ES2344843T3 - Medios exentos de producto animal y procedimientos para obtener una toxina botulinica. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para obtener una toxina botulínica biológicamente activa, que comprende las etapas de: (a)proporcionar un medio de fermentación que esté exento de un producto derivado de un animal, comprendiendo el medio de fermentación soja hidrolizada, (b)cultivar una bacteria Clostridium botulinum en el medio de fermentación en condiciones que permitan la producción de una toxina botulínica, y (c)recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación.

Description

Medios exentos de producto animal y procedimientos para obtener una toxina botulínica.
Antecedentes
La presente invención se refiere a un medio y a un procedimiento para obtener toxina botulínica biológicamente activa. En particular, la presente invención se refiere a medios, cultivos y procedimientos de fermentación anaeróbica, sustancialmente libres de producto animal, de un organismo tal como la bacteria botulínica Clostridium, para obtener abundante toxina botulínica biológicamente activa.
Una composición farmacéutica adecuada para administración a un ser humano para una finalidad de investigación, terapéutica, diagnóstica o cosmética puede comprender un ingrediente activo. La composición farmacéutica puede comprender también uno o varios excipientes, tampones, vehículos, estabilizadores conservantes y/o agentes que confieren volumen. El ingrediente activo en una composición farmacéutica puede ser un ingrediente biológico tal como una toxina botulínica. La toxina botulínica se puede obtener por un procedimiento de cultivo, fermentación y composición que hace uso de uno o varios productos derivados de animales (tal como un medio de cultivo de caldo de carne y una fracción de sangre o un excipiente derivado de sangre). La administración a un paciente de una composición farmacéutica cuyo ingrediente biológico activo se obtiene por un procedimiento que hace uso de productos derivados de animales puede someter al paciente al riesgo potencial de recibir diversos patógenos o agentes infecciosos. Por ejemplo, en una composición farmacéutica pueden estar presentes priones. Un prión es una partícula infecciosa proteinácea que se supone que surge como isomorfo de conformación anormal de la misma secuencia de ácido nucleico que hace la proteína normal. Se ha supuesto hipotéticamente además que la capacidad de infección reside en una "reacción de reclutamiento" de la proteína isomorfa normal al isomorfo de la proteína de prión a un nivel postdireccional. Aparentemente, la proteína celular endógena normal es inducida a un plegamiento anormal en una conformación patógena de prión.
La enfermedad de Creutzfeld-Jacob es un raro trastorno neurodegenerativo de encefalopatía humana espongiforme transmisible en la que el agente transmisible aparentemente es un isomorfo anormal de una proteína de prión. Un individuo con enfermedad de Creutzfeld-Jacob puede deteriorarse desde una salud aparentemente perfecta a un mutismo acinético en seis meses. Así, puede existir riesgo potencial de adquirir una enfermedad mediada por prión, tal como la enfermedad de Creutzfeld-Jacob, por administración de una composición farmacéutica que contenga un agente biológico, tal como una toxina botulínica, obtenida usando productos derivados de animales.
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Toxina botulínica
El género Clostridium tiene más de 127 especies agrupadas por morfología y función. La bacteria anaeróbica, gram positiva, Clostridium botulinum produce una potente neurotoxina polipeptídica, toxina botulínica, que causa una enfermedad neuroparalítica en seres humanos y animales, denominada botulismo. Comúnmente, la Clostridium botulinum y sus esporas se encuentran en el suelo y la bacteria puede crecer en recipientes de alimentos inadecuadamente esterilizados y cerrados de conservas domésticas, que son la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo típicamente se manifiestan de 18 a 36 horas después de comer los alimentos infectados con un cultivo o con esporas de Clostridium botulinum. La toxina botulínica aparentemente puede pasar no atenuada a través del revestimiento del intestino y atacar neuronas periféricas motoras. Los síntomas de intoxicación por la toxina botulínica pueden evolucionar desde dificultad al andar, tragar y hablar a la parálisis de los músculos respiratorios y la muerte.
El tipo A de toxina botulínica es el agente biológico natural más letal conocido para el hombre. Aproximadamente, 50 picogramos de toxina botulínica de tipo A (complejo de neurotoxina purificado) es DL_{50} en ratones. Sobre base molar, el tipo A de toxina botulínica es 1,8 mil millones de veces más letal que la difteria, 600 millones de veces más letal que el cianuro sódico, 30 millones de veces más letal que la cobratoxina y 12 millones de veces más letal que el cólera. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, págs. 63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins 11, editado por B.R. Singh y otros, Plenum Pres, New York (1976) (donde la DL_{50} del tipo A de la toxina botulínica de 0,3 ng igual a 1 se corrige por el hecho de que aproximadamente 0,05 ng de BOTOX® es igual a 1 unidad). BOTOX ® es la marca comercial del complejo del tipo A de toxina botulínica disponible comercialmente en Allergan, Inc., de Irvine, California. Una unidad (U) de toxina botulínica se define como DL_{50} después de inyección peritoneal en ratones hembra Swiss Webster con un peso de 18-20 g cada uno. Con otras palabras, una unidad de toxina botulínica es la cantidad de toxina botulínica que mata 50% de un grupo de ratones hembra Swiss Webster. Se han caracterizado siete neurotoxinas botulínicas en general inmunológicamente distintas que son, respectivamente, los serotipos A, B, C_{1}, D, E, F y G, cada una de las cuales se distingue por neutralización con anticuerpos específicos para el tipo. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en cuanto a la especie animal a que afectan y la gravedad y la duración de la parálisis que inducen. Por ejemplo, se ha determinado que el tipo A de toxina botulínica es 500 veces más potente, según es ha determinado por el grado de parálisis producido en ratas, que el tipo B de toxina botulínica. Además, se ha determinado que el tipo B de toxina botulínica es no tóxico en primates a una dosis de 480 U/kg, que es aproximadamente 12 veces la DL_{50} de primates para el tipo A de toxina botulínica. Al parecer, las toxinas botulínicas se unen con gran afinidad a las neuronas motoras colinérgicas, se translocalizan en la neurona y bloquean la liberación presináptica de acetilcolina.
Las toxinas botulínicas se han utilizado en series clínicas para el tratamiento de, por ejemplo, trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. El tipo A de toxina botulínica ha sido aprobado por la U.S. Food and Drug Administration para el tratamiento de blefaroespasmos esenciales, estrabismo y espasmo hemifacial en pacientes de más de 12 años, para el tratamiento de la distonía cervical y para el tratamiento de la arruga del entrecejo (facial). La FDA ha aprobado también un tipo B de toxina botulínica para el tratamiento de la distonía cervical. Los efectos clínicos de la inyección periférica (esto es, intramuscular o subcutánea) del tipo A de toxina botulínica usualmente se ven antes de una semana después de la inyección y frecuentemente al cabo de unas pocas horas después de la inyección. La duración típica de la mitigación sintomática (esto es, parálisis de músculo flácido) de una sola inyección del tipo A de toxina botulínica puede ser de aproximadamente tres meses a aproximadamente seis meses.
Aunque aparentemente todos los serotipos de toxinas botulínicas inhiben la liberación de acetilcolina neurotransmisora en la conexión neuromuscular lo hacen afectando a diferentes proteínas neurosecretoras y/o a la escisión de estas proteínas en diferentes sitios. El tipo A de toxina botulínica es una endopeptidasa de zinc que puede hidrolizar específicamente una unión de péptido de la proteína SNAP-25 intracelular asociada a la vesícula intracelular asociada. El tipo E de toxina botulínica también escinde la proteína asociada sinaptosómica de 25 kilo Dalton (kD) (SNAP-25), pero también selecciona diferentes secuencias de aminoácidos dentro de esta proteína, en comparación con la toxina A Los tipos B, D, F y G de toxina botulínica actúan sobre la proteína asociada a vesícula (VAMP, también denominada sinaptobrevina), escindiendo cada serotipo la proteína en un sitio diferente. Finalmente, el tipo C_{1} de resina botulínica ha demostrado que escinde sintaxina y SNAP-25, ambas. Estas diferencias del mecanismo de acción pueden afectar a la potencia relativa y/o la duración de la acción de los diversos serotipos de toxina botulínica.
Independientemente del serotipo, el mecanismo molecular de la intoxicación de la toxina parece que es similar e implica como mínimo tres etapas. En la primera etapa del proceso, la toxina se une a la membrana presináptica de la neurona diana por interacción específica entre la cadena pesada (cadena H) y un receptor de la superficie celular; el receptor se cree que es diferente para cada serotipo de la toxina botulínica y para la toxina botulínica. El segmento terminal carboxilo de la cadena H, H_{C}, parece que es importante para que la toxina seleccione la superficie celular.
En la segunda etapa, la toxina cruza la membrana plasmática de la célula envenenada. Primeramente, la célula engulle la toxina mediante endocitosis mediada por receptor y se forma un endosoma que contiene la toxina. Luego, la toxina se escapa del endosoma al citoplasma de la célula. Esta última etapa se cree que está mediada por el segmento terminal amino de la cadena de H, H_{N}, que desencadena un cambio de conformación de la toxina en respuesta a un pH de aproximadamente 5,5 o más bajo. Se sabe que los endosomas poseen una bomba de protón que disminuye el pH intraendosomático. El desplazamiento de conformación expone restos hidrófobos de la toxina, lo que permite que la toxina se embeba en la membrana endosómica. La toxina se translocaliza luego a través de la membrana endosómica en el citosol.
La última etapa del mecanismo de la actividad de la toxina botulínica parece que implica la reducción de la unión por el enlace disulfuro de la cadena H y la L. La actividad tóxica total de la botulina y las toxinas botulínicas está contenida en la cadena L de la holotoxina; la cadena L es una endopeptidasa de zinc (Zn^{2+}) que escinde selectivamente proteínas esenciales para reconocimiento y acoplamiento de vesículas que contienen neutrotransmisor con la superficie citoplasmática de la membrana plasmática, y la fusión de las vesículas con la membrana plasmática. La neurotoxina botulínica, las toxinas botulínicas B, D, F y G causan degradación de la sinaptobrevina (también denominada proteína asociada a vesículas (VAMP)), una proteína sinaptosómica de membrana. La mayor parte de la VAMP presente en la superficie citosólica de la vesícula sináptica se elimina como resultado de uno cualquiera de estos acontecimientos de escisión. Cada toxina escinde específicamente un enlace diferente.
El peso molecular de la molécula de proteína de toxina botulínica, para la totalidad de los siete serotipos conocidos de toxina botulínica, es de aproximadamente 150 kD. Es interesante que las toxinas botulínicas son liberadas por la bacteria Clostridiana como complejos que comprenden la molécula de proteína de toxina botulínica de 150 kD asociada con proteínas no tóxicas. Así, el complejo del tipo A de toxina botulínica puede ser producido por la bacteria Clostridiana en las formas de 900 kD, 500 kD y 300 kD. Los tipos B y C_{1} de toxina botulínica se producen aparentemente sólo como complejo de 500 kD. El tipo D de toxina botulínica se produce como complejos 300 kD y 500 kD. Finalmente, los tipos E y F de toxina botulínica se producen sólo como complejos de aproximadamente 300 kD. Los complejos (esto es, un peso molecular mayor que aproximadamente 150 kD) se cree que contienen una proteína no tóxica de hemaglutinina y una proteína no tóxica no hematoglutinínica. Estas dos proteínas no tóxicas (que junto con la molécula de toxina botulínica pueden comprender el complejo relevante de neurotoxina) pueden actuar para proporcionar a la molécula de toxina botulínica estabilidad frente a la desnaturalización y protección frente a los ácidos digestivos cuando se ingiere la toxina. Además, es posible que los complejos mayores de toxina botulínica (de un peso molecular mayor que aproximadamente 150 kD) den por resultado una velocidad de difusión más lenta de la toxina botulínica fuera del sitio de inyección intramuscular del complejo de toxina botulínica. Los complejos de toxina pueden disociarse en la proteína de toxina y las proteínas de hematoglutinina por tratamiento del complejo con hematíes a pH 7,3. La proteína de la toxina tiene una marcada inestabilidad después de eliminación de la proteína de hematoglutinina.
Todos los serotipos de toxina botulínica son producidos por la bacteria Clostridium botulinum como proteínas inactivas de cadena simple que deben ser escindidas o melladas por proteasas para ser neuroactivas. Las cepas bacterianas que producen los serotipos A y G de toxina botulínica poseen proteasas endógenas y, por tanto, los serotipos A y G se pueden recuperar de cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. A diferencia, los serotipos C_{1}, D y E de toxina botulínica son sintetizadas por cepas no proteolíticas y, por tanto, son típicamente inactivados cuando es recuperan del cultivo. Sin embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo B de toxina botulínica sólo escinden una porción de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas melladas y no melladas depende del tiempo de incubación y la temperatura del cultivo. Por tanto, un cierto porcentaje de cualquier preparación de, por ejemplo, el tipo B de toxina botulínica es probable que sea inactivo, posiblemente siendo ello la causa de la significativamente menor potencia del tipo B de toxina botulínica en comparación con el tipo A de toxina botulínica. La presencia de moléculas inactivas de toxina botulínica en una preparación clínica contribuirá a la carga global de proteína de la preparación, que se ha asociado a antigenia incrementada, sin contribuir a su eficacia clínica. Además, es sabido que el tipo B de toxina botulínica tiene, después de inyección intramuscular, una duración de la actividad más corta y también que es menos potente que el tipo A de toxina botulínica al mismo nivel de dosis.
Estudios in vitro han indicado que la toxina botulínica inhibe la liberación inducida por el catión calcio de la acetilcolina y la norepinefrina de cultivos primarios de células y tejido del tronco del encéfalo Además se ha dado cuenta de que la toxina botulínica inhibe la liberación inducida de glicina y de glutamato en cultivos primarios de neuronas de la médula espinal y que, en preparaciones de sinaptosomas del cerebro, la toxina botulínica inhibe la liberación de cada uno de los neurotransmisores acetidilcolina, dopamina, norepinefrina, CGRP y glutamato.
El tipo A de toxina botulínica cristalina de alta calidad se puede producir a partir de la cepa Hall A de Clostridium botulinum con características de >3 x 10^{7} U/mg, una A_{260}/A_{278} de menos de 0,60 y un patrón inequívoco de bandas en gel de electroforesis. Se puede usar el conocido procedimiento de Schantz para obtener el tipo A de toxina botulínica cristalina, según Schantz E.J. y otros, Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol Rev. 56:80-99 (1992) 56:80-99 (1992). Generalmente, el complejo del tipo A de toxina botulínica se puede aislar y purificar a partir de una fermentación por cultivo del tipo A de Clostridium botulinum en un medio adecuado. La toxina en bruto se puede cosechar por precipitación con ácido sulfúrico y concentrar por ultrafiltración. La purificación se puede hacer disolviendo el precipitado de ácido en cloruro cálcico. Luego se puede precipitar la toxina con etanol frío. El precipitado se puede disolver en tampón de fosfato sódico y centrifugar. Después de secar, se puede obtener complejo del tipo A de toxina botulínica cristalina de aproximadamente 900 kD, con una potencia específica de DL_{50} 3 x 107 U/mg o más. Este conocido procedimiento se puede usar también, después de separar las proteínas no tóxicas, para obtener toxinas botulínicas puras tales como, por ejemplo, el tipo A de toxina botulínica con un peso molecular de aproximadamente 150 kD con una potencia específica de DL_{50} 1-2 x 10^{8 U}/mg o más, y el tipo F de toxina botulínica purificada con un peso molecular de aproximadamente 155 kD con una potencia especifica de DL_{50} 1-2 x 10^{7} U/mg o más.
Las toxinas botulínicas (la molécula de 150 kilodalton) y los complejos de toxina botulínica (de 300 kDa a 900 kDa) se puede adquirir, por ejemplo, de List Biologcal Laboratories, Inc., Campbell, California; el Centre for Applied Mictrobiology and Research, Porton Down, RU; Wako (Osaka, Japón), así como de Sigma Chemicals de St. Louis, Missouri. Entre las composiciones farmacéuticas comercialmente disponibles que contienen toxina botulínica están incluidas Botox® (un complejo de neurotoxina del tipo A de toxina botulínica con albúmina de suero humano y cloruro sódico), asequible de Allergan, Inc., de Irvine, California, en viales de 100 unidades como polvo liofilizado a reconstituir con cloruro sódico al 0,9% antes del uso), Dysport® (complejo de hemaglutinina de toxina de tipo A de Clostridium botulinum con albúmina de suero humano y lactosa en la formulación), asequible de Pisen Limited, Berkshire, RU, como polvo a reconstituir con cloruro sódico al 0,9% antes del uso), y MyoBloc^{MC} (una solución inyectable que comprende el tipo B de toxina botulínica, albúmina de suero humano, succinato sódico y cloruro sódico, a un pH de aproximadamente 5,6, asequible de Elan Corporation, Dublín, irlanda).
El éxito del tipo A de toxina botulínica para tratar una variedad de afecciones clínicas ha conducido al interés por otros serotipos de toxina botulínica. Así, al menos los tipos A, B, E y F de toxina botulínica se han usado clínicamente en seres humanos. Además, para tratar seres humanos se ha usado toxina botulínica pura (de aproximadamente 150 kD). Véase, por ejemplo, Col A. y otros, Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox R) with the highly purified neurotoxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov. Disord 2000; 15 (supl 3): 165. Por tanto, se puede preparar una composición farmacéutica usando una toxina botulínica pura (de aproximadamente
150 kDa).
Se sabe que la toxina botulínica de tipo A es soluble en soluciones acuosas diluidas a pH de 4-6,8. A pH por encima de aproximadamente 7, las proteínas no tóxicas estabilizadoras se disocian de la neutrotoxina, dando por resultado una pérdida gradual de toxicidad, en particular a medida que aumentan el pH y la temperatura. Schantz E.J. y otros, Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment, (en particular págs. 44-45), que es el capítulo 3 de Jankovic J. y otros, Therapy with Botulin Toxin, Marcel Dekker, Inc. (1994).
Como con las enzimas en general, las actividades biológicas de la toxinas botulínicas (que son peptidasas intracelulares) dependen, al menos en parte, de su conformación tridimensional. Así, el tipo A de toxina botulínica se destoxifica por calor, varios productos químicos, estiramiento de la superficie y secado de la superficie. Además, se sabe que la dilución del complejo de toxina obtenido por el conocido proceso de cultivo, fermentación y purificación a las concentraciones mucho mas bajas usadas para las composiciones farmacéuticas da por resultado una rápida destoxificación de la toxina a no ser que esté presente un estabilizador adecuado. La dilución de la toxina desde cantidades en miligramos a una solución que contiene nanogramos por mililitro presenta significativas dificultades a causa de la rápida pérdida de la toxicidad específica después de una dilución tan grande. Puesto que la toxina se debe usar meses o años después de que se formule la composición farmacéutica que contiene la toxina, la toxina se puede estabilizar con un agente estabilizador tal como albúmina y gelatina.
Se ha dado cuenta de que se ha usado una toxina botulínica en diversos escenarios clínicos incluidos los siguientes:
(1)
aproximadamente 75-125 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular (múltiples músculos) para tratar la distonía cervical,
(2)
2-10 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular para tratar líneas del entrecejo (surcos de las cejas) (5 unidades inyectadas intramuscularmente en el músculo procerus y 10 unidades inyectadas intramuscularmente en cada músculo corrugator supercilii),
(3)
aproximadamente 30-80 unidades de BOTOX® para tratar el estreñimiento por inyección intraesfínter del músculo puborrectal,
(4)
aproximadamente 1-5 unidades por músculo de BOTOX® inyectado intramuscularmente para tratar bleforoespasmo por inyección en el músculo lateral pretarsal orbicularis oculi del párpado superior y el músculo lateral pretarsal orbicularis oculi del párpado inferior,
(5)
para tratar el estrabismo, se han inyectado intramuscularmente en músculos extraoculares entre 1 y 5 unidades de BOTOX®, variando la cantidad inyectada sobre la base del músculo en el que se inyecta y la cuantía de parálisis del músculo deseada (esto es, la cuantía de la corrección de dioptrías deseada),
(6)
para tratar la espasticidad después de un accidente cerebrovascular, por inyección intramuscular de BOTOX® en cinco diferentes músculos flexores de miembros superiores según se indica:
(a)
flexor digitorum profundis: 7,5 U a 30 U,
(b)
flexor digitorum sublimus: 7,5 U a 30 U,
(c)
flexor carpi ulnaris: 10 U a 40 U,
(d)
flexor carpi radialis: 15 U a 60 U,
(e)
bíceps brachii: 50 U a 200 U. Cada uno de los cinco músculos indicados ha recibido la inyección en la misma sesión, de manera que el paciente recibe de 90 a 360 U de BOTOX® en el músculo flexor del miembro superior por inyección intramuscular en cada sesión de tratamiento,
(7)
para tratar la migraña, la inyección pericraneal (simétricamente en los músculos glabellar, frontalis y temporalis) de 25 U de BOTOX® ha demostrado un beneficio significativo como tratamiento profiláctico de la migraña en comparación al vehículo, por evaluación de las mediciones de la menor frecuencia de la migraña, gravedad máxima, vómitos asociados y uso de medicación aguda durante un período de tres meses después de la inyección de 25 U.
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Es conocido que el tipo A de toxina botulínica puede tener eficacia durante hasta 12 meses (European J. Neurology 6 (supl. 4): págs 111-1150: 1999) y, en algunas circunstancias, hasta 27 meses. The Laryngoscope 109:1344-1346:1999. Sin embargo, la duración de una inyección tranmuscular de Botox® típicamente es de aproximadamente 3 a 4 meses.
Una composición farmacéutica que contiene toxina botulínica, disponible comercialmente, se vende bajo la marca comercial BOTOX® (asequible de Allergan, Inc., de Irvine, California). BOTOX® está constituida por un complejo del tipo A de toxina botulínica, albúmina de suero humano y cloruro sódico envasados en forma estéril, secada en vacío. El tipo A de toxina botulínica se obtiene a partir de un cultivo de la cepa Hall de Clostridium botulinum en un medio que contiene N-Z amina y extracto de levadura. El complejo de toxina de tipo A se purifica de la solución de cultivo mediante una serie de precipitaciones, obteniéndose un complejo cristalino que consiste en la proteína de toxina activa de alto peso molecular y una proteína de hemaglutinina asociada. El complejo cristalino se redisuelve en una solución que contiene solución salina y albúmina esterilizada por filtración (0,2 micrómetros) antes de secado en vacío. El BOTOX® se puede reconstituir con solución salina estéril, no conservada, antes de inyección intramuscular. Cada vial de BOTOX® contiene aproximadamente 100 unidades (U) de complejo de tipo A de toxina botulínica de Clostridium, 0,5 miligramos de albúmina de suero humano y 0,9 miligramos de cloruro sódico en forma estéril, secado en vacío, sin conservante.
Para reconstituir BOTOX® secado en vacío se usa solución salina estéril normal sin conservante (solución inyectable de cloruro sódico al 0,9%) para llegar a la cantidad apropiada de diluyente en la jeringa de tamaño apropiado. Puesto que el BOTOX® se desnaturaliza por burbujeo o una agitación violenta similar, el diluyente se inyecta suavemente en el vial. Por razones de esterilidad, el BOTOX® se debe inyectar antes de 4 horas después de la reconstitución. Durante este tiempo, el BOTOX® se guarda en una nevera (2ºC a 8ºC). El BOTOX® reconstituido es transparente, incoloro y está exento de material en partículas. El producto secado al aire se almacena en un congelador por debajo de -5ºC.
En general, se distinguen cuatro grupos fisiológicos de C. botulinum (I, II, III y IV). Los organismos capaces de producir una toxina serológicamente diferente pueden proceder de más de un grupo fisiológico. Por ejemplo, las toxinas de tipo B y F pueden producirlas cepas del Grupo I o II. Además, se han identificado otras cepas de las especies de Clostridium (C, baratiii, tipo F; C. butyricum, tipo E; C. novyi, tipo C_{1} o D) que pueden producir neurotoxinas botulínicas.
En la Tabla I se indican los grupos fisiológicos de Clostridium botulinum.
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TABLA I Grupos fisiológicos de Clostridium botulinum
1 
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Estos tipos de toxina se pueden producir por selección del grupo fisiológico apropiado de organismos Clostridium botulinum. Los organismos designados como Grupo I usualmente se denominan proteoliticos y producen toxinas botulínicas de los tipos A, B y F. Los organismos designados como Grupo II son sacarolíticos y producen toxinas botulínicas de los Grupos B, E y F. Los organismos designados como Grupo III producen toxinas botulínicas de los grupos C y D y se distinguen de los organismos de los grupos I y II por la producción de cantidades significativas de ácido propiónico. Los organismos del Grupo IV producen sólo neurotoxina del tipo G.
Es conocida la obtención de una toxina del tétano usando medios específicos sustancialmente exentos de productos animales. Véase, por ejemplo, la patente U.S. nº. 6.558.926. Pero incluso los medios "exentos de productos animales" descritos en la patente usan Bacto-peptona, una digestión de carne. Significativamente, la producción de toxina de tétano por clostridium tetani frente a la producción de toxina botulínica por una bacteria Clostridium botulinum implica diferentes cultivos, medios y parámetros y consideraciones. Véase, por ejemplo, Johnson, E.A. y otros, Clostridium botulinum and its neurotoxins: a metabolic and celular perspective, Toxicon 39 (2001), 1703-1722. Whilmer y otros, Applied Env. Microbiol. 54 (1988), 753-759, describen medios definidos para cultivar C. Botulinam, aunque se encuentra una disminución de 5 a 50 veces en el rendimiento de toxina.
Se necesitan, por tanto, medios y procedimientos que estén exentos o sustancialmente exentos de productos animales, tales como proteínas derivadas de animales, para obtener o producir toxina botulínica biológicamente activa.
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Sumario
La presente invención satisface esta necesidad y proporciona medios y procedimientos que están exentos o sustancialmente exentos de productos animales, tales como proteínas derivadas de animales, para obtener o producir una toxina botulínica biológicamente activa. La toxina botulínica obtenida se puede usar para preparar composiciones farmacéuticas con un ingrediente activo de toxina botulínica.
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Definiciones
Tal como se usan aquí, las palabras o términos señalados a continuación tienen las siguientes definiciones.
"Aproximadamente" significa que el asunto, parámetro o término así calificado abarca un intervalo de más o menos diez por ciento por encima o por debajo del valor establecido del asunto, parámetro o término considerado.
"Administración" o "administrar" significa la etapa de dar (esto es, administrar) una composición farmacéutica a un sujeto. Las composiciones farmacéuticas descritas aquí se "administran localmente" mediante, por ejemplo, administración intramuscular (i.m.), intradérmica, subcutánea, administración intratecal, intracraneal, administración intraperitoneal (i.p.), o por vías de administración tópica (transdérmica) e implantación (por ejemplo, de un dispositivo de liberación lenta tal como un implante polímero o una bomba miniosmótica).
"Exento de producto animal" o "sustancialmente exento de producto animal" abarca, respectivamente, "exento de proteína animal", o "sustancialmente exento de proteína animal" y significa la ausencia o ausencia sustancial de derivado de sangre, mezcla sangres y otros productos o compuestos derivados de animales. "Animal" significa un mamífero (tal como un ser humano), pájaro, reptil, pez, insecto, araña u otra especie animal. "Animal" excluye microorganismos tales como bacterias. Así, un medio o procedimiento exento de producto animal o un medio o procedimiento sustancialmente exento de producto animal dentro del alcance de esta invención puede incluir una toxina botulínica o una bacteria Clostridium botulinum. Por ejemplo, un procedimiento exento de producto animal o un procedimiento sustancialmente exento de producto animal significa un procedimiento que está sustancialmente exento o enteramente exento de proteínas derivadas de un animal, tales como inmunoglobulinas, digestión de carne, subproductos de carne y productos o digestiones de leche o productos lácteos. Así, un ejemplo de un procedimiento exento de producto animal es un procedimiento (tal como un procedimiento de cultivo bacteriano o de fermentación bacteriana) que excluye productos de carne y leche o subproductos de carne o leche.
"Toxina botulínica" significa una neurotoxina producida por Clostridium botulinum, así como una toxina botulínica (o su cadena ligera o su cadena pesada) producida recombinantemente por una especie no Clostridiana. La expresión "toxina botulínica", tal como se usa aquí, abarca los serotipos A, B, C, D, E, F y G de resina botulínica. Toxina botulínica, tal como se usa aquí, abarca también complejo de toxina botulínica (esto es, los complejos de 300, 600 y 900 kDa) así como la toxina botulínica purificada (esto es, de aproximadamente 150 kDa). "Toxina botulínica purificada" se define aquí como una toxina totulínica que está aislada, o sustancialmente aislada, de otras proteínas, incluidas proteínas que forman un complejo de toxina botulínica. Una toxina botulínica purificada puede tener una pureza de más de 95%, preferiblemente mayor que 99%. Están excluidas del alcance de la presente invención las citoxinas globulínicas C_{2} y C_{3}, que no son neurotoxinas.
"Neurotoxina clostridiana" significa una neutotoxina producida, o nativa, de una bacteria clostridiana tal como Clostridium botulinum, Clostridium butiricon o Clostridium beratti, así como una toxina clostridiana producida recombinantemente por una especie no clostridiana.
"Totalmente exenta" (esto es, terminología "constituida por") significa que, dentro del intervalo de detección del instrumento o el procedimiento que se está usando, no se puede detectar o no se puede confirmar su presencia.
"Enteramente exenta" (o "constituida esencialmente por" significa que sólo se pueden detectar indicios de la sustancia.
"Inmovilización" significa una etapa que impide que un sujeto mueva una o varias partes del cuerpo. Si se inmoviliza un número suficiente de partes del cuerpo, el sujeto se inmovilizará. Así, "inmovilización" abarca la inmovilización de una parte del cuerpo tal como un miembro, y/o la completa inmovilización de un sujeto.
"Toxina botulínica modificada" significa una toxina botulínica que tiene suprimido, modificado o reemplazado al menos uno de sus aminoácidos, respecto a una toxina botulínica nativa. Además, la toxina botulínica modificada puede ser una neurotoxina producida recombinantemente, o un derivado o fragmento de una neurotoxina producida recombinantemente. Una toxina botulínica modificada retiene al menos una actividad biológica de la toxina botulínica nativa, tal como la capacidad de unirse a un receptor de toxina botulínica, o la capacidad de inhibir la liberación de un neurotransmisor de una neurona. Un ejemplo de una toxina botulínica modificada es una toxina botulínica que tiene una cadena ligera de un serotipo de toxina botulínica (tal como el serotipo A) y una cadena pesada de un serotipo de toxina botulínica diferente (tal como serotipo B). Otro ejemplo de una toxina botulínica modificada es una toxina botulínica acoplada a un neurotransmisor, tal como sustancia P.
"Paciente" significa un sujeto humano o no humano que recibe cuidado médico o veterinario. Consecuentemente, como se describe aquí, las composiciones se pueden usar en el tratamiento de cualquier animal, tal como un mamífero.
"Composición farmacéutica" significa una formulación en la que el ingrediente activo puede ser una toxina botulínica. La palabra "formulación" significa que hay como mínimo un ingrediente adicional en la composición farmacéutica además del ingrediente activo neurotoxina. Por tanto, una composición farmacéutica es una formulación que es adecuada para diagnosis o administración terapéutica (por ejemplo, por inyección intramuscular o subcutánea o por inserción de un depósito o implante) a un sujeto, tal como un paciente humano. La composición farmacéutica puede estar: en condición liofilizada o secada en vacío; como solución formada después de reconstituir la composición farmacéutica liofilizada o secada en vacío con solución salina o agua; o como una solución que no requiere reconstitución. El ingrediente activo puede ser uno de los serotipos A, B, C_{1}, D, E, F o G de toxina botulínica, o una toxina botulínica, pudiendo ser producidos todos ellos naturalmente por una bacteria clostridana. Como se ha indicado, una composición farmacéutica puede ser líquida o sólida, por ejemplo, secada en vacío. Los ingredientes constitutivos de una composición farmacéutica pueden estar incluidos en una composición individual (esto es, estando presentes todos los ingredientes constitutivos excepto cualquier fluido de constitución requerido, en el momento de componer inicialmente la composición farmacéutica), o como un sistema de dos componentes, por ejemplo, una composición secada en vacío reconstituida con un diluyente tal como solución salina, diluyente que contiene un ingrediente no presente al componer inicialmente la composición farmacéutica. Un sistema de dos componentes proporciona el beneficio de permitir la incorporación de ingredientes que no son suficientemente compatibles durante un tiempo de almacenamiento prolongado con el primer componente del sistema de dos componentes. Por ejemplo, el vehículo o disolvente de reconstitución puede incluir un conservante que proporcione protección suficiente frente al crecimiento de microbios durante el período de uso, por ejemplo, una semana de almacenamiento refrigerado, pero no está presente durante el período de almacenamiento congelado durante un período de dos años, tiempo durante el cual puede degradar la toxina. Otros ingredientes, que pueden no ser compatibles con una toxina clostridiana u otros ingredientes para períodos de tiempo largos, se pueden incorporar de esta manera; esto es, se añaden en un segundo vehículo (esto es, en el líquido de reconstitución) aproximadamente en el momento de uso. En la publicación de patente U.S. 2003 0118598 A1 se describen procedimientos para formular una composición farmacéutica que tiene como ingrediente activo toxina botulínica.
"Sustancialmente exento" significa que está presente a un nivel de menos de uno por ciento en peso de la composición farmacéutica.
"Formulación terapéutica" significa una formulación que se puede usar para tratar y aliviar un trastorno o enfermedad tal como un trastorno o enfermedad caracterizado por hiperactividad (esto es, espasticidad) de un músculo periférico.
La presente invención proporciona medios que comprenden como mínimo niveles reducidos de subproductos animales o lácteos y, preferiblemente, están sustancialmente exentos de subproductos animales o lácteos. "Subproductos animales o lácteos" significa cualquier compuesto o combinación de compuestos que ha siso producido en una célula animal o por una célula de animal (excluidas bacterias), sea in vivo o in vitro. Entre las fuentes no animales de ingredientes de medios tales como proteínas, aminoácidos y nitrógeno, figuran vegetales, microbios (tales como levadura) y compuestos sintéticos.
La presente invención proporciona procedimientos para obtener toxina botulínica usando como mínimo un medio que este sustancialmente exento de subproductos animales o lácteos. Por ejemplo, la toxina botulínica se puede obtener cultivando Clostridium botulinum en un medio de fermentación que está sustancialmente exento de productos animales.
La presente invención abarca también una toxina botulínica obtenida cultivando Clostridium botulinum en un medio de fermentación sustancialmente exento de productos animales y que comprende productos derivados de vegetales. Además, una toxina botulínica se puede obtener cultivando Clostridium botulinum en un medio de fermentación que está sustancialmente exento de productos animales y que comprende algunos productos basados en soja.
En otra realización preferente, se puede obtener una toxina botulínica cultivando Clostridium botulinum en un medio de fermentación sustancialmente exento de productos animales y que contenga soja hidrolizada como medio sustitutivo de productos derivados de un animal. Preferiblemente, el crecimiento en un medio de fermentación transcurre hasta como mínimo lisis celular. La fuente de Clostridium botulinum usada para inoculación del medio de fermentación puede obtenerse de una Clostridium botulinum que contiene un medio de siembra. Preferiblemente, la Clostridium botulinum crecida en un medio de siembra y usada como inoculante para un medio de fermentación no ha experimentado lisis celular. La Clostridium botulinum puede ser liofilizada como cultivo en leche de animal o en leche de soja. Preferiblemente, la Clostridium botulinum se liofiliza como cultivo en leche de soja.
La presente invención proporciona también una composición que comprende un medio sustancialmente exento de productos animales para cultivo de Clostridium botulinum.
En una realización, la composición comprende un medio sustancialmente exento de productos derivados de animales mientras que contiene al menos un producto derivado de una fuente no animal, y que también comprende una Clostridium botulinum.
En otra realización, la composición comprende un medio sustancialmente exento de productos derivados de animales mientras que contiene al menos un producto derivado de un vegetal y que también comprende una Clostridium botulinum. Una realización final de la presente invención puede ser una composición que comprende un medio que está sustancialmente exento de productos derivados de un animal mientras que contiene como mínimo un producto derivado de soja y que también comprende Clostridium botulinum.
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Descripción
La presente invención está basada en el descubrimiento de medios y procedimientos que están exentos o sustancialmente exentos de un producto animal o un subproducto animal, útiles para cultivo y fermentación de un organismo (tal como la bacteria Clostridium botulinum) capaz de producir toxina botulínica biológicamente activa. La toxina botulínica obtenida se puede usar para producir composiciones farmacéuticas de un ingrediente activo toxina botulínica. Así, se describen aquí medios de cultivo que tienen niveles significativamente bajos de productos de carne o leche y las realizaciones preferentes de medios están sustancialmente exentos de tales productos de animales.
La presente invención abarca el sorprendente hallazgo del inventor de que no se requieren productos basados en animales en medios para el crecimiento de Clostridium botulinum y, en particular, que productos basados en vegetales pueden reemplazar productos basados en animales típicamente empleados en tales medios para el crecimiento de Clostridium botulinum.
Los medios actualmente usados para crecimiento y fermentación de bacterias usualmente comprenden uno o varios ingredientes de origen animal. De acuerdo con la presente invención, los medios preferidos para crecimiento de Clostridium botulinum contienen ingredientes derivados de animales que comprenden no más de 5 a aproximadamente 10 por ciento en peso del peso total del medio. Más preferiblemente, los medios dentro del alcance de la presente invención comprenden no más de aproximadamente 1 a aproximadamente menos de 5 por ciento del peso total del medio de productos de origen animal. Muy preferiblemente, todos los medios y cultivos usados para crecimiento y cultivo de Clostridium botulinum para la producción de toxina botulínica están completamente exentos de productos de origen animal, Entre estos medios se encuentran, no limitativamente, medios para fermentación a pequeña y gran escala de Clostridium botulinum, medios para crecimiento de cultivos de Clostridium botulinum usados para inocular el (primer) medio de siembra y el (segundo) medio de fermentación, así como medios usados para almacenamiento a largo plazo de cultivos de Clostridium botulinum (por ejemplo, cultivos madre).
En ciertas realizaciones preferentes de la presente invención, el medio para crecimiento de clostridium botulinum y la producción de toxina botulínica pueden comprender productos basados en soja para reemplazar productos de origen animal. Alternativamente, en vez de un producto basado en soja se puede usar semilla desamargada de Lupinus campestris. Es sabido que el contenido de proteínas de la semilla de L. campestris es muy similar al de la soja. Preferiblemente, estos medios incluyen productos de soja o de L. campestris que están hidrolizados y que son solubles en agua. Sin embargo, los productos de soja o de L. campestris que son insolubles se pueden usar también en la presente invención para reemplazar productos animales. Entre los productos comunes de origen animal que pueden ser sustituidos por productos de soja o L. Campestris figuran infusión de corazón de vaca (ICV), productos de peptona de origen animal, tales como Bacto-peptone, caseínas hidrolizadas y subproductos lácteos de animales, tales como leche de animales.
Preferiblemente, los productos que contienen los medios basados en soja o L. campestris para el crecimiento de Clostridium botulinum son similares a los medios de crecimiento comúnmente empleados que contienen productos de origen animal, excepto que todos los productos de origen animal están reemplazados por productos de origen vegetal. Por ejemplo, los medios de fermentación basados en soja pueden comprender un producto basado en soja, una fuente de carbono tal como glucosa, sales tales como NaCl y KCl, ingredientes que contienen fosfato tales como Na_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4}, cationes divalentes tales como hierro y magnesio, polvo de hierro y aminoácidos tales como L. cisteína y L-tirosina. Los medios usados para crecer cultivos de Clostridium botulinum para inoculación (esto es, la semilla del primer medio) del (segundo) medio de fermentación preferiblemente contienen al menos un producto basado en soja, una fuente de sal tal como NaCl y una fuente de carbono tal como glucosa.
La presente invención proporciona un procedimiento para el crecimiento de Clostridium botulinum que maximiza la producción de una toxina botulínica usando medios que sustancialmente están exentos de productos de origen animal. El crecimiento para la producción de Clostridium botulinum y toxina botulínica puede realizarse por fermentación en un medio que contiene subproductos de soja que reemplazan ingredientes derivados de subproductos animales (un medio de siembra). Dependiendo del tamaño y volumen de la etapa de fermentación, el número de crecimientos sucesivos en los medios de cultivo para aumentar la biomasa del cultivo puede variar. Para que crezca una cantidad adecuada de Clostridium botulinum para inocular el medio de fermentación, se puede realizar una etapa o múltiples etapas que implican crecimiento en un medio de siembra. Para un procedimiento de crecimiento de Clostridium botulinum que esté exento de productos de origen animal, es preferible que el crecimiento de Clostridium botulinum comience a partir de un cultivo almacenado en un medio de cultivo no animal. El cultivo almacenado, preferiblemente liofilizado, se produce por crecimiento en medios que contienen proteínas derivadas de soja y subproductos no animales. El crecimiento de Clostridium botulinum en un medio de fermentación puede tener lugar por inoculación directamente a partir de un cultivo liofilizado almacenado.
En una realización preferente de la presente invención, el crecimiento de Clostridium botulinum transcurre en dos fases, crecimiento de la siembra y fermentación. Ambas fases se realizan en condiciones anaeróbicas. La fase de crecimiento de la siembra generalmente se usa para "subir a escala" la cantidad de microorganismos de un cultivo almacenado. La finalidad de la fase de crecimiento de la siembra es aumentar la cantidad de microorganismos disponibles para la fermentación. Además, la fase de crecimiento de la siembra permite rejuvenecer microbios relativamente durmientes en cultivos almacenados y hacer que crezcan a cultivos que crecen activamente. Además, el volumen y la cantidad de microrganismos viables usados para inocular el cultivo de fermentación puede controlarse con mayor precisión desde un cultivo de crece activamente que desde un cultivo almacenado. Así, se prefiere el crecimiento de un cultivo de siembra para inoculación del medio de fermentación. Además, se puede usar un número cualquiera de etapas consecutivas que implican crecimiento en medios de siembra para aumentar a escala la cantidad de Clostridium botulinum para inoculación del medio de fermentación. Se hace notar que el crecimiento de Clostridium botulinum en la fase de fermentación puede efectuarse directamente desde el medio de cultivo por inoculación directa.
En la fase de fermentación, para inocular un medio de fermentación se usa una porción, o la totalidad, del medio de siembra que contiene Clostridium botulinum del crecimiento de la siembra. Preferiblemente, para inocular el medio de fermentación se usa aproximadamente 2-4% de un medio de siembra que tiene Clostridium boitulinum de la fase de crecimiento de siembra. La fermentación se usa para producir la cantidad máxima de microbios en un medio anaeróbico a gran escala (Ljungdahl y otros, Manual of industrial microbiology and biotechnology (1986), editado por Demain y otros, American Society for Microbiology, Washington, D.C., pág. 84).
Una toxina botulínica se puede aislar y purificar usando procedimientos de purificación de proteínas bien conocidos por los expertos de cualificación normal en la técnica de purificación de proteínas (Coligan y otros, Current Protocols in Protein Science, Wiley and Sons; Ozutsumi y otros, Appl. Environ. Microbiol. 49; 939-943: 1985.
Para la producción de toxina botulínica, se pueden hacer crecer cultivos de Clostridium botulinum en un medio de siembra para inoculación del medio de fermentación. El número de etapas sucesivas que implican crecimiento en un medio de siembra puede variar dependiendo de la escala de producción de toxina botulínica en la fase de fermentación. Sin embargo, como previamente se ha discutido, el crecimiento en la fase de fermentación puede proceder directamente de la inoculación de un cultivo almacenado. Generalmente, los medios de siembra basados en animales comprenden ICV, bactopeptona, NaCl y glucosa para crecimiento de Clostridium botulinum. Como se ha discutido previamente, se pueden preparar de acuerdo con la presente invención medios de siembra alternativos en los que los componentes basados en animales están sustituidos por componentes no basados en animales. Por ejemplo, sin que ello sea limitativo, productos basados en soja pueden sustituir a ICV y bactopeptona en el medio de siembra para crecimiento de Clostridium botulinum y producción de toxina botulínica. Preferiblemente, el producto basado en soja es soluble en agua y comprende soja hidrolizada, aunque también pueden crecer cultivos de Clostridium botulinum en medios que contienen soja insoluble. Pero los niveles de crecimiento y posterior producción de Clostridium botulinum son más altos en medios derivados de productos de soja solubles.
De acuerdo con la presente invención se puede usar cualquier fuente de productos basados en soja. Preferiblemente, la soja es soja hidrolizada. Las fuentes de soja hidrolizada son asequibles de una variedad de vendedores comerciales. Entre éstos figuran, no limitativamente, Hy-Soy (Quest International), Soy peptone (Gibco), Bac-Soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, SE50M (DMV International Nutritionals, Fraser, NY) y SE50MK (DMV). Muy preferiblemente, la fuente de soja hidrolizada es Hy-Soy o SE50MK. Son conocidas otras fuentes potenciales de soja hidrolizada.
Las concentraciones de Hy-Soy en el medio de siembra de acuerdo con la presente invención varían entre 25 y 200 g/l. Preferiblemente, la concentración de Hy-Soy en el medio de siembra varía entre 50 y 150 g/l. Muy preferiblemente, la concentración de Hy-Soy en el medio de siembra es de aproximadamente 100 g/l. Además, la concentración de NaCl varía de 0,l a 2,0 g/l. Preferiblemente, la concentración de NaCl varía de 0,2 a 1,0 g/l. Muy preferiblemente, la concentración de NaCl en el medio de siembra es de aproximadamente 0,5 g/l. La concentración de glucosa varía entre 0,1 g/l y 5,0 g/l. Preferiblemente, la concentración de glucosa varía entre 0,5 g/l y 2,0 g/l. Muy preferiblemente, la concentración de glucosa en el medio de siembra es de aproximadamente 1,0 g/l. También se prefiere para la presente invención, pero no es necesario, esterilizar la glucosa en autoclave junto con los otros componentes del medio de siembra. El nivel de pH preferido del medio de siembra antes del crecimiento varía entre 7,5 y 8,5. Muy preferiblemente, el pH preferido del medio de siembra antes del crecimiento es de aproximadamente 8,1.
El crecimiento de Clostridium botulinum en el medio de siembra puede realizarse en una o varias etapas. Preferiblemente, en el medio de siembra se realiza en dos etapas. En la etapa uno, un cultivo de Clostridium botulinum se pone en suspensión en una cantidad de medio de siembra y se incuba a 34\pm1ºC durante aproximadamente 24-48 horas en medio anaeróbico. En la etapa dos, se usa una porción o la totalidad del medio de la etapa uno que contiene Clostridium botulinum para inocular un medio de siembra de la etapa dos para posterior crecimiento. Después de la inoculación, el medio de la etapa dos se incuba a 34\pm1ºC durante aproximadamente 1-4 días también en medio anaeróbico. Preferiblemente, el crecimiento en el medio de siembra de la etapa dos se realiza durante aproximadamente 3 días. También es preferible que el crecimiento en el medio de siembra en cualquier etapa no dé por resultado la lisis celular antes de la inoculación del medio de fermentación con el crecimiento final en el medio de siembra.
Los medios de fermentación estándar que contienen subproductos animales para el crecimiento de Clostridium botulinum se pueden basar en la receta de Mueller y Miller (MM; J. Bacteriol. 67:271, 1954). Los ingredientes en el medio MM que contiene subproductos animales incluyen ICV y NZ-CaseTT. NZ-Case TT es una fuente comercialmente disponible de péptidos y aminoácidos que resultan de la digestión enzimática de caseínas, un grupo de proteínas que se encuentra en la leche de animales. La presente invención demuestra que ICV y NZ-Case TT pueden ser sustituidos por productos no basados en animales en un medio de fermentación. Por ejemplo, pero sin ser limitativo, los componentes basados en animales de los medios MM usados para fermentación de Clostridium botulinum pueden ser reemplazados por productos basados en soja. Preferiblemente, los productos basados en soja son solubles en agua y derivan de soja hidrolizada aunque, como se ha discutido previamente, en la práctica de la presente invención se pueden usar también productos de soja insolubles.
De acuerdo con la presente invención se puede usar cualquier fuente de productos basados en soja. Preferiblemente, la soja hidrolizada se obtiene de Quest International (Sheffield) bajo el nombre comercial HY-Soy, o de DMV International Nutrionals (Fraser, NY) bajo el nombre comercial SE50MK. También se pueden obtener productos de soja solubles de varias fuentes, incluidas, no limitativamente, Soy peptone Gibco), Bac-soytone (Gibco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7 y SE50MK (DMV International Nutritionals, Fraser, NY).
En otra realización preferente de la presente invención, el medio usado para fermentación de Clostridium botulinum está exento de subproductos animales y comprende soja hidrolizada, glucosa, NaCl, Na_{2}HPO_{4}, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, KH_{2}PO_{4}, L-cisteína, L-tirosina y hierro en polvo. Como se ha descrito para el medio de siembra, la soja hidrolizada puede reemplazar subproductos animales en el medio de fermentación. Entre estos subproductos animales figuran ICV y NZ-Case TT (caseína digerida enzimáticamente).
La concentración de Hy-Soy en el medio de fermentación para producción de toxina botulínica preferiblemente está en el intervalo de aproximadamente 10-100 g/l. Preferiblemente, la concentración es Hy-Soy vería entre aproximadamente 20 y 60 g/l. Muy preferiblemente, la concentración de Hy-Soy en el medio de fermentación es de aproximadamente 35 g/l. Para una producción máxima de toxina botulínica, las concentraciones de componentes en el medio de fermentación particularmente preferidas son de aproximadamente 7,5 g/l de glucosa, 5,0 g/l de NaCl, 0,5 g/l de Na_{2}HPO_{4}, 175 mg/l de KH_{2}PO_{4}, 50 mg/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 125 mg/l de L-cisteína y 125 mg/l de L.-tirosina. La cantidad de hierro en polvo usada puede variar de 50 mg/l a 2000 mg/l. Preferiblemente, la cantidad de polvo de hierro varía entre aproximadamente 100 mg/l y 1000 mg/l. Muy preferiblemente, la cantidad de polvo de hierro usada en el medio de fermentación varía entre aproximadamente 200 mg/l y 600 mg/l.
Para niveles de producción óptimos de toxina, el pH inicial (antes del tratamiento en autoclave) del medio de fermentación basado en soja varía preferiblemente entre aproximadamente 5,5 y 7,1. Preferiblemente, el pH inicial del medio de fermentación está entre aproximadamente 6,0 y 6,2. Como se ha descrito para el medio de siembra, los componentes del medio de fermentación, incluidos glucosa y hierro, preferiblemente se tratan juntos en el autoclave para esterilización.
Preferiblemente, una porción del medio de siembra de la segunda etapa usado para crecimiento de Clostridium botulinum se usa para inocular el medio de fermentación. La fermentación se realiza en una cámara anaeróbica a aproximadamente 34\pm1ºC durante aproximadamente 7 a 9 días. El crecimiento se controla midiendo la densidad óptica (D.O) del medio. La fermentación se para preferiblemente después de efectuar la lisis durante al menos 48 horas según determinación efectuada por medida del crecimiento (densidad óptica). A medida que transcurre la lisis de las células, disminuirá la D.O. del medio.
En una realización preferente de la presente invención, los cultivos de Clostridium botulinum usados para almacenamiento a largo plazo de Clostridium botulinum e inoculación del medio de siembra se hacen crecer y se liofilizan en leche de soja antes de almacenamiento a 4ºC. Los cultivos de Clostridium botulinum en leche animal liofilizados para almacenamiento se pueden usar también para la producción de toxina botulínica. Sin embargo, para mantener medios que están sustancialmente exentos de subproductos animales a lo largo de la producción de toxina botulínica, se prefiere que el cultivo inicial de Clostridium botulinum se conserve en leche de soja y no en leche animal.
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Ejemplos
Los ejemplos siguientes presentan procedimientos específicos abarcados por la presente invención y no son limitativos del alcance de la invención. Se pueden obtener cultivos de Clostridium botulinum de varias fuentes, entre las que figura List Laboratories, Campbell, California. Todos los experimentos y medios se pueden preparar con agua bidestilada. En todos los siguientes Ejemplos, "Clostridium botulinum" significa la cepa Hall A (número de designación de ATCC 3502) de Clostridium botulinum.
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Ejemplo 1 Preparación de un medio de siembra exento de producto animal para Clostridium botulinum
Se puede preparar un medio de siembra de control usando los ingredientes siguientes para cada litro de medio: NaCl (5 g), Bacto-peptone (10 g), glucosa, (10 g), ICV (hasta 1 litro), pH 8,1 (ajustado con NaOH 5 N).
Se puede preparar un medio de siembra de ensayo (exento de producto animal) usando los ingredientes siguientes para cada litro de medio: NaCl (5 g), Soy-peptone (10 g), glucosa (10 g), Hy-Soy (35 g/l, hasta tener 1 litro de líquido de medio), pH 8,1 (ajustado con NaOH 5 N).
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Ejemplo 2 Cultivo de Clostridium botulinum en un medio de siembra exento de producto animal
Se puede poner en suspensión un cultivo liofilizado de Clostridium botulinum en 1 ml de cada uno de los medios de control y de ensayo del Ejemplo 1, dividido (cada medio de siembra) en 2 tubos cada uno de los cuales puede contener 10 ml del respectivo medio de siembra, e incubar luego a 34ºC durante aproximadamente 24-48 horas. Luego se puede usar 1 ml de cultivo para inocular 1 matraz de cultivo DeLong Bellico de 125 ml que contiene 40 ml del respectivo medio de siembra. El cultivo inoculado se puede incubar luego a 33ºC\pm1ºC durante 24 horas en una cámara Coy Anaerobic Chamber (Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, Mich.)
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Ejemplo 3 Preparación de un medio de fermentación exento de producto animal para Clostridium botulinum
Se puede preparar un medio de fermentación basal usando los ingredientes siguientes para cada dos litros de medio: glucosa (15 g), NaCl (10 g), NaH_{2}PO_{4} (1 g), KH_{2}PO_{4} (0,350 g), MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,1 g), HCl-cisteína (0,250 g), HCl-tirosina (0,250 g), hierro en polvo (1 g), ZnCl_{2} (0,250 g) y MnCl_{2} (0,4 g).
Se puede preparar un medio de fermentación de control usando los ingredientes siguientes para cada 2 litros de medio preparado: ICV (500 ml, esto corresponde a aproximadamente 45,5 g de infusión de corazón de vaca en seco), NZ-Case TT (30 g) y medio basal (hasta 2 litros), pH 6,8.
Se puede preparar primeramente el medio basal de fermentación y ajustarlo a pH 6,8. La infusión de corazón de vaca (ICV) se puede preparar luego y ajustar su pH a 6,8 con NaOH 5 N. Luego se puede añadir luego la ICV al medio basal. Seguidamente se puede preparar NZ-Case TT Luego se añade NZ-Case TT al medio basal al que se ha añadido ya la infusión de corazón de vaca y se ha disuelto añadiendo HCl. El pH se puede ajustar luego a 6,8 con NaOH 5 N. Este medio se puede separar luego en porciones de 8 ml en cada uno de 16 tubos de ensayo de 100 mm, a lo que sigue el tratamiento en autoclave durante 25 min a 120ºC.
Se puede preparar un medio de fermentación de ensayo (exento de producto animal) sustituyendo la ICV presente en el medio de fermentación por una fuente de nitrógeno de ensayo. Entre las fuentes de nitrógeno de ensayo adecuadas para el medio de fermentación figuran: Hy-Soy (Quest International), Soy peptone (Gibco), Bac-Soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ-Soy (Quest), NZ Soy BL4, NZ Soy BL7, SE50M (DMV), SE50 (DMV), SE%)MK (DMV), Soy Peptone (Gibco), Bacto-Soyton (Difco), Nutrisoy (ADM), Bakes Nutrisoy (ADM), harina de Nutrisoy harina comestible de haba de soja, extracto de levadura Bacto (Difco), extracto de levadura (Dico), Hy-Yest 412 (Quest), Hy-Yest 411 (Quest), Hy-Yest 444 (Quest), Hy.Yest 455 (Quest), extracto de Bacto-Malt (Difco), macerado de maíz, y Proflo (Traders).
El medio de fermentación de ensayo se puede preparar como se ha indicado antes para preparar el medio de fermentación de control excepto que se excluye la ICV y la fuente correspondiente de nitrógeno puede ajustarse primeramente a pH 6,8 con HCl 3 N o con NaOH 5 N. Los medios se pueden poner en porciones de 8 ml en 16 tubos de ensayo de 100 mm, y luego se someten a tratamiento en autoclave a 120ºC durante 20-30 min.
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Ejemplo 4 Crecimiento de Clostridium botulinum en un medio de fermentación exento de producto animal
Se puede usar una porción de 40 \mul del cultivo en medio de siembra de ensayo (exento de producto animal) para inocular cada parte alícuota de 8 ml del medio de fermentación de control o ensayo en un tubo de ensayo de 8 ml de 16 x 100 mm. Los cultivos se pueden incubar luego a 33\pm1ºC durante 24 horas. Los tubos se pueden incubar luego en una cámara anaeróbica para crecimiento de la bacteria. Cada ensayo del medio se puede realizar por triplicado (esto es, puede implicar tres inoculaciones diferentes del mismo medio) y también puede incluir un control no inoculado que se puede usar como blanco para el espectrofotómetro). El crecimiento (determinado por densidad óptica, DO) se puede medir cada 24 horas con un espectrofotómetro Turner (modelo 330) a 600 nm. El cultivo se puede parar después de que la lisis haya durado aproximadamente 48 horas y luego se puede medir la producción de toxina botulínica.
Se pueden realizar experimentos adicionales con un medio de fermentación de Hy-Soy que contiene los ingredientes siguientes: Hy-Soy (17,5 g), glucosa (3,75 g), NaCl (2,5 g), Na_{2}HPO_{4} (0,25 g), MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,025 g), KH_{2}PO_{4} (0,0875 g), L-cisteína (0,0625 g), L-tirosina (0,0625 g), hierro en polvo (0,25 g), pH 6,8.
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Ejemplo 5 Determinación de la producción de toxina botulínica por crecimiento de Clostridium botulinum en un medio de fermentación exento de productos animal
Las células cultivadas del Ejemplo 4 se pueden centrifugar y luego se puede determinar el pH del material sobrenadante. Los niveles de toxina botulínica se pueden medir añadiendo una antitoxina patrón y midiendo el tiempo transcurrido antes de la floculación. Se puede determinar Tf (el tiempo requerido para que se produzca la floculación, en minutos) y Lf (el límite de floculación, equivalente a 1 unidad de antitoxina patrón, establecido por floculación). Se pueden tomar 4 ml de caldo de fermentación de cada tubo de fermentación para un cultivo dado y combinar de manera que se puedan mezclar 12 ml en total en un tubo de centrifugadora de 15 ml. Luego se pueden centrifugar los tubos a 5000 rpm (3400g) durante 30 min a 4ºC. Se pueden añadir partes alícuotas de 1 ml a los tubos que contienen 0,1-0,6 ml de antisuero de toxina botulínica patrón y agitar los tubos cuidadosamente para mezclar su contenido. Luego se pueden poner los tubos en un baño de agua a 45\pm1ºC y se puede registrar el tiempo inicial. Los tubos se pueden comprobar frecuentemente y se puede registrar como Tf el tiempo inicial. La concentración de toxina en el tubo en el que se puede iniciar primeramente la floculación se puede designar LfFF. La concentración de toxina en el que se puede iniciar la floculación en segundo lugar se puede designar LfF.
Paralelamente se pueden realizar ensayo de fermentación, crecimiento y producción de toxina para: (a) el medio de siembra de control (usado para inocular el medio de fermentación de control) y el medio de fermentación de control, y (b) el medio de siembra de ensayo (exento de producto animal) (usado para inocular el medio de fermentación de ensayo) y el medio de fermentación de ensayo (exento de producto animal). Significativamente, se puede determinar que la fermentación de Clostridium botulinum en medios exentos de productos animales e inoculados de cultivos que también están exentos de productos animales (en los que los productos de base de soja reemplazan los productos de animal) pueden dar por resultado un Lf_{toxina} de aproximadamente 50 o más. Como mínimo, Lf_{toxina} es igual a aproximadamente 10. Preferiblemente, Lf_{toxina} es como mínimo 20. Muy preferiblemente, Lf_{toxina} es mayor que 50.
Además se puede determinar que diversos productos soportan el crecimiento de Clostridium botulinum en medios de fermentación que no tienen ICV. Así, la ICV puede ser reemplazada por varias preparaciones de soja solubles para crecimiento de Clostridium botulinum. La mejor concentración puede ser de 12,5 o 25 g/l. Hy-Soy (Sheffield) puede dar el crecimiento más alto. Las preparaciones de soja insolubles pueden ser menos eficaces.
Además, se pueden obtener resultados que demuestran que Hy-Soy de Quest, SE50MK de DMV y NZ-Soy de Quest pueden ser productos de soja eficaces en términos de su capacidad para reemplazar la ICV para el crecimiento de Clostridium botulinum. El mejor producto para la producción de toxina puede ser Quest Hy-Soy de Quest a 22,5 g/l. Unas concentraciones más altas de este producto pueden producir un mejor crecimiento pero no mejoran la producción de toxina. Los mismos resultados se pueden obtener, se ha propuesto, con SE50MK, para la que una concentración más alta puede generar un crecimiento mayor pero no aumentar la producción de toxina. Por otra parte, NZ-Soy puede dar un crecimiento más alto y una producción más alta de toxina a su concentración máxima.
Finalmente, se puede determinar que los productos de soja pueden remplazar eficazmente la ICV así como la NZ-Case TT. La eliminación de NZ-Case TT de medios basados en soja puede reducir el crecimiento de 2 a 4 veces. El mejor producto de soja para crecimiento tanto en presencia como en ausencia de NZ-Case TT puede ser SE50MK. Hy-Soy puede reemplazar ICV y NZ-Case TT para la producción de toxina. Sin embargo, puede ser necesario un ciclo de fermentación más largo de 1 o 2 días. La Hy-Soy podría remplazar ICV y NZ.-Case TT en medios para la producción de toxina. Sin embargo, se puede determinar que los extractos de levadura pueden ser inhibidores de la producción de toxina.
Se puede determinar que HY-Soy a 22,75 g/l puede reemplazar completamente ICV y HY-Case TT para la producción de toxina. A diferencia del efecto sobre el crecimiento en el que 56,88 g/l de HY-Soy puede ser la concentración óptima; 34,13 g/l de HY-Soy puede ser la concentración óptima para la fase de producción de toxina.
Así, el inventor ha determinado sorprendentemente que Hy-Soy + Hy-Yest pueden remplazar ICV y Bacto-peptone en medios para crecimiento de la siembra de Clostridium botulinum. Además se pueden diseñar experimentos para determinar las concentraciones óptimas de componentes en medios de siembra para producir los niveles máximos de producción de toxina botulínica por Clostridium botulinum. La producción de toxina por Clostridium botulinum en medio de siembra y en medio de fermentación exentos de ICV y NZ-Case TT puede alcanzar o exceder los niveles alcanzados en medios que contienen ICV y NZ-Case TT.
Se pueden determinar las concentraciones óptimas de Hy-Soy o [Hy-Soy+ Hy-Yest] para crecimiento en medio de siembra. Se puede confirmar experimentalmente que Hy-Soy puede remplazar ICV y Bacto-peptone como fuente de nitrógeno en un medio de siembra para crecimiento de Clostridium botulinum y para la producción de toxina botulínica en la subsiguiente fase de fermentación. También, Hy-Soy como fuente de nitrógeno en el medio de siembra, en comparación con Hy-Soy más Hy-Yest, puede producir niveles más altos de toxina botulínica en la posterior etapa de fermentación. Las concentraciones de Hy-Soy en medios de siembra que producen los mejores niveles de toxina varían de aproximadamente 62,5 g/l a 100 g/l.
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Hay experimentos adicionales diseñados para determinar las concentraciones óptimas de Hy-Soy en medio de siembra para la producción máxima de toxina botulínica por Clostridium botulinum por fermentación. Así, 30 g, 50 g, 75 g y 100 g de Hy-Soy en el medio de siembra pueden dar por resultado la producción de toxina botulínica por fermentación de Clostridium botulinum y ésta es comparable o excede a los niveles de toxina botulínica producidos en medio de siembra que contiene ICV y Bacto-peptone como fuente de nitrógeno.
Se puede encontrar que una concentración de 100 g/l de Hy-Soy en el medio de siembra dio por resultado los niveles más altos de producción de toxina en la posterior etapa de fermentación. Además, los datos indican que la etapa 1 de siembra del medio de siembra de Hy-Soy produjo un crecimiento mayor después de 48 horas que después de 24 horas.
Aunque la presente invención se ha descrito detalladamente en lo relacionado con ciertos procedimientos preferidos, son posibles otras realizaciones, versiones y modificaciones dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, dentro del alcance de la presente invención está una amplia variedad de procedimientos libres de producto animal.

Claims (7)

1. Un procedimiento para obtener una toxina botulínica biológicamente activa, que comprende las etapas de:
(a)
proporcionar un medio de fermentación que esté exento de un producto derivado de un animal, comprendiendo el medio de fermentación soja hidrolizada,
(b)
cultivar una bacteria Clostridium botulinum en el medio de fermentación en condiciones que permitan la producción de una toxina botulínica, y
(c)
recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación.
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2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que, en la etapa de cultivo, el cultivo se realiza hasta que la densidad de células del cultivo disminuye debido a la lisis celular.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que, en la etapa de cultivo, el cultivo se realiza hasta como mínimo 48 horas después de la caída inicial de la densidad de células debido a la lisis celular.
4. Un procedimiento para la producción de una toxina botulínica, procedimiento que comprende las etapas de:
(a)
proporcionar un primer medio de cultivo que esté exento de un producto derivado de un animal y que comprenda soja hidrolizada,
(b)
cultivar una bacteria Clostridium botulinum en el primer medio en condiciones que permitan el crecimiento de la Clostridium botulinum,
(c)
proporcionar un segundo medio que esté exento de un producto derivado de un animal y que comprenda soja hidrolizada,
(d)
inocular el segundo medio con el primer medio,
(e)
cultivar una bacteria Clostridium botulinum en el segundo medio en condiciones que permitan la producción de una toxina botulínica, y
(f)
recuperar la toxina botulínica.
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5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que, en la etapa de cultivar una Clostridium botulinum en el primer medio, las condiciones comprenden una temperatura de aproximadamente 34ºC y que además comprende no disminuir la densidad de células durante el cultivo, en el que, en la etapa de inocular un segundo medio con un primer medio, para inocular el segundo medio se usa de 2 a 4% del primer medio, y
en el que, en la etapa de cultivar la bacteria en el segundo medio, las condiciones que permiten el crecimiento comprenden una temperatura de aproximadamente 34ºC y además comprenden cultivar hasta que la densidad de células en el cultivo disminuye debido a la lisis celular.
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6. Una composición que comprende (i) una Clostridium botulinum y (ii) un medio de cultivo para producir una toxina botulínica, en la que el medio está sustancialmente exento de un producto derivado de un animal y comprende soja hidrolizada.
7. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica exenta de producto animal en la que el ingrediente activo es una toxina botulínica, procedimiento que comprende las etapas de:
(a)
obtener una toxina botulínica biológicamente activa por un procedimiento como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y
(b)
formular la toxina botulínica con un excipiente adecuado, preparando de esta manera una composición farmacéutica exenta de producto animal en la que el ingrediente activo es una toxina botulínica.
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