CN103663570A - 一种在室温下制备卵巢癌靶向纳米四氧化三铁颗粒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在室温下制备卵巢癌靶向纳米四氧化三铁颗粒的方法。将铁盐、亚铁盐及多肽均匀分散于盐酸溶液中，碱分散于水中，在室温下将二者混合，通过液相沉淀法并利用多肽的矿化作用，制备出分散好、直径分布在20-50nm、生物相容性好且具有靶向卵巢癌细胞(SK-OV-3)的四氧化三铁纳米颗粒。本发明具有操作简单易行及环境友好等特点。

Description

一种在室温下制备卵巢癌靶向纳米四氧化三铁颗粒的方法

技术领域

本发明涉及一种在室温下利用合成多肽辅助制备卵巢癌靶向纳米四氧化三铁颗粒的方法。

背景技术

由于四氧化三铁纳米颗粒具有较大的表面积、超顺磁性以及其他良好的物理、化学、生物等性质，因此在磁共振成像(MRI)、靶向给药、细胞分离筛选以及肿瘤治疗(热疗)等领域具有极大的应用潜力。然而，最近一些研究报道四氧化三铁纳米颗粒能使诸如人巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞系、平滑肌细胞、脐静脉血管内皮细胞、癌细胞等细胞活力降低、形态发生变化，细胞毒性较大，且其稳定性差(易被氧化)、无靶向性等缺点限制了临床应用。四氧化三铁纳米颗粒经过表面修饰(接枝多肽、核酸、蛋白质和聚合物等)后，在保留其本身性质的同时能显著增强其生物相容性且具有其他的特殊性能。因此，通过使用不同的合成方法和反应参数，进而控制纳米材料的尺寸和形状，制备具有优良生物相容性能的四氧化三铁纳米材料是目前研究热点。

制备四氧化三铁纳米颗粒的方法有很多，常见的且应用较多的有：氧化还原法、共沉淀法、化学气相沉积、电化学沉积等方法。然而这些方法多数需要特定的合成条件：高温、高压、强氧化剂以及复杂的模板等，因此制备四氧化三铁纳米颗粒成本较高、条件苛刻，且在高温等条件下使纳米粒子无法获得生物活性表面成分和结构，另外在表面改性(接枝靶向多肽)过程中诸如上述条件会对多肽的生物活性造成严重的破坏，故而使得制备出的四氧化三铁纳米颗粒在生物医学领域中无法广泛的应用。常用的四氧化三铁纳米颗粒的表面改性手段是化学接枝，如果引进生物活性物质(叶酸、多肽、蛋白等)，在接枝过程中化学试剂对生物活性分子的结构等造成破坏，进而影响生物分子的生物活性，另外在接枝过程中不可避免会造成纳米粒子粒径发生变化；因此开发一种低温简便、环境友好、具有生物相容性、肿瘤靶向的四氧化三铁纳米颗粒制备方法是非常有必要的。

专利申请公开NO.201110458312报道了一种能特异性靶向卵巢癌细胞的多肽WSGPGVWGASVK(简写WSG)，该多肽分子量小，组织穿透性好，无免疫原性，不仅能靶向结合卵巢癌细胞，而且还能抑制卵巢癌细胞黏附、迁移以及存活率，多肽能通过结合的细胞表面受体介导有效地进入细胞，有助于对药物及基因于细胞内的传递，是一种卵巢癌的靶向传递系统中的理想配体。基于此开发体内肿瘤靶向造影剂、热疗剂具有巨大的应用前景。

发明内容

本发明提供了一种在温和条件下简单制备具有生物相容性、卵巢癌细胞靶向的四氧化三铁纳米颗粒的方法。

目前为止，制备具有靶向性质的四氧化三铁纳米粒子的方法都是得到四氧化三铁纳米粒子之后再经过化学改性后接枝靶向基团，制备过程繁琐复杂，且接枝率较低，产品纯度低，靶向性质差。但是本发明注意到，在制备四氧化三铁过程中利用合适的铁盐、溶剂，即使不经过复杂的化学接枝过程也能将靶向多肽连接于四氧化三铁纳米颗粒上。因此在本发明提出一种新的技术方案。其中，利用多肽辅助矿化性能、铁盐自氧化作用，通过简单沉淀法制备多肽-纳米四氧化三铁材料，该方法包括以下步骤：a)将六水合氯化铁、四水合氯化亚铁以及多肽溶解于盐酸溶液中，形成均匀分散液；b)将氢氧化钠水溶液与上述六水合氯化铁、四水合氯化亚铁以及多肽溶液混合，经反应后转变为多肽-四氧化三铁纳米颗粒；c)将反应后的混合液静置陈化。

在本发明的方法中，所述多肽WSG浓度为0.05-1.5mg／mL，优选为0.1-1.0mg／mL。所述多肽浓度过低不足以起到矿化成核作用，也无法满足后续靶向性质，浓度过高则会与铁盐溶液形成配合物，导致氧化沉淀反应无法顺利进行。

在本发明的方法中，所述氢氧化钠溶液浓度为：1.0-2.0M，优选为：1.5-3.0M；浓度过高则反应体系pH值无法控制，且对多肽的生物活性有所损害；浓度过低则无法完全反应。在缓慢搅拌条件下逐滴将所述碱液加入到所述铁盐溶液中，继续搅拌1-2小时。

在本发明的方法中，为得到纯净的分离产物，在步骤c)中需要洗涤和分离操作。采用的方法很多，在本发明中优选为离心法，离心速度优选为4000-6000转／分钟，离心时间优选为0.5-2小时，离心次数为5次。用于洗涤沉淀的试剂为二次水和乙醇，洗涤次数为5次，前三次为二次水洗涤，后两次为乙醇洗涤。分离纯化后的四氧化三铁纳米颗粒为干态储存。且干态储存之前的烘干温度优选为20-37℃.。

根据本发明方法可以在室温下制备得到表面修饰有多肽WSG的四氧化三铁纳米材料。本发明方法具有简单易行，产物环境友好等优点。由于纳米颗粒表面修饰有多肽，且多肽被证明具有靶向卵巢癌肿瘤血管内皮细胞性质，因此在提高纳米颗粒的生物相容性的同时也赋予了纳米四氧化三铁靶向卵巢癌的性质。

附图说明

结合附图对本发明作进一步说明，其中，

图1是制备WSG-四氧化三铁纳米颗粒的示例性步骤。

图2示出WSG-四氧化三铁纳米颗粒的透射电子显微镜照片。

图3示出WSG-四氧化三铁纳米颗粒在卵巢癌细胞内分布的透射电子显微镜照片。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明作进一步说明，这些实施例只是为了更好地理解本发明，并且在任何情况下都不应该将其解释为限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书所限定。

本发明中多肽-四氧化三铁纳米颗粒的制备是在室温下的液相沉淀法实现的。

本发明提供的制备纳米四氧化三铁材料的方法对于设备、试剂无特殊的要求，因此易于量产。以下是本发明的示例性的具体实施方案，通过这些实施方案可以更充分地理解本发明的上述优点。

实施例1

将5.3g六水氯化铁和1.98g四水氯化亚铁溶解于25ml盐酸溶液中，用磁力搅拌器搅拌混合欲处理15分钟，再将5mg多肽溶液加入上述溶液，继续搅拌30分钟，将分散液装入具塞锥形瓶中，常温放置24小时。将15g氢氧化钠分散于250mL二次水中，搅拌混合均匀。在温度为25℃.，搅拌速度为300转／分钟的条件下，向铁盐、多肽溶液中逐滴加入上述氢氧化钠水溶液250mL。继续在300转／分钟的速度下搅拌2-6小时，以利于溶液反应的充分进行。之后将混合体系在室温下静置2天，以利于四氧化三铁纳米颗粒的成核生长。最后产物通过洗涤和离心获得。在离心过程中，反应产物以4000转／分钟速度离心20分钟，沉底物用去离子水洗涤后，再次离心2-3次，且转速逐次增加到6000转／分钟，离心时间每次加长20分钟，最后用无水乙醇洗涤后得到较纯净产物。最后在37℃.以下空气气氛下烘干24小时。

实施例2

将5mg多肽、5.3g六水氯化铁和1.98g四水氯化亚铁溶解于25ml盐酸溶液中，用磁力搅拌器搅拌混合欲处理15分钟；将15g氢氧化钠分散于250mL二次水中，搅拌混合均匀。在室温条件下将上述铁盐溶液和碱液逐滴加入锥形瓶中，继续在300转／分钟的速度下搅拌2-6小时，以利于溶液反应的充分进行。后续洗涤和离心过程与实施例1中相同。

实施例3WSG-Fe3O4粒子的细胞毒性研究

细胞接种于96孔板中，培养至80％覆盖，吸除培养基。加入用完全培养基稀释的不同浓度多肽-Fe3O4粒子悬浮液，200μL／孔，培养24h、48h、72h。每个实验组4-6个平行，进行2-3次重复实验，以多肽-Fe₃O₄粒子浓度为0组作为对照。在检测时间点加入MTT溶液，20μL／孔(注意避光)，37℃培养箱中孵育24h。吸取每孔中液体，加入150μL／孔二甲基亚砜(DMSO)，37℃孵育30min。490nm下酶标仪测定其吸光度值。

实施例4多肽-Fe₃O₄粒子与细胞孵育后细胞的超微结构检测

将细胞接种于培养瓶中，培养至覆盖80％以上。更换培养基为含有0.1mg／mL浓度多肽-Fe3O4粒子悬浮液(完全培养基+WSG-Fe₃O₄粒子)，培养24h。WSG-Fe₃O₄粒子浓度为0组作为对照。去掉培养基，PBS洗涤2-3遍；消化细胞后，用0.9％的生理盐水洗涤，2,000rpm离心15min。重复洗涤3次，将细胞转入微量离心管中，2,000rpm离心15min。弃上清，缓慢滴加0.5％戊二醛，4℃静置30min。13,000rpm离心15min，弃上清。在PE管中加入1mL的3％戊二醛，保存于4℃冰箱中。1％四氧化锇后固定，丙酮逐级脱水，Epon812包埋。超薄切片机切片40-50nm，用醋酸铀及枸橼酸铅双染后收集于铜网，透镜观察。

Claims (1)

1.一种在室温下制备卵巢癌靶向纳米四氧化三铁颗粒的方法，该方法包括以下步骤：

a)将六水合氯化铁、四水合氯化亚铁以及多肽溶解于盐酸溶液中，形成均匀分散液，其中多肽WSG浓度为：0.05-1.5mg／mL，六水合氯化铁浓度为：0.5-1.0M，四水合氯化亚铁浓度为0.2-0.6M，盐酸浓度为：0.3-0.6M；

b)将浓度为1.0-2.0M氢氧化钠水溶液与上述六水合氯化铁、四水合氯化亚铁以及多肽溶液混合，其中，混合溶液与氢氧化钠水溶液体积比为1：1～10，然后继续搅拌2小时，经反应后转变为四氧化三铁纳米颗粒；

c)将反应后的混合液静置陈化，然后离心分离，并洗涤3-5次，干燥得样品。

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