TWI293113B - Magnetic nanoparticles with fluorescent and specific targeting functions - Google Patents
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J293113 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於一種磁性奈米微粒，且特別有關於一 種具有專一性標不功能與營光顯不之磁性奈米微粒。 【先前技術】 磁性奈米微粒應用於生物技術方面包括：造影、輔助 診斷及辅助治療及生物材料分離等。在造影方面主要是作 • 為造影劑或追蹤劑，用於提高影像上的對比效果或追蹤特 定疾病。此外磁性奈米微粒亦可用於藥物釋放或癌症治療 - 等。 ' 目前已有多項影像分析技術應用於人體疾病診斷上， 如X光電腦斷層攝影裝置（Computer Topography，CT)、磁 振造影、超音波影像攝影(ultrasound，US)等等。已普遍應 用的電腦斷層技術檢查須使用X光，其成像原理為利用人 * 體中不同結構因具有不同密度而對X光繞射結果不同，且 為改善此項技術在臨床檢驗上之使用效果5在檢測時可使 用造影劑以增加組織、器官間之影像的對比。然而由於此 技術需使用X光，會造成游離輻射，因此相對來說，不會 產生游離輻射的磁振造影(MRI)提供另一項診斷時的選擇。 磁振造影不同於一般的X光攝影或電腦斷層，它並不 是利用X光來形成影像，其成像的主要訊號來源是由觀察 0424-A21175TWF(N2)；P02940019TW；esmond 5 •1293113 強磁場下質子磁旋（magnetic spin)與無線電波頻率電磁輻 • 射的相關而得。在將欲分析的器官或組織放置於強磁場下 後，利用無線電波能量的撞擊，接著質子的核磁化產生遲 緩現象(relaxation)而形成影像。 一般來說，目前MRI是一般醫學檢測中除了斷層掃 描、超音波檢查的更精密檢測，一般病人事先經由斷層掃 描、超音波檢查後得知腫瘤特性後經由MRI來確定病灶。 ⑩ 順磁性氧化鐵奈米微粒在MRI顯影劑上有提升對比度 的特性。氧化鐵微粒在一定的尺寸之下可以增加水分子的 " 自旋速度，進而增加影像對比度，是目前新囉起的顯影劑。 • 然而，目前市售之磁性奈米顯影劑並没有針對專一性修飾 過的顯影劑，因而產生的對比效果仍有改善的空間。 此外，如果除了磁振造影欲以光學檢測方式進一步確 定病灶，以目前的技術而言，需要使用額外的螢光劑才能 籲以光學影像偵測重複確定病灶，除了手續複雜外，兩次偵 測的結果也會因為時間上的延遲而有所誤差，導致偵測結 果無法即時比對。 【發明内容】 有鑑於此，本發明的目的即是針對上-述缺失提出一種 具有專一性標示功能，並且結合磁性與光學影像偵測之多 功能顯影劑。 0424-A21175TWF(N2)；P02940019TW；esmond 6 •1293113 ' 為達上述與其他目的，本發明係在磁性奈米微粒上接 - 枝專一性修飾的官能基，以增加其標的效率，在MRI顯影 效果上能夠更加突顯出病灶對比。此外，在磁性奈米微粒 " 上同時接枝螢光染劑，可提供光學檢測上作為另一種即時 診斷的方式，以再次確認病灶。 根據上述，本發明之多功能磁性奈米微粒包括：一磁 性奈米微粒；一生物相容性高分子，以化學鍵結修飾該磁 • 性奈米微粒；一螢光染劑，耦接至該生物相容性高分子； 以及，一專一性辨識分子，耦接至該生物相容性高分子。 - 為讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明 ' 顯易懂，下文特舉出較佳實施例，並配合所附圖式，作詳 細說明如下： 【實施方式】 本發明結合專一性標示功能與具有螢光特性之奈米磁 性檄粒，其中專一性標示功能可以強化標的物的影像，而 結合兩種不同的訊號來源（磁性與光性）可以增加對病灶的 確定，因此增加檢測的方便性與正確性。 請參閱第1圖，本發明之多功能磁性奈来微粒1〇〇， 係利用一生物相容性高分子12，以化學鍵結方式修飾一磁 性奈米微粒10，且生物相容性高分子12同時耦接一螢光 染劑14及一專一性辨識分子16。如圖中所示，生物相容 0424-A21175TWF(N2)；P02940019TW；esmond 7 1293113 性高分子12最好披覆磁性奈米微粒1G而形成—殼核結構。 磁性奈米微粒1〇較佳為鐵、結、錄、或前述之氧化物， 但亦可為其他任何具有磁性的單一材料或複合物，其中又 以具有超順磁性者更佳。磁性奈綠粒1()的_較佳約 3-10nm。 適當的生物相容性高分子12包括但不限於：聚乙二醇 (PEG)、聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)、聚丙交酯(pLA)、聚 乙父S日（PGA)、聚己内酯（pCL)、或聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)等。生物相容性高分子12可利用一偶合劑（未顯示) 與磁性奈米微粒1Q形成化學鍵結並形成單層批覆。較佳的 偶合制為胺基三烷氣基矽烷(amino trialkoxysilane)，例如 3 胺基丙基—乙氧基梦烧（3_amin〇pr〇pyitriethoxysilane ; APS)。生物相容性高分子12可以增加磁性奈米微粒1〇在 @ t *液相容性，也較容易排出人體。值得 應〉主忍的7C ’本發明藉此可免除任何界面活性劑的使用。 生物相谷性高分子12，鍵結至磁性奈米微粒10後， 可進一步將其末端修飾形成反應性官能基，以利後續與螢 ^ fU4H性辨識分子16進行耦接。常用的專-性 辨識刀子16例如有：抗體、蛋白質、胜肽、酵素、醣類、 醋蛋白 '核酸 '脂質等。熟悉此技藝人士可根據實際需要 送擇專一性辨識分子，得到各種標示式磁性奈米微粒，以 0424-A21175TWF(N2)；p〇294〇〇i 9TW；esmond •1293113 料其標的_。例如可❹雜分子來專—觸乳癌細 I上的f〇late接受器（receptor)，而在此例中，葉酸分子的 _接方式可利用末端具有胺基的生物相容性高分子12叙 之反應形成-C〇Nh_鍵結。 ，、 本發明之礤性奈米微粒更同時耦接螢光染劑14，以便 '、光车心’則，再次確認病灶。螢光染劑14較佳亦是以共 價鍵與生物相容性高分子12鍵結。適當螢光染劑包括：有 #機染劑、無機染劑、有機金屬錯合物等。螢光染劑的激發 與放射光源並無特別限定，可為可見光（VIS)、近紅外光 (NIR)、或紫外光(UV)等。經過上述螢光染劑14與專一性 痄戮刀子6祸接後的奈米微粒，其粒技較佳為。 若尺寸太大則顆粒不容易進入細胞，或者導致被白血球吞 噬。 藉由磁性奈米微粒耦接螢光染劑，本發明可結合兩種 訊號來源（磁性與光性）來增加對病灶的確定，而且實驗結 果顯示’螢光染劑的耦接並不會影響磁性奈米微粒在MRI 上的顯影對比度。 【實施例1 :磁性奈米粒子的製備】 將 FeCl2.4H20 2.98245g (0.015mole)加入 FeCl3.6H20 8.109g(0.03mole)以攪拌子攪拌至全溶，放人雙頸瓶中用攪 0424-A21175TWF(N2)；P02940019TW；esmond ‘1293113 摔器以5_>m在6(TC環境下擾掉。將5ΝΝ·以每秒一 滴的速率（1〇(M遍/Sec)滴入雙頸瓶中，反應至全黑測其 pH值為13即停止加入。持續攪拌15分鐘後冷卻至室溫， 利用離心機3000rpm轉10分鐘收取沉殿物。將沉殿物分別 放置50ml離心管中，每管浸泡〇 5ΝΗα並使其沉澱物分 散，利用9000rpm轉30分鐘收取沉澱物，加DMS〇(dimethyl sulfoxide)稍微沖洗，每管加入DMs〇使其沉澱物分散後， • 利用離心機9000rPm轉30分鐘收取上層液。通過0.2聚四 氟乙炸濾膜（PTFE filter)之上層液即得懸浮之四氧化三鐵 • 奈米微粒。 【實施例2 :生物相容性高分子修飾】 將聚乙二醇雙叛酸酯（PEG biscarboxylate ; Mn=600) 0」67mol在圓底燒瓶中加入（U8m〇l亞硫醯氯（thionyl • chloride)，加熱回流I·5小時後，減壓（76mmHg)蒸餾1小 時。再加入 〇·44 mol 2,2,2-三氟乙醇（2,2,2-trifluoroethanol) 加熱回流，並減麈蒸館1小時形成PEG-二三氟乙酯（PEG-ditrifluoroethylester) ° 將135 mol APS加入PEG-二三氣乙酯溶液中反應8小 時。將實施例1中〇.866mmole的氧化鐵溶在l〇〇mlDMSO 中加入 PEG-三氟乙酯梦院（PEG-trifluoroetliylester silane) 0424-A21175TWF(N2)；P02940019TW；esmond 10 1293113 1.4mmole。最後力口入0.016mole 乙二胺（EDA)搖晃震盡2 ‘小時，得到末端胺基的高分子修飾氧化鐵微粒。 【實施例3:專一性辨識分子修飾】 將1.7mmole葉酸溶在DMSO中震|至全溶，再將 0.76mmole NHS(N-hydroxysuccinimide)與 3.9mmole EDAC (l-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide)溶在上 # 述溶液中並且於°C下震盪1小時。將溶液調至pH=9加 入200mg(0.58mmole)實施例2之氧化鐵微粒，溶在上述 • DMS〇溶液中，搖晃8小時，得到具有葉酸修飾之氧化鐵 ' 微粒。 【實施例4 :螢光染劑修飾】 將2mg/ml已接枝葉酸之氧化鐵微粒溶至1〇ml去離子 水溶液中，加入 1 (T6mole/ml NIR 染劑 CypHer5E (Amersham Biosciencese公司）lml至溶液中反應7小時，得到兼具專 一性分子與染劑修飾的氧化鐵微粒。
【實施例5 ··對比度測試】以BRUKER公司之〇·47Τ 20MHz—MQ20mini_spec測量實施例4所得之氧化鐵微粒， 付到對比度為12 (r2/rl=2〇r/16.7)，優於市售SCHERING 0424~A21175TWF(N2)；P02940019TW；esmond •1293113 公司Resovist⑧之顯影劑（對比度=6 〇4)。 【實施例6 :細胞株專一性辨識】 分種Hff(人類包皮纖維組織母細胞）、HeLa(人類 ^ 頸上皮癌細胞）、KB(人類口腔上皮癌細跑）、 MDA_MB_231(人類乳癌細胞）四種細胞株，加入〗 t汽施例
4所得之氧化鐵微粒（200 pg/ml)，經過清洗並回收細胞株 後’以TEM切片檢測’其結果如第2-5圖所示。其中，心 了 Hff因為沒有folate接受器外，其餘具有如咖接受哭的 細胞株KB、MDA-MB-231、HeLa均可看到氧化鐵微粒進 入細胞中，如圖中箭頭所示。 另一方面，以流式細胞儀（flow cytometry)檢測具有榮 光之細胞比例，檢測結果如下表： 細胞株 氧化鐵微粒攝入率 Hff (控制組） 4.95% HeLa 31.90% MDA-MB-231 54.17% KB 70.26% 由表中可看出，具有folate接受器的細胞株KB、 MDA-MB-231、HeLa ’其攝入比例遠大於控制組pjff，符 合丁EM的切片結杲。 雖然本發明已以數個較佳實施例揭露如上，然其並非 0424-A21175TWF(N2)；P02940019TW；esmond 12 1293113 用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之 精神和範圍内，當可作任意之更動與潤飾，因此本發明之 保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
0424-A21175TWF(N2)；P02940019TW；esmond 13 .1293113 【圖式簡單說明】 第1圖繪示本發明具有專一性標示功能與螢光顯示之 磁性奈米微粒。 第2-5圖分別為實施例6中四種細胞株Hff'KB、 HeLa、MDA-MB_231 的 TEM 的切片結果。 【主要元件符號說明】 100〜多功能磁性奈米微粒； 10〜磁性奈米微粒； 12〜生物相容性高分子； 14〜榮光染劑； 16〜專一性辨識分子。 0424-A21175TWF(N2)；P02940019TW；esmond 14
Claims (1)
- .1293113 十、申請專利範圍： 1. 一種具有專一性標示功能與螢光顯示之磁性奈米微 粒’包括· 一磁性奈米微粒； 一生物相容性高分子，以化學鍵結修飾該磁性奈米微 粒； 一螢光染劑，耦接至該生物相容性高分子；以及 一專一性辨識分子，麵接至該生物相容性高分子。 2. 如申請專利範圍第1項所述之具有專一性標示功能 與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該磁性奈米微粒具有超 順磁性。 3. 如申請專利範圍第1項所述之具有專一性標示功能 與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該磁性奈米微粒擇自下 歹1]至少其一：鐵、钻、鎳、或前述之氧化物。 4. 如申請專利範圍第1項所述之具有專一性標示功能 與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該磁性奈米微粒之粒徑 約為 3_10nm 〇 5. 如申請專利範圍第1項所述之具有專一性標示功能 與螢光顯示之磁性奈米微粒，其耦接有該螢光染劑與該專 一性辨識分子之磁性奈米微粒，粒徑約15-100nm。 6. 如申請專利範圍第1項所述之具有專一性標示功能 與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該螢光染劑之激發或放 0424-A21175TWF(N2)；P02940019TW；esmond 15 •1293113 射光源為可見光、近紅外光、或紫外光。 7. 如申請專利範圍第1項所述之具有專一性標示功能 與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該螢光染劑為有機染 劑、無機染劑、或有機金屬錯合物。 8. 如申請專利範圍第1項所述之具有專一性標示功能 與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該專一性辨識分子為抗 體、蛋白質、胜肽、酵素、醣類、醣蛋白、核酸、或脂質。 馨 9.如申請專利範圍第1項所述之具有專一性標示功能 與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該生物相容性高分子係 ， 擇自下列至少其一：聚乙二醇（PEG)、聚乳酸-聚乙二醇 、 (PLA-PEG)、聚丙交酯（PLA)、聚乙交酯（PGA)、聚己内酯 (PCL)、或聚曱基丙烯酸曱酯(PMMA)。 10. 如申請專利範圍第1項所述之具有專一性標示功能 與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該生物相容性高分子末 •端具有胺基。 11. 如申請專利範圍第1項所述之具有專一性標示功能 與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該螢光染劑與該專一性 辨識分子係以共價鍵與談生物相容性高分子鍵結。 12. 如申請專利範圍第11項所述之具有專一性標示功 能與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中談專一性辨識分子與 該生物相容性高分子形成-CONH-鍵結。 0424-A21175TWF(N2)；P02940019TW；esmond 16 •1293113 13. 如申請專利範圍第1項所述之具有專一性標示功能 與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該生物相容性高分子係 披覆該磁性奈米微粒形成一殼核結構。 14. 如申請專利範圍第11項所述之具有專一性標示功 能與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該生物相容性高分子 係形成一單層披覆。 15. 如申請專利範圍第1項所述之具有專一性標示功能 拳 與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該生物相容性高分子係 經由一偶合劑與該磁性奈米微粒形成鍵結。 ' 16.如申請專利範圍第15項所述之具有專一性標示 w 功能與螢光顯示之磁性奈米微粒，其中該偶合劑為胺基 三烧氧基石夕炫（amino trialkoxysilane)。0424-A21175TWF(N2)；P02940019TW；esmond 17
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