に記載のキット。
91. バイオマーカーのパネルが、配列番号２８〜３６から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチド、及び、配列番号３７〜４４から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドを更に含む、請求項８９に記載のキット。
92. 試薬が、パネルにおいて選択されたポリペプチドに結合する抗体試薬である、請求項８９に記載のキット。
93. 結合したポリペプチドの検出及び定量に使用する試薬を更に含む、請求項８９に記載のキット。
94. 試薬が第二抗体を含む、請求項９３に記載のキット。
95. 試料の収集、試料の調製及び試料の分析の少なくとも１つのための消耗実験器具を更に含む、請求項８９に記載のキット。

Images