WO2010029947A1 - 造影剤組成物及びその製造方法 - Google Patents

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WO2010029947A1
WO2010029947A1 PCT/JP2009/065760 JP2009065760W WO2010029947A1 WO 2010029947 A1 WO2010029947 A1 WO 2010029947A1 JP 2009065760 W JP2009065760 W JP 2009065760W WO 2010029947 A1 WO2010029947 A1 WO 2010029947A1
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WO
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apoferritin
contrast agent
complex
encapsulated
contrast
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PCT/JP2009/065760
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English (en)
French (fr)
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顕 牧野
俊作 木村
英郎 佐治
寛之 木村
浩 原田
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国立大学法人京都大学
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    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner

Definitions

  • the present invention relates to a contrast agent composition and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a contrast agent capable of reducing the dose with high sensitivity and a method for producing the same.
  • MRI is a method of imaging information inside the living body using the nuclear magnetic resonance phenomenon, and MRI used in the clinic targets 1 H contained in a large amount of water and fat in the body.
  • 1 H nuclei exposed to a strong static magnetic field resonantly absorb radio waves (RF) of a specific frequency and precess the nuclear magnetic moment.
  • RF radio waves
  • 1 H atoms return to their original state (relaxation phenomenon), but the relaxation time of 1 H atoms varies depending on tissues and lesions.
  • An image is created by using the difference in relaxation time as a contrast. Therefore, non-contrast imaging that does not use a contrast agent is possible with MRI, but in order to image the target site with higher contrast, a contrast agent that promotes relaxation of surrounding 1 H nuclei (contrast agent for MRI ) Is effective.
  • a paramagnetic substance As a contrast agent for MRI, a paramagnetic substance is used which has an effect of shortening the relaxation time by interaction with nearby 1 H nuclei.
  • gadolinium (Gd) is used as a paramagnetic substance in a positive contrast agent that shortens the longitudinal relaxation time (T 1 ).
  • Gd is highly toxic as it is, and Gd-DOTA (the following formula)
  • An object of the present invention is to provide a contrast agent or a contrast agent composition capable of reducing the dose of a contrast agent with high sensitivity and a method for producing the same.
  • the present inventors have surprisingly found a method in which a contrast medium can be encapsulated in a large amount and efficiently in apoferritin, which is an iron storage protein present in the living body, and the method further includes encapsulating the contrast medium in apoferritin.
  • the present inventors have found that the contrast agent composition is capable of imaging with higher sensitivity than conventional contrast agents, and have further improved the invention.
  • the present invention includes, for example, the following methods for producing a contrast agent composition of items 1 to 4, a contrast agent composition of items 5 to 9, a compound that can be used as a contrast agent of item 10, and a dextran-modified apoferritin of item 11 This relates to a particle size control method.
  • a contrast agent composition of items 1 to 4 a contrast agent composition of items 5 to 9, a compound that can be used as a contrast agent of item 10, and a dextran-modified apoferritin of item 11
  • This relates to a particle size control method.
  • the contrast agent for MRI added in the step is Gd-DTPA or the following formula (I)
  • R 1 and R 2 may be the same or different and each independently represents —H, —CH 2 COOH, —CH 2 CH 2 COOH, or 1 to 6 carbon atoms which may have one or more substituents. These substituents are the same or different and are at least one selected from the group consisting of OH, NHOH and NH 2 groups.
  • a method for producing a contrast agent composition according to Item 1. Item 3.
  • the method for producing a contrast agent composition according to Item 1 or 2 wherein the contrast agent body of the contrast agent for MRI added in the step (B) is positively charged.
  • the contrast agent for MRI added in the process is Gd-Me 2 DO2A (the following formula)
  • Item 5 A contrast agent composition produced by the method for producing a contrast agent composition according to any one of Items 1 to 4.
  • Item 6. A contrast agent composition comprising 20 molecules or more of an MRI contrast agent encapsulated in one molecule of apoferritin.
  • the contrast agent for MRI is Gd-DTPA or the following formula (I)
  • R 1 and R 2 may be the same or different and each independently represents —H, —CH 2 COOH, —CH 2 CH 2 COOH, or 1 to 6 carbon atoms which may have one or more substituents. These substituents are the same or different and are at least one selected from the group consisting of OH, NHOH and NH 2 groups.
  • Item 8. Item 6.
  • the contrast agent composition according to Item 5 wherein the outer surface of the apoferritin is modified with PEG, dextran, or a fluorescent dye.
  • Item 8 The contrast agent composition according to Item 6 or 7, wherein an outer surface of the apoferritin is modified with PEG, dextran, or a fluorescent dye.
  • the present invention it is possible to provide a contrast agent or a contrast agent composition that can reduce the dose of the contrast agent with higher sensitivity and a method for producing the same.
  • Gd-DTPA coordinates water An outline of how Gd-DTPA coordinates water is shown.
  • Gd-Me 2 DO2A shows the results of the measurement of the longitudinal relaxation time by the inversion recovery method.
  • the schematic diagram of the method of encapsulating Gd ion or Gd complex in apoferritin is shown.
  • (A) shows a known method
  • (b) shows the method of the present invention.
  • the results of measuring the amount of apoferritin and the amount of Gd in each fraction by dividing the Gd complex-encapsulated apoferritin solution into each fraction by size exclusion chromatography are shown.
  • (A) shows the UV spectrum (250 nm), and (b) shows the ICP emission analysis results.
  • ⁇ indicates the result immediately after the dissociation and reconstruction of ferritin and the inclusion of the Gd complex
  • ⁇ indicates only the Gd complex-encapsulating ferritin (fraction 5) after 168 hours.
  • SEC size exclusion chromatography
  • T 1 relaxation ability of Gd-Me 2 DO2A-encapsulated apoferritin containing 12.4 or 37.5 Gd-Me 2 DO2A per molecule of apoferritin ie, Example 3 and Example 4
  • a schematic diagram of PEG modification of the outside of apoferritin is shown.
  • the result of having introduced PEG into apoferritin and observing the change in the molecular weight of the apoferritin subunit by electrophoresis (SDS-PAGE) is shown.
  • SDS-PAGE electrophoresis
  • the schematic diagram which modifies the outside of apoferritin with dextran is shown.
  • R—NH 2 represents apoferritin
  • —NH 2 represents the amino group of the lysine residue of apoferritin.
  • DLS dynamic light scattering method
  • Sample A is a sample prepared by decomposing apoferritin at pH 2.0, adding a Gd complex at pH 4.5, and then adjusting to pH 7.4.
  • Sample B was not adjusted to pH 2.0, but a Gd complex was added at pH 7.4. It is a sample.
  • the contrast agent composition of the present invention is prepared by treating apoferritin with an acidic (eg, pH 1.5 to 3.0) solution, for example.
  • an acidic (eg, pH 1.5 to 3.0) solution for example.
  • Each of these is dissociated, and after this is once in a weakly acidic state (for example, 4.0 to 5.0), a contrast agent is added, and then a neutral to weakly alkaline (for example, pH 6.0 to 8.5) state. It is manufactured by making.
  • the contrast agent composition thus produced has a structure in which a molecule of contrast agent is encapsulated in apoferritin, and the contrast agent is highly concentrated in apoferritin. High concentration can be achieved by treating the apoferritin with an acidic solution and adding the contrast agent in this acidic state instead of adding the contrast agent once, and then adding the contrast agent.
  • One of the features of the present invention is that the contrast agent is added after it is once weakly acidic.
  • Apoferritin is a protein that exists widely in the living body and has a function of storing iron ions. It has a spherical shell structure in which 24 subunits are associated and the outer diameter and inner diameter are about 13 nm and 8 nm, respectively, and 14 channels of 0.7 to 1.0 nm exist on the surface of the spherical shell, From here, iron ions and water can enter and exit. In addition, by changing pH, association and dissociation of 24 subunits (hereinafter sometimes referred to as “apoferritin subunits”) can be reversibly controlled.
  • ferritin what has iron inside apoferritin is called ferritin.
  • ⁇ ⁇ Ferritin is known to exist widely in various species of organisms. Although any apoferritin derived from any organism can be used for the contrast agent composition of the present invention, those derived from living organisms to be administered and from other species are preferred. For example, when administered to mice or rats frequently used in animal experiments or clinically to humans, apoferritin derived from animals is preferable, and apoferritin derived from mammals is more preferable. Particularly, apoferritin derived from cattle and horses is preferable because it can be obtained relatively easily (for example, it can be purchased from Sigma Aldrich, CALBIOCHEM, etc.). Apoferritin derived from the same species is most preferable.
  • oil here refers not only to those purified from living organisms but also genetic engineering techniques (eg, production in E. coli, cell-free synthesis, etc.), chemical synthesis techniques, etc. It is meant to include those manufactured artificially using.
  • one or more preferably 1 to several tens, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to several, and still more preferably 1 to A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which 5 amino acids, particularly preferably 1, 2, 3 or 4 amino acids have been deleted, substituted or added, functioning as an apoferritin subunit (ie associated with other subunits)
  • Apoferritin containing a polypeptide that can form a spherical shell structure and can allow iron ions, water, and the like to enter and exit the sphere from the surface of the spherical shell is also included in the “origin” herein.
  • the amount of apoferritin used for producing the contrast agent composition of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately set according to the amount of contrast agent to be used.
  • Apoferritin is dissolved in an acidic solution.
  • the acidic solution for dissolving apoferritin is not particularly limited as long as apoferritin can be dissociated into each subunit, but a metal that can be incorporated into apoferritin (for example, iron, manganese, cobalt, nickel, chromium, indium) Etc.) Those containing ions are not preferred.
  • a metal that can be incorporated into apoferritin for example, iron, manganese, cobalt, nickel, chromium, indium
  • Those containing ions are not preferred.
  • Examples of preferable acidic solutions include hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid and the like.
  • the acidic solution for dissolving apoferritin typically has a pH of 1.5 to 3.0, preferably 1.8 to 2.5, more preferably 2.0 to 2.3.
  • the amount of the acidic solution used can be appropriately set according to the amount of apoferritin used.
  • an acidic solution may be added thereto to adjust the pH to the above.
  • the amount of water and acidic solution in which apoferritin is dissolved can be set as appropriate according to the amount of apoferritin used.
  • the temperature at which the acidic solution is added to apoferritin or water in which apoferritin is dissolved is not particularly limited, but it is preferably performed at a low temperature (eg, 0 to 15 ° C.). It is preferred to carry out at 4 ° C. Moreover, it is preferable to make the pH of the solution uniform by gently stirring while adding the acidic solution.
  • the measurement of pH can be performed suitably using a well-known method, it is suitable to put a pH meter in a solution and to measure it while performing operation (or every operation).
  • the apoferritin thus dissolved in the acidic solution is dissociated into each subunit. That is, in an “acidic (pH 1.5 to 3.0) solution in which apoferritin is dissolved”, apoferritin is dissolved in a dissociated state in each subunit.
  • the pH of the treatment liquid thus obtained (hereinafter sometimes referred to as “an acidic solution in which apoferritin is dissolved”) is adjusted to be weakly acidic.
  • the weak acid here specifically refers to a pH of 3.5 to 5.0, preferably a pH of 4.0 to 4.5, and more preferably a pH of 4.2 to 4.5.
  • apoferritin is contained in a state dissociated into each subunit. However, by making pH weakly acidic, each subunit is bound weakly. It is thought that it will become.
  • the method for adjusting the pH to be weakly acidic is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding an alkaline substance or an alkaline solution, and a method of adding an alkaline solution is particularly preferable.
  • the alkaline substance to be used include sodium hydroxide, potassium hydroxide and calcium hydroxide.
  • the alkaline solution to be used include sodium hydroxide aqueous solution, potassium hydroxide aqueous solution and calcium hydroxide aqueous solution.
  • those containing metal ions that can be incorporated into apoferritin are not preferred.
  • dissolved is also unpreferable.
  • the amount and concentration of the alkaline substance or alkaline solution used can be appropriately set according to the amount of acidic solution in which apoferritin is dissolved, pH, and the like.
  • a contrast agent is added to the treatment liquid (adjusted to weak acidity) obtained in the step.
  • the contrast agent here is an X-ray contrast agent or an MRI contrast agent, and an MRI contrast agent is preferred.
  • the treatment liquid obtained in the step (A) may be added to the contrast agent or the solution containing the contrast agent, but the contrast agent or the contrast agent is contained in the treatment liquid obtained in the step (A). It is preferred to add the solution.
  • a contrast agent is a certain compound or its pharmaceutically acceptable salt, the said compound may be called a contrast agent main body.
  • the Gd complex when a Gd complex or a salt thereof is used as a contrast agent, the Gd complex may be referred to as a contrast agent body. That is, when a Gd complex is used as a contrast agent, the Gd complex is also a contrast agent body. When a Gd complex salt is used as a contrast agent, the Gd complex is the contrast agent body.
  • a water-soluble iodine contrast agent As a contrast agent of the X-ray contrast agent, for example, a water-soluble iodine contrast agent can be mentioned. Specific examples include iopromide, iomiprol, iopamidol, ioversol, iohexol, ioxirane, iotrolane, iodixanol, sodium amidotrizoate meglumine, sodium iotaramate, meglumine iotalamate, oxaglucic acid, meglumine iotroxate, and the like.
  • MRI contrast agents examples include positive contrast agents (Gd contrast agents) and negative contrast agents (Fe contrast agents).
  • negative contrast agent examples include fermoxides.
  • positive contrast agent examples include gazide amide hydrate, cadteridol, gadoteric acid meglumine, gadopentetate meglumine, and the like. Furthermore, as a positive contrast agent, the following formula (I)
  • R 1 and R 2 may be the same or different and each independently represents —H, —CH 2 COOH, —CH 2 CH 2 COOH, or 1 to 6 carbon atoms which may have one or more substituents. These substituents are the same or different and are at least one selected from the group consisting of OH, NHOH and NH 2 groups. ] Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Formula (I) represents a Gd complex which is a contrast agent body of meglumine gadoterate when R 1 and R 2 are —CH 2 COOH, where R 1 is —CH 2 COOH and R 2 is —CH 2 CH. In the case of (OH) CH 3 , it represents a Gd complex which is a contrast agent body of cadteridol.
  • a compound of the formula (I) in which R 1 and R 2 are —H is Gd-DO2A
  • a compound of the formula (I) in which R 1 and R 2 are —CH 2 COOH is Gd-DOTA
  • R 1 A compound of formula (I) in which R 2 is —CH 2 COOH and R 2 is —CH 2 CH (OH) CH 3 may be referred to as Gd-HPDO3A (Gd ions are assigned to DO2A, DOTA, and HPDO3A, respectively) Represents a compound).
  • the number of carbon atoms of the alkyl group in “the linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have one or more substituents” represented by R 1 and R 2 is preferably 1 to 4, More preferably, it is 1 to 3, particularly preferably 1 or 2.
  • the “straight or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have one or more substituents” represented by R 1 and R 2 has a substituent, the number is typically Is 1 to 3, preferably 1 or 2, and particularly preferably 1.
  • the substituent is at least one selected from the group consisting of OH group, NHOH group and NH 2 group, preferably OH groups.
  • R 1 or R 2 is an alkyl group
  • an electron is donated to the N atom to which R 1 or R 2 is bonded, so that the N atom can coordinate the gadolinium ion more stably, which is preferable.
  • R 1 or R 2 is an alkyl group having an OH group, NHOH group or NH 2 group as a substituent, these groups are preferable because they contribute to increasing the solubility. It is preferable that R 1 and R 2 are both such groups.
  • R 1 and R 2 are the same or different and are, for example, —H, —CH 3 , —CH 2 CH 3 , —CH 2 CH 2 CH 3 , —CH (CH 3 ) 2 , —CH 2 OH, —CH 2 CH 2 OH, —CH (OH) CH 3 , —CH 2 CH 2 CH 2 OH, —CH (OH) CH 2 CH 3 , —CH 2 CH (OH) CH 3 , —C (OH) (CH 3 ) 2, -CH (CH 2 OH) (CH 3), - CH 2 COOH, preferably a -CH 2 CH 2 COOH or the like.
  • —CH 3 , —CH 2 CH 3 , —CH 2 OH, —CH 2 CH 2 OH, and —CH (OH) CH 3 are preferable.
  • R 1 and R 2 are preferably at least one of “a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have one or two or more substituents”, and more preferably both are “1 or A straight or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have two or more substituents.
  • Particularly preferred combination of (R 1, R 2) are, for example (-H, -H), (- CH 3, -H), (- CH 3, -CH 3), (- CH 3, -CH 2 CH 3 ), (—CH 2 CH 3 , —CH 2 CH 3 ), (—CH 2 CH 3 , —H).
  • the compound represented by the formula (I) in which the combination of (R 1 , R 2 ) is (—CH 3 , —CH 3 ) may be hereinafter referred to as Gd-Me 2 DO2A.
  • apoferritin is a protein that takes in positively charged iron ions in vivo, a compound having a positive charge is more easily taken into apoferritin. Therefore, among the compounds represented by the formula (I), those having no charge are preferable, and those having a positive charge are more preferable.
  • the compound of the formula (I) has a charge of ⁇ 1 because the Gd ion is +3 and COOH is COO ⁇ in the solution and has a charge of ⁇ 1. Therefore, if R 1 and R 2 are not taken into account, the compound has a charge of +1 as a whole.
  • the entire compound has a charge of -1.
  • Such a negatively charged compound can be encapsulated in apoferritin as long as it is a method for producing a contrast agent composition according to the present invention.
  • R 1 is —CH 2 COOH and R 2 is a group having no charge
  • the compound further has a charge of ⁇ 1. Is preferred.
  • R 1 and R 2 are both groups having no charge, the compound represented by formula (I) as a whole has a charge of +1, which is more preferable.
  • R 1 and R 2 are alkyl groups having an NH 2 group as a substituent, the NH 2 group has a positive charge, and the entire compound has no charge or a positive charge. It is preferable because it contributes to
  • the sum of the charges of R 1 and R 2 is preferably ⁇ 1 or more, and more preferably 0 or more. That is, the total charge of the compound represented by formula (I) is preferably 0 or more, and more preferably +1 or more.
  • the conventional Gd complex which is the main body of the Gd contrast agent is mainly an 8-coordinate compound of Gd ions (for example, Gd-DOTA, Gd-DTPA), and only one molecule of water can coordinate per molecule of the Gd complex.
  • the compound of the formula (I) (Gd complex) is 6-coordinated by 4 N atoms and 2 COO ⁇ unless R 1 and R 2 are taken into consideration.
  • R 1 is a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have one or more substituents
  • R 2 is a negative charge.
  • Group eg, —CH 2 COOH or —CH 2 CH 2 COOH
  • R 1 and R 2 are both a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms that may have one or more substituents, it becomes a 6-coordinate compound of Gd ion, Three water molecules can coordinate to Gd ions.
  • the coordination number of water per molecule of Gd complex increases, the effect of shortening the relaxation time per molecule of Gd complex is greatly improved, which is preferable. This can also reduce the dose of the Gd contrast agent.
  • R 1 is preferably a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have one or more substituents, and more preferably R 1 and R 2 are both hydrogen atoms. Alternatively, it is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have one or more substituents.
  • the ligand of the compound (complex) represented by the formula (I) is represented by the following formula (1).
  • reaction ⁇ Reaction which manufactures a compound (1) from a compound (2) can be performed by making it react with an acid in a suitable solvent or under absence of solvent. Hereinafter, this reaction may be referred to as “reaction ⁇ ”.
  • the solvent to be used examples include water; lower alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol and tert-butanol; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; ethers such as diethyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, monoglyme and diglyme; methyl acetate Esters such as ethyl acetate; Halogenated hydrocarbons such as chloroform, dichloromethane, dichloroethane, and carbon tetrachloride; Amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, and N-methylpyrrolidone; Dimethyl sulfoxide Hexamethylphosphoric triamide or a mixed solvent thereof. Of these, halogenated hydrocarbons such as chloroform, dichloromethane, dichloroethane, and carbon tetrachloride are preferable, and dichloromethane is more preferable
  • Examples of the acid used include mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid and hydrobromic acid, and organic acids such as formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid and p-sodium toluenesulfonic acid. Of these, trifluoroacetic acid is preferred.
  • the amount of the acid used is usually at least about 2 mol, preferably about 2 to 10 mol, relative to 1 mol of the compound (2), but the acid may be used in a large excess relative to the compound (2). .
  • This reaction normally proceeds suitably at about 0 to 200 ° C., preferably about 0 to 150 ° C., and is generally completed in about 10 minutes to 30 hours.
  • stirring may be performed.
  • the solvent and the acid are preferably distilled off under reduced pressure.
  • separation and purification can be performed using an ion exchange column.
  • the protecting group R 3 is not particularly limited as long as the reaction ⁇ can proceed.
  • a tert-butyl group is preferable.
  • R 3 is a general carboxyl-protecting group (see, for example, Protective groups in organic synthesis, Greene, TW; Wuts, PGM), and is a group that cannot be deprotected by reaction ⁇ (eg, methyl group, ethyl group) However, those skilled in the art can appropriately carry out known appropriate deprotection reactions.
  • Compound (2) can be produced by an appropriate method, and can be produced, for example, as shown in Reaction Scheme-2 below. [Reaction Formula-2]
  • reaction ⁇ The reaction for producing the compound (2) from the compound (3) can be performed by reacting the compound (3) and the compound (4) in a solvent in which an appropriate basic compound is present. Hereinafter, this reaction may be referred to as “reaction ⁇ ”.
  • Examples of the solvent used include: ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; ethers such as diethyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, monoglyme and diglyme; acetonitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; chloroform, dichloromethane, dichloroethane, Halogenated hydrocarbons such as carbon tetrachloride; Amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone; Dimethyl sulfoxide; Hexamethylphosphoric triamide or a mixed solvent thereof it can.
  • ketones such as acetone and methyl ethyl ketone
  • ethers such as diethyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, monoglyme and diglyme
  • acetonitrile esters such as methyl a
  • halogenated hydrocarbons such as chloroform, dichloromethane, dichloroethane, and carbon tetrachloride, and acetonitrile are preferable, and dichloromethane and acetonitrile are more preferable.
  • Examples of the basic compound include carbonates such as sodium carbonate, potassium carbonate, sodium hydrogen carbonate and potassium hydrogen carbonate; metal hydroxides such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide and lithium hydroxide. In particular, potassium carbonate is preferred.
  • the amount of the basic compound used is usually at least about 2 mol, preferably about 2 to 10 mol, relative to 1 mol of the compound (3), but the basic compound is used in a large excess relative to the compound (3). It may be used.
  • the amount of compound (4) to be used is generally at least about 2 mol, preferably about 2 to 10 mol, relative to 1 mol of compound (3). A large excess may be used.
  • Compound (4) is a compound represented by XCH 2 COOR 3 .
  • X represents a halogen atom, that is, F, Cl, Br or I, preferably Cl, Br or I, and more preferably Br.
  • R 3 is the same as described above. That is, the reaction is not particularly limited as long as the reaction ⁇ and the reaction ⁇ can proceed, and general protective groups for carboxyl groups (see, for example, Protective groups in organic synthesis, Greene, TW; Wuts, PGM) can be used.
  • general protective groups for carboxyl groups see, for example, Protective groups in organic synthesis, Greene, TW; Wuts, PGM
  • tert-butyl group methyl group, ethyl group and the like. Of these, a tert-butyl group is preferred.
  • R 1 and R 2 are an alkyl group having a substituent
  • the substituent needs to be protected before applying the compound (4).
  • an ester-type or ether-type protective group can be used for the —OH group
  • an amide-type or urethane-type protective group can be used for the —NH 2 group.
  • n-BuLi is used during the synthesis of compound (3)
  • ether-based protection that is stable especially under basic conditions It is more preferable to use some urethane-based protecting groups such as a group and an Fmoc group.
  • Compound (3) can be produced by an appropriate method, for example, it can be produced as shown in the following reaction scheme-3. [Reaction Formula-3]
  • the reaction for producing compound (3) from cyclen is, for example, a compound that can serve as a protecting group for protecting cyclen 1-position and 7-position (on the diagonal line) in a solvent in which a suitable base is present (for example, CH 3 SiCl 3 And R 1 X, R 2 X (X represents a halogen atom, that is, F, Cl, Br or I, preferably Cl, Br or I, more preferably I. In Reaction Scheme-3, X is I.) in the presence of n-butyllithium (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1995, 1233-1234).
  • R 1 X and R 2 X are different from each other in R 1 and R 2 , R 1 X and R 2 X are added to the reaction system by 1 equivalent each with a time difference (for example, 30 minutes to 2 hours), Those in which R 1 and R 2 are different can be easily synthesized (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1995, 1233-1234).
  • the obtained compound having only R 1, having only R 2, those having R 1 and R 2, even a mixture of three compounds, known methods (e.g., chromatography Chromatography).
  • Examples of the solvent used include ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; ethers such as diethyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, monoglyme, and diglyme; N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, and the like. Amides; dimethyl sulfoxide; hexamethylphosphoric triamide or a mixed solvent thereof. Of these, ether solvents are preferred, and tetrahydrofuran is more preferred.
  • Examples of the base include diisopropylethylamine (DIEA) triethylamine (Et 3 N), and diisopropylethylamine is particularly preferable.
  • DIEA diisopropylethylamine
  • Et 3 N triethylamine
  • diisopropylethylamine is particularly preferable.
  • the amount of base used is usually about 2 to 3 moles, preferably about 2 to 2.2 moles per mole of cyclen, but the base may be used in a large excess relative to cyclen.
  • This reaction usually proceeds suitably at about 0 to 200 ° C., preferably about 0 to 150 ° C., and the reaction for obtaining compound (5) from cyclen is generally completed in about 30 minutes to 3 hours.
  • the amount of n-BuLi used is about 2 to 3 moles per 1 cyclen, and R 1 X and R 2 X are preferably about 1 to 2 moles per cyclen. Further, only when R 1 and R 2 are the same group, they may be used in a large excess with respect to cyclen.
  • the compound (1) that can be produced as described above coordinates a gadolinium ion to become a gadolinium complex.
  • This gadolinium complex or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be used as a contrast agent for MRI.
  • the said gadolinium complex is basic, it can form a salt with a normal pharmaceutically acceptable acid.
  • Such acids include inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid and phosphoric acid, and methanesulfonic acid, p-sodium toluenesulfonic acid, acetic acid, citric acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, apple Examples include, but are not limited to, organic acids such as acid and lactic acid.
  • the said gadolinium complex is acidic, it can form a salt by making a pharmacologically acceptable basic compound act.
  • Examples of such basic compounds include, but are not limited to, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, and the like.
  • Coordination of gadolinium ions to the compound (1) can be performed, for example, by dissolving the compound (1) in a solution (for example, water or physiological saline) and gradually adding a gadolinium salt thereto.
  • a solution for example, water or physiological saline
  • the amount of the compound (1) and gadolinium salt to be used is not particularly limited, and since these are coordinated at a ratio of 1 mol: 1 mol, each appropriate amount can be calculated.
  • the gadolinium salt may be used in a large excess, or the compound (1) may be used in a large excess with respect to the gadolinium salt.
  • gadolinium salt gadolinium chloride, gadolinium nitrate, gadolinium perchlorate, or the like can be used, and gadolinium chloride is particularly preferable.
  • the conditions for adding the gadolinium salt to the solution of the compound (1) are not particularly limited as long as complex formation can be performed, but it is preferable to gradually add at 30 to 70 ° C.
  • the pH of the reaction solution at this time is pH 6.0 to 7.5, preferably 6.0 to 7 while adding an alkaline solution (for example, sodium hydroxide aqueous solution, potassium hydroxide aqueous solution, or calcium hydroxide aqueous solution). It is preferable to control to be 0.0. If the alkalinity becomes too strong, Gd 3+ may form Gd (OH) 3 and white precipitation may occur. Therefore, the addition is preferably carried out gradually little by little with gentle stirring. Further, after the addition, it is preferable to continue stirring gently for about 10 minutes to 48 hours.
  • the X-ray contrast medium or MRI contrast medium is preferably dissolved in a solution (for example, water or physiological saline) and then added to the treatment liquid obtained in step (A), and is obtained as described above.
  • a solution of the contrast agent for MRI that is, a compound in which gadolinium ions are coordinated to compound (1)
  • preparations of X-ray contrast agents already distributed as solutions for example, the main components are iopromide, iomiprol, iopamidol, ioversol, iohexol, ioxirane, iotrolan, iodixanol, sodium amidotrizoate meglumine, sodium iotaramate, meglumine iotalamate, ioxaglu MRI contrast agent preparations (for example, fermoxides, gazide amide hydrate, cadteridol, gadoterate meglumine (Gd-DOTA salt), gadopentetate meglumine (Gd-DTPA) Salt))) can also be used.
  • the sales companies of these drugs are described in, for example, “Today's Therapeutic Drug 2005 Edition-Explanation and Manual, edited by Yu Mizushima, Nanedo”.
  • the pH of the contrast agent solution is typically 6.0 to 7.5, preferably 6.0 to 7. 0.
  • the pH is 4.0 or less or 8.0 or more, when added to the treatment liquid obtained in the step (A), the apoferritin subunit may be weakly bound, which is preferable. Absent.
  • the amount of contrast agent added is usually 10 to 100,000 moles, preferably 100 to 10,000 moles, more preferably about 100 to 1000 moles per mole of apoferritin. A large excess may be used.
  • step (A) It is preferable to add the contrast agent solution to the treatment liquid obtained in step (A) (preferably gradually) and then gently agitate, for example, for 5 minutes to 2 hours to mix both liquids.
  • processing liquid obtained in the step (B) the liquid after the contrast agent solution is added (and stirred) to the processing liquid obtained in the step (A) may be hereinafter referred to as “processing liquid obtained in the step (B)”.
  • ⁇ Process (C)> The pH of the treatment liquid obtained in the step (B) is adjusted from near neutral to weakly alkaline, apoferritin subunits are associated, and apoferritin encapsulates an X-ray contrast medium or an MRI contrast medium.
  • near neutrality to weak alkalinity is specifically pH 6.0 to 8.5, preferably 6.5 to 8.0, more preferably 7.0 to 7.5, and still more preferably.
  • the pH is 7.2 to 7.4.
  • the treatment liquid obtained in the step (B) is weakly acidic, it is preferable to add an alkaline solution in order to adjust it to the above-mentioned neutrality to weakly alkaline pH.
  • the alkaline solution include a sodium hydroxide solution, a potassium hydroxide solution, and a calcium hydroxide solution, and a sodium hydroxide solution is particularly preferable.
  • the concentration and amount of the alkaline solution can be appropriately set according to the amount of the treatment liquid obtained in the step (B).
  • the mixture may be further stirred for 5 minutes to 6 hours at room temperature to low temperature (eg, 4 ° C.).
  • purification can also be performed by subjecting the obtained solution to size exclusion chromatography.
  • the contrast agent composition produced by the method for producing a contrast agent composition that has undergone the above steps (A), (B), and (C) has a structure in which a large amount of contrast agent is encapsulated in apoferritin.
  • the acid solution in which apoferritin is once dissolved is made weakly acidic (step (A)), and then a contrast agent is added (step (B)), so that a large amount of the solution is not required.
  • a contrast medium (about 10 to 200 times) can be encapsulated in apoferritin.
  • the contrast agent is used unless the contrast agent is used in a very large amount (for example, 1000 times equivalent to apoferritin) as compared with the method for producing the contrast agent composition of the present invention. It cannot be encapsulated in apoferritin and the efficiency is very poor. Therefore, the method for producing a contrast medium composition of the present invention is more efficient, and the amount of contrast medium to be used can be saved.
  • apoferritin is a protein that takes in positively charged iron ions, a contrast agent that has no charge compared to a contrast agent that has a negative charge, and further a contrast agent that has a positive charge. However, it is preferable because it is easily incorporated into apoferritin.
  • the contrast agent composition of the present invention produced as described above has a structure in which a contrast agent is encapsulated in apoferritin. Therefore, when the Gd complex contrast agent is encapsulated in apoferritin, the Gd complex is also stabilized by an amino group, a carboxyl group, or the like inside the apoferritin.
  • the Gd complex contrast agent encapsulated in apoferritin can be a 6-coordinate or 7-coordinate compound of Gd ions, and a conventional Gd complex contrast agent (eight coordination of Gd ions).
  • the number of coordination bonds is smaller than that of the main compound, the number of stable complexes may be slightly lower (Gd ions are likely to deviate from the ligand).
  • ferritin By being encapsulated in ferritin, it is stabilized and it becomes difficult to produce toxicity, and it can sufficiently withstand practical use as a contrast agent for MRI.
  • the T 1 relaxation time is significantly shortened compared to the same amount of the Gd complex contrast agent itself.
  • water channels are supplied to the inside of the apoferritin by channels existing in the apoferritin, and apoferritin promotes the exchange of water molecules close to the Gd complex. This is probably because an effect (polymer effect) due to suppression of movement due to incorporation of a Gd complex into apoferritin can be obtained.
  • the number of contrast agent molecules encapsulated in apoferritin is not particularly limited except for the area inside apoferritin, but is usually about 5 to 1000, preferably about 10 to 250, more preferably about 20 to 200. In particular, those containing 20 or more contrast agent molecules are preferred, those containing 30 or more are more preferred, and those containing 50 or more are more preferred.
  • the number of contrast agent molecules encapsulated in apoferritin for example, when a Gd complex contrast agent is encapsulated in apoferritin, the apoferritin concentration is captured by ICP emission analysis using the Lowry method. The amount of Gd thus obtained can be calculated, and the number of Gd complex contrast agents encapsulated in one molecule of apoferritin can be calculated from these values.
  • the contrast agent composition of the present invention has a structure in which a contrast medium is encapsulated in apoferritin, it is considered that the size thereof is equivalent to that of apoferritin (outer diameter is about 13 nm).
  • EPR Enhanced Permeation and Retention
  • EPR effect is due to rapid angiogenesis in cancer tissue, a large gap of about 100 nm is formed in the blood vessel, and the development of the lymphatic system, which is the excretory system, is also delayed.
  • molecules (or aggregates) of the order of nm are administered into blood, they are preferentially leaked and collected in cancer tissues.
  • the contrast agent composition of the present invention when administered to a living organism suffering from cancer, the contrast agent composition of the present invention accumulates particularly in the cancer tissue selectively due to the EPR effect, and can contrast the cancer tissue more clearly.
  • the apoferritin surface of the contrast medium composition of the present invention can be chemically modified.
  • the particle size is typically 20 to 100 nm, preferably about 30 to 80 nm.
  • the particle size can be measured by, for example, dynamic light scattering (DLS).
  • the contrast agent composition of the present invention which is a Gd complex-encapsulated apoferritin is also likely to accumulate in the liver.
  • accumulation of the contrast medium composition of the present invention in the liver can be prevented and the residence time in blood can be extended.
  • the accumulation is induced by a foreign body recognition function by the reticuloendothelial system, and by chemically modifying the apoferritin surface of the contrast agent composition of the present invention, Since foreign substance recognition by the reticuloendothelial system can be avoided, it is presumed that the above-described effect can be obtained.
  • the outer diameter of the composition can be increased by modifying the apoferritin surface of the contrast agent composition of the present invention with, for example, polyethylene glycol (PEG) or polysaccharide (for example, dextran).
  • PEG polyethylene glycol
  • polysaccharide for example, dextran
  • a multimodality probe with optical imaging can be prepared.
  • PEG or polysaccharide for example, dextran
  • modification with dextran is more preferable.
  • a carboxyl group or an amino group existing outside of apoferritin can be used.
  • PEG-COOH poly (ethylene-glycol) dioglycolic-acid
  • WSC water-soluble carbodiimide
  • NHS ester active ester
  • dextran can be modified with dextran by reacting with lysine residue of apoferritin after activating dextran with cyanogen bromide.
  • dextran is a material studied as a carrier and the like in the field of DDS (drug delivery system) and is considered to be highly safe and is preferable as a modifying group for apoferritin.
  • the particle size of apoferritin modified with dextran can be increased by increasing the amount of cyanogen bromide.
  • the amount of cyanogen bromide to be used is usually 15 mg or more, preferably 15 to 300 mg, more preferably 20 to 200 mg per 500 mg of dextran.
  • dextran-modified apoferritin having an average particle size of about 30 nm can be prepared.
  • dextran-modified apoferritin having an average particle diameter of about 60 nm can be prepared.
  • cyanogen bromide may be added to dextrin at a time, or may be added in several times (preferably 2 to 5 times).
  • the molecular weight of dextran used for modification is not particularly limited, and examples thereof include 10,000 to 200,000, preferably 20000 to 100,000.
  • the present invention enables dextran to be activated with cyanogen bromide and reacted with a lysine residue of apoferritin to produce apoferritin modified with dextran as described above.
  • a particle size control method for dextran-modified apoferritin is also included, wherein the particle size of apoferritin modified with dextran is controlled by controlling the amount of cyanogen bromide.
  • a structure in which the contrast agent is encapsulated in the modified apoferritin by mixing the apoferritin modified as described above with the apoferritin used. It is also possible to obtain a contrast agent composition having The mixing ratio (molar ratio) is not particularly limited. For example, (apoferritin: modified apoferritin) (19: 1 to 0:20), preferably (9: 1) to (0:10). .
  • the modification frequency of the obtained contrast agent composition can be changed by the ratio. That is, the larger the ratio of “chemically modified apoferritin” used, the greater the amount of modification provided in the resulting contrast agent composition.
  • the apoferritin surface is modified with a polysaccharide (for example, dextran), the polysaccharide is multipoint-crosslinked with the apoferritin surface, so it is difficult to dissociate the polysaccharide-modified apoferritin into each apoferritin subunit. Therefore, it is difficult to use apoferritin modified with a polysaccharide as the “modified apoferritin”.
  • the “chemically modified apoferritin” is not particularly limited. For example, it is modified with Dy776.
  • Apoferritin or apoferritin modified with PEG is preferred.
  • apoferritin encapsulating a contrast agent and the surface of the apoferritin chemically modified is also included in the contrast agent composition of the present invention.
  • the contrast agent composition of the present invention can be formulated in the form of a medical preparation and administered into the body, and is usually formulated as an injection (solution, emulsion, suspension).
  • the solution in which the contrast medium composition of the present application is dissolved is preferably sterilized and isotonic with blood.
  • the diluent used for forming these liquids, emulsions and suspensions known ones that are widely used can be used, for example, water, ethanol, propylene glycol, ethoxy Isooxyallyl alcohol, polyoxyisostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbetane fatty acid esters and the like.
  • a sufficient amount of sodium chloride, glucose or glycerin may be included in the preparation to prepare an isotonic solution, and the structure of the contrast agent composition of the present application (particularly the structure of apoferritin) may be changed.
  • normal solubilizing agents, buffering agents, soothing agents, etc. and further, if necessary, coloring agents, preservatives, flavorings, flavoring agents, sweetening agents, etc. Good.
  • the amount of contrast agent contained in apoferritin is typically 0.0001 to 1 mmol mol / kg. 0.001 to 0.5 mmol mol / kg is preferable, and 0.01 to 0.1 mmol mol / kg is more preferable.
  • the contrast medium composition of the present invention having a structure in which a contrast medium is encapsulated in apoferritin modified with a fluorescent molecule is administered to a mammal (for example, administered by injection into the tail vein of a mouse or rat).
  • a mammal for example, administered by injection into the tail vein of a mouse or rat.
  • an imaging system for example, Xenogene's IVIS-200
  • the pharmacokinetics can be examined. This also makes it possible to determine whether or not an EPR effect can be obtained.
  • the contrast agent composition of the present application is obtained by efficiently encapsulating a contrast agent in apoferritin.
  • the Gd complex contrast medium encapsulated is stabilized in the apoferritin and the toxicity is less likely to occur.
  • the effect of shortening the relaxation time (relaxation degree) of water per molecule of the Gd complex contrast agent is increased by the polymer effect and the water molecule exchange promoting effect. Therefore, compared to the same amount of the Gd complex contrast agent not encapsulated in apoferritin, the T 1 relaxation time is greatly shortened. From these facts, the dose can be greatly reduced.
  • the compound represented by the above formula (I) having an overall charge of 0 or more, particularly 1 or more is encapsulated in apoferritin, it is more easily encapsulated in apoferritin. A larger number of contrast agents are included. Thereby, the cost performance in the manufacturing process is improved. Moreover, the amount of contrast agent-encapsulated apoferritin to be administered can be reduced by encapsulating a large number. Furthermore, Gd complexes with fewer than 8 coordination numbers have more water coordination sites for Gd ions and more water molecules that promote relaxation, increasing the degree of relaxation and reducing the amount of contrast agent to be administered. Can be reduced.
  • Test Example 1 as production following Gd-Me 2 DO2A, to produce a Gd-Me 2 DO2A.
  • the production scheme of Gd-Me 2 DO2A is first shown below.
  • Test Example 2 it was Gd-Me 2 Do2A evaluation Gd-Me 2 complex stability constant and longitudinal relaxation time measurement Do2A prepared in Test Example 1 of the complex.
  • Arsenazo III is known to form a 2: 1 complex with Gd, and its complex stability constant (log K ML ) is 12.8.
  • Arsenazo III when complexed with Gd, has UV absorption at 660 nm with a molar extinction coefficient of 50000 M -1 cm -1 , so Gd-Me 2 DO2A and Arsenazo III are mixed in an arbitrary ratio to achieve an equilibrium state. Then, the complex stability constant of Gd-Me 2 DO2A was calculated by determining the amount of Gd complexed with Arsenazo III, and the log K ML was 18.2. The complex stability constant of Gd-DOTA is reported to be around 25, and Gd-DO2A is reported to be about 13, which is just about the middle.
  • the longitudinal relaxation time of Gd-Me 2 DO2A was measured by the inversion recovery method (inversion recovery method).
  • inversion recovery method A Bruker DPX-400 was used for the measurement. Specifically, an aqueous solution serving as a sample was sealed inside a capillary and measured in a deuterated chloroform solution by the inversion recovery method.
  • the T 1 relaxation time was measured at a Gd complex concentration of 0 to 5 mM, and the inverse of concentration and relaxation time was plotted (Fig. 2). As a result, the relaxation rate R 1 was 6.73 mM -1 s. It became -1 .
  • the relaxation degree of Gd-DOTA which is an 8-coordinate complex of Gd
  • Gd-Me 2 DO2A is 6-coordinated. It is thought that the degree of relaxation increased as a result of increasing the number of water molecules whose relaxation was promoted by Gd.
  • Table 1 summarizes the reported complex stability constants and relaxation degree R 1 for various gadolinium complexes. Note that the relaxation degree of Gd-DO2A is larger than that of Gd-DOTA, but this is also considered to be because Gd-DO2A is a 6-coordinate complex of Gd.
  • Test Example 3 Optimization of encapsulation of Gd-Me 2 DO2A complex in apoferritin.
  • a known method used in small molecule inclusion experiments in apoferritin is to add molecules to be included in an apoferritin solution that is dissociated in an acidic state (for example, pH 2.0), and add it to an alkaline solution (for example, 1 N NaOH aqueous solution). By reverting the pH to neutral, apoferritin is re-associated and a small molecule is encapsulated.
  • Gd ions or Gd complexes were encapsulated in apoferritin by the known method and the method of the present invention (known method: FIG. 3a, method of the present invention: FIG. 3b) and compared.
  • the product was purified by size exclusion chromatography (Sephacryl S-100: inner diameter 10 mm, length 180 mm) (GE Healthcare Bioscience). Specifically, the flow rate was a free fall rate, the temperature was 4 ° C., and the fraction was collected every 40 drops. And the fraction considered to contain the most apoferritin was selected by measuring the UV absorption spectrum at 230 nm.
  • the apoferritin concentration was calculated by the Lowry method, and the amount of Gd incorporated by ICP emission analysis was calculated (Table 2, Reference Examples 1 to 3).
  • the Lowry method was performed using a protein assay Lowry kit manufactured by Nacalai Tesque, and the absorbance at a measurement wavelength of 750 nm was measured using a Hitachi U-2001 Spectrometer.
  • a calibration curve was prepared using an apoferritin solution of 0.1 ⁇ M to 5.0 ⁇ M.
  • SPS 4000 manufactured by Seiko Electronics Industry Co., Ltd. was used.
  • a calibration curve was prepared using 0-100 ppm gadolinium chloride aqueous solution.
  • the amount of Gd-DOTA and Gd-Me 2 DO2A incorporated into apoferritin is the theoretical value calculated for each complex from the volume ratio (ie, the apoferritin concentration calculated from the ratio of the solvent volume to the internal volume of apoferritin). The value was larger than the number of gadolinium present in the internal volume per molecule. Furthermore, compared with the case where it is encapsulated in apoferritin by the above-mentioned known method (Reference Examples 1 to 3), 5 to 15 times as much amount can be encapsulated in apoferritin even though the preparation amount for apoferritin is significantly smaller. I found out.
  • the cationic Gd-Me 2 DO2A is about 20 times as large as Gd-DOTA (comparison between Example 2 and Example 7) and about 290 times the theoretical value calculated from the volume ratio (Example 5). It was found that the Gd complex was incorporated into apoferritin. That is, it was confirmed that the cationic molecule was successfully incorporated into apoferritin with high efficiency. In particular, when the inclusion yield of the added Gd complex in Example 5 was determined, it was about 25%, and a dramatic improvement in the encapsulation efficiency was achieved.
  • the encapsulation yield can be calculated by determining the amount of Gd complex encapsulated in ferritin by size exclusion chromatography and the amount of Gd complex remaining without encapsulation.
  • the amount of Gd complex contained in each fraction is determined by separating and purifying the reaction solution after the inclusion operation by size exclusion chromatography and analyzing each fraction with an ICP emission spectrometer. (See FIG. 4B). From the ratio of these amounts, the encapsulation yield can be determined.
  • Test Example 4 Stability of Gd complex encapsulated in apoferritin
  • Gd complex-encapsulated apoferritin was produced under the same conditions as in Example 6, and the stability of the resulting Gd complex-encapsulated apoferritin was examined. went.
  • a sample immediately after preparation of Gd-complex-encapsulated apoferritin and a sample in which a fraction containing purified Gd-encapsulated apoferritin was stored in a buffer solution at 4 ° C for 168 hours were respectively separated by GE Healthcare Sephacryl S- It was applied to 100 size exclusion chromatography (eluent: 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl (pH 7.4)), and collected by the fraction collector every 40 drops.
  • FIG. 4 shows the results of analyzing the absorbance at 250 nm for each fraction by UV (Hitachi U-2001 Spectrometer) and the Gd content by ICP emission analysis (SPS4000 manufactured by Seiko Denshi Kogyo Co., Ltd.).
  • the results of UV are shown in FIG. 4 (a), and the results of ICP emission analysis are shown in FIG. 4 (b). It is possible to know the presence of protein from the UV analysis result and the presence of gadolinium from the ICP emission analysis result.
  • Test Example 5 Relaxation ability evaluation of Gd-encapsulated apoferritin ⁇ Measurement of relaxation time>
  • Relaxation degree 30.14 mM ⁇ 1 s ⁇ 1 ).
  • the horizontal axis indicates the Gd concentration contained in each sample.
  • Apoferritin encapsulating a Gd complex showed a stronger T 1 relaxation ability than Gd-DOTA and Gd-Me 2 DO2A even at low Gd concentrations.
  • the longitudinal relaxation time was measured and the relaxation degree (R 1 ) was determined.
  • the relaxation degree of Gd-Me 2 DO2A-encapsulated apoferritin was 14.0 mM ⁇ 1 s ⁇ 1 in Example 3, and 14.4 in Example 4. mM ⁇ 1 s ⁇ 1 .
  • the relaxation degree of Gd-Me 2 DO2A and Gd-DOTA was 7.6 mM ⁇ 1 s ⁇ 1 and 3.9 mM ⁇ 1 s ⁇ 1 , respectively. From this, the relaxation degree of Gd-Me 2 DO2A-encapsulated apoferritin was about twice that before encapsulating and about 3 to 4 times that of Gd-DOTA, for example, in Example 3, and succeeded in increasing the sensitivity by encapsulation. I was able to confirm.
  • Test Example 6 Chemical modification of apoferritin (PEG modification)
  • PEG modification Chemical modification of apoferritin
  • PEG-COOH was NHS esterified and then modified with apoferritin. The scheme is shown below.
  • reaction solution was purified by size exclusion chromatography (Sephacryl S-100).
  • PEG was confirmed by observing changes in the molecular weight of the apoferritin subunit by electrophoresis (SDS-PAGE) (FIG. 8).
  • Test Example 7 Chemical modification of apoferritin (dextran modification)
  • dextran which is a water-soluble polysaccharide in which glucose is connected mainly by ⁇ (1 ⁇ 6) bonds
  • Dextran was activated with cyanogen bromide and then reacted with a lysine residue of apoferritin (FIG. 9).
  • dextran-modified apoferritin was measured by a dynamic light scattering method (DLS) to determine the particle size. This revealed that dextran-modified apoferritin having an average particle size of about 60 nm can be prepared (FIG. 10 (a)).
  • DLS dynamic light scattering method
  • cyanogen bromide to be used was changed and examined in the same manner. Specifically, dextran-modified apoferritin was obtained in the same manner as above except that cyanogencyanobromide (20 mg) was added to the reaction solution three times every 30 minutes, and the particle size was determined by dynamic light scattering (DLS). Were determined. As a result, it was confirmed that dextran-modified apoferritin having an average particle size of about 30 nm could be prepared (FIG. 10 (b)).
  • the particle size of apoferritin modified with dextran can be controlled by the amount of cyanogen bromide used to activate dextran during dextran modification. Specifically, it was found that the larger the amount of cyanogen bromide used to activate dextran, the larger the particle size of the resulting dextran-modified apoferritin.
  • Test Example 8 Chemical modification of apoferritin (Dy776) 0.4 mg of Dy776 (manufactured by Dyomics) having a terminal carboxyl group structure was dissolved in 0.1 mL of deionized water. 0.1 mg of water-soluble carbodiimide, 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, hydrochloride was added and stirred at 0 ° C. and pH 6.0 for 15 minutes. Subsequently, apoferritin (9.2 mg) dissolved in 0.1 mL of deionized water was added to the reaction solution, and the mixture was stirred overnight and allowed to react with light. After completion of the reaction, purification was performed using a Sephacryl S-100 column to obtain Dy776 modified apoferritin.
  • Test Example 9 Examination of imaging ability of MRI contrast agent composition comprising Gd complex-encapsulated apoferritin Examination of imaging ability of MRI contrast agent composition comprising dextran-modified apoferritin encapsulating Gd complex was performed as follows. It was. ⁇ Preparation of MRI contrast agent composition comprising apoferritin encapsulating Gd complex> Apoferritin encapsulating a Gd complex was prepared in the same manner as in Example 5 of Test Example 3. The Gd complex-encapsulated apoferritin was modified with dextran in the same manner as described in Test Example 7. As a result, Gd complex-encapsulated dextran-modified apoferritin having an average particle size of 60 nm was obtained.
  • Sample 1 was subjected to longitudinal relaxation time measurement by the inversion recovery method in the same manner as in Test Example 2, and the relaxation degree (R 1 ) was 23.5 mM ⁇ 1 s ⁇ 1 .
  • sample 1 Dextran-modified Gd complex-encapsulated apoferritin (average particle size: 60 nm) (Gd: 0.0708 mg / 250 ⁇ L) sample 2... Gd-DOTA (Commercially available drug “Magnescope” (active ingredient: meglumine gadoterate) Reference) (Gd: 0.42 mg / 250 ⁇ L)
  • the doses of sample 1 and sample 2 were determined as follows. sample 1 ... Since the relaxation degree (R 1 ) is 23.5 mM -1 s -1 and the relaxation degree of Gd-DOTA is (R 1 ) is 3.96 mM -1 s -1 , the dose of Gd in sample 2 The Gd weight was set to (3.96 / 23.5) times.
  • the value (3.96 mM -1 s -1 ) of the relaxation degree (R 1 ) of the Gd-DOTA is a value obtained as a result of measuring the longitudinal relaxation time by the inversion recovery method as in Test Example 2. is there. sample 2 ...
  • the dosage was determined based on the dosage for administration to humans (Gd-DOTA 75 mg / kg). Since the body weight of the nude mouse used in the experiment was 20 g, administration was performed so that the dose of Gd-DOTA was 1.5 mg.
  • the contrast effect was evaluated by the brightness per pixel of the MRI image.
  • nude mice were anesthetized by intraperitoneally administering an anesthetic (Nembutal).
  • Gd complex-encapsulated apoferritin contrast agent gradually showed a contrast between the cancerous site and healthy tissue after administration, and reached the maximum (1.44) 24 hours after administration.
  • the EPR effect improves the retention of the MRI contrast medium in the blood, and it is thought that the contrast was gradually improved after 24 hours because the contrast medium gradually accumulated in the site of the cancer.
  • Gd complex-encapsulated apoferritin contrast agent composition (sample 1) has a cancer site contrast enhancement effect (24 hours later: 1.25 ⁇ 1.44) compared to the maximum value in Gd-DOTA (immediately after administration: 1.25 ⁇ 1.33) It was more than twice as strong.
  • This outer shell is Dy-776-modified dextran-encapsulated dextran-modified apoferritin (hereinafter referred to as “Gd-complex-encapsulated dextran Dy-776 apoferritin”), as mentioned above, cancer derived from human cervical cancer at the base of the right foot This was administered to nude mice transplanted with tissue, and the blood kinetics of contrast media in cancer-bearing mice were examined with a near-infrared imaging device.
  • FIG. 13 shows the results of imaging in the same individual immediately after administration, 1, 6, 24, and 48 hours later.
  • Gd-complex-encapsulated dextran Dy-776 apoferritin is selectively stored at the cancer site by the EPR effect without releasing the encapsulated Gd complex. It was confirmed that
  • Test Example 10 Examination of efficiency of incorporation of Gd complex into apoferritin In an attempt to encapsulate 120 equivalents of Gd-Me 2 DO2A complex with respect to apoferritin by the following two methods.
  • Sample A Apoferritin was decomposed at pH 2.0, Gd complex was added at pH 4.5, and then adjusted to pH 7.4.
  • Sample A was prepared in the same manner as “Method of the Invention” described in Test Example 3, and Sample B was prepared at pH 7.4 without changing the pH in the method. Both samples were purified by size exclusion chromatography (Sephacryl S-100), and the Gd concentration contained in each fraction was quantified using an ICP emission analyzer (FIG. 14).
  • the fraction near fraction number 5 shows a high molecular weight fraction containing apoferritin
  • the fraction near fraction number 9 shows a low molecular weight fraction containing a free Gd complex not encapsulated or adsorbed in apoferritin.
  • sample A a Gd complex was detected from the fraction near fraction number 5, and only a small amount of Gd complex was detected in the fraction near fraction number 9 compared to sample B. Therefore, the Gd complex was found inside apoferritin. It was confirmed that was taken in.
  • the Gd complex-encapsulated apoferritin contrast agent composition encapsulating the Gd complex under the conditions of Sample A was stored in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) buffer solution or serum, and 24, 48, 96, 168 hours passed. After ultrafiltration (MWCO 30000), the filtrate was analyzed by ICP emission spectrometry. As a result, Gd was not detected from any sample. Further, even when each sample was repeatedly washed with a buffer solution by ultrafiltration, Gd was not detected from the filtrate. From this, it was confirmed that the Gd complex was contained in apoferritin very stably in the Gd complex-encapsulated apoferritin contrast agent composition.
  • the area shown with the oblique line in FIG. 14 represents the amount of Gd complex adhering to the outer surface of the apoferritin bulb shell, it is extremely small, and the Gd complex is contained in apoferritin very stably as described above. Therefore, it is considered that most of the Gd complexes are encapsulated in apoferritin in the Gd complex-encapsulated apoferritin contrast agent composition.

Abstract

本発明は、高感度で造影剤の投与量を減らすことが可能な造影剤又は造影剤組成物及びその製造方法を提供することを課題とする。 （Ａ）：アポフェリチンが溶解したｐＨ１．５～３．０の酸性溶液を、ｐＨ３．５～５．０に調整する工程、（Ｂ）：（Ａ）工程で得た処理液に、Ｘ線造影剤又はＭＲＩ用造影剤を添加する工程、（Ｃ）：（Ｂ）工程で得た処理液を、ｐＨ６．０～８．５に調整する工程、を含むことを特徴とする、造影剤組成物の製造方法をここに提供する。当該製造方法で得られる造影剤組成物は、造影剤の分子がアポフェリチンに内包された構造を有し、アポフェリチン内に造影剤が高濃縮されている。

Description

造影剤組成物及びその製造方法
　本発明は、造影剤組成物及びその製造方法に関する。より詳細には、高感度で投与量を減らすことが可能な造影剤及びその製造方法に関する。
　MRIとは核磁気共鳴現象を利用して生体内部の情報を画像化する方法で、臨床にて用いられているMRIは体内に多量に存在する水や脂肪に含まれる1Hを対象としている。強い静磁場に晒された1H原子核は特定の周波数のラジオ波（RF）を共鳴吸収し、原子核磁気モーメントを歳差運動させる。このRFの照射を停止すると、1H原子は元の状態へと戻っていくが（緩和現象）、1H原子の緩和時間は組織や病変において異なる。この緩和時間の差をコントラストとして利用することにより、画像が作られる。よってMRIでは造影剤を使用しない非造影撮像法も可能であるが、目的とする部位をよりコントラスト良く撮像するためには周囲に存在する1H原子核の緩和を促進するコントラスト剤（MRI用造影剤）の使用が有効である。
　MRI用造影剤には近傍の1H原子核との相互作用により緩和時間を短縮する効果のある常磁性体が用いられる。例えば、縦緩和時間（T1）を短縮する陽性造影剤では常磁性体としてガドリニウム（Gd）が用いられる。しかしながらGdはそのままでは毒性が高く、造影剤として使用するためにはGd-DOTA（下式）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Gd-DTPA（下式）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
といった錯体として投与する必要がある。一方、錯形成によって水の配位サイトを減らしてしまうために、十分な造影効果を得るために大量の薬剤を投与する必要がある。例えば図１に示すように、Gd-DTPAをMRI用造影剤として用いた場合、水の配位サイトは１しか存在しない。また、Gd錯体造影剤にはアナフィラキシー様ショック、血圧低下、呼吸困難などの副作用症状も報告されている。そこでより高感度で投与量を減らすことが可能な新規MRI用造影剤の開発が求められている。
特開２００８－３７８５６号公報
Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，Ｎｏ．６，ｐ１０１７－１０１９
　本発明は、高感度で造影剤の投与量を減らすことが可能な造影剤又は造影剤組成物及びその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、驚くべき事に、造影剤を生体内に存在する鉄貯蔵タンパク質であるアポフェリチンに大量に効率よく内包できる方法を見出し、また、該方法でアポフェリチンに造影剤を内包させた造影剤組成物が、従来の造影剤に比べてより高感度に造影が可能であることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は例えば、以下の項１～４の造影剤組成物の製造方法、項５～９の造影剤組成物、項１０の造影剤として用い得る化合物、及び項１１のデキストラン修飾アポフェリチンの粒径制御方法に係る。
項１．
（Ａ）アポフェリチンが溶解したｐＨ１．５～３．０の溶液のｐＨを、３．５～５．０に調整する工程、
（Ｂ）（Ａ）工程で得た処理液に、Ｘ線造影剤又はＭＲＩ用造影剤を添加する工程、
（Ｃ）（Ｂ）工程で得た処理液のｐＨを、６．０～８．５に調整する工程、
を含むことを特徴とする、造影剤がアポフェリチンに内包された造影剤組成物の製造方法。
項２．
（Ｂ）工程で添加するＭＲＩ用造影剤が、Gd-DTPA又は下記式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
〔式中、Gdは配位されたGd３＋を表し、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一又は異なってよく、各々独立に、－Ｈ、－ＣＨ２ＣＯＯＨ、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨあるいは１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であって、該置換基は同一又は異なってＯＨ基、ＮＨＯＨ基及びＮＨ２基からなる群より選ばれる少なくとも１種である。〕
で表される化合物、
あるいはその薬学上許容される塩である、
項１に記載の造影剤組成物の製造方法。
項３．
（Ｂ）工程で添加するＭＲＩ用造影剤の造影剤本体が、正電荷を帯びたものである、項１又は２に記載の造影剤組成物の製造方法。
項４．
（Ｂ）工程で添加するＭＲＩ用造影剤が、Gd-Me2DO2A（下式）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
又はその薬学上許容される塩である、項１に記載の造影剤組成物の製造方法。
項５．
項１～４のいずれかに記載の造影剤組成物の製造方法で製造された、造影剤組成物。
項６．
アポフェリチン１分子に、２０分子以上のＭＲＩ用造影剤が内包された、造影剤組成物。
項７．
前記ＭＲＩ用造影剤が、Gd-DTPA又は下式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
〔式中、Gdは配位されたGd３＋を表し、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一又は異なってよく、各々独立に、－Ｈ、－ＣＨ２ＣＯＯＨ、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨあるいは１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であって、該置換基は同一又は異なってＯＨ基、ＮＨＯＨ基及びＮＨ２基からなる群より選ばれる少なくとも１種である。〕
で表される化合物、
あるいはその薬学上許容される塩である、
項６に記載の造影剤組成物。
項８．
前記アポフェリチンの外表面が、PEG、デキストラン又は蛍光色素で修飾された、項５に記載の造影剤組成物。
項９．
前記アポフェリチンの外表面が、PEG、デキストラン又は蛍光色素で修飾された、項６又は７に記載の造影剤組成物。
項１０．
下式で表される化合物（Gd-Me2DO2A）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
〔式中、Gdは配位されたGd３＋を表す〕
又はその薬学上許容される塩。
項１１．
デキストランを臭化シアンにて活性化し、アポフェリチンのリシン残基と反応させることで、デキストランで修飾されたアポフェリチンを製造する際に、
前記臭化シアンの量を制御することで、デキストランで修飾されたアポフェリチンの粒径を制御することを特徴とする、デキストラン修飾アポフェリチンの粒径制御方法。
　本発明によれば、より高感度で造影剤の投与量を減らすことができる造影剤又は造影剤組成物及びその製造方法を提供することができる。
Gd-DTPAが水の配位する様子の概略を示す。 Gd-Me2DO2Aについて反転回復法にて縦緩和時間の測定を行った結果を示す。 Gdイオン又はGd錯体をアポフェリチンに内包する方法の概要図を示す。（ａ）に公知の方法、（ｂ）に本発明の方法を示す。 Gd錯体内包アポフェリチン溶液を、サイズ排除クロマトグラフィーで各フラクションに分け、それぞれの画分のアポフェリチン量及びGd量を測定した結果を示す。（ａ）にＵＶスペクトル（２５０ｎｍ）を、（ｂ）にＩＣＰ発光分析結果を示す。（ａ）及び（ｂ）のいずれにおいても、◆はフェリチンの解離及び再構築を行いGd錯体の内包を行った直後の結果を示し、■はGd錯体内包フェリチン（フラクション5）のみを168時間後再びSEC（サイズ排除クロマトグラフィー）分析した結果を示す。 Gd-Me2DO2A内包アポフェリチン（実施例６）について反転回復法にて縦緩和時間の測定を行った結果を示す。 アポフェリチン一分子当たりに12.4 または37.5 個のGd-Me2DO2A を内包したGd-Me2DO2A 内包アポフェリチン（すなわち、実施例３及び実施例４）のT1 緩和能の評価のため、1.5 T のMRI装置にてTR = 500 msec、TE = 15 msec として撮像したT1 強調画像を示す。 アポフェリチンの外側をPEG修飾する概要図を示す。 アポフェリチンにPEGを導入し、電気泳動（SDS-PAGE）によるアポフェリチンサブユニットの分子量の変化を観察した結果を示す。 アポフェリチンの外側をデキストラン修飾する概要図を示す。なお、図中、Ｒ－ＮＨ２はアポフェリチンを示し、この－ＮＨ２はアポフェリチンのリシン残基が有するアミノ基を示す。 デキストラン修飾アポフェリチンの粒子径を、動的光散乱法（DLS）により測定した結果を示す。 Gd錯体内包アポフェリチンMRI造影剤組成物及び市販造影剤をヌードマウスに投与し、0, 1, 6, 24, 48時間経過後のMRI画像について癌疾部位とそれに隣接した筋肉部分についてピクセル当たりの明度測定を行い、その平均値をグラフ化した図を示す。◆がGd錯体内包アポフェリチンを、■が市販造影剤（Ｇｄ－ＤＯＴＡ）を、それぞれ示す。 Gd錯体内包アポフェリチンMRI造影剤組成物及び市販造影剤（Ｇｄ－ＤＯＴＡ）をヌードマウスに投与し、24時間経過後、T1強調画像を動物用コイルを用いて撮像した結果を示す。なお、ROIはregion of interest（関心領域）の略であり、ROIの値は円で囲った領域の平均明度を示す。明度測定にはAdobe Photoshop CS4 Extendedを用いた。 外殻がDy-776修飾されたGd錯体内包デキストラン修飾アポフェリチンを投与した担癌ヌードマウスを、近赤外線イメージング装置で撮影した結果を示す。 アポフェリチンに対して120当量のGd-Me2DO2A錯体を、２通りの方法で内包し、それぞれのサンプルをサイズ排除クロマトグラフィー（Sephacryl S-100）にて精製し、各分画についてICP発光分析装置を用いて含まれているGd濃度を定量した結果を示す。サンプルAはpH 2.0でアポフェリチンを分解後、pH 4.5にてGd錯体を添加し、その後pH 7.4に調整したサンプルであり、サンプルＢはpH 2.0にはせず、pH 7.4でGd錯体を添加したサンプルである。
　以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
　本発明の造影剤組成物は、上記項１の（Ａ）～（Ｃ）工程に記載のように、例えばアポフェリチンを酸性（例えばｐＨ１．５～３．０）溶液で処理して各サブユニットごとに解離させ、次にこれを一旦弱酸性（例えば４．０～５．０）の状態にして造影剤を添加した後、中性付近～弱アルカリ性（例えばｐＨ６．０～８．５）状態にすることにより製造される。
　このようにして製造された造影剤組成物は、造影剤の分子がアポフェリチンに内包された構造を有し、アポフェリチン内に造影剤が高濃縮されている。アポフェリチンを酸性溶液で処理し、この酸性状態において造影剤を添加するのではなく、一旦弱酸性の状態にしてから造影剤を添加することにより高濃縮を達成することができる。この「一旦弱酸性の状態にしてから造影剤を添加する」点が本発明の特徴の１つである。
　以下、各工程ごとに説明する。
＜（Ａ）工程＞
　アポフェリチンを溶解した酸性溶液を、ｐＨを弱酸性に調整する。
　アポフェリチンは生体内に広く存在するタンパク質であり、鉄イオンを貯蔵する働きがある。２４個のサブユニットが会合した、外径及び内径がそれぞれ約１３ｎｍ、８ｎｍの球殻状構造を有し、当該球殻表面には０．７～１．０ｎｍの１４個のチャネルが存在し、ここから鉄イオンや水を出入りさせることができる。また、ｐＨを変化させることにより、２４個のサブユニット（以下、「アポフェリチンサブユニット」ということがある）の会合、解離を可逆的にコントロールすることができる。
　なお、アポフェリチン内部に鉄を持つものをフェリチンと呼ぶ。
　フェリチンは、様々な種の生物に広く存在することが知られている。本発明の造影剤組成物には、どの生物由来のアポフェリチンをも用いることができるが、投与対象となる生物と近種の生物由来のものが好ましい。例えば、動物実験に頻用されるマウス又はラットに対して、あるいは臨床においてヒトに対して投与する場合は、動物由来のアポフェリチンが好ましく、哺乳類由来のアポフェリチンがより好ましい。特に、牛や馬由来のアポフェリチンは比較的容易に入手することができる（例えばシグマアルドリッチ、CALBIOCHEM等から購入できる）ことから、好ましい。また、同一種由来のアポフェリチンが最も好ましい。
　なお、ここでの「由来」は、その生物の生体から精製されたものはもちろん、遺伝子工学的手法（例えば大腸菌内での製造、無細胞合成系での製造等）、化学合成的手法等を用いて人工的に製造されたものも含む意味である。また、その生物のアポフェリチンサブユニットのアミノ酸配列において、１又は２個以上（好ましくは１～数十個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～数個、よりさらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１、２、３又は４個）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、アポフェリチンサブユニットとして機能するポリペプチド（すなわち、他のサブユニットと会合して球殻状構造を形成し得、当該球殻表面から鉄イオンや水等を球内部へ出入りさせることができるポリペプチド）が含まれるアポフェリチンも、ここでの「由来」に含まれる。
　本発明の造影剤組成物を製造するのに用いるアポフェリチンの量は、特に制限されず、使用する造影剤量に応じて、適宜設定することができる。
　アポフェリチンは、酸性溶液に溶解される。アポフェリチンを溶解する酸性溶液としては、アポフェリチンを各サブユニットに解離させる事ができれば、特に制限されないが、アポフェリチン内に取り込まれ得る金属（例えば、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル、クロム、インジウム等）イオンが含まれるものは好ましくない。好ましい酸性溶液としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸等が挙げられる。
　また、アポフェリチンを溶解する酸性溶液は、典型的にはｐＨ１．５～３．０、好ましくは１．８～２．５、より好ましくは２．０～２．３である。
　用いる酸性溶液量は、用いるアポフェリチンの量に応じて、適宜設定することができる。なお、アポフェリチンを一旦水に溶解させた後、これに酸性溶液を加えて上記のｐＨへと調整してもよい。この場合も、アポフェリチンを溶解させる水及び酸性溶液の量も、用いるアポフェリチンの量に応じて適時設定することができる。
　アポフェリチンあるいはアポフェリチンを溶解させた水に、酸性溶液を加えるときの温度は特に制限されないが、低温（例えば０～15℃）で行うのが好ましい。４℃で行うのが好適である。また、酸性溶液を加えながら穏やかに撹拌し、溶液のｐＨを均一にすることが好ましい。
　なお、ｐＨの測定は、適宜公知の方法を用いて行うことができるが、溶液中にｐＨメーターを入れ、操作を行いつつ（あるいは操作を行うたびに）計測するのが好適である。
　このようにして酸性溶液に溶解されたアポフェリチンは、各サブユニットに解離する。すなわち、「アポフェリチンが溶解した酸性（ｐＨ１．５～３．０）溶液」では、アポフェリチンは各サブユニットに解離した状態で溶解している。
　このようにして得られた処理液（以下「アポフェリチンが溶解した酸性溶液」ということがある）のｐＨを弱酸性に調整する。ここでの弱酸性とは、具体的にはｐＨ３．５～５．０のことを指し、好ましくはｐＨ４．０～４．５であり、より好ましくはｐＨ４．２～４．５である。なお、上述のようにアポフェリチンが溶解した酸性溶液内では、アポフェリチンが各サブユニットに解離した状態で含まれているが、ｐＨを弱酸性にすることによって、当該各サブユニットが弱く結合するようになると考えられる。
　ｐＨを弱酸性に調節する方法は特に制限されないが、例えばアルカリ性物質又はアルカリ性溶液を加える方法が挙げられ、特にアルカリ性溶液を加える方法が好ましい。用いるアルカリ性物質としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等が挙げられ、用いるアルカリ性溶液としては、例えば水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液等が挙げられる。但し、アポフェリチン内に取り込まれ得る金属イオンが含まれるものは好ましくない。また、アポフェリチンが溶解した酸性溶液に加えることで、沈殿を生じるものも好ましくない。
　用いるアルカリ性物質又はアルカリ性溶液の量、濃度は、アポフェリチンが溶解した酸性溶液の量、ｐＨ等に応じて、適宜設定することができる。
＜（Ｂ）工程＞
　（Ａ）工程で得られた処理液（弱酸性に調整されている）に、造影剤を添加する。ここでの造影剤は、Ｘ線造影剤又はＭＲＩ用造影剤であり、ＭＲＩ用造影剤が好適である。添加の方法としては、造影剤又は造影剤を含む溶液に（Ａ）工程で得られた処理液を加えてもよいが、（Ａ）工程で得られた処理液に造影剤又は造影剤を含む溶液を加える方が好適である。なお、造影剤はある化合物、又はその薬学上許容される塩であるが、当該化合物のことを造影剤本体と呼ぶことがある。例えば、Gd錯体又はその塩が造影剤として用いられる場合は、Gd錯体を造影剤本体と呼ぶことがある。すなわち、Gd錯体が造影剤として用いられる場合は、当該Gd錯体は造影剤本体でもある。Gd錯体塩が造影剤として用いられる場合は、Gd錯体が造影剤本体である。
　Ｘ線造影剤の造影剤としては、例えば水溶性のヨード造影剤が挙げられる。具体的には、例えば、イオプロミド、イオミプロール、イオパミドール、イオベルソール、イオヘキソール、イオキシラン、イオトロラン、イオジキサノール、アミドトリゾ酸ナトリウムメグルミン、イオタラム酸ナトリウム、イオタラム酸メグルミン、イオキサグル酸、イオトロクス酸メグルミン等が挙げられる。
　ＭＲＩ用造影剤としては、例えば、陽性造影剤（Gd造影剤）、陰性造影剤（Fe造影剤）が挙げられる。
　陰性造影剤としては、具体的には、例えばフェルモキシデスなどが挙げられる。
　陽性造影剤としては、具体的には、例えばガジドアミド水和物、カドテリドール、ガドテル酸メグルミン、ガドペンテト酸メグルミン等が挙げられる。さらに、陽性造影剤としては、下記式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
〔式中、Gdは配位されたGd３＋を表し、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一又は異なってよく、各々独立に、－Ｈ、－ＣＨ２ＣＯＯＨ、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨあるいは１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であって、該置換基は同一又は異なってＯＨ基、ＮＨＯＨ基及びＮＨ２基からなる群より選ばれる少なくとも１種である。〕
で表される化合物、又はその薬学上許容される塩も挙げられる。
　なお、式（Ｉ）は、Ｒ１及びＲ２が－ＣＨ２ＣＯＯＨのときはガドテル酸メグルミンの造影剤本体であるGd錯体を表し、Ｒ１が－ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｒ２が－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３のときはカドテリドールの造影剤本体であるGd錯体を表す。また、以下、Ｒ１及びＲ２が－Ｈの式（Ｉ）の化合物をGd-DO2Aと、Ｒ１及びＲ２が－ＣＨ２ＣＯＯＨの式（Ｉ）の化合物をGd-DOTAと、Ｒ１が－ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｒ２が－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３の式（Ｉ）の化合物をGd-HPDO3Aと表記することがある（それぞれ、DO2A、DOTA、HPDO3AにGdイオンが配意した化合物であることを表す）。
　Ｒ１及びＲ２で表される「１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基」におけるアルキル基の炭素数は、好ましくは１～４、より好ましくは１～３、特に好ましくは１又は２である。
　Ｒ１及びＲ２で表される「１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基」が置換基を有する場合、その数は、典型的には１～３であり、好ましくは１又は２であり、特に好ましくは１である。当該置換基はＯＨ基、ＮＨＯＨ基及びＮＨ２基からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、好ましくはＯＨ基である。
　また、Ｒ１又はＲ２がアルキル基の場合、Ｒ１又はＲ２が結合するＮ原子に電子を供与するため、Ｎ原子がより安定にガドリニウムイオンを配位することが可能になり、好ましい。さらにまた、Ｒ１又はＲ２がＯＨ基、ＮＨＯＨ基又はＮＨ２基を置換基として有するアルキル基の場合、これらの基が溶解性を高めるのに寄与するため、好ましい。Ｒ１及びＲ２がともにこのような基であっても好ましい。
　Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、例えば－H、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ２ＯＨ、－ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、－Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）２、－ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）（ＣＨ３）、－ＣＨ２ＣＯＯＨ、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ等であることが好ましい。中でも－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＯＨ、－ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、が好ましい。
　Ｒ１及びＲ２は、好ましくは少なくとも一方が「１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基」であり、より好ましくは両方が「１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基」である。特に好ましい（Ｒ１、Ｒ２）の組み合わせは、例えば（－Ｈ、－Ｈ）、（－ＣＨ３、－Ｈ）、（－ＣＨ３、－ＣＨ３）、（－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３）、（－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３）、（－ＣＨ２ＣＨ３、－Ｈ）である。なお、（Ｒ１、Ｒ２）の組み合わせが（－ＣＨ３、－ＣＨ３）である式（Ｉ）で表される化合物を、以下Gd-Me2DO2Aと表記することがある。
　アポフェリチンは、生体内で正に荷電した鉄イオンを取り込むタンパク質であるため、正電荷を有する化合物のほうが、アポフェリチン内に取り込まれやすい。よって、式（Ｉ）で表される化合物のなかでも、電荷を有さないものが好ましく、正電荷を有するものがさらに好ましい。
　式（Ｉ）の化合物は、Gdイオンが＋３、ＣＯＯＨが溶液中ではＣＯＯ－となって－１の電荷を有するため、Ｒ１及びＲ２を考慮しなければ全体として＋１の電荷を有する。
　ここで、例えばＲ１及びＲ２がともに－ＣＨ２ＣＯＯＨの場合（すなわちGd-DOTAの場合）、さらに－１×２＝－２の電荷を有することになるため、式（Ｉ）で表される化合物全体としては－１の電荷を有することになる。このような負の電荷を有する化合物も、本発明に係る造影剤組成物の製造方法であれば、アポフェリチンに内包させることが可能である。
　そして、例えば、Ｒ１が－ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｒ２が電荷を有さない基の場合、さらに－１の電荷を有することになるため、式（Ｉ）で表される化合物全体としては、電荷を有さず、好ましい。また、Ｒ１及びＲ２がともに電荷を有さない基の場合、式（Ｉ）で表される化合物全体として＋１の電荷を有することとなり、さらに好ましい。なお、Ｒ１、Ｒ２がＮＨ２基を置換基として有するアルキル基である場合は、当該ＮＨ２基が＋の電荷を帯び、化合物全体として電荷を有さないか、＋の電荷を帯びることに貢献するため好ましい。
　このように、Ｒ１及びＲ２は、Ｒ１及びＲ２の電荷の和が－１以上であることが好ましく、０以上であることがより好ましい。すなわち、式（Ｉ）で表される化合物全体として電荷が０以上であることが好ましく、＋１以上であることがより好ましい。
　またさらに、前述のように、錯形成によってGdイオンの水の配位サイトを減らしてしまうと、十分な造影効果を得るために大量の薬剤を投与する必要がある。従来のGd造影剤本体であるGd錯体はGdイオンの８配位の化合物が主であり（例えばGd-DOTA、Gd-DTPA）、Gd錯体１分子当たり水は１分子しか配位できない。式（Ｉ）の化合物（Gd錯体）は、Ｒ１、Ｒ２を考慮しなければ、４つのＮ原子及び２つのＣＯＯ－により、６配位となっている。ここで、式（Ｉ）の化合物において、Ｒ１が水素原子あるいは１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、Ｒ２が負電荷を有する基（例えば－ＣＨ２ＣＯＯＨ又は－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）であれば、７配位となり、Gdイオンに水２分子が配位できる。さらに、Ｒ１、Ｒ２ともに水素原子あるいは１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であれば、Gdイオンの６配位の化合物となり、Gdイオンに水３分子が配位できる。このように、Gd錯体１分子当たりの水の配位数が増えれば、Gd錯体１分子当たりの緩和時間短縮効果が大幅に改善されることになり好ましい。また、これにより、Gd造影剤の投与量を減らすことができる。
　従って、好ましくはＲ１は水素原子あるいは１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２はともに水素原子あるいは１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基である。
　なお、式（Ｉ）で表される化合物（錯体）の配位子を下記式（１）で表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
〔式中、Ｒ１及びＲ２は前記に同じ。〕
　式（１）で表される化合物（以下、「化合物（１）」と表記することがある。また、他式で表される化合物も同様に表記することがある。すなわち、式（No.）で表される化合物を「化合物（No.）」と表記することがある。）は、適当な方法で製造され得るが、例えば下記反応式－１のように、式（２）で表される化合物（化合物（２））から、保護基であるＲ３（例えばtert-ブチル基）を除くことで製造され得る。
［反応式－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
〔式中、Ｒ１及びＲ２は前記に同じ。Ｒ３は保護基を表す。〕
　化合物（２）から化合物（１）を製造する反応は、適当な溶媒中又は無溶媒下、酸と反応させることで行われ得る。この反応を、以下「反応α」ということがある。
　用いられる溶媒としては、例えば、水； メタノール、エタノール、イソプロパノール、tert－ブタノール等の低級アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、モノグライム、ジグライム等のエーテル類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン等のアミド類；ジメチルスルホキシド； ヘキサメチル燐酸トリアミド又はこれらの混合溶媒等を挙げることができる。中でもクロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類が好ましく、ジクロロメタンがより好ましい。
　用いられる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の鉱酸及び蟻酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、ｐ－ トルエンスルホン酸等の有機酸を挙げることができる。中でもトリフルオロ酢酸が好ましい。
　酸の使用量は、化合物（２）１モルに対して、通常少なくとも２モル程度、好ましくは２～１０モル程度であるが、酸は、化合物（２）に対して大過剰に用いてもよい。
　この反応は、通常０～２００℃程度、好ましくは０～１５０℃程度にて好適に進行し、一般に１０分～３０時間程度で終了する。
　反応中、撹拌を行ってもよい。
　反応後、溶媒及び酸は減圧留去するのが好ましい。また、イオン交換カラムを用いて、分離精製することができる。
　保護基Ｒ３としては、反応αが進行し得るものであれば特に制限されず、例えばtert-ブチル基が好ましい。
　また、Ｒ３が一般的なカルボキシル基の保護基（例えばProtective groups in organic synthesis, Greene, T. W.; Wuts, P. G. M.著を参照）であって、反応αによって脱保護できない基（例えばメチル基、エチル基等）であっても、当業者であれば適宜公知の適当な脱保護反応を行うことができる。
　化合物（２）は、適当な方法で製造され得るが、例えば下記反応式－２のようにして製造され得る。
［反応式－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記に同じ。Ｘはハロゲン原子を表す。〕
　化合物（３）から化合物（２）を製造する反応は、化合物（３）と化合物（４）を適当な塩基性化合物の存在する溶媒中で反応させることで行われ得る。この反応を、以下「反応β」ということがある。
　用いられる溶媒としては、例えば、；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、モノグライム、ジグライム等のエーテル類；アセトニトリル；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン等のアミド類；ジメチルスルホキシド； ヘキサメチル燐酸トリアミド又はこれらの混合溶媒等を挙げることができる。中でもクロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類やアセトニトリルが好ましく、ジクロロメタン、アセトニトリルがより好ましい。
　塩基性化合物としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の炭酸塩； 水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウム等の金属水酸化物等を挙げることができ、特に炭酸カリウムが好ましい。
　塩基性化合物の使用量は、化合物（３）１モルに対して、通常少なくとも２モル程度、好ましくは２～１０モル程度であるが、塩基性化合物は、化合物（３）に対して大過剰に用いてもよい。
　また、化合物（４）の使用量は、化合物（３）１モルに対して、通常少なくとも２モル程度、好ましくは２～１０モル程度であるが、塩基性化合物は、化合物（３）に対して大過剰に用いてもよい。
　この反応は、通常０～２００℃程度、好ましくは０～１５０℃程度にて好適に進行し、一般に１０分～３０時間程度で終了する。
化合物（４）は、ＸＣＨ２ＣＯＯＲ３で表される化合物である。
　Ｘはハロゲン原子、すなわちＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを表し、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩが好ましく、Ｂｒがより好ましい。
　Ｒ３は前記に同じである。すなわち、反応α及び反応βが進行し得るものであれば特に制限されず、一般的なカルボキシル基の保護基（例えばProtective groups in organic synthesis, Greene, T. W.; Wuts, P. G. M.著を参照）が使用できるが、例えばtert-ブチル基、メチル基、エチル基等が挙げられる。中でもtert-ブチル基が好ましい。
Ｒ１及びＲ２が置換基を有するアルキル基である場合、化合物（４）を適用する前に、それらの置換基も保護されている必要がある。具体的には、例えば、－OH基にはエステル系又はエーテル系の保護基、－NH２基にはアミド系又はウレタン系保護基を用いることができる。なお、下記反応式－３に記載のように、化合物（３）の合成時にn-BuLiを用いる場合は、n-BuLiが強塩基性であるため、特に塩基性条件にて安定なエーテル系保護基やFmoc基などの一部のウレタン系保護基を用いるのがより好ましい。
　化合物（３）は、適当な方法で製造され得るが、例えば下記反応式－３のようにして製造され得る。
［反応式－３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記に同じ。〕
　cyclenから化合物（３）を製造する反応は、例えばcyclenを適当な塩基の存在する溶媒中で、シクレンの1位及び7位（対角線上）を保護する保護基となり得る化合物（例えばCH3SiCl3）と反応させ、さらにこれにＲ１Ｘ、Ｒ２Ｘ（Ｘはハロゲン原子、すなわちＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを表し、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩが好ましく、Ｉがより好ましい。反応式－３ではＸはＩである。）をｎ－ブチルリチウム存在下で反応させることで行われ得る（J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1995, 1233-1234）。
　なお、Ｒ１ＸとＲ２ＸのＲ１とＲ２が異なる場合、Ｒ１ＸとＲ２Ｘを1当量ずつ、時間差をつけて（例えば30分～２時間）反応系に加えることで、Ｒ１とＲ２が異なるものを容易に合成することができる（J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1995, 1233-1234）。また、得られた化合物が、Ｒ１のみを有するもの、Ｒ２のみを有するもの、Ｒ１及びＲ２を有するもの、の3種の化合物の混合物であったとしても、公知の方法（例えばクロマトグラフィー）で分離精製することができる。
　用いる溶媒としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、モノグライム、ジグライム等のエーテル類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン等のアミド類；ジメチルスルホキシド； ヘキサメチル燐酸トリアミド又はこれらの混合溶媒等を挙げることができる。中でもエーテル類の溶媒が好ましく、中でもテトラヒドロフランがより好ましい。
　塩基としては、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（diisopropylethyl amine：DIEA）トリエチルアミン（Et3N）等を挙げることができ、特にジイソプロピルエチルアミンが好ましい。
　塩基の使用量は、cyclen１モルに対して、通常２～３モル程度、好ましくは2～2.2モル程度であるが、塩基は、cyclenに対して大過剰に用いてもよい。
　この反応は、通常０～２００℃程度、好ましくは０～１５０℃程度にて好適に進行し、cyclenから化合物（５）を得る反応は一般に３０分～３時間程度で終了する。またn-BuLiの使用量はcyclen1モルに対して2～3モル程度で、R1X、R2Xはcyclenに対してそれぞれ1～2モル程度が好ましい。また、R1及びR2が同一の基のときに限り、cyclenに対して大過剰に用いても良い。
　例えば上記のようにして製造され得る化合物（１）は、ガドリニウムイオンを配位し、ガドリニウム錯体となる。このガドリニウム錯体又はその薬学上許容される塩は、ＭＲＩ用造影剤として用いることができる。なお、当該ガドリニウム錯体は、塩基性であれば通常の薬学上許容される酸と塩を形成し得る。斯かる酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸及びメタンスルホン酸、ｐ－ トルエンスルホン酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸等の有機酸が挙げられるが、これらに限定されない。また、当該ガドリニウム錯体は、酸性であれば、薬学上許容される塩基性化合物を作用させることにより塩を形成し得る。斯かる塩基性化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　化合物（１）へのガドリニウムイオンの配位は、例えば、化合物（１）を溶液（例えば水あるいは生理食塩水等）に溶解させ、これに徐々にガドリニウム塩を加えることで行い得る。
　用いる化合物（１）及びガドリニウム塩の量は特に制限されず、これらが1モル：１モルの割合で配位することから、それぞれの適当量を計算することもできるが、化合物（１）に対してガドリニウム塩を大過剰に用いてもよいし、ガドリニウム塩に対して化合物（１）を大過剰に用いてもよい。
　また、ガドリニウム塩としては、塩化ガドリニウム、硝酸ガドリニウム、過塩素酸ガドリニウム等を用いることができ、特に塩化ガドリニウムが好適である。
　ガドリニウム塩を化合物（１）の溶液に添加する際の条件については、錯形成が行われ得るのであれば特に制限されないが、３０～７０℃にて徐々に添加することが好ましい。また、このときの反応溶液のｐＨは、アルカリ性溶液（例えば水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、又は水酸化カルシウム水溶液）を加えながら、ｐＨ６．０～７．５、好ましくは６．０～７．０になるよう制御することが好ましい。なお、アルカリ性が強くなり過ぎるとGd3+がGd(OH)3を形成して白色沈殿が生じる恐れがあるため、添加は穏やかに撹拌しながら少量ずつ徐々に行うことが好ましい。また、添加後、１０分～４８時間程度穏やかに撹拌を続けることが好ましい。
　例えば、化合物（１）がＲ１及びＲ２とも－ＣＨ３である場合（以下当該化合物を「Me2DO2A」と表記することがある）、上述のようにしてガドリニウムを配位させることで、Gd-Me2DO2Aの溶液を得ることができる。
　Ｘ線造影剤又はＭＲＩ用造影剤は、溶液（例えば水あるいは生理食塩水等）に溶解させた後、（Ａ）工程で得た処理液に添加するのが好ましく、上述のようにして得られるＭＲＩ用造影剤（すなわち、化合物（１）にガドリニウムイオンが配位したもの）の溶液をそのまま（Ａ）工程で得た処理液に添加することができる。
　また、既に溶液として流通しているＸ線造影剤の製剤（例えば主成分がイオプロミド、イオミプロール、イオパミドール、イオベルソール、イオヘキソール、イオキシラン、イオトロラン、イオジキサノール、アミドトリゾ酸ナトリウムメグルミン、イオタラム酸ナトリウム、イオタラム酸メグルミン、イオキサグル酸、イオトロクス酸メグルミンのもの）及びＭＲＩ用造影剤の製剤（例えば主成分がフェルモキシデス、ガジドアミド水和物、カドテリドール、ガドテル酸メグルミン(Gd-DOTAの塩)、ガドペンテト酸メグルミン(Gd-DTPAの塩)のもの）を利用することもできる。なお、これらの薬の販社は、例えば「今日の治療薬２００５年度版－解説と便覧、水島裕　編、南江堂」に記載されている。
　なお、（Ａ）工程で得られた処理液に造影剤の溶液を添加する場合、当該造影剤の溶液のｐＨは典型的には６．０～７．５、好ましくは６．０～７．０である。ｐＨが４．０以下あるいは８．０以上であると、（Ａ）工程で得られた処理液に添加した際、アポフェリチンのサブユニットが弱く結合している状態を壊す恐れがあるため、好ましくない。
　また、造影剤の添加量としては、アポフェリチン１モルに対して、通常10～100000モル、好ましくは100～10000モル、より好ましくは100～1000モル程度であるが、アポフェリチンの量に対して大過剰に用いてもよい。
　（Ａ）工程で得られた処理液に造影剤の溶液を添加（好ましくは徐々に添加）した後、例えば５分～２時間穏やかに撹拌し、両液を混合させるのが好ましい。
　このように、（Ａ）工程で得られた処理液に造影剤の溶液を添加（及び撹拌）した後の液を、以下「（Ｂ）工程で得た処理液」ということがある。
＜（Ｃ）工程＞
　（Ｂ）工程で得た処理液のｐＨを中性付近～弱アルカリ性に調節し、アポフェリチンのサブユニットを会合させ、アポフェリチンにＸ線造影剤又はＭＲＩ用造影剤を内包させる。
　ここでの中性付近～弱アルカリ性とは、具体的にはｐＨ６．０～８．５であり、好ましくは６．５～８．０、より好ましくは７．０～７．５、さらに好ましくはｐＨ７．２～７．４である。
　（Ｂ）工程で得た処理液は、弱酸性であるため、これを前述の中性付近～弱アルカリ性ｐＨに調整するためには、アルカリ性溶液を加えることが好ましい。アルカリ性溶液としては、例えば、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、水酸化カルシウム溶液等が挙げられ、特に水酸化ナトリウム溶液が好ましい。アルカリ性溶液の濃度、量は、（Ｂ）工程で得た処理液の量等に応じて、適宜設定することができる。
　ｐＨを調整した後、さらに５分～６時間、常温～低温（例えば４℃）で撹拌してもよい。また、得られた溶液をサイズ排除クロマトグラフィーに供することで、精製を行うこともできる。
　このようにして、アポフェリチン内にＸ線造影剤又はＭＲＩ用造影剤が濃縮された、造影剤組成物を得ることができる。
　以上の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）工程を経る造影剤組成物製造方法により、製造される造影剤組成物は、アポフェリチンに造影剤が多量に内包された構造を有する。特に、一旦アポフェリチンを溶解した酸性溶液を弱酸性にして（（Ａ）工程）から、造影剤を添加する（（Ｂ）工程）ことにより、弱酸性にする工程を経ない方法に比べ、多量（約10～200倍）の造影剤をアポフェリチンに内包させることができる。
　また、弱酸性にする工程を経ない方法では、本発明の造影剤組成物製造方法に比べ、造影剤を非常に多量（例えばアポフェリチンに対して１０００倍当量）に用いなければ、造影剤をアポフェリチンに内包させることができず、効率が非常に悪い。よって、本発明の造影剤組成物製造方法はより効率的であり、使用する造影剤量を節約することもできる。
　さらに、弱酸性にする工程を経ない方法では、アポフェリチンの球殻状構造の内部ではなく、球殻の外側表面に造影剤が多量に吸着した構造を有するものが得られることが問題になっている。これは、アポフェリチンに対して適用する造影剤量が非常に多量であることが一因と考えられる。一方、本発明の造影剤組成物製造方法で得られるアポフェリチンに造影剤が内包された造影剤組成物では、アポフェリチンの球殻外側に吸着する造影剤はほとんど存在せず、造影剤は安定にアポフェリチンに結合しており、生体に投与した時の安全性の面でも優れている。
　また、上述のように、アポフェリチンは正に荷電した鉄イオンを取り込むタンパク質であることから、負電荷を有する造影剤よりも電荷を有さない造影剤、さらには正電荷を有する造影剤の方が、アポフェリチン内に取り込まれやすく、好ましい。
　例えば上述のようにして製造される本発明の造影剤組成物は、アポフェリチンに造影剤が内包された構造を有する。このため、Gd錯体造影剤がアポフェリチンに内包されている場合、アポフェリチン内部のアミノ基、カルボキシル基等によってもGd錯体が安定化される。本発明の造影剤組成物において、アポフェリチンに内包されるGd錯体造影剤は、Gdイオンの６配位あるいは７配位の化合物であり得、従来のGd錯体造影剤（Gdイオンの８配位の化合物が主）より配位結合数が少ないことから若干錯体安定数が低くなる（Gdイオンが配位子から外れやすい）ことがあるが、そのようなGd錯体造影剤であっても、アポフェリチンに内包することにより安定化され、毒性が出にくくなり、十分ＭＲＩ用造影剤としての実用に耐え得る。
　さらに、Gd錯体造影剤をアポフェリチンに内包させると、同量のGd錯体造影剤そのものに比べ、大幅にＴ１緩和時間が短縮される。これは、Gd錯体がアポフェリチンに内包されると、アポフェリチンに存在するチャネルによって、水分子がアポフェリチン内部に供給されること、アポフェリチンがGd錯体へ近接する水分子の交換を促進すること、Gd錯体がアポフェリチン内部に取り込まれることによる運動の抑制による効果（高分子効果）を得ることができること、等のためと考えられる。
　アポフェリチン内に内包される造影剤分子の数は、アポフェリチン内部の広さ以外には特に制限されないが、通常５～１０００、好ましくは１０～２５０、より好ましくは２０～２００程度である。特に造影剤分子が２０以上内包されたものが好ましく、３０以上内包されたものがさらに好ましく、５０以上内包されたものがよりさらに好ましい。
　なお、アポフェリチン内に内包される造影剤分子の数については、例えばアポフェリチン内に内包されるのがGd錯体造影剤である場合、Lowry法にてアポフェリチン濃度を、ICP発光分析にて取り込まれたGdの量を算出し、これらの値からアポフェリチン１分子に内包されるGd錯体造影剤の数を算出することができる。
　このような本発明の造影剤組成物は、アポフェリチンに造影剤を内包した構造をしていることから、その大きさはアポフェリチンと同等の大きさ（外径約13nm）を有すると考えられ、生体内に投与した際、EPR（Enhanced Permeation and Retention）効果が期待できる。
　EPR効果とは、癌組織では急速な血管新生のために血管におよそ100 nmに及ぶ大きな間隙が形成され、排泄系であるリンパ系の発達も遅れているために、粒径が数10～100 nm程度の分子（または集合体）を血中に投与した場合、それらが癌組織において優先的に漏れ出て溜まり易いという効果のことである。
　従って、本発明の造影剤組成物は、癌に罹患した生物に投与した時に、EPR効果により選択的に癌組織に特に多く溜まり、癌組織をより鮮明に造影し得る。
　より強いEPR効果を得るために、本発明の造影剤組成物のアポフェリチン表面を化学修飾することも可能である。より強いEPR効果を得るためには、典型的には、粒径を20～100nm、好ましくは30～80nm程度にする。なお、粒径は例えば動的光散乱法（DLS）により測定することができる。
　また、フェリチンは生体内で肝臓や脾臓に多量に存在していることが知られている。Gd錯体内包アポフェリチンである本発明の造影剤組成物もまた肝臓へ集積しやすい。しかし、本発明の造影剤組成物のアポフェリチン表面を化学修飾することで、本発明の造影剤組成物の肝臓への集積を防止し、血中滞留時間を延ばすことができる。
　限定的な解釈を望むものではないが、当該集積は細網内皮系による異物認識機能により誘導されると考えられており、本発明の造影剤組成物のアポフェリチン表面を化学修飾することで、細網内皮系による異物認識を回避することができるため、上述の効果が得られると推察される。
　例えばポリエチレングリコール（PEG）、多糖（例えばデキストラン）等で、本発明の造影剤組成物のアポフェリチン表面を修飾し、組成物の外径を大きくすることができる。なお、蛍光分子（例えばDy、特にin vivoイメージングに用い得るもの）で修飾した場合は、光イメージングとのマルチモダリティーなプローブを調製することも可能である。また、特に制限されないが、本発明の造影剤組成物の肝臓への集積を防止し、血中滞留時間を延ばすためには、ＰＥＧ又は多糖（例えばデキストラン）による修飾をすることが好ましく、多糖（例えばデキストラン）による修飾をすることがより好ましい。
　修飾には、アポフェリチンの外側に存在するカルボキシル基やアミノ基を用いることができる。例えば、PEG-COOH（poly(ethylene glycol)dioglycolic acid）の末端カルボキシル基を水可溶性カルボジイミド（WSC）にて活性化、あるいはNHSエステル（活性エステル）化し、アポフェリチンのリシン残基と縮合することで、PEGによる修飾が可能である。なお、修飾に用いるＰＥＧの分子量は特に制限されないが、例えば１０００～１００００、好ましくは２０００～８０００が例示できる。
　また、例えば、デキストランを臭化シアンにて活性化した上で、アポフェリチンのリシン残基と反応させることで、デキストランによる修飾が可能である。特に、デキストランはDDS（drug delivery system）の分野においてキャリア等として研究される材料であり、安全性も高いと考えられ、アポフェリチンの修飾基として好ましい。またさらに、上記方法によってデキストラン修飾をアポフェリチンに施す際、臭化シアン量を増やすことでデキストランで修飾されたアポフェリチンの粒径を大きくすることができる。使用する臭化シアン量は、５００ｍｇのデキストランに対して通常１５ｍｇ以上、好ましくは１５～３００ｍｇ、より好ましくは２０～２００ｍｇである。
　具体的には、例えば、臭化シアンを６０ｍｇ用いた場合は、平均粒子径が30 nm程度のデキストラン修飾アポフェリチンを調製できる。また、臭化シアンを１２０ｍｇ用いた場合は、平均粒子径が６０ nm程度のデキストラン修飾アポフェリチンを調製できる。なお、臭化シアンはデキストリンに１度に加えてもよいし数回（好ましくは２～５回）に分けて加えてもよい。
　なお、修飾に用いるデキストランの分子量は特に制限されないが、例えば１００００～２０００００、好ましくは２００００～１０００００が例示できる。
　本発明は、EPR効果を得る等のため、デキストランを臭化シアンにて活性化し、アポフェリチンのリシン残基と反応させることで、デキストランで修飾されたアポフェリチンを製造する際に、上記のように、前記臭化シアンの量を制御することで、デキストランで修飾されたアポフェリチンの粒径を制御することを特徴とする、デキストラン修飾アポフェリチンの粒径制御方法も包含する。
　また、例えば、造影剤をアポフェリチンに内包する際に、使用するアポフェリチンに上述のような修飾がされたアポフェリチンを混ぜておくことで、修飾されたアポフェリチンに造影剤が内包された構造を有する造影剤組成物を得ることもできる。混合比率（モル比）は特に制限されず、例えば（アポフェリチン：修飾されたアポフェリチン）＝（１９：１～０：２０）、好ましくは（９：１）～（０：１０）で行い得る。当該比率により、得られる造影剤組成物の修飾頻度を変えることができる。つまり、用いる“化学修飾されたアポフェリチン”の比率が大きいほど、得られる造影剤組成物が備える修飾の量が多くすることができる。
　ただし、多糖（例えばデキストラン等）によりアポフェリチン表面を修飾すると、多糖がアポフェリチン表面と多点架橋するため、多糖修飾されたアポフェリチンを各アポフェリチンサブユニットへと解離させることが難しい。よって、多糖による修飾がされたアポフェリチンを、当該“修飾されたアポフェリチン”として用いることは難しい。このようなアポフェリチンを各アポフェリチンサブユニットへ解離させることが困難である修飾がされたアポフェリチンでなければ、当該“化学修飾されたアポフェリチン”は特に制限されないが、例えばDy776にて修飾されたアポフェリチン又はＰＥＧにより修飾されたアポフェリチンが好ましい。例えば、アポフェリチンとDy776にて修飾されたアポフェリチン（Dy776修飾アポフェリチン）をモル比にて（アポフェリチン：Dy776修飾アポフェリチン）＝（９：１）で混合したものを用いて、部分的にDy776で修飾されたアポフェリチンに造影剤が内包された造影剤組成物を作成することができる。
　以上のように、造影剤を内包したアポフェリチンであって、当該アポフェリチン表面を化学的に修飾したものも、本発明の造影剤組成物に含まれる。
　本発明の造影剤組成物は、医療製剤の形態に製剤されて体内へ投与され得、通常は注射剤（液剤、乳剤、懸濁剤）として製剤される。製剤にあたっては、本願の造影剤組成物を溶解した溶液は、殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましい。これらの液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に成形する際に用いられる希釈剤としては、公知のものを広く用いられているものを使用することができ、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルベタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。この場合、等張性の溶液を調製するのに十分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを製剤中に含有させてもよく、また本願の造影剤組成物の構造（特にアポフェリチンの構造）を変化させない範囲において、通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を、更に必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等、及び／ 又は他の医薬品を含有させてもよい。
　本願の造影剤組成物の投与量としては、臨床で使用される場合、成人に対しては、典型的にはアポフェリチンに内包された造影剤の量が０．０００１～１ｍ mol／ｋｇであり、０．００１～０．５ｍ mol／ｋｇが好ましく、０．０１～０．１ｍ mol／ｋｇがより好ましい。
　またさらに、蛍光分子で修飾されたアポフェリチンに造影剤が内包された構造を有する本発明の造影剤組成物を、哺乳動物へ投与し、（例えばマウス又はラットの尾静脈へ注射により投与し）、イメージングシステム（例えばXenogene製 IVIS-200）等を用いることにより、その体内動態を調べることができる。また、これにより、EPR効果が得られるか否かを判定することも可能である。
　以上のように、本願の造影剤組成物は、アポフェリチンに効率よく造影剤を内包させて得られるものである。特にGd錯体造影剤を内包させたものは、Gd錯体がアポフェリチン内で安定化され、毒性が出にくくなる。また、高分子効果、水分子交換促進効果により、Gd錯体造影剤一分子あたりの水の緩和時間短縮効果（緩和度）が大きくなる。よって、アポフェリチンに内包しない同量のGd錯体造影剤に比べ、大幅にＴ１緩和時間が短縮される。これらのことから、投与量を大幅に減少させることが可能となる。
　また、上記式（Ｉ）で表される化合物であって、全体として電荷が０以上、特に１以上の電荷を有するものをアポフェリチンに内包させる場合は、アポフェリチン内部に、より内包されやすいため、より多数の造影剤が内包される。これにより、製造工程におけるコストパフォーマンスが改善される。また、多数内包されることにより、投与すべき造影剤内包アポフェリチン量を減らすことができる。さらにまた、配位数が8よりも少ないGd錯体はGdイオンへの水の配位サイトが増え、緩和が促進される水分子が増えるため、緩和度が大きくなり、投与すべき造影剤量を減らすことができる。
　以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
試験例１：Gd-Me 2 DO2Aの製造
　以下のようにして、Gd-Me2DO2Aを製造した。当該Gd-Me2DO2Aの製造スキームを、まず下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　当該スキームを次に具体的に説明する。
1,7-dimethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane（化合物（iii））の合成
　1,4,7,10-tetraazacyclododecane（cyclen, 1.25 g）をテトラヒドロフラン（tetrahydrofran：THF）15 mLに溶解させた後、トリメチルクロロシラン（trimethylchlorosilane）1.19 g、ジイソプロピルエチルアミン（diisopropylethyl amine：DIEA）2.78 mLを加え、室温にて1時間撹拌した。濾紙にて白色沈殿を除去したのち、溶媒を減圧留去した。THF 20 mLにて再溶解させた後、－30 ℃にて1.6 Mのｎ－ブチルリチウム（n-butyl lithium）、ｎ－ヘキサン（n-hexane）溶液13.6 mL、ヨードメタン（Iodomethane）1.0 mLを順番に加え、3時間撹拌した。反応終了後、2N HCl水溶液30 mLを加え、室温にて12時間激しく撹拌した後、クロロホルム（chloroform）にて目的とする化合物（iii）（1.04 g、収率72%）を抽出した。
1,7-dimethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,10-diacetic acid, 4,10-di-tert-butyl ester （化合物（ii））の合成
　化合物（iii）（0.55 g）と炭酸カリウム（pottasium carbonate）0.38 gの混合物をアセトニトリル（acetonitrile）4.0 mLに分散させ、撹拌しながらブロモ酢酸tert-ブチルエステル（bromoacetic acid-tert-butyl ester）0.89 mLを60 ℃にて滴下した。12時間撹拌させることにより反応を完結させた後、白色沈殿を濾紙にて取り除き、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム/メタノール = 20/1, v/v）にて精製し、目的とする化合物（ii）（0.92 g）を収率72%にて得た。
1,7-dimethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,10-diacetic acid (Me 2 DO2A, 化合物（i））の合成
　ジクロロメタン（Dichloromethane）8.0 mLに化合物（ii）0.30 gを溶解したのち、0 ℃にてトリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid：TFA）4.0 mLを加えた。室温にて12時間撹拌後、溶媒とTFAを減圧留去し、イオン交換カラム（Dowex 50W-X8）にて分離、精製を行うことで目的とする化合物Me2DO2A（i）（0.20 g）を収率88%にて得た。
Gd-Me 2 DO2Aの調製
Me2DO2A（i）（0.25 g）を脱イオン水（15 mL）に溶解させたのち、50℃にて徐々に塩化ガドリニウム（0.29 g）を加えた。このとき反応溶液のpHは0.1 N水酸化ナトリウム水溶液を加えながら6.0～6.5になるように制御した。50℃にて24時間撹拌することにより、錯形成反応を完了させ、Gd-Me2DO2Aを得た。
試験例２：Gd-Me 2 DO2A錯体の評価
　試験例１で製造したGd-Me2DO2Aの錯体安定定数ならびに縦緩和時間測定を行った。 
　錯体安定定数の算出は、Inorg. Chem. 1994, 33, 3567-3575に記載の方法に従った。具体的には、錯体安定定数の算出には、Gd錯体の錯体安定乗数算出によく使用されるArsenazo III（下式）を用いた方法を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　Arsenazo IIIはGdと2:1の錯体を形成することが知られており、その錯体安定定数（log KML）は12.8である。Arsenazo IIIはGdと錯形成すると660 nmにモル吸光係数50000 M-1 cm-1のUV吸収を持つようになることから、Gd-Me2DO2AとArsenazo IIIを任意の比率で混合し、平衡状態にした上で、Arsenazo IIIと錯形成したGd量を決定することにより、Gd-Me2DO2Aの錯体安定定数を算出したところlog KML= 18.2となった。Gd-DOTAの錯体安定定数が25前後、Gd-DO2Aは13程度と報告されており、この値はちょうどその中間程度である。このことから、DOTAと比べるとカルボキシル基を2つ欠失させているために錯形成能力が低下する一方、二つのメチル基により、Nの配位能が高められていることが明らかとなった。なお、錯体安定定数が低いとガドリニウムの毒性の影響が大きくなることから、ガドリニウム錯体を実際に造影剤として用いるためには、錯体安定定数が１５～１６以上であることが必要といわれているが、Gd-Me2DO2Aはこの値をクリアーすることもわかった。
　また、Gd-Me2DO2Aについて反転回復法（inversion recovery法）にて縦緩和時間の測定を行った。測定には、Bruker製DPX-400を用いた。具体的には、試料となる水溶液をキャピラリー内部に封入し、重クロロホルム溶液中にて反転回復法にて測定した。
　Gd錯体の濃度を0～5 mMの濃度にてT1緩和時間測定を行い、濃度と緩和時間の逆数をプロットしたところ（図２）、直線にのり、緩和度R1は6.73mM-1 s-1となった。Gdの8配位錯体であるGd-DOTAの緩和度は4 mM-1 s-1前後であることを考えると、Gd-Me2DO2Aは6配位となったことにより、水の配位サイトが1から3に増え、Gdにより緩和が促進される水分子が増えた結果、緩和度が大きくなったと考えられる。
　下記表１に、各種ガドリニウム錯体について、既報の錯体安定定数及び緩和度R1をまとめる。なお、Gd-DO2Aの緩和度もGd-DOTAより大きいが、これもGd-DO2AはGdの６配位錯体であるためと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
試験例３：アポフェリチンへのGd-Me 2 DO2A錯体の内包の最適化
　Gd-Me2DO2Aのアポフェリチンへの内包を試みた。従来より、アポフェリチンへの小分子を内包させる試みは行われている。アポフェリチンへの小分子内包実験で使用される公知の方法は、酸性（例えばpH 2.0）にて解離状態にあるアポフェリチン溶液に内包させたい分子を加え、アルカリ性溶液（例えば1 N NaOH水溶液）にてpHを中性に戻すことによりアポフェリチンを再度会合、小分子を内包させる、というものである。
　そこで、当該公知の方法、及び本発明の方法により、Gdイオン又はGd錯体をアポフェリチンに内包し（公知の方法：図３ａ、本発明の方法：図３ｂ）、比較した。
　具体的には、当該公知の方法により、GdCl3、Gd-DOTA、及びGd-Me2DO2Aを用いて、それぞれアポフェリチンへ内包させることを試みた。また、本発明の方法により、Gd-DOTA、Gd-Me2DO2Aを、それぞれアポフェリチンへ内包させることを試みた。
［公知の方法による検討］
ウマ脾臓由来のアポフェリチン4.6 mg（CALBIOCHEM）（以下の例のアポフェリチンも同じ物を使用）を脱イオン水（0.5 mL）に溶解させた後、1N塩酸水溶液にてpHを2.0に調整し、4 ℃にて15分撹拌した。次に、アポフェリチンに対して10000当量のGdCl3、Gd-DOTA、又は Gd-Me2DO2Aを、それぞれ0.5 mLの脱イオン水に溶解させたものを当該pH2.0の溶液に加えた後、1N水酸化ナトリウム水溶液にてpH = 7.4とした。更に2時間4 ℃にて撹拌した。生成物の精製はサイズ排除クロマトグラフィー（Sephacryl S-100：内径10mm・長さ180mm）（GEヘルスケアバイオサイエンス）にて行った。具体的には、流速は自由落下速度、温度は4℃とし、40ドロップ毎にフラクションを回収した。そして、230nmにおけるUV吸収スペクトルの測定により、最も多くのアポフェリチンが入っていると考えられるフラクションを選抜した。
　当該選抜フラクションを用い、Lowry法にてアポフェリチン濃度を、ICP発光分析にて取り込まれたGdの量を算出した（表２、参考例1～3）。Lowry法はナカライテスク製のプロテインアッセイLowryキットを用いて行い、日立製U-2001Spectrometerを用いて、測定波長750 nmでの吸光度を測定した。また、検量線は0.1μM～5.0μMのアポフェリチン溶液を用い作成した。ICP発光分析はセイコー電子工業株式会社製 SPS 4000を用いた。また、0～100ppmの塩化ガドリニウム水溶液を用いて検量線を作成した。
　その結果、Gd-Me2DO2AはGd-DOTAよりも20倍以上効率よく取り込まれることがわかった（表２、参考例1-3）。しかし、pH 7.4に戻した際のアポフェリチンの回収率が低く、25%程度であり（ほとんどのタンパク質が沈殿として回収された）、また、アポフェリチンに対するGd錯体の仕込み量が多量に必要であった（添加したGdのうち、１％以下しかアポフェリチンに内包されなかった）。
［本発明の方法による検討］
アポフェリチン（4.6 mg）を脱イオン水（0.5 mL）に溶解させた後、1N塩酸水溶液にてpHを2.0に調整し、4 ℃にて15分撹拌した。引き続き、1N水酸化ナトリウム水溶液にてpHを4.0～4.5とし、アポフェリチンに対して120、240、又は600当量のGd-DOTA、又は Gd-Me2DO2Aを、それぞれ0.5 mLの水に溶解させたものを、徐々に当該溶液に加えた。添加が終わってから30分間撹拌の後、1N水酸化ナトリウム水溶液にてpH = 7.4とし、更に2時間4 ℃にて撹拌した。生成物の精製は上記公知の方法による検討と同様に、サイズ排除クロマトグラフィー（Sephacryl S-100、溶離液：10 mM Tris-HCl,150 mM NaCl (pH7.4)）にて行い、最も多くのアポフェリチンが入っていると考えられるフラクションを選抜した。そして、当該選抜フラクションを用い、上記公知の方法による検討と同様にして、Lowry法にてアポフェリチン濃度を、ICP発光分析にて取り込まれたGdの量を算出した（表２、実施例1～７）。
　その結果、アポフェリチンの凝集が抑制され、90%以上のアポフェリチンを回収することができるようになった（表２、実施例1～７）。限定的な解釈を望むものではないが、上記公知の方法では、pH 2.0にてGd錯体をアポフェリチンの解離体に加えると、アポフェリチンが再会合するために必須な残基にGd錯体が配位してしまい、pHを7.4に戻しても球状の会合体を作らず凝集してしまうのに対し、本発明の方法であれば、一旦弱酸性の状態にすることで各サブユニットが弱く結合し、再会合に必至な残基にGd錯体が配位することがほとんどないため、このような差が生じたものと考えられる。
　また、Gd-DOTAとGd-Me2DO2Aのアポフェリチンへの取り込み量では、いずれの錯体も体積比から計算される理論値（すなわち、溶媒体積とアポフェリチン内部体積の比から算出したアポフェリチン一分子当たりの内部体積中に存在するガドリニウム数）よりも大きな値となった。さらに、上記公知の方法によりアポフェリチンに内包させた場合（参考例1～3）に比べ、アポフェリチンに対する仕込み量が大幅に少ないにもかかわらず、５～１５倍もの量がアポフェリチンに内包できたことがわかった。
　また特に、カチオン性のGd- Me2DO2Aは、Gd-DOTAより最大で約20倍（実施例２及び実施例７の比較）、体積比から計算される理論値の約290倍（実施例５）ものGd錯体をアポフェリチン内部に取り込むことがわかった。すなわちカチオン性分子を高効率にてアポフェリチン内部に取り込ませることに成功したことが確認できた。特に、実施例５における添加したGd錯体の内包収率を求めたところ、約25%であり、飛躍的な内包効率の向上が達成された。なお、内包収率は、サイズ排除クロマトグラフィーによりフェリチンに内包されたＧｄ錯体量と、内包されずに残ったＧｄ錯体量を求めることにより、算出できる。具体的には、サイズ排除クロマトグラフィーにより、内包操作後の反応溶液を分離、精製し、各フラクションを全てICP発光分析装置にて分析することで各フラクションに含有しているGd錯体量を決定することができる（図４（ｂ）参照）。これらの量の比から、内包収率を求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
試験例４：アポフェリチンへ内包されたGd錯体の安定性
　実施例６を得たのと同様の条件でGd錯体内包アポフェリチンを製造し、得られたGd錯体内包アポフェリチンの安定性について検討を行った。Gd錯体内包アポフェリチンを調製直後のサンプルと、精製後Gd内包アポフェリチンが含まれている画分を4℃にて168時間緩衝溶液中にて保存したサンプルを、それぞれGEヘルスケア製Sephacryl S-100サイズ排除クロマトグラフィー（溶離液：10 mM Tris-HCl,150 mM NaCl (pH7.4)）にかけ、フラクションコレクターにて40ドロップ毎に回収した。各フラクションをUV（日立製U-2001Spectrometer）にて250nmにおける吸光度ならびにICP発光分析（セイコー電子工業株式会社製SPS4000）にてGd含有量を分析した結果を図４に示す。UVの結果は図４（ａ）に、ICP発光分析の結果は図４（ｂ）に示す。なお、UV分析結果からタンパク質の存在を、ICP発光分析結果からガドリニウムの存在を知ることができる。
　図４に示すように、Gd錯体内包直後では5本目当たりにGd錯体を内包したアポフェリチンのUVピーク（図４（ａ））とICP発光分析のピーク（図４（ｂ））が見られた（すなわち、当該５本目のフラクション（フラクション５）が実施例６である）。また、7本目以降に再構築しなかったアポフェリチンと取り込まれなかったGd錯体のピークがそれぞれUV、ICP発光分析から観察できた。Gd錯体内包アポフェリチンが最も多く含まれている画分（フラクション5）を168時間冷蔵保存後、再度サイズ排除クロマトグラフィーをかけ、UVとICP発光分析にてフラクションを観察した結果（赤線）では、フラクション5付近にのみGd錯体内包アポフェリチン由来と考えられるピークが観察され、分解したアポフェリチンやアポフェリチンの外側に漏れ出し遊離な状態にあるGdのピークは観察されなかった。すなわち、アポフェリチンに内包されたGd錯体は少なくとも168時間は安定に存在していること、アポフェリチンのチャンネルを通してGdが外側に漏出してこないことが確認できた。なお、168時間後の測定は、検出強度が弱くなっているが、これはフラクション５の全量の1/3を精製して用いたためであり、168時間後のアポフェリチン内のGd錯体量は変化していないと考えられる。また、各フラクションは、サイズ排除クロマトグラフィー（Sephacryl S-100）により分画されたものであり、フラクションナンバーが大きいフラクションほど、分子量が小さいものが含まれることを示す。
試験例５：Gd内包アポフェリチンの緩和能評価
＜緩和時間測定＞
　Gd-Me2DO2A内包アポフェリチンについて、試験例２と同様にGd-Me2DO2A反転回復法にて縦緩和時間測定を行ったところ、緩和度R1 = 30～40 mM-1 s-1と、非常に高い値となった（図５に実施例６を用いて緩和度を求めた際の濃度と緩和時間の逆数プロット図を示す。緩和度：30.14 mM-1 s-1）。アポフェリチンがGd錯体へ近接する水分子の交換を促進していること、Gd錯体がアポフェリチン内部に取り込まれることによる運動の抑制による効果（高分子効果）が緩和度向上の理由として考えられる。
＜画像取得による緩和能評価＞
　アポフェリチン一分子当たりに12.4 または37.5 個のGd-Me2DO2A を内包したGd-Me2DO2A 内包アポフェリチン（すなわち、実施例３及び実施例４）のT1 緩和能の評価を行った。図６に1.5 T のMRI装置にてTR = 500 msec、TE = 15 msec として撮像したT1 強調画像を示す。横軸は各サンプルに含まれているGd 濃度を示している。Gd 錯体を内包したアポフェリチンは低いGd濃度においてもGd-DOTAやGd-Me2DO2Aと比べて強いT1緩和能が認められた。また、それぞれの縦緩和時間を測定し、緩和度（R1）を求めたところGd-Me2DO2A 内包アポフェリチンの緩和度は実施例３で14.0 mM-1 s-1、実施例４で14.4 mM-1 s-1、となった。また、Gd-Me2DO2A、Gd-DOTA の緩和度はそれぞれ7.6 mM-1 s-1、3.9 mM-1 s-1となった。このことから、Gd-Me2DO2A 内包アポフェリチンの緩和度は、例えば実施例３において、内包する前の約2 倍、Gd-DOTAの3～4 倍程度となり、内包による高感度化に成功したことが確認できた。
試験例６：アポフェリチンの化学修飾（ＰＥＧ修飾）
　EPR効果を得るために、アポフェリチンの外側に存在する72個のリシン残基をPEG修飾することにより、本発明の造影剤組成物の粒径を制御できるかを検討した。（図７）。
　PEG-COOHをNHSエステル化した上で、アポフェリチンの修飾を行った。当該スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　具体的には、次のようにして行った。末端がカルボン酸型の分子量5 kDaポリエチレングリコール（PEG-COOH, 50 mg）をジクロロメタン（0.5 mL）に溶解させたのち、ヒドロキシスクシンイミド（hydroxy succinimide）6 mg、ジシクロヘキシルカルボジイミド（dicyclohexylcarbodiimide：DCC） 6 mgを加え4 ℃にて20時間撹拌した。溶媒を除去後、酢酸エチル（ethyl acetate）にて洗浄し、減圧乾燥したものをアポフェリチン（4.6 mg）の脱イオン水溶液（0.5 mL）に加え、20時間撹拌した。引き続き反応溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（Sephacryl S-100）にて精製した。PEGの導入は電気泳動（SDS-PAGE）によるアポフェリチンサブユニットの分子量の変化を観察することで確認した（図８）。
　図８に示す結果から、アポフェリチンに対してPEG-OSuを120当量反応させた時（サブユニット当たり5当量）には、サブユニット当たりにPEG鎖が3または4本導入されていることが確認できた。
試験例７：アポフェリチンの化学修飾（デキストラン修飾）
　多糖修飾はグルコースが主にα(1→6)結合にて繋がった水溶性多糖であるデキストランを用いた。デキストランを臭化シアンにて活性化した上で、アポフェリチンのリシン残基と反応させた（図９）。
　具体的には、次のようにして行った。デキストラン（40 kDa, 500 mg）を脱イオン水（10 mL）に溶解させた。反応溶液にcyanogen bromide（40 mg）を30分ごと3回加えた。このとき反応溶液のpHは1N水酸化ナトリウム水溶液にて常に10.7となるように調整した。反応終了後、透析を行い、過剰量のcyanogen bromideを除去した。Gd-Me2DO2Aの内包アポフェリチン（25 mg）をこのデキストラン溶液（0.5 mL）に溶解させ、pH 9.0、4 ℃にて12時間撹拌した。グリシン（10 mg）を加え、更に3時間反応させたのち、過剰量のグリシンを透析にて除去した後、サイズ排除クロマトグラフィー（Sephacryl S-100）にて精製した。
　生成したデキストラン修飾アポフェリチンを、動的光散乱法（DLS）により測定し、粒子径を決定した。これにより、平均粒径が60 nm程度のデキストラン修飾アポフェリチンを調製できることが明らかとなった（図１０（ａ））。
　またさらに、用いるcyanogen bromideの量を変え、同様に検討を行った。具体的には、反応溶液にcyanogen bromide（20 mg）を30分ごと3回加えた点以外は、上記と同様にしてデキストラン修飾アポフェリチンを得、動的光散乱法（DLS）により粒子径を決定した。その結果、平均粒子径が30 nm程度のデキストラン修飾アポフェリチンを調製できたことが確認できた（図１０（ｂ））。
　このことから、デキストランにて修飾したアポフェリチンの粒径は、デキストラン修飾を行う際、デキストランを活性化するために用いる臭化シアンの量によって制御できることがわかった。具体的には、デキストランを活性化するために用いる臭化シアンの量が多いほど、得られるデキストラン修飾アポフェリチンの粒径を大きくできることがわかった。
試験例８：アポフェリチンの化学修飾（Dy776）
　末端が遊離のカルボキシル基の構造をもったDy776（Dyomics製）0.4 mgを0.1 mLの脱イオン水に溶解させた。水可溶性カルボジイミド、1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochlorideを0.1 mg加え、0 ℃、pH 6.0にて15分間撹拌した。引き続き、0.1 mLの脱イオン水に溶解させたアポフェリチン（9.2 mg）を反応溶液に加え、遮光しながら一晩撹拌、反応させた。反応終了後、Sephacryl S-100カラムにて精製を行い、Dy 776修飾アポフェリチンを得た。　
試験例９：Gd錯体内包アポフェリチンからなるMRI造影剤組成物の造影能の検討
　以下のようにして、Gd錯体を内包したデキストラン修飾アポフェリチンからなるMRI造影剤組成物の造影能の検討を行った。
＜Gd錯体内包アポフェリチンからなるMRI造影剤組成物の調製＞
　上記試験例３の実施例５と同様にして、Gd錯体を内包したアポフェリチンを調製した。そして、上記試験例７に記載した方法と同様にして当該Gd錯体内包アポフェリチンをデキストラン修飾した。これにより、平均粒径60 nmのGd錯体内包デキストラン修飾アポフェリチンを得た。
　このようにして調製したGd錯体内包デキストラン修飾アポフェリチンを、以下sample 1として用いた。
　なお、sample 1について、試験例２と同様に反転回復法にて縦緩和時間測定を行ったところ、緩和度（R1）は23.5 mM-1 s-1であった。
＜MRI造影剤組成物を用いたMRI撮像＞
　右足根元にヒトの子宮頸癌由来の癌組織を移植したヌードマウスを実験動物として用いた。以下に示す容量の造影剤組成物（sample 1）又は造影剤（sample 2）を当該ヌードマウスに尾静脈から注射により投与し（n = 3）、投与前、投与直後、1、6、24、48時間後の合計6回撮像を行った。

sample 1 … Dextran修飾したGd錯体内包アポフェリチン（平均粒径：60 nm）(Gd: 0.0708 mg/250 μL)

sample 2 … Gd-DOTA（市販薬「マグネスコープ」（有効成分：ガドテル酸メグルミン）Referenceとして使用）(Gd: 0.42 mg/250 μL)

　なお、sample 1及びsample 2の投与量は、以下のようにして決定した。
sample 1 …緩和度（R1）が23.5 mM-1 s-1であり、Gd-DOTAの緩和度が（R１）が3.96 mM-1 s-1であるので、Gdの投与量がsample2におけるGd重量の（3.96/23.5）倍となるようした。なお、当該Gd-DOTAの緩和度（R１）の値（3.96 mM-1 s-1）は、試験例２と同様に反転回復法にて縦緩和時間測定を行った結果得られた値である。
sample 2 … ヒトへ投与する場合の投薬量（Gd-DOTA 75 mg/kg）に準拠して投与量を決定した。実験に用いたヌードマウスの体重は２０ｇであったため、Gd-DOTAの投与量が1.5mgとなるように投与した。
　撮像はサーフェスコイルを用い、TR = 500 ms、TE = 15 ms（T1強調画像）、スライス幅2 mmとした。また、造影効果はMRI画像のピクセル当たりの明度にて評価した。なお、撮像にあたり、ヌードマウスには麻酔薬（ネンブタール）を腹腔内投与して麻酔を施した。
　同一個体の0, 1, 6, 24, 48時間経過後のMRI画像について、癌疾部位とそれに隣接した筋肉部分についてピクセル当たりの明度測定を行い、その平均値をグラフ化した（図１１）。Gd-DOTA（sample 2）は投与直後にコントラストが最大になり、その後速やかに低下した。投与直後に癌疾部位のコントラストが健常組織よりも良くなったのは癌組織では血流量が多いためであると考えられる。
一方、Gd錯体内包アポフェリチン造影剤は投与後徐々に癌疾部位と健常組織のコントラストがつき、投与24時間後に最大（1.44）となった。EPR効果によりMRI造影剤の血中滞留性が向上し、徐々に癌疾部位に造影剤が貯まったことが24時間後にコントラストが最も良くなった原因であると考えられる。また、Gd錯体内包アポフェリチン造影剤組成物（sample 1）の癌疾部位コントラスト増強効果（24時間後：1.25 → 1.44）はGd-DOTAにおける最大値（投与直後：1.25 → 1.33）と比べて2倍以上強かった。
　また、投与から24時間経過後、sample 1投与ヌードマウスとsample 2投与ヌードマウスのT1強調画像を動物用コイルを用いて撮像した結果を図１２に示す（撮像条件はサーフェスコイルを用いた場合と同じ）。サーフェスコイルを用いて撮像した場合と同様に右足根元に移植された癌疾部位に造影剤組成物又は造影剤が集積していることが見て取れる。コントラスト（癌疾部位の明度／癌疾部位以外の部分の明度）は、Gd-DOTA（sample 2）が（7666 / 5242）= 1.46であるのに対して、Gd錯体内包アポフェリチンMRI造影剤（sample 1）では（10369 / 6361）= 1.63と増強されていることが確認できた。
＜Gd錯体内包アポフェリチンMRI造影剤組成物の血中動態＞
　上記の担癌ヌードマウスでのMRI撮像に使用したGd錯体内包デキストラン修飾アポフェリチンを用い、試験例８に記載の方法と同様にして、当該アポフェリチンの外殻を近赤外蛍光剤Dy-776にて修飾した。
　この外殻がDy-776修飾されたGd錯体内包デキストラン修飾アポフェリチン（以下「Gd錯体内包デキストランDy-776アポフェリチン」という）を、上述のように、右足根元にヒトの子宮頸癌由来の癌組織を移植したヌードマウスに投与し、近赤外イメージング装置にて担癌マウスでの造影剤の血中動態について調べた。同一個体において、投与直後、1、6、24、及び48時間後に撮像した結果を図１３に示す。
　図１３に示されるように、投与直後、Gd錯体内包デキストランDy-776アポフェリチンは血流にのりマウス全体に拡散していた。また、投与１時間後ではまだかなりの量が体内に残っていた。デキストランによる修飾によって細網内皮系細胞によるGd錯体内包デキストランDy-776アポフェリチンの異物認識が抑制され、血中滞留時間が長くなったためであると考えられた。一方、投与6時間、24時間後と徐々にマウスの体内から造影剤が抜けて行っているのが確認できた。主に腎臓から尿として排出されていると考えられた。また、癌疾部位にGd錯体内包デキストランDy-776アポフェリチンが貯まってきていることを観察することができた。デキストランによる修飾によって、EPR効果が得られたためと考えられた。
　さらに、投与から48時間経つと健常組織からほぼGd錯体内包デキストランDy-776アポフェリチンが抜け、EPR効果により癌疾部位のみに特異的にMRI造影剤が貯まっていることを確認することができた。
　以上のように、MRIと近赤外光イメージングの双方の実験結果から、Gd錯体内包デキストランDy-776アポフェリチンは内包したGd錯体を放出することなく、EPR効果により癌疾部位に選択的に貯まっていることが確認できた。
試験例１０：Gd錯体のアポフェリチン内部への取り込み効率の検討
　アポフェリチンに対して120当量のGd-Me2DO2A錯体を次の２通りの方法で内包を試みた。
　サンプルＡ　… pH 2.0でアポフェリチンを分解後、pH 4.5にてGd錯体を添加し、その後pH 7.4に調整した。
　サンプルＢ　… pH 2.0にはせず、pH 7.4でGd錯体を添加した。
　具体的には、サンプルＡは試験例３に記載の“本発明の方法”と同様にして調製し、サンプルＢは当該方法においてｐＨを変化させずpH 7.4において調製をした。両サンプルとも、サイズ排除クロマトグラフィー（Sephacryl S-100）にて精製し、各分画についてICP発光分析装置を用いて含まれているGd濃度を定量した（図１４）。
図１４においてフラクションナンバー5付近の画分はアポフェリチンを含む高分子量画分を、フラクションナンバー9付近の画分はアポフェリチンに内包あるいは吸着されなかった遊離のGd錯体を含む低分子量画分を示している。
サンプルＢの操作条件（pH 7.4からpHを変化させない）ではアポフェリチンは会合したままの状態であり、アポフェリチンにほとんど内包されない。よって、フラクションナンバー５付近の画分でGd錯体が検出されれば、それはアポフェリチンの球殻外側にGd錯体が吸着していることを示すと考えられる。しかし、図１４に示されるとおり、サンプルBでは、フラクションナンバー５付近の画分からはほとんどGd錯体は検出されておらず、またフラクションナンバー９付近の画分に大量のGd錯体が検出されていることから、使用したGd錯体の大部分はアポフェリチンに内包もされておらず、また、表面への吸着もほとんどされていないことが確認できた。
　一方、サンプルＡでは、フラクションナンバー５付近の画分からGd錯体が検出され、フラクションナンバー９付近の画分にはサンプルＢに比べ少量のGd錯体しか検出されていないことから、アポフェリチン内部にGd錯体が取り込まれたことが確認できた。
　またさらに、サンプルＡの条件でGd錯体を内包したGd錯体内包アポフェリチン造影剤組成物を10 mM Tris-HCl（pH 7.4）緩衝溶液又は血清中で保管し、24、48、96、168時間経過後に限外濾過（MWCO 30000）して、その濾液についてICP発光分析で分析した。その結果、いずれのサンプルからもGdは検出されなかった。また各サンプルについて限外濾過にて緩衝溶液で洗浄を繰り返してもその濾液からGdは検出されなかった。このことから、Gd錯体内包アポフェリチン造影剤組成物においてGd錯体は極めて安定にアポフェリチンに含まれることが確認できた。
　なお、図１４において斜線で示した面積はアポフェリチン球殻外側表面に付着したGd錯体量を表すとも考えられるが、極微量であり、上述のようにGd錯体は極めて安定にアポフェリチンに含まれることから、Gd錯体内包アポフェリチン造影剤組成物において、ほとんどのGd錯体はアポフェリチンに内包されているものと考えられる。

Claims (10)

  1. （Ａ）アポフェリチンが溶解したｐＨ１．５～３．０の溶液のｐＨを、３．５～５．０に調整する工程、
    （Ｂ）（Ａ）工程で得た処理液に、Ｘ線造影剤又はＭＲＩ用造影剤を添加する工程、
    （Ｃ）（Ｂ）工程で得た処理液のｐＨを、６．０～８．５に調整する工程、
    を含むことを特徴とする、造影剤がアポフェリチンに内包された造影剤組成物の製造方法。
  2. （Ｂ）工程で添加するＭＲＩ用造影剤が、Gd-DTPA又は下記式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式中、Gdは配位されたGd３＋を表し、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一又は異なってよく、各々独立に、－Ｈ、－ＣＨ２ＣＯＯＨ、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨあるいは１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であって、該置換基は同一又は異なってＯＨ基、ＮＨＯＨ基及びＮＨ２基からなる群より選ばれる少なくとも１種である。〕
    で表される化合物、
    あるいはその薬学上許容される塩である、
    請求項１に記載の造影剤組成物の製造方法。
  3. （Ｂ）工程で添加するＭＲＩ用造影剤の造影剤本体が、正電荷を帯びたものである、請求項１に記載の造影剤組成物の製造方法。
  4. （Ｂ）工程で添加するＭＲＩ用造影剤が、Gd-Me2DO2A（下式）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     又はその薬学上許容される塩である、請求項１に記載の造影剤組成物の製造方法。
  5. 請求項１に記載の造影剤組成物の製造方法で製造された、造影剤組成物。
  6. アポフェリチン１分子に、２０分子以上のＭＲＩ用造影剤が内包された、造影剤組成物。
  7. 前記ＭＲＩ用造影剤が、Gd-DTPA又は下式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     〔式中、Gdは配位されたGd３＋を表し、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一又は異なってよく、各々独立に、－Ｈ、－ＣＨ２ＣＯＯＨ、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨあるいは１又は２以上の置換基を有することのある炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であって、該置換基は同一又は異なってＯＨ基、ＮＨＯＨ基及びＮＨ２基からなる群より選ばれる少なくとも１種である。〕
    で表される化合物、
    あるいはその薬学上許容される塩である、
    請求項６に記載の造影剤組成物。
  8. 前記アポフェリチンの外表面が、PEG、デキストラン又は蛍光色素で修飾された、請求項５に記載の造影剤組成物。
  9. 前記アポフェリチンの外表面が、PEG、デキストラン又は蛍光色素で修飾された、請求項６に記載の造影剤組成物。
  10. 下式で表される化合物（Gd-Me2DO2A）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     〔式中、Gdは配位されたGd３＋を表す〕
    又はその薬学上許容される塩。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ308442B6 (cs) * 2012-12-21 2020-08-26 Mendelova Univerzita V Brně Způsob přípravy nanočástic apoferritinu s uzavřeným protinádorovým léčivem
CN115721739A (zh) * 2022-12-09 2023-03-03 牡丹江医学院 一种用于肾盂肾炎核磁造影的造影剂及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05506793A (ja) * 1990-03-09 1993-10-07 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 磁気共鳴造影の改良およびその関連技術
JP2002503644A (ja) * 1997-12-30 2002-02-05 ブラッコ エッセ ピ ア キレート化剤としての１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４−二酢酸誘導体
JP2007169261A (ja) * 2005-12-23 2007-07-05 Ind Technol Res Inst 特異的標的機能を有する蛍光磁気ナノ粒子

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05506793A (ja) * 1990-03-09 1993-10-07 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 磁気共鳴造影の改良およびその関連技術
JP2002503644A (ja) * 1997-12-30 2002-02-05 ブラッコ エッセ ピ ア キレート化剤としての１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４−二酢酸誘導体
JP2007169261A (ja) * 2005-12-23 2007-07-05 Ind Technol Res Inst 特異的標的機能を有する蛍光磁気ナノ粒子

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARBARO, P. ET AL., DALTON, vol. 14, 2000, pages 2393 - 2401 *
GENINATTI CRICH S. ET AL.: "Magnetic Resonance Visualization of Tumor Angiogenesis by Targeting Neural Cell Adhesion Molecules with the Highly Sensitive Gadolinium-Loaded Apoferritin Probe", CANCER RES., vol. 66, no. 18, 2006, pages 9196 - 9201 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ308442B6 (cs) * 2012-12-21 2020-08-26 Mendelova Univerzita V Brně Způsob přípravy nanočástic apoferritinu s uzavřeným protinádorovým léčivem
CN115721739A (zh) * 2022-12-09 2023-03-03 牡丹江医学院 一种用于肾盂肾炎核磁造影的造影剂及其应用

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