TWI294914B - Animal product free media and processes for obtaining a botulinum toxin - Google Patents

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1294914 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種用於獲取具有生物活性 & <肉毒桿a毒 素的培養基及方法。詳言之，本發明係關於實質性不含動 物產物之培養基、培養物及諸如肉毒梭菌細菌之有機=的 厭氧發酵方法，以獲取充足的具有生物活性之肉毒桿菌毒 素0 【先前技術】 適合投予人類或動物以用於治療、診斷、研究或化妝之 目的的醫藥組合物可包含活性成份。該醫藥組合物亦可包 括一或多種賦形劑、緩衝劑、載劑、穩定劑、防腐劑及/或 膨化劑。醫藥組合物中之活性成份可為諸如肉毒桿菌毒素 之生物學物質（biologic)。該肉毒桿菌毒素可藉由一培養、 發酵及化合方法獲取，該方法制—或多種動物衍生產物 (如肉湯培養基及血液餾份或血液衍生賦形劑）。向患者投予 一其中之活性成份生物學物質係通過使用動物衍生產物之 方法而獲取的醫藥組合物可使得患者處於接收各種病原體 或傳染劑的潛在危險中。例如，在醫藥組合物中可存在朊 病毒（prion)。朊病毒為蛋白質感染粒子，其被假設起源於 來自產生正常蛋白質之相同核酸序列的反常構型異型。已 進一步假設··感染性可存在於正常異型蛋白質至朊病毒蛋 白質異型在後轉譯程度上的”募集反應”中。顯然，正常的 内源性細胞蛋白質被誘發以誤折為病原性朊病毒構型。 庫貝氏病（Creutzfeldt_Jac〇b)為一種罕見的人類傳染性海 95765.doc 1294914 綿狀腦病之神經退化性病症，其中傳染性因子明顯為朊病 毒蛋白質之反常異型。患有庫賈氏病的個體在六個月 自明顯完全健康狀態劣化至運動不能性緘默。因此，可存 在自醫藥組合物之投藥而獲得諸如庫賈氏病之朊病毒：： 之疾病的潛在危險’其中該醫藥組合物含有藉由使用動物 街生產物而獲取之諸如肉毒桿菌毒素的生物學物質。 肉毒桿菌毒素 梭菌屬按其形態及功能分類具有127種以上。該厭氧性、 革蘭氏陽性細菌肉毒梭菌產生有效的多肽神經毒素、肉毒 桿囷毒素，其可引起人類及動物的神經麻痹性病，稱為肉 毒中毒。通常可在土壤中發現肉毒梭菌及其孢子且該細菌 可在家居罐頭工廠的未適當滅菌及密封的食品容器中生 長，此係諸多肉毒中毒病例之原因。通常在食用以肉毒梭 菌培養物或孢子感染的食品之後18至36個小時顯現肉毒中 毒之效應。肉毒桿菌毒素明顯地可未衰減地穿過内臟襯裏 且襲擊周邊運動神經元。肉毒桿菌毒素中毒之症候群可自 行動困難、吞咽困難及講話困難發展至呼吸肌麻痹及死亡。 肉毒桿菌毒素類型A為人類所知最致命的天然生物因 子。約50微微克肉毒桿菌毒素（純化神經毒素複合物）類型A 為老鼠中之LDw。以莫耳計，肉毒桿菌毒素類型a之致命性 咼於白喉1 ·8億倍，咼於氰化納6億倍，高於眼鏡蛇毒素3〇〇〇 萬倍且咼於隹亂 1200 萬倍。singh，Critical Aspects of

Bacterial Protein Toxins，Natural Toxins II，B.R. Singh等人 編’第 63-84 頁（第 4章），pienum press，New York (1976)(其 95765.doc 1294914 中，0.3 ng肉毒桿菌毒素類型A之所確定LD50等於1 U被校正 為約0·05 ng BOTOX⑧等於1單位之事實）。BOTOX®為可自 Allergan，Inc·，of Irvine，California購得的肉毒桿菌毒素類 型A純化神經毒素複合物之商標。將一單位（U)之肉毒桿菌 毒素定義為經腹膜内注射至各重18-20克之雌性瑞士 Webster鼠中的LD50。換言之，一單位之肉毒桿菌毒素為殺 死一組雌性瑞士 Webster鼠之50%的肉毒桿菌毒素。已將七 種一般免疫之特殊肉毒桿菌神經毒素特徵化，其分別為肉 毒桿菌神經毒素血清型A、B、Ci、D、E、F及G，其中每 一種可藉由與特定類型抗體之中和作用而加以區分。肉毒 桿菌毒素之該等不同血清類型在其所感染的動物種類及在 其所引起麻痹之嚴重性及持續時間上有所不同。舉例而 言，藉由量測在老鼠中所產生麻痹比率已確定：肉毒桿菌 毒素類型A比肉毒桿菌毒素類型B更有效500倍。此外，已 確定肉毒桿菌毒素類型B在480 U/kg的劑量下對於靈長類 係無毒，此劑量為肉毒桿菌毒素類型A對於靈長類LD50的約 12倍。肉毒桿菌毒素明顯地以高親合力與膽鹼能運動神經 元結合，且被轉移至神經元中並阻塞乙醯膽鹼之突觸前釋 放。 肉毒桿菌毒素已用於臨床配置，以治療（例如）特徵為活 動過強之骨絡肌的神經肌肉病症。肉毒桿菌毒素類型A已經 美國食品及藥品管理局（U.S· Food and Drug Administration) 核准用於治療大於12歲之患者的原發性眼瞼痙攣、斜視及 半顏面痙攣，用於治療頸肌張力障礙及用於治療眉間（面部） 95765.doc 1294914 敏紋。FDA亦核准肉毒桿菌表 干菌t素類型B用於治療頸肌張力障 礙。周邊注射（意即，瘦舰内 肌肉内_皮下）肉毒桿菌毒素類型 之fe»床效應通常在注射一 周牯間内且通常在注射後若干 5 W日守間内顯現出來0自肉表士曰# 自肉t扣囷毒素類型A之單一肌肉内 注射的症狀減輕（意即，馳绣松 .% ^〖生肌肉麻痹）之通常持續時間可 為約3個月至約6個月。 :管全部肉毒桿菌毒素灰清型均明顯地抑制神經遞質乙 =驗於神經肌肉接點處之釋放，但是其係藉由感染不同 ^申經分泌蛋白質及/或於不同位置裂開該等蛋白質而達 成此。肉毒桿菌毒素A為鋅肽鍵 、 1矸服鍵内切酶，其可特定地水解細 =泡囊相關之蛋白質叫25的肽鍵。肉毒桿菌類型㈣ 開25千道爾頓⑽）突觸體相關的蛋白質（SNAP-25)，但

與肉毒桿菌毒素類型A相比盆目枵A ，、s ‘為此蛋白質中不同的胺 :酸序列。肉毒桿菌毒素類型b、d,g對與泡囊相關之 蛋白（VAMP，亦稱為（突觸泡蛋白㈣卿⑽⑽⑽起作用， 清型於不同位置裂開該蛋白質。最後，已顯示肉 f桿菌毒素類型Cl裂開突觸蛋白（咖㈣及sNAp_25。該 寺作用機制上之差里可能旦< _ $ 工 、j此〜響各種肉毒桿菌毒素類型的相 對效能及/或作用持續時間。 不管何種A清型’毒素中毒之分子機制看似相似且涉及 至少三個步驟或階段。在此過程之第一步驟中，毒素通過 重鏈（H鏈）與細胞表面受體之間的特定交互作用而結合至 目標神經it的突觸前膜；認為該受體對於肉毒㈣毒素之 各灰清型&對於肉毒桿菌毒素而言係不同。Η鏈之叛基末端 95765.doc 1294914 片段Hc對於使毒素靶向細胞表面十分重要。 在第二步驟中，毒素穿過中毒細胞之質膜。毒素首先通 過受體調節之内噬作用而被細胞呑噬，且形成含有該毒素 之核内體。然後，該毒素逃離核内體進入該細胞之細胞質 中。此最後步驟被認為係藉由Η鏈胺基末端片段HN來調 節，其引發毒素構型的變化以響應約5.5或更低之pH值。已 知核内體具有降低核内體内pH值的質子泵。該構型變換使 毒素中的疏水性殘基暴露，其允許毒素自身嵌入核内體膜 中。然後，毒素通過核内體膜移位至細胞質液中。 肉毒桿菌毒素活性之機制的最後一步驟看似涉及連接Η 與L鏈之雙硫鍵的減少。肉毒桿菌及肉毒桿菌毒素之整個毒 性活性包含於全毒素之L鏈中；該L鏈為鋅（Ζη++)肽鏈内切 酶，其選擇性地裂開主要用於識別含有神經遞質之泡囊且 使其停靠於電漿膜之細胞質表面，並使該泡囊與電漿膜相 融合的蛋白質。肉毒桿菌神經毒素、肉毒桿菌毒素b、d、 F及G引起突觸體膜蛋白synaptobrevin(亦稱為泡囊相關之 膜蛋白質（VAMP))的降解。由於該等開裂事件之任一種，使 知存在於該突觸泡囊之細胞質表面的大多數VAMp被移 除。各毒素特定地裂開不同結合。

對於所有七種已知的肉毒桿菌毒素灰清型而言，肉毒桿 菌毒素蛋白質分子之分子量為約150 kD。有趣的是，該等 肉毒桿菌毒素被梭菌細菌釋放為包含150 kD肉毒桿菌毒素 蛋白貝分子及相關非毒素蛋白質的複合物。因此，肉毒桿 菌毒素類型A複合物可由梭菌細菌生成為9〇〇 kD、500 kD 95765.doc 1294914 及300 kD之形式。顯然，肉毒桿菌毒素類型b及匕僅生成為 500 kD之複合物。肉毒桿菌毒素類型〇被生成為3〇〇 500 kD之複合物。最後，肉毒桿菌毒素類型E&F被生成為 僅約300 kD之複合物。咸信該等複合物（意即，分子量大於 約150 kD)含有非毒素性血球凝集素蛋白質及非毒素性且 無毒性非血球凝集素蛋白質。該等兩種非毒素性蛋白質（其 連同肉毒桿菌毒素分子可包含相應的神經毒素複合物）可 發揮作用以提供預防肉毒桿菌毒素分子變性的穩定性，且 當攝食毒素時使其免於消化液酸。此外，較大（大於約15〇 kD分子量）的肉毒桿菌毒素複合物可能導致肉毒桿菌毒素 自肉毒桿菌毒素複合物之肌肉内注射部位擴散的速率減 1*又。可藉由在pH 7.3時以紅jk球處理複合物而使該等毒素 複合物離解為毒素蛋白質及血球凝集素蛋白質。毒素蛋白 質在移除血球凝集素蛋白質上具有顯著不穩定性。 所有肉毒桿菌毒素血清型皆由肉毒梭菌細菌形成為非活 性單鏈蛋白質，其必須藉由蛋白酶而裂開或斷開以變得具 有神經活性。形成肉毒桿菌毒素血清型A及G之細菌菌株具 有内源性蛋白酶且因此血清型A與G可主要以其活性來气 自細菌培養物中回收。相比而言，肉毒桿菌毒素主 、 〆月Sf C1、 D及E藉由非蛋白水解菌株而被合成且因此在自培養物中 回收時通常為非活性。血清型B及F藉由蛋白水解或非蛋白 水解菌株而生成且因此可以活性或非活性形式加 a 收。 然而，甚至生成（例如）肉毒桿菌毒素類型B血清型 土 <隻白水 解菌株僅裂開所生成毒素之部分。斷開與未斷開八 J、刀子的 95765.doc -10- 1294914 確切比率視培育時間長短及培養物之溫度μ。因此，某 一百分率之（例如）肉毒桿菌毒素類型Β毒素之任何製劑可 為非活性，此或許可以解釋肉表 主 枰η母杯囷骨素類型β與肉毒桿菌 毒素類型a相比而言具有所知链戈 丸所知顯者較低效能的緣由。在臨床 製劑中非活性肉毒桿菌毒素分子的存在將有助於該製劑的 總蛋白質負荷’其與增加的抗原性相關，而對其臨床功效 I热幫助。此外’已知肉毒桿菌毒素類型B經肌肉内注射時 具有較短的活性持續時❹在相同劑量水平上亦具有低於 肉毒桿菌類型A的效能。 在活體外的研究已顯不肉毒桿菌毒素抑制鉀陽離子誘發 之乙醯錢及去甲腎上腺素自腦幹㈣之原生細胞培養物 中的釋放此外，已報道：肉毒桿菌毒素抑制脊髓神經元 之原生培養物中甘胺酸及麩胺酸的釋放且已報道：在腦突 觸體製劑中，肉毒桿菌毒素抑制神經遞質乙酼膽驗、多巴 胺、去甲腎上腺素、CGRP及麵胺酸中任一者的釋放。 同口口貝、、、口日日肉t桿菌毒素類型A可自肉毒梭菌之Hall A 菌株生成，其特徵為yxl〇7u/mg、小於〇·6(^Α26〇/Α278及 附帶於凝膠電泳上的獨特圖案。如Schantz，E丄等人之 Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol Rev. 56: 80-99 (1992) 中所提及，已知的Schantz方法可用於獲取結晶之肉毒桿菌 毒素類型A。一般而言，肉毒桿菌毒素類型A複合物可藉由 在適當培養基中培養肉毒梭菌類型A而自厭氧發酵加以分 離且純化。原毒素可藉由以硫酸沈澱而被收穫，且可藉由 95765.doc -11 - 1294914 超微過濾加以濃縮。可藉由將酸沈澱物溶解於氯化鈣中來 執行純化。而後，可藉由以冷乙醇來沈澱該毒素。可將該 沈澱物溶於磷酸鈉緩衝液中且進行離心作用。接著經將其 乾燥可獲取具有3xl07 LD5G U/mg或更高特定效能的約900 kD結晶肉毒桿菌毒素類型A複合物。亦可在分離出非毒素 性蛋白質之上，使用此已知方法以獲取純淨的肉毒桿菌毒 素，諸如（舉例而言）：具有約150 kD之分子量且具有1-2x108 LD5〇 U/mg或更高特定效能的純化肉毒桿菌毒素類型A ;具 有約156 kD之分子量且具有l-2xl08 LD5〇 U/mg或更高特定 效能的純化肉毒桿菌毒素類型B;及，具有約155 kD之分子 量且具有1-2x107 LD5〇 U/mg或更高特定效能的純化肉毒桿 菌毒素類型F。 肉毒桿菌毒素（150千道爾頓分子）及肉毒桿菌毒素複合 物（300 kDa 至 900 kDa)可自（例如）List Biological Laboratories, Inc., Campbell, California ； the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.； Wako (Osaka, Japan)及自 Sigma Chemicals of St Louis， Missouri獲取。可購得的含有醫藥組合物之肉毒桿菌毒素包 括Botox®(具有人類血清蛋白及氣化鈉之肉毒桿菌毒素類 型 A神經毒素複合物，可自 Allergan，Inc.，Irvine，California 以100單位小瓶作為凍乾粉末購得，使用前以〇·9%氯化鈉使 其復原）、Dysport®(在調配物中具有人類血清蛋白及乳糖之 肉毒梭菌類型A毒素血球凝集素複合物，可自Ipsen Limited， Berkshire，U.K.以粉末獲取，使用前以0.9%氯化鈉使其復原） 95765.doc -12- 1294914 及MyoBloc™(包含肉毒桿菌毒素類型B、人類血清蛋白、琥 珀酸鈉及氣化鈉的可注射溶液，pH值約為5·6，可自Elan Corporation，Dublin，Ireland獲取）0 肉毒桿菌毒素類型A在處理各種臨床病況中所取得的成 功已引起對於其它肉毒桿菌毒素血清型之關注。因此，至 少肉毒桿菌毒素類型A、B、E及F已在臨床上用於人類。此 外，純（約150 kDa)肉毒桿菌毒素已用於治療人類。參看（例 如）Kohl A.等人，Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox(R)) with the highly-purified neurotoxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15 (增刊3): 165。因此，可使用純肉毒桿菌毒素（約150 kDa)製備醫藥組合物。 已知類型A肉毒桿菌毒素可溶於pH 4-6.8之稀釋水溶液 中。在pH值高於約7時，穩定化無毒性蛋白質自神經毒素離 解，尤其是隨pH值及溫度升高而導致毒性逐漸喪失。 Schantz E.J.等人，Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (明確而言，第 44-45 頁），為 Jankovic，J.等人，Therapy with Botulinum Toxin，Marcel Dekker，Inc (1994)，第 3 章。 一般而言，如同酶一樣，肉毒桿菌毒素（細胞内的肽鏈内 切酶）的生物活性至少部分地需視其空間構型而定。因此， 肉毒桿菌毒素類型A可藉由加熱、各種化學品表面拉伸及表 面乾燥來解毒。此外，吾人已知：除非存在適當穩定劑， 否則將藉由已知培養、發酵及純化所得的毒素複合物稀釋 95765.doc -13- 1294914 至用於醫藥組合物調配的相當低之毒素濃度導致該毒素之 迅速解甘。將毒素自毫克量稀釋成每毫升含毫微克的溶液 會因該高度稀釋導致特異性毒性迅速喪失而顯得相當困 難。即使在含有該毒素之醫藥組合物經調配後 ，該毒素可 使用數月或數年，但仍可以諸如白蛋白及明膠之穩定劑來 穩定該毒素。 據報道，肉毒桿菌毒素已用於各種臨床配置中，其包括 以下内容： (1) 每次肌肉内注射（多種肌肉）約75_125單位之BOTOX⑧ 以治療頸肌張力障礙； (2) 每次肌肉内注射5_1〇單位之Β〇τ〇χ@以治療眉間紋 (眉紋）（5單位經肌肉内注射至降眉間肌且1〇個單位肌肉内 注射至各皺眉肌）； (3) 將約30-80單位之BOTOX⑧藉由恥骨直腸肌之經括約 肌内注射以治療便秘； (4) 籍由向上眼瞼之外側前跗骨輪匝眼肌及下眼瞼之外 側前跗骨輪匝眼肌進行注射，而每次將約丨巧單位之 BOTOX®經肌肉内注射至肌肉以治療眼驗瘦攣； (5) 為治療斜視，經肌肉内向眼外肌注射約1_5單位間的 BOTOX⑧，所注射量基於待注射肌肉之尺寸及所要麻痒之 肌肉範圍（意即，所想要屈光度校正的量）而變化； * (6)為治療中風後遺留之上肢痙攣，按下面所述，經肌肉 • 内將BOTOX®注射至五個不同的上肢屈肌： (a)屈指深肌：7.5 U至30 U; 95765.doc -14- 1294914 (b) 屈指淺肌：7·5 U至30 U ; (c) 尺侧屈腕肌：10 U至40 U ; (d) 橈側屈腕肌·· 15 U至60 U ; (e) 肱二頭肌：50 U 至 200 U。 在同一治療階段，注射所指五種肌肉中之每一種， 使得患者在各治療階段藉由肌肉内注射而接收90 U至 360 U之上肢屈肌BOTOX® ; (7)為治療偏頭痛，經顱骨膜注射（對稱地注射至眉間肌、 額肌及顳肌）25 U之BOTOX®與媒劑相比已顯示出預防性 治療偏頭痛的顯著優勢，此如在注射25 U後之三個月期間 内偏頭痛頻率、最高嚴重性、相關嘔吐及急性藥物使用之 降低的量側值所量測。 已知肉毒桿菌毒素類型A可具有長達12個月之功效 (European J· Neurology 6 (Supp 4) ·· S111-S1150 : 1999)， 且在某些情況下，可長達27個月。The Laryngoscope 109 : 1 344-1346 : 1999。然而，經肌肉内注射Botox®之通常持續 時間一般為約3至4個月。 一種可購得之含有肉毒桿菌毒素的醫藥組合物以商標 BOTOX⑧出售（得自 Allergan，Inc.，of Irvine，California)。 BOTOX®係由以無菌、真空乾燥形式封裝的純化肉毒桿菌 毒素類型A複合物、人血清清蛋白及氣化納所組成。肉毒桿 菌毒素類型A係由生長在含有N-Z胺及酵母萃取物之培養 基中之肉毒梭菌之Hall菌株的培養物製成。藉由一系列酸 沈澱而將肉毒桿菌毒素類型A複合物自培養溶液純化成由 95765.doc -15- 1294914 活性高分子量毒素蛋白質及相關血球凝集素蛋白質組成的 結晶複合物，將該結晶複合物再次溶解於含有生理食鹽水 及白蛋白之溶液中，且在真空乾燥之前進行無菌過濾（〇·2 微米）。在進行肌肉内注射之前，可以無菌、未經防腐之生 理食鹽水將BOTOX®復原。每小瓶BOTOX®含有約1〇〇單位 (U)之肉毒梭菌毒素類型Α、〇·5毫克人血清清蛋白及0.9毫克 氯化納，其為無菌、真空乾燥形式，不含防腐劑。 使用不含防腐劑的無菌標準生理食鹽水（0·9〇/ο氣化鈉注 射劑）以復原經真空乾燥之BOTOX⑧，其係藉由將適量稀釋 劑抽入至適當尺寸之注射器中。因為ΒΟΤοχ⑧經起泡或類 似強烈授拌會變質，所以將稀釋劑緩慢注射至小瓶中。鐾 於無菌原因，應在復原之後四小時内投用BOTOX®，在此 期間’將經復原的BOTOX®儲存於冷藏庫（2。〇至8 °C )中。經 復原BOTOX®係透明、無色且不含微教之物質。該真空-乾 燥產物儲存在-5°C或更低溫度的凍庫中。 大體上’已鑒別出四群生理學之肉毒桿菌菌群（I、π、 III及IV)。該等能夠產生一血清學上不同毒素的有機體可能 係來自一個以上之生理性菌群。例如，類型3及F毒素可由 菌群I或II之菌株產生。此外，已鑑定出其他梭菌菌株可產 生肉毋才干函神經毋素（C· baratii ’類型ρ ; C.butyricum，類 型 E ; C.novyi，類型 C!或 D)。。 肉毒梭菌類型之生理學菌群列於表j中。 表I.肉毒梭菌之生理學菌群η 95765.doc -16- 1294914 菌群 毒素 血清型 生物化學作用 牛奶 消化 作用 葡萄糖 發酵作 用 脂肪 酶 嗟菌 體及 質體 在表型 上相關 的梭菌 (不產 生毒素） I A、B、F 蛋白水解性 糖分水解性 + + + + C.spor ogencs II B、E、F 非蛋白水解性 糖分水解性 作用於神經 - + + + III C、D 非蛋白水解性 糖分水解性 土 + + + C.novyi IV G 蛋白水解性 非糖分水解性 + - - - C. subterminale 藉由自肉毒梭菌有機體中選擇適當生理學菌群來製備這 些毒素類型。指定為菌群I之該等有機體通常被認為是具 有蛋白水解性，且可產生肉毒桿菌毒素類型A、B及F。指 定為菌群II之該等有機體為糖水解性，且可產生肉毒桿菌毒 素類型B、E及F。指定為菌群III之該等有機體僅產生肉毒 桿菌毒素類型C及D，且不同於菌群I及II之有機體之處在 於能產生大量的丙酸。菌群IV有機體僅產生神經毒素類型 G。 吾人已知藉由使用實質性不含動物產物的特定培養基可 獲取破傷風毒素。參看（例如）美國專利第6,558,926號。但 是，應注意此專利案所揭示之”不含動物產物11的培養基還 使用了 Bacto-peptone(肉類水解物）。顯著的是：由破傷風梭 菌生成之破傷風毒素與由肉毒梭菌細菌生成之肉毒桿菌毒 素相比需要不同的生長、培養基及發酵參數及所考慮因 素。參看（例如）Johnson，Ε·Α·等人，Clostridium botulinum 95765.doc -17- 1294914 and its neurotoxins ： a metabolic and cellular perspective, Toxicon 39 (2001)，1703-1722。 因此，需要一種不含或實質性不含動物產物如動物衍生 蛋白質之培養基及方法，以獲取或生成具有生物活性的肉 毒桿菌毒素。 【發明内容】 本發明係滿足此需求且提供不含或實質性不含動物產物 諸如動物衍生蛋白質之培養基及方法，以獲取或生成具有 生物活性的肉毒桿菌毒素。所得肉毒桿菌毒素可用於製作 肉毒桿菌毒素活性成份醫藥組合物。 定義 如本文中所使用，下文所提及之詞語或術語具有以下定 義。 ’’約”意指如此加以限定之項目、參數或術語涵蓋所指出 項目、苓數或術語的值之上或之下正或負1〇%的範圍。 ’’投藥"或，，投予"意指將醫藥組合物給予（意即，投予）主體 之步驟。本文所揭示之醫藥組合物係藉由以下方式來"局部 投藥，，：例如，肌肉内（1.m·)、真皮内、皮下投藥，鞘内投 藥：顧骨内、腹膜内（1·ρ·)投藥、局部（經皮膚）及植入（意即， 緩杈釋放裝置如聚备體植入或微滲透泵）路徑投藥。 不各動物產物”或”實質性不含動物產物，，分別涵蓋”不含 $物蛋白貝’’或”實質性不含動物蛋白質，，，且意指不含或實 =性不含血液衍生、血液蓄積及其它動物衍生的產物或化 口物。動物”意指哺乳動物（如人類）、鳥、爬行動物、魚、 95765.doc -18 - 1294914 :蟲、换蛛或其它動物種類。"動物"不包括諸如細菌之微

生物。因此，在本於明餻R X月乾圍内的不含動物產物之培養基 Γ法或實質衫含動物產物之培養基或方法可包括肉毒桿 囷毒素或肉毒桿菌細菌。例如，不含動物產物之方法 f性不含動物產物之方法意指實質性不含或基本上不含或 疋王不3動物知生蛋白質如免疫球蛋白、肉類水解物、肉 類副產物及奶類或乳製品或水解物之方法。因此，不含動 物產物之方法的實例為不包括肉類及乳製品或肉類或奶製 品副產物之方法（如、細菌培養或系田菌發酵方法）。 "肉毒桿g毒素"意指藉由肉毒梭菌所生成之神經毒素， 及藉由非梭菌屬物種重組而製成的肉毒桿菌毒素（其輕鏈 或重鏈）。文中所用短語"肉毒桿菌毒素"涵蓋肉毒桿菌毒素 血清型入、；8、（：、〇、£、17及〇。文中所用之肉毒桿菌毒素 亦涵蓋肉毒桿菌毒素複合物（意即，3〇〇、6〇〇及9〇〇 kDa複 合物）及純化之肉毒桿菌毒素（意即，約15〇 kDa)。，,純化之 肉毒桿菌毒素"被界定為自包括形成肉毒桿菌毒素複合物 之蛋白貝在内的其它蛋白質分離或實質性分離之肉毒桿菌 毒素。純化之肉毒桿菌毒素可具有高於95〇/〇之純度且較佳 為高於99%之純度。非神經毒素之肉毒桿菌c2及c3細胞毒 素不包括於本發明範圍内。 π梭菌神經毒素，，意指自梭菌屬細菌如肉毒梭菌、丁酸梭 菌或比第梭菌（Clostridium beratti)產生或其原生之神經毒 素’及由非梭菌屬物種重組而製成的梭菌神經毒素。 ”完全不含，，（意即，術語，，由……組成”）意指在所用工具或 95765.doc -19- 1294914 方法之彳貞測範圍内，該物質無法被偵測到或無法證實其存 在。 ”基本上不含，，（或”基本上由……組成”）意指僅可谓測到 痕量之該物質。 固疋忍指防止主體移動一或多個身體部位之步驟。若 充足數量之身體部位被固定，則該主體將因此被固定。因 此，’’固定"涵蓋身體部位（如肢體）之固定，及/或主體之完 全固定。 ’’改質之肉毒桿菌毒素”意指與天然肉毒桿菌毒素相比， 具有至少一個經刪除、經改質或經置換的胺基酸之肉毒桿 菌毒素。此外，改質之肉毒桿菌毒素可為重組生成之神經 毒素或為重組製成神經毒素之衍生物或片段。改質之肉毒 桿菌毒素保持天然肉毒桿菌毒素之至少一種生物活性，諸 如，結合至肉毒桿菌毒素受體之能力，或抑制自神經元釋 放神經遞質之能力。改質之肉毒桿菌毒素的一個實例為具 有來自肉毒桿菌毒素血清型（如血清型Α)之輕鏈及來自不 同肉毒桿菌毒素血清型（如血清型Β)之重鏈的肉毒桿菌毒 素。改質之肉毒桿菌毒素的另一實例為偶合至神經遞質如 物質Ρ之肉毒桿菌毒素。

’’患者” 因此，如 動物之任何動物。 醫藥組合物1’意 意指其中活性成份可為肉毒桿菌毒素 配物。詞語”調配物"意指除神經毒素活性成份之外，該等 95765.doc -20- 1294914 醫藥組合物中具有的至少一種額外成份。因此，醫藥組合 物為適用於診斷性或治療性投予（意即，藉由肌肉内或皮下 注射或藉由將藥物儲槽插入或植入）主體如人類患者之調 配物。該醫藥組合物可如下··處於凍乾或真空乾燥條件； 為在以生理食鹽水或水將凍乾或真空乾燥之醫藥組合物復 原後所形成之溶液，或；為無需復原之溶液。活性成份可 為肉毒桿菌毒素血清型A、B、Ci、D、E ' 一種或 肉毒桿菌毒素，其中均由梭菌屬細菌天然地製成。如所指 出，醫藥組合物可為液體或固體，例如經真空乾燥。醫藥 組合物之組成成份可包括於單一組合物中（意即，在化合該 醫藥組合物之最初時間時，除任何所需復原流體外的所有 組成成份均存在）或作為二成分體系，例如藉由諸如生理食 鹽水之稀釋劑而復原之真空乾燥組合物，該稀釋劑含有在 最初化合該醫藥組合物時不存在的成份。二成分體系提供 允許倂入在長期的存放儲#中無》去與該二成分體系中之第 成刀充刀相今的成份之益處。例如，復原媒劑或稀釋劑 可包括在使用期内（例如—週之冷;東儲存）提供充分保護以 防止微生物生長之防腐劑’但其在兩年冷藏储存期間不存 在而在此』間其可月色使毒素降解。無法在長時間段中與 梭菌屬毒素或其它成份相容之其它成份可以此方式併入； 意即，在適當使用時間時以第二媒劑（意即，以復原流體） 添加。在美國專利公開案· 〇1 18598 ai中揭示了用於調 配肉毒桿菌毒素活性成份醫藥組合物之方法。 ”實質性不含”意指以小於醫藥組合物之i重量％的含量存 95765.doc -21 - 1294914 在。 ，，治療性調配物"意指可用於治療且藉此減輕病症或疾病 (諸如以周邊肌肉活動過度（意即，痙攣）為特徵之病症或疾 病）之調配物。 上本發明提供包含至少降低含量之動物或奶製品副產物且 較佳實質性不含動物或奶製品副產物之培養基。"動物或奶 製品副產物”意指可在活體内或在活體外，於動物（不包括 細菌）細胞内或由動物細胞生成之任何化合物或化合物之 組合。諸如蛋白質、胺基酸及氮之培養基成份的較佳非動 物來源包括蔬菜、微生物（如酵母）及合成化合物。 本發明亦提供使用至少一種實質性不含動物或奶製品副 產物之培養基來獲取肉毒桿菌毒素之方法。例如，肉毒桿 菌毒素可藉由在實質性不含動物產物之發酵培養基中培養 肉毒梭菌而獲得。 本發明亦涵蓋在實質性不含動物產物且包含蔬菜衍生產 物之卷酵培養基中培養肉毒梭菌而得的肉毒桿菌毒素。此 外，可藉由在實質性不含動物產物且包含某些基於大豆之 產物的發酵培養基中培養肉毒梭菌而獲取肉毒桿菌毒素。 在另一較佳實施例中，可藉由在實質性不含動物產物且 含有作為動物衍生產物之替代的水解大豆之發酵培養基中 支口養肉毋枚囷而獲取肉毒桿菌毒素。較佳地，持續在發酵 培養基中的生長直到至少細胞溶菌作用發生。用於發酵培 養基之接種的肉毒梭菌之來源可自含有肉毒梭菌之種子培 養基獲取。較佳地，在種子培養基中生長且用作發酵培養 95765.doc -22- 1294914 基之接種體的肉毒梭菌不經受細胞溶菌作用。用於種子培 養縫種之肉毒梭菌的來源可自柬乾之培養物獲取。肉毒 f菌可作為動物乳或大豆乳中之培養物而被凍乾。肉毒梭 菌較佳作為大豆乳中之培養物被凍乾。 本發明亦提供—種包含實質性不含動㈣生產物之培養 基以用於培養肉毒梭菌的組合物。 在實施例中’該組合物包含實質性不含動物衍生產物 之培養基，同時含有衍生自非動物源之至少一種產物，且 亦包含肉毒梭菌。 在另-實施例中，該組合物包含實f性不含動物衍生產 物之培養基，同時含有衍生自蔬菜之至少一種產物，且亦 包含肉毒梭菌。本發明之最後實施例可為包含實質性不含 動物何生產物之培養基，同時含有衍生自大豆之至少一種 產物，且亦包含肉毒梭菌的組合物。 【實施方式】 本發明係基於不含或實質性不含動物產物或動物副產物 之培養基及方法的發現，其可用於能生成具有生物活性之 肉毒桿菌毒素的有機體（諸如，肉毒梭菌細菌）之培養及發 酵。所獲取之肉毒桿菌毒素可用於製作肉毒桿菌毒素活性 成伤醫藥組合物。因此，本文揭示出具有顯著減少的肉類 或奶製品副產物含量之生長培養基且較佳之培養基實施例 是實質性不含此類動物產物。 本發明涵蓋吾人驚奇之發現，即··在用於肉毒梭菌生長 之培養基中並不需要基於動物之產物，且尤其是，基於蔬 95765.doc -23- 1294914 菜之產物可替換在用於肉毒梭菌生長之此類培養基中常用 的基於動物之產物。 目前用於細菌生長及發酵之培養基通常包含一種或多種 動物衍生成份。根據本發明，用於肉毒梭菌生長之較佳培 養基含有不多於培養基總重量之約5%至約10%之動物衍生 成份。更佳地，本發明範圍内之培養基包含不多於培養基 總重量之約1%至少於約5%的動物衍生產物。最佳地，用於 生成肉毒桿菌毒素之肉毒梭菌生長的所有培養基及培養物 均完全不含動物衍生產物。 該等培養基包括（但不限於）：用於小規模及大規模肉毒 梭菌發酵之培養基，用於接種種子（第一）培養基及發酵（第 一）培養基之肉毒桿菌培養物的生長之培養基，及用於長期 儲存肉毒梭菌培養物（例如，儲存培養物）之培養基。 在本發明之某些較佳實施例中，用於肉毒梭菌的生長且 用於生成肉毒桿菌毒素之培養基可包含基於大豆的產物以 替換動物衍生產物。或者，可使用野生羽扇豆之去苦味種 子以代替，基於大豆之產物。已知野生羽扇豆種子的蛋白質 含量與大豆的蛋白質含量極其類似。該等培養基較佳包括 可水解且可溶於水的大豆或野生羽扇豆衍生產物。然而， 不溶性大豆或野生羽扇豆產物亦可用於本發明中以替換動 物產物。可由大豆或野生羽扇豆產物取代之常見動物衍生 產物包括：牛心浸出物（BHI)、諸如細菌蛋白腺之動物衍生 蛋白脒產物、水解乾酪素及諸如動物乳之奶製品副產物。 較佳地，除了實質性全部動物衍生產物皆由蔬菜衍生產 95765.doc -24- 1294914 物所替換之外，含有基於大豆或基於野生羽扇豆之產物以 用於肉毒梭菌生長之培養基類似於通常所用的含有動物衍 生產物之生長培養基。例如，基於大豆之發酵培養基可包 含·基於大豆之產物、諸如葡萄糖之碳來源、諸如NaC1& KC1之鹽、諸如NkHPO4、KH2p〇4之含有磷酸鹽的成份、諸 如鐵及鎂之二價陽離子、鐵粉及諸如L-半胱胺酸及L•酪胺 西文之胺基酸。用於供發酵（第二）培養基之接種（意即種子或 第一培養基）用之肉毒梭菌培養物之生長的培養基較佳含 有至；一種基於大豆之產物、諸如NaC1之鹽來源及諸如葡 萄糖之碳來源。 本發明提供一種用於肉毒梭菌生長之方法，其使得藉由 使用實質性不含動物冑生產物之培養基所生成<肉毒桿菌 毒素達到最大化。用於生成肉毒梭菌及肉毒桿菌毒素之生 長可藉由在含有替換衍生自動物副產物之成份的大豆副產 物之培養基中發酵而發生。用於發酵培養基之接種體可衍 生自較小規模的生長培養基（種子培養基）。視發酵步驟之尺 寸及體積不同，為增加培養物之生物量而在種子培養基中 連續生長的數目可有所變化。為生長適量之肉毒梭菌以接 種發酵培養基，可執行涉及在種子培養基中生長之一個步 驟或夕個步驟。對於生長不含動物衍生產物之肉毒梭菌的 方法而言，較佳為肉毒梭菌之生長自儲存於非動物衍生培 養基中之培養物開始。較佳經凍乾之該儲存培養物係藉由 在含有衍生自大豆之蛋白質且不含動物副產物之培養基中 生長而生成。肉毒梭菌在發酵培養基中之生長可藉由直接 95765.doc -25- 1294914 自儲存、凍乾之培養物接種而發生。 在本發明之一較佳實施例中，肉毒梭菌之生長以二階段_ 種子生長及發酵進行。該等二階段均在厭氧環境下執行。 種子生長階段通常用於自儲存培養物中”按比例擴大 (scale-up)微生物之數量。種子生長階段之目的在於增加發 酵可得之微生物的數量。此外，種子生長階段允許在儲存 培養物中存在相關休眠之微生物以恢復並生長成活性生長 培養物。另外，可自活性生長培養物比自儲存培養物更精 確地控制用於接種發酵培養物之活微生物之體積與數量。 因此’較佳為用於接種發酵培養基之種子培養物的生長。 此外’可使用涉及在種子培養基中生長以按比例擴大用於 發酵培養基接種之肉毒桿菌的數量的任何數目之連續步 驟。應注意，可藉由直接接種而直接自儲存培養物進行肉 毒梭菌在發酵階段之生長。 在發酵階段中，含有來自種子生長之肉毒梭菌的種子培 養基之一部分或其全部可用於接種發酵培養基。較佳地， 具有來自種子生長階段之肉毒桿菌的種子培養基之約2-4% 用於接種發酵培養基。發酵用於在大範圍厭氧環境中產生 最大量的微生物（Ljungdahl 等人，Manual of industrial microbiology and biotechnology (1986)，Demain 等人編， American Society for Microbiology，Washington，D.C·第 84 頁）。 肉毒桿麵毒素可藉由使用熟悉蛋白質純化技術者所熟知 的蛋白質純化方法而加以分離且純化（C〇ligan等人Current 95765.doc -26- 1294914

Protocols in Protein Science，Wiley & Sons ’ Ozutsumi等人 Appl· Environ· Microbiol· 49; 939-943 · 1985) o 為生成肉毒桿菌毒素，肉毒梭菌之培養物生長在種子培 養基中，以接種發酵培養基。視在發酵階段所生成肉毒桿 菌之規模不同，與生長於種子培養中之連續步驟之數目會 有所變化。然而，如前文所論述，在發酵階段之生長係接 種儲存培養物直接進行。以動物為基礎之種子培養基通常 包含BHI、細菌蛋白腺、NaCl及葡萄糠，以用於肉毒梭菌 生長。如前文所論述，可根據本發明製備替代性種子培養 基，其中係以非動物為基礎之成分取代以動物為基礎之成 分。例如（但不限於），以大豆為基礎之產物可取代用於肉毒 梭菌之生長及肉毒桿菌毒素之生成之種子培養基中之BHI 及細菌蛋白腺。儘管肉毒梭菌之培養物可在含有非溶解性 大豆之培養基中生長，但該以大豆為基礎之產物較佳為可 溶於水，且包含經水解大豆。然而，生長程度及隨後毒素 生成之含量在衍生自可溶性大豆產物之培養基中較高。 任何來源之以大豆為基礎之產物可使用於根據本發明 中。較佳地，該大豆為經水解大豆。可自多個商業售主獲 得經水解大豆之來源。其包括（但不限於）：Hy-Soy (Quest International)、Soy peptone (Gibco)、Bac-soytone (Difco)、 AMISOY (Quest)、NZ soy (Quest)、NZ soy BL4、NZ soy BL7 ' SE50M (DMV International Nutritionals, Fraser, N.Y.) 及SE50MK (DMV)。經水解大豆之最佳來源為Hy-Soy或 SE50MK。經水解大豆之其它可能來源為已知。 95765.doc -27- 1294914

Hy-Soy在如本發明種子培養基中之濃度範圍為25-2〇〇 公克/公升之間’ Hy_Soy在種子培養基中之濃度範圍較佳為 5〇_150公克/公升之間，Hy-Soy在種子培養基中之濃度最佳 為約100公克/公升。此外，NaCl濃度範圍為0· 1-2.0公克/公 升之間’ NaCl濃度範圍較佳為〇·2_ι·〇公克/公升之間，NaCl 在種子培養基中濃度最佳為約〇·5公克/公升。葡萄糖濃度範 圍為0.1公克/公升與5.0公克/公升之間，葡萄糖濃度範圍較 佳為0_5-2·0公克/公升之間，在種子培養基中葡萄糖濃度最 佳為約1.0公克/公升。本發明較佳但非必要的是以高溫高壓 一起滅菌處理葡萄糖及種子培養基中之其它成分。在生長 之前，種子培養基之較佳pH範圍為7.5-8.5之間。在肉毒梭 菌生長之前，種子培養基之pH最佳為約8.1。 在種子培養基中，肉毒梭菌之生長可以一或多個階段進 行。較佳地，在種子培養基中之生長以兩個階段進行。在 第一階段中’將肉毒梭菌之培養物懸浮於一定量的種子培 養基中且在34士 1°C下於厭氧環境中培育24-48小時。較佳 地，在階段一中之生長進行約48小時。在第二階段中，將 第一階段含有肉毒梭菌之培養基之一部分或全部用於接種 第二階段種子培養基，以進一步生長。在接種之後，將該 第二階段培養基在34士 1°C下，亦於厭氧環境中培育約ι_4 天。在該第二階段種子培養基中之生長較佳進行約3天。較 佳為，在種子培養基中以最後生長來接種發酵培養基之 前’在任何階段之種子培養基中之生長均不引起細胞溶菌 作用。 95765.doc -28- 1294914

含有動物副產物以用於肉毒梭菌生長之標準發酵培養基 可基於 Mueller與 Miller之製法（MM; J. Bacteriol. 67:271， 1954)。在含有動物副產物之MM培養基中的成份包括BHI 及NZ-CaseTT。NZ-CaseTT為肽及胺基酸的可購來源，該等 肽及胺基酸衍生自在動物乳中所發現之一組蛋白質一乾路 素的酶解。本發明證明：非基於動物之產物可替代發酵培 養基中之BHI及NZ-CaseTT。例如（但不限於），基於大豆之 產物可替換用於肉毒梭菌發酵之MM培養基的基於動物之 成分。儘管如先前所論述，不溶性大豆產物亦可用於實施 本發明，但基於大豆之產物較佳為水溶性且自經水解大豆 衍生而得。 如本發明可使用基於大豆之產物的任何來源。經水解大 豆較佳以商標名 Hy-Soy 自 Quest International Sheffield)獲 得或以商標名 SE50MK 自 DMV International Nutritional

Fraser，N.Y.)獲得。可溶性大豆產物亦可自多種來源獲取， 其中包括（但不限於）·· Soy peptone (Gibco)、Bac_soytone (Difco)、AMISOY (Quest)、NZ soy (Quest)、NZ soy BL4、 NZ soy BL7 及 SE50MK DMV International Nutritionals， Fraser，Ν·Υ·) o 在本發明之另一較佳實施例中，用於肉毒梭菌發酵之培 養基不含動物副產物且包含經水解大豆、葡萄糖、NaCl、 Na2HP04、MgS047H20、KH2P〇4、L-半胱胺酸、L_酪胺酸 及鐵粉。如對於種子培養基所揭示，經水解大豆可替換發 酵培養基中之動物副產物。該等動物副產物包括BHI及 95765.doc -29- 1294914 NZ-CaseTT酶分解之乾酪素）。 用於生成肉毒桿菌毒素之發酵培養基中的Hy-Soy濃度範 圍較佳為約10-100公克/公升之間。Hy-Soy濃度範圍較佳為 約20-60公克/公升之間。在發酵培養基中jjy-Soy之濃度最 佳為約35公克/公升。為生成最大量之肉毒桿菌毒素，發酵 培養基中之成分的尤其較佳之濃度為：約7.5公克/公升的葡 萄糖；5.0公克/公升的NaCl ; 0.5公克/公升的Na2HP〇4 ; 175 毫克/公升的KH2P〇4; 50毫克/公升的MgS047H20; 125毫克 /公升的L-半胱胺酸；及125毫克/公升的L-酪胺酸。所用粉 末化鐵之量的範圍可為自50毫克/公升L至2000毫克/公升。 粉末化鐵之量範圍較佳為約100毫克/公升與1〇〇〇毫克/公升 之間。用於發酵培養基中之粉末化鐵之量範圍最佳為約200 毫克/公升與600毫克/公升之間。

為生成最佳水平毒素，基於大豆之發酵培養基的最初pH 值（在高壓釜處理前）範圍較佳為約5 5至71之間。發酵培養 基之最初pH值較佳為約6·〇至6·2之間。如對於種子培養基 2描述，發酵培養基之成分（包括葡萄糖與鐵）較佳為一同經 高壓釜處理，以進行滅菌。 較佳地，將用於肉毒梭菌生長之第二階段種子培養基之 β刀用於接種發酵培養基。發酵是在厭氧腔室中於約 W±1°C下進行約7至9天。藉由量測培養基之光學密度⑴d.) 來監控生長。較佳在如生長量測（光學密度）所測定細胞溶菌 作用已進行至少48小時之後停止發酵。隨著細胞溶菌作 用’培養基之O.D.會降低。 95765.doc -30- 1294914 在本發明之-較佳實施财，用於長_存肉毒梭菌且 用於接種種子培養基之肉毒梭菌的培養物在代儲存之前 於豆奶中生長且滚乾。在動物乳中經滚乾以用於儲存之肉 毒梭菌的培養物亦可用於生成肉毒 在生成肉毒桿菌毒素之整個過程中，保持實質=含= 副產物之培養基，較佳為將肉毒梭菌之最初培養物保存於 豆奶中而非動物乳中。 實例 以下實例陳㉛了本發明戶斤涵蓋之特$方法且並不意欲限 制本發明之範圍。肉毒梭菌培養物可自若干來源獲取，其 中包括 List Laboratories、CampbeU、California。全部實驗 及培養基均可以二次蒸顧水製備。在以下之全部實例中，” 肉毒梭菌’f意指肉毒梭菌類型A之Hall A ATCC制定編號 3502)菌株。 實例1 用於肉毒梭菌之不含動物產物之種子培養基的製備 對於母1公升培養基而言，可使用以下成份來製備對照種 子培養基· NaCl (5公克）、Bacto-peptone 10公克）、葡萄糖 (10公克）、BHI至1公升）、pH值為8·1以5NNaOH調節）。 對於每1公升培養基而言，可使用以下成份來製備測試 (不含動物產物）種子培養基·· NaCl (5公克）、Soy-peptone (10 公克）、葡萄糖（10公克）、Hy-Soy (35克/公升，以組成1公升 培養基流體）、pH值為8·1 (以5 N NaOH調節）。 實例2 95765.doc -31 - 1294914 在不含動物產物之種子培養基中培養肉毒梭菌 可將肉毒梭菌之凍乾培養物各懸浮於實例1中的1毫升對 照種子培養基及1毫升測試種子培養基中，將其（各種子培 養基）分開放入兩個試管中，其中各試管可含有10毫升的各 自種子培養基，且接著於34°c下培育約24-48小時。然後， 可將一毫升培養物用於接種含有40毫升（各自）種子培養基 之125毫升之DeLong Bellco培養瓶。可在Coy厭氧室（Coy Laboratory Products Inc·，Grass Lake，Mich.)中，將該接種 之培養物於33°C 土 1°C下培育24小時。 實例3 用於肉毒梭菌之不含動物產物之發酵培養基的製備 對於每兩公升培養基而言，可使用以下成份來製備基礎 發酵培養基：葡萄糖（15公克）、NaCl(10公克）、NaH2P04(l 公克）、ΚΗ2Ρ04(0·350公克）、MgSO47H2O(0.1 公克）、半胱 胺酸-HC1(0.250公克）、酪胺酸-HC1(0.250公克）、鐵粉（1公 克）、ZnCl2(0.250 公克）及 MnCl2(0.4 公克）。 對於所製備之每兩公升培養基而言，可使用以下成份來 製備對照發酵培養基：BHI(500毫升；此對應於約45.5克淨 重之牛心浸出物）、NZ-CaseTT(30公克）及基礎培養基（達到2 公升）、pH值為6.8。 可首先製備基礎發酵培養基且將其調節至pH 6.8。然 . 後，製備牛心浸出物（BHI)BHI且以5 N NaOH將其pH調節至 8。然後，將BHI添加至基礎培養基中。而後，可製備 NZ-CaseTT。接著，將NZ-CaseTT添加入已添加有牛心浸出 95765.doc -32- 1294914 物之基礎培養基中，且藉由添加HC1而使NZ-CaseTT溶解。 而後’可以5 N NaOH將pH調節至6.8。接著，將此培養基 分成8毫升之部份，且放入16個1〇〇毫米測試試管之每一個 中，繼之於120°C下高壓釜處理25分鐘。 可藉由使用測試氮源來替代對照發酵培養基中所存在之 BHI來製備測試發酵培養基（不含動物產物）。適合之測試發 酵培養基氮源包括·· Hy-Soy (Quest)、AMI-Soy (Quest)、 NZ-Soy (Quest)、NZ-Soy BL4 (Quest)、NZ-Soy BL7 (Quest)、Sheftone D (Sheffield)、SE50M (DMV)、SE50 (DMV)、SE%) MK (DMV)、Soy Peptone (Gibco)、 Bacto-Soyton (Difco)、Nutrisoy 2207 (ADM)、Bakes Nutrisoy (ADM)、Nutrisoy flour、Soybean meal、Bacto-Yeast Extract (Difco)、Yeast Extract (Gibco)、Hy-Yest 412 (Quest)、Hy-Yest 441 (Quest)、Hy-Yest 444 (Quest)、Hy_Yest 455 (Quest)、 Bacto-Malt Extract (Difco)、Corn Steep及 Proflo(Traders)。 除了不包括BHI外可如上文中對於對照發酵培養基之陳 述來製備測試發酵培養基，且首先以3 N HC1或以5 N NaOH 將相應氮源調節至pH 6.8。可將培養基以8毫升部份分配至 16個100毫米測試試管中，繼之於120°C下高壓爸處理20-30 分鐘。 實例4 在不含動物產物之發酵培養基中肉毒梭菌的生長 可將測試種子培養基培養物（不含動物產物）之40 μΐ部份 用於在8毫升的16x100毫米測試試管中接種各8毫升對照或 95765.doc -33- 1294914 測試發酵培養基等份試樣。然後，可於33 土 1°C下培育培養 物24小時。接著將試管在厭氧腔室中加以培育以允許細菌 之生長。可以三次重複來執行各培養基分析（意即，可涉及 相同培養基之三次獨立接種），且亦可包括未經接種之對照 物’其可用作分光光度計中之空白值。可以Turner分光光 度計（型號330)於660奈米下，每24小時來量測生長（由光學 密度OD確定）。應在細胞溶菌作用持續約48小時之後停止培 養’且可接著量測肉毒桿菌毒素之產生。 對於每500毫升培養基而言，可以含有以下成份之Hy_s〇y 發酵培養基執行額外實驗：11厂8(^(17.5公克）、葡萄糖（3.75 公克）、NaCl(2.5 公克）、Na2HPO4(0.25 公克）、 MgS〇47H2〇(0.〇25 公克）、ΚΗ2Ρ〇4(〇·〇875 公克）、L-半胱胺 酸（0·0625公克）、L-酪胺酸（〇·〇625公克）、鐵粉（〇·25公克）、 pH 6.8 〇 實例5 由在不含動物產物之發酵培養基中生長之肉毒梭菌所產生 肉毒桿菌毒素的測定 可離心實例4的經培養細胞，且可接著確定上清液之pH 值。可藉由添加標準抗毒素且量測在絮凝作用之前所經時 間來量測在給定樣品中之肉毒桿菌毒素含量。可測定Kf(產 生絮凝作用所需時間，以分鐘計）及Lf(絮凝作用之限定；等 同於1國際單位之標準抗毒素，由絮凝作用建立）。對於給 定培養物而言，可自各發酵試管中取出4毫升發酵肉湯且可 組合在一起，使得總12毫升可混合於15毫升之離心試管 95765.doc •34- 1294914 中。可於4C下以5000 rpm離心該等試管（3400 g)。可將上 月液之1¾升荨份试樣添加至含有毫升標準肉毒桿 菌毒素抗血清之試管中，且可小心搖晃該等試管以混合其 内含物。而後，將該等試管置於45±rc之水浴中，且記錄 仞始時間。可頻繁地檢驗該等試管且將絮凝作用開始之時 間記錄為Kf。將在首先產生絮凝作用之試管中的毒素濃度 標記為LfFF。將在其次產生絮凝作用之試管中的毒素濃度 標記為LfT。 可對於以下兩者執行平行發酵、生長及毒素生成分析： (a)對知、種子培養基（用於接種對照發酵培養基）及對照發酵 培養基；及（2)(不含動物產物）測試種子培養基（用於接種測 試發酵培養基）及（不含動物產物）測試發酵培養基。重要的 疋，可確疋·肉毒梭菌在不含動物產物之培養基中的發酵 及自亦不含動物產物（以基於大豆之產物替換動物產物）之 培養物中的接種可導致約50或50以上之Lf毒素。Lf毒素最低等 於約10。Lf毒素較佳為至少20 0 Lf毒素最佳為5〇以上。 此外，可確定，各種大豆產物支援在缺少BHI之發酵培養 基中的肉毒梭菌生長。因此，可溶性大豆製劑可替換bhi 以用於肉毒梭菌之生長。最佳濃度可為125公克/公升或25 公克/公升。Hy-Soy(Sheffield)可給出最高生長。不溶性大 豆製劑效果不佳。 另外’可獲取結果以顯示· Quest Hy_Soy、DMV SE50MK 及Quest NZ-Soy在其替換bhi以用於肉毒梭菌生長的能力 方面為有效的大豆產物。該等結果可揭示，可能對於生長 95765.doc -35- 1294914 較佳之大豆產物（諸如Quest Hy-Soy、DMV SE50MK及Quest NZ-Soy)在替換BHI用於毒素產生上亦有效。對於毒素產生 而言，最佳的大豆產物可為22.75公克/公升之Quest Hy-Soy。此產物之較高濃度可產生較好的生長但並不改良 毒素產生。據提議，以SE50MK可獲取類似結果，其中較高 濃度可產生增加之生長，但並不增加毒素產生。另一方面， NZ-Soy在其較高濃度下可提供較高的生長且生成較多毒 素。 最後，可確定，大豆產物可有效地替換BHI及 NZ-CaseTT。自基於大豆之培養基中移除NZ-CaseTT可降低 約2-4倍之生長。在存在及不存在NZ-CaseTT之兩種情況 下，對於生長而言之最佳大豆產物可為SE50MK。Hy-Soy 可替換BHI及NZ-CaseTT，以用於毒素產生。然而，可能需 要1或2天之較長的發酵週期。Hy-Soy可替換培養基中之 BHI及NZ-CaseTT，以用於毒素產生。然而，可確定酵母提 取物可抑制毒素產生。 可確定22.75公克/公升之HY-Soy可完全替換BHI及 HY-CaseTT，以用於毒素產生。與對生長之影響不同（其中 56.88公克/公升之HY-Soy可為最佳），對於毒素產生階段而 言，34.13公克/公升之HY-Soy可為最佳。 因此，吾人已驚奇地確定了 Hy-Soy或[Hy_Soy +Hy-Yest] 可否替換培養基中之BHI及Bac to-peptone以用於肉毒梭菌 之種子生長。此外，可設計實驗以確定種子培養基中成分 之最佳濃度從而藉由肉毒梭菌產生最高水準的肉毒桿菌毒 95765.doc -36- 1294914 素。藉由肉毒梭菌在不含BHI及NZ-CaseTT的種子培養基及 發酵培養基中之生長而生成之毒素可達到或超過在含有 BHI及NZ-CaseTT之培養基中所得之水平。 吾人可確定用於種子培養基中生長之Hy-Soy或[Hy-Soy +Hy_Yest]的最佳濃度。實驗可證實·· Hy-Soy可替換BHI及 Bacto-peptone作為種子培養基中之氮源以用於肉毒梭菌之 生長且用於在隨後之發酵階段中產生肉毒桿菌毒素。同 樣，與Hy-Soy+Hy-Yest相比而言，Hy-Soy作為種子培養基 中之氮源在隨後之發酵步驟中可產生較高水平之肉毒桿菌 秦素。產生最高水平之毒素的種子培養基中Hy-Soy之濃度 範圍為約62.5公克/公升至1〇〇公克/公升。 設計額外試驗以確定Hy_s〇y在種子培養基中之最優濃 度’以用於藉由肉毒梭菌經由發酵來產生最大量之肉毒桿 菌毒素。因此，種子培養基中之3〇公克、5〇公克、75公克 及100公克之Hy-Soy均可藉由肉毒梭菌之發酵而導致產生 肉毒桿菌毒素，且其可比得上或超過在含有bhi及 Bacto-peptone作為氮源之種子培養基中所製成之肉毒桿菌 毒素的水平。 了發現在種子培養基中1〇〇公克/公升濃度之Hy-Soy於隨 後之發酵步驟中可導致產生最高水平之毒素。此外，數據 顯不’ Hy-Soy種子培養基之種子步驟1在48小時之後比24 小時之後產生更多生長。 文中引用了多種公開案、專利案及/或文獻，其全部内容 均以引用的方式倂入本文中。 95765.doc 1294914 儘管已關於某些較佳方法而詳細描述了本發明，但處於 本發明範圍内的其它實施例、變形及修正均係可能。舉例 而言，多種不含動物產物之方法係處於本發明之範圍内。 因此’以下中4專利範圍之精神及範圍不應僅限於上文 所陳述之較佳實施例的描述。 95765.doc

Claims (1)

1294m S\ [i Ψ、rjf7791號專利申請案 r , 又中請專利範圍替換本(96年9月)匕—^ Jf、申請專利範圍： .-種製得—具有生物活性之肉 括步驟為： 母I之方法 其包 母菌或蔬菜所獲得 、麥芽及玉米所組 (a)提供一發酵培養基，其包含由酵 之蛋白質，其中該蔬菜係選自由大豆 成之群； (b) 在允許產生一肉毒桿菌喜丰 .# ^ t扦囷毋π之條件下，於該發酵培 養基中培養一肉毒梭菌細菌；及 (c) 自該發酵培養基中回收_ 主* Τ ^ 具有生物活性之肉毒桿菌 毋素。 叫求項1之方法，其中在提供發酵培養基之步驟中，該 坨養基包含一衍生自蔬菜之蛋白質產物。 3·如=求項2之方法，其中該蔬菜為大豆。 月求員1之方法’其中在該培養步驟中，執行該培養直 於、、、田胞溶菌作用而使得培養物之細胞密度下降。 长員1之方法，其中在該培養步驟中，執行該培養直 至由於細胞〉谷菌作用使得細胞密度之初次下降後至少Μ 小時。 6. 一種用於製備一肉切菌毒素之方法 為： 該方法包括步驟 )k ί、弟培養基，其包含一衍生自蔬菜之蛋白質 產物’其中该蔬菜係、選自由大豆、麥芽及玉米所組成之 群； (b)在允許一肉毒梭菌生長之條件下，於該第一培養基 95765-960929.doc 1294914 中培養該肉毒梭菌細菌； 衍生自蔬菜之蛋白質 麥芽及玉米所組成之 (c)k供一弟一培養基，其包含 產物，其中該蔬菜係選自由大豆 群； (幻以該第一培養基接種該第二培養基； ⑷在允許產生一肉毒桿菌毒素的條件下， 養基中培養一肉毒梭菌細菌；及 一圪 (f)回收该肉毒桿菌毒素。 如請求項6之方法，其中在提供 心 杈t、弟一培養基之步驟中，今 弟一培養基中包含一衍生白士- μ “ _生自大丑之蛋白質產物，且1中 在接種該第二培養基之步驟中， '、 4弟一培養基包含衍生 自大丑之該蛋白質產物。 8· 請求項6之方法’其中.在提供第-培養基之步驟中，該 2培養基包含-經水解大豆，且其中在接種—第二培 養广之❹射，該發酵培養基包含經水解大豆。 9 ·如請求項6之方法，苴中λ笛一 w至& 八 罘一坨養基中培養肉毒梭菌之 二驟中，該等條件包含約攝氏34度之溫度，且進一步包 含在培養期間細胞密度不會降低， ^中在以第-培養基接種第二培養基之步驟中，將該 第-培養基之2%至4〇/。用於接種該第二培養基；且 其中在於該第二培養基中培養該細菌之步驟中，允許 生長之該等條件包含約攝氏34度之溫度，且進一步包含 ，行培養直至由於細胞溶菌❹而使得培養物細胞密度 減少。 95765-960929.doc 1294914 ίο. 11. 12. 13. 、、且合物’其包含用於產生— 梭滅及培養物培養基，其中該 4目毒素之一肉毒 之蛋白質產物，其中該鋅二基包含-衍生自蔬菜 所組成之群。 μ^采糸選自由大豆、麥芽及玉米 =項10之組合物，其中該蔬菜為“ 項10之組合物，其中該組合物包含__ Λ -種製作_實質性不含動物：：解大：。 其中該活性成分為一肉毒桿菌毒素二組合物之方法’ ⑷製得-具有生物活性之肉毒桿菌毒方，法包:步驟為： j毋杆_|素，其步驟為： 匈料基，其包含切母8或蔬菜所 :付之蛋白質，其中該蔬菜係選自由大豆、麥 芽及玉米所組成之群； (11)在允許產生一肉毒桿菌毒素之條件下，於該發 酵培養基中培養一肉毒梭菌；及 (⑴）自该發酵培養基中回收一具有生物活性之肉毒 桿卤毒素； (b)以一合適的賦形劑調配該肉毒桿菌毒素，藉此製成 一貫質性不含動物產物之醫藥組合物，其中該活性成分 為一肉毒桿菌毒素。 95765-960929.doc