KR101159068B1 - 분자영상 프로브 제조용 신규 리간드, 그 리간드를 포함하는 분자영상 프로브, 그 분자영상 프로브를 포함하는 분자영상 입자, 그 제조방법 및 그것을 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

분자영상 프로브 제조용 신규 리간드, 그 리간드를 포함하는 분자영상 프로브, 그 분자영상 프로브를 포함하는 분자영상 입자, 그 제조방법 및 그것을 포함하는 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 분자영상 프로브 제조용 신규 리간드, 그 리간드를 포함하는 분자영상 프로브, 그 분자영상 프로브를 포함하는 분자영상 입자, 그리고 그 제조방법 및 그것을 포함하는 약학 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112010013675052-pat00026

상기 화학식 1에서, n, m, 및 k는 명세서에서 정의된 바와 같다.

Description

분자영상 프로브 제조용 신규 리간드, 그 리간드를 포함하는 분자영상 프로브, 그 분자영상 프로브를 포함하는 분자영상 입자, 그 제조방법 및 그것을 포함하는 약학 조성물{Novel ligand for preparing molecular imaging probe, molecular imaging probe comprising the ligand, molecular imaging particle comprising the imaging probe, and a process for the preparation thereof, and a pharmaceutical composition comprising the same}
본 발명은 분자영상 프로브 제조용 신규 리간드, 그 리간드를 포함하는 분자영상 프로브, 그 분자영상 프로브를 포함하는 분자영상 입자, 그리고 그 제조방법 및 그것을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
분자영상(molecular imaging)은 세포(cellular) 또는 그 이하(subcellular) 단계의 생물학적 과정을 생체 내에서 영상화하여 그 특성을 규명하고 정량화하는 분야이다. 이러한 방법으로 생성된 영상은 세포의 분자적 대사경로를 반영하게 되고, 특히 질병 모델에서 생명체의 생리적인 환경에서의 질병과정을 반영하여 질병 진단 방법으로서 각광받고 있으며 계속해서 발전해 가고 있다.
이러한 분자영상 진단법으로는 자기공명영상촬영(MRI), 양전자단층촬영(PET)용, 단일광자전산화단층술(SPECT), 전산화단층촬영(CT) 등이 있다. 이러한 분자영상 진단을 위해서는 분자영상 프로브가 사용되며, 각 분자영상 진단법에 사용될 수 있는 방사성 금속이온을 리간드에 킬레이팅함으로써 제조된다. 분자영상의 가능성, 실용성, 안전성, 정확성 등을 위한 분자영상 프로브를 개발하기 위해 계속 연구되고 있다.
현재 상용화 되어 있는 MRI 조영제는 DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)에 Gd가 결합된 복합체가 가장 많이 사용되고 있다. DOTA는 거대시클릭 리간드(macrocyclic ligand)로서, 질소의 비공유전자쌍이 Gd 이온의 d-orbital과 상호작용을 하여서 상자성을 나타내게 한다. 이때 거대시클릭 리간드에 부착되어 있는 4 개의 카르복실레이트 이온 역시 Gd 이온과 상호작용하여 Gd 주위에 있을 수 있는 물 이온의 환경을 바꾸게 된다. 따라서, MRI 신호를 증폭할 수 있는 기회를 가지게 된다.
DOTA와 같이 분자영상 프로브를 제조하기 위해 사용되는 다양한 리간드가 개발되어 왔으며, DOTA 이외에도 DTPA(diethylene triamine pentaacetic acid), NOTA(1,4,7-triazacycloneonane-N,N',N"-triacetic acid), TACN(triazacycloneonane), 또는 이들의 유도체 등이 있다(WO 03/101919, WO 04/021996, WO04/031348).
이러한 분자영상 프로브 제조용 리간드는 방사성 금속이온과 빠르고 높은 수율로 결합이 이루어지는 것이 바람직하다. 낮은 수율로 방사성 금속이온이 라벨링되는 경우 킬레이팅되지 않은 방사성 금속이온을 분리하기 위해 생성물을 크로마토그래피로 정제하는 과정이 추가로 필요하여, 실용적이지 않을 수 있다. 또한, 분자영상 프로브로부터 방사성 금속이온이 생체 내에서 방출될 경우 비종양 세포나 정상조직에 방사독성을 유발할 수 있다. 따라서, 방사성 금속이온과 높은 수율로 킬레이팅 되면서, 일단 방사성 금속이온과 킬레이팅하여 분자영상 프로브를 형성하게 되면 안정하여 방사성 금속이온의 방출이 잘 이루어지지 않는 분자영상 프로브 제조용 리간드가 필요하다.
상기 분자영상 프로브는 방사성 금속이온이 세포 독성을 나타내어 종양조직에서 종양을 제거함으로써 종양의 진단 뿐만아니라 치료에도 동시에 사용될 수도 있다. 이러한 분자영상 프로브는 정확한 진단 및 또는 치료를 위해 특정 세포 및 기관으로 선택적으로 타겟팅하는 하는 것이 중요하며, 이를 위해 나노입자에 결합시킬 수 있다. 나노입자의 크기는 50 ~ 150 nm 정도로 조절될 수 있으며, 나노입자의 크기에 따라 특정 세포 및 기관에 선택적으로 위치시킬 수 있다. 또한, 나노입자의 표면에 특별한 암세포의 표면에 많이 존재하는 단백질을 선택적으로 캡쳐(capture)할 수 있는 수용체를 부착하게 되면 특정 암세포의 진단 및 치료에 우월성을 가질 수 있다. 현재 이러한 선택적이고 복합적인 암의 진단과 치료는 많은 연구 중에 있다. 또한, 이러한 나노입자의 표면에는 분자영상 프로브 이외에도 형광 영상 프로브, 비특이적 생물학적 결합을 선택적으로 제어할 수 있는 PEG(polyethyleneglycol)기, 나노입자의 특이적 전달을 위한 항체, 나노입자의 세포흡수를 촉진하기 위한 CPPs(Cell penetrating peptides), 유전자 치료를 위한 siRNA 등과 같은 프로브가 결합되어 다양한 진단 및/또는 치료에 동시에 사용될 수 있는 다능성 나노입자가 개발되고 있다(Ritu et al, Bioconjugate Chem., 2009, 20, 1860-1868).
이에 본 발명자들은 분자영상에 사용될 수 있는 방사성 금속이온과 결합력이 우수하여 수율 및 안정성이 높은 분자영상 프로브를 형성할 수 있는 리간드를 개발하기 위해 연구한 결과, 신규한 분자영상 프로브 제조용 리간드를 개발하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 분자영상 진단법에 실용적이고 안전하게 사용될 수 있는 분자영상 프로브 제조용 리간드 화합물, 및 그 화합물을 제조하기 위한 중간체, 그 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 리간드 화합물 및 방사성 금속 이온을 포함하는, 분자영상 진단법에 실용적이고 안전하게 사용될 수 있는 분자영상 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명은 또 다른 목적은 상기 분자영상 프로브 제조용 리간드 화합물 또는 분자영상 프로브를 포함하는 분자영상 진단용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분자영상 프로브가 나노입자 또는 LDL(low density lipoprotein)에 결합된 분자영상 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분자영상 프로브가 나노입자 또는 LDL(low density lipoprotein)에 결합된 분자영상 입자를 포함하는 진단 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112010013675052-pat00001
상기 화학식 1에서, n은 1 ~ 7의 정수이고;
m은 0 ~ 3의 정수이고;
k는 1 ~ 100의 정수이며;
Q는 NH 또는 S이다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물 및 방사성 금속 이온을 포함하는 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물, 또는 상기 화학식 1의 화합물 및 방사성 금속이온을 포함하는 복합체를 포함하는 분자영상 진단용 약학 조성물을 제공한다.
상기 화학식 1의 화합물은
하기 화학식 2의 화합물을 N-히드록시숙신이미드와 반응시켜 하기 화학식 3의 화합물을 형성시키는 단계;
상기 화학식 3의 화합물을 하기 화학식 4의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 5의 화합물을 생성시키는 단계; 및
상기 화학식 5의 화합물의 보호기 R1 및 R2를 탈보호하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:
[화학식 2]
Figure 112010013675052-pat00002
[화학식 3]
Figure 112010013675052-pat00003
[화학식 4]
Figure 112010013675052-pat00004
[화학식 5]
Figure 112010013675052-pat00005
상기 화학식 2-5에서,
k, m, 및 n은 상기 화학식 1에서 정의된 바와 같고;
Q는 NH 또는 S이고;
R1은 t-부틸옥시카르보닐(Boc), 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 벤질 카바메이트(benzyl carbamate), 아세타미드(acetamide), 트라이플루오로아세타미드(trifluoroacetamide), 프탈이미드(phthalimide), 벤질아민(benzylamine), 트리페닐메틸아민(triphenylamine), 벤질리덴아민(benzylideneamine), 및 p-톨루엔설폰아미드(p-Toluenesulfonamide)로부터 선택된 보호기이고;
R2는 C1-6알킬이며;
R3는 아미노 또는 티올기이다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물을 제조하기 위한 중간체인 하기 화학식 2의 화합물을 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112010013675052-pat00006
상기 화학식 2에서, n은 1 ~ 7의 정수이고,
R2는 각각 독립적으로 C1-6알킬이다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1의 화합물 및 방사성 금속 이온을 포함하는 복합체가 나노입자 또는 LDL(low density liposome)에 결합된 분자영상 입자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 분자영상 입자를 포함하는 진단용 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 방사성 금속이온과 결합력이 우수하여 높은 수율로 안정성이 높은 분자영상 프로브를 제작할 수 있는 리간드의 개발을 위해 연구한 결과 얻어진 새로운 리간드 화합물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서 분자영상 프로브의 제조를 위한 리간드로서 사용될 수 있는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112010013675052-pat00007
상기 화학식 1에서, n은 1 ~ 7의 정수이고,
m은 0 ~ 10의 정수이고,
k는 1- 100의 정수이다.
상기 화학식 1의 화합물에서 n은 바람직하게는 1 ~ 5, 더욱 바람직하게는 1-3의 정수이고, m은 바람직하게는 0 ~ 7, 더욱 바람직하게는 0 ~ 5의 정수이고, k는 바람직하게는 1 ~ 50, 더욱 바람직하게는 1 ~ 30, 더욱 더 바람직하게는 1 ~ 10의 정수이다.
본 발명은 다른 일 측면에 있어서,
하기 화학식 2의 화합물을 N-히드록시숙신이미드와 반응시켜 하기 화학식 3의 화합물을 형성시키는 단계;
[화학식 2]
Figure 112010013675052-pat00008
[화학식 3]
Figure 112010013675052-pat00009
상기 화학식 3의 화합물을 하기 화학식 4의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 5의 화합물을 생성시키는 단계; 및
[화학식 4]
Figure 112010013675052-pat00010
[화학식 5]
Figure 112010013675052-pat00011
상기 화학식 5의 화합물의 보호기 R1 및 R2를 탈보호하는 단계를 포함하는, 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 화학식 2 ~ 5에서, n, m, k, 및 Q는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고, R1은 t-부틸옥시카르보닐(Boc), 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 벤질 카바메이트(benzyl carbamate), 아세타미드(acetamide), 트라이플루오로아세타미드(trifluoroacetamide), 프탈이미드(phthalimide), 벤질아민(benzylamine), 트리페닐메틸아민(triphenylamine), 벤질리덴아민(benzylideneamine), 및 p-톨루엔설폰아미드(p-Toluenesulfonamide)로부터 선택된 보호기이고; R2는 C1-6알킬이며; R3는 아미노 또는 티올기이다.
상기 화학식 3의 화합물은 화학식 2의 화합물을 N-히드록시숙신이미드(NHS)와 반응시켜 형성될 수 있다. 우선 화학식 2의 화합물을 pH 9 조건으로 한 다음, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미(EDC)드 또는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)와 같은 카르복실기 활성화 시약을 첨가하고, NHS와 반응하게 되면 최종적으로 NHS로 활성화된 카르복실기가 형성되어 화학식 3의 화합물이 형성될 수 있다. 상기 pH 조건은 NaHCO3 를 사용해서 조절할 수 있다. 상기 화학식 3의 화합물을 아미노 및/또는 티올기를 양말단에 갖고 한쪽 아미노 또는 티올만 보호된 PEG 링커인 화학식 4의 화합물과 반응을 시켜 화학식 5의 화합물을 형성시킬 수 있다. 이때 pH를 약 8로 조절하는 것이 바람직하며, PBS 완충제를 이용하여 pH를 조절할 수 있다. 카르복실기 및 아미노기가 모두 보호되어 있는 화학식 5의 화합물은 적절한 용매(예: 1,4-디옥산) 중의 묽은 염산용액을 가하여 용이하게 탈보호시켜 화학식 1의 화합물로 변환될 수 있다.
상기 화학식 4의 화합물의 제조방법의 일 구현예로서 하기 반응식 1의 방법이 이용될 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112010013675052-pat00012
상기 반응식 1에 나타내는 바와 같이, 디아미노 또는 디티올의 이중 작용기(bi-fucntional group)를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 Boc 보호기를 도입하기 위해서는 적절한 용매 중에서 Boc2O를 반응시킬 수 있으며, 촉매로는 DMAP(4-Dimethylaminopyridine)와 용매로는 DCM(diclolromethane)이 이용될 수 있으며, 환류반응을 수행할 수 있다. 상기 디아미노 또는 디티올의 이중 작용기(bi-fucntional group)를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 Fmoc 보호기를 도입하기 위해서는 적절한 용매 중에서 Fmoc-Cl를 반응시킬 수 있으며, 용매로는 DCM(diclolromethane)이 이용될 수 있으며, NaHCO3와 같은 물질을 이용하여 pH를 약 10으로 조절하고 환류반응을 수행함으로써 Fmoc 보호기를 도입할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물의 중간체인 하기 화학식 2의 화합물을 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112010013675052-pat00013
상기 화학식 2에서, n은 1 ~ 7의 정수이고, R2는 C1-6 알킬이다.
상기 화학식 2의 화합물은 바람직한 일 구현예에 따르면 하기 반응식 2에 의해 제조될 수 있다.
[반응식 2]
Figure 112010013675052-pat00014
상기 반응식 2에서 화학식 a2의 화합물은 화학식 a1의 화합물을 환원제를 이용하여 에스테르기를 히드록시기로 환원시킴으로써 생성될 수 있다. 환원제로는 상기 에스테르기를 히드록시기로 환원시키면서 카르복실기는 환원시키지 않는 임의의 환원제가 이용될 수 있으며, 예를 들어 LiAlH4, DIBLA(diisobutylaluminium hydride) 등이 있다. 그런 다음, 화학식 2a의 화합물에서 히드록실기를 브롬화시켜 화학식 a이 화합물이 생성될 수 있다. 브롬화를 위해서는 히드록시기를 브롬화시키는 임의의 브롬화제가 이용될 수 있으며, 대표적으로는 PBr3를 이용할 수 있다.
상기 반응식 1에서 화합물(b)은 1,4,7-트리아자시클로노난(TACN)(b1)을 바이알킬화(bi-alkylation) 함으로써 이루어질 수 있다. 이 때 pH, 반응 온도, 및 시간을 적절히 조절하여 선택적으로 화학식 b의 화합물이 얻어질 수 있으며, 바람직하게는 반응온도는 1,4,7-트리아자시클로노난(TACN)에 브로모 알킬 화합물(a2)을 첨가할 때 0℃를 유지하면서 천천히 브로모 알킬 화합물을 첨가할 수 있다. 이때 첨가가 끝난 후 반응시간은 24시간까지 TLC(Thin layer chromatography)로 확인하면서 반응 시간을 조절할 수 있다. 반응이 끝난 후 pH 적정을 통해서 모노 알킬화, 바이 알킬화, 트리 또는 멀티 알킬화된 화합물을 분리 정제하여 바이 알킬화 화합물을 분리한다. 일반적으로는 pH 9~11사이에서 바이 알킬화 화합물(b)가 존재하며, 바이 알킬화의 확인은 NMR 혹은 MS 스펙트로미터로 확인할 수 있다. 분리 속도를 빠르게 하기 위해서는 HPLC를 이용해서 분리해낼 수 있다. 상기 화학식 a1 및 b1의 화합물은 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 상업적으로 입수 가능한 물질로부터 제조하거나, 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용할 수 있다.
화학식 a 및 화학식 b의 화합물을 반응시켜 화학식 2의 화합물을 제조 시에는, 화학식 a의 화합물 1 당량에 화학식 b의 화합물 2 당량이 치환될 수 있도록 반응물이 양을 조절하여야 한다. 또한, 화학식 a의 화합물 및 화학식 b의 화합물을 pH 8~9 조건에서 반응함으로써 화학식 2의 화합물이 생성될 수 있다. 그리하여 얻어진 화학식 2의 화합물은 NMR, TLC, 또는 HR-MS 등의 분석방법으로 분자의 성질 및 구조를 확인할 수 있으며, 만일 합성 후 확인 시에 생성물이 순수하지 않을 경우 필요에 따라 HPLC나 속성 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제 작업을 거쳐야 한다. 분리 및 정제 후에 다시 분석하여 순수한 생성물을 확인하고 각 다음 단계의 화학반응을 시작하는 것이 바람직하다.
상기 화학식 1의 화합물은 방사성 금속 이온을 킬레이팅 결합하여, 분자영상 프로브로서 사용될 수 있는 복합체를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물 및 방사성 금속이온을 포함하는 복합체를 제공한다.
상기 본 발명이 제공하는 복합체는 화학식 1의 화합물의 중심의 벤젠의 pi-전자와 거대 시클릭 분자인 트리아자시클로노난(TACN)의 중심에 킬레이팅 되는 방사성 금속이온 간의 정전기적 상호작용은 상당한 결합력을 제공할 수 있다. 또한, 종래의 분자영상 프로브를 구성하는 리간드 화합물은 일반적으로 1 개의 거대 시클릭 구조를 포함하지만, 상기 화학식 1의 화합물은 2 개의 거대 시클릭 구조를 포함하여 방사성 금속 이온과의 결합력이 높다. 따라서, 상기 화학식 1의 화합물은 방사성 금속 이온과 함께 분자영상 프로브를 높은 수율로 제조할 수 있으며, 안정한 분자영상 프로브를 형성할 수 있다.
상기 방사성 금속이온은 분자영상 진단 기술에 이용될 수 있는 임의의 방사성 금속이온이 이용될 수 있으며, 예를 들어 Gd(III), Mg(Ⅱ), Mn(Ⅲ), Cr(Ⅲ), Fe(Ⅱ), Fe(Ⅲ), Co(Ⅱ), Ni(Ⅱ), Cu(Ⅱ), 213Bi, 212Bi, 212Pb, 225Ac, 111In, 90Y, 67Cu, 64Cu, 66Ga, 86Y, 89Zr, 67Ga, 란타노이드(즉, 원자 번호 57 - 71을 갖는 임의의 원소) 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 란타노이드로는 Pr(Ⅲ), Nd(Ⅲ), Sm(Ⅲ), Yb(Ⅲ), Tb(Ⅲ), Dy(Ⅲ), Ho(Ⅲ), Er(Ⅲ),177Lu, 166Ho, 또는 153Sm 등이 있다. 상기 방사성 금속이온의 종류에 따라, 상기 복합체인 분자영상 프로브가 사용될 수 있는 분자영상 기술이 달라진다. MRI에 사용될 수 있는 방사성 금속이온으로는 Gd(Ⅲ), Mg(Ⅱ), Mn(Ⅲ), Cr(Ⅲ), Fe(Ⅱ), Fe(Ⅲ), Co(Ⅱ), Ni(Ⅱ), Cu(Ⅱ), Pr(Ⅲ), Nd(Ⅲ), Sm(Ⅲ), Yb(Ⅲ), Tb(Ⅲ), Dy(Ⅲ), Ho(Ⅲ), Er(Ⅲ) 등이 있다. 그중에서도 가돌리늄 이온, Gd(Ⅲ)은 가장 높은 상자성을 가지고, 적절한 리간드와 복합체를 형성 시 낮은 독성을 나타내며, 물분자가 리간드와 금속 킬레이팅 착물에 결합되는 확률이 늘어날 수 있는 조건을 나타내므로 본 리간드의 구조는 바람직하다. PET에 사용될 수 있는 방사성 금속이온으로는 213Bi, 212Bi, 212Pb, 225Ac, 111In, 90Y, 67Cu, 64Cu, 66Ga, 86Y, 89Zr, 67Ga, 177Lu, 166Ho, 또는 153Sm 등이 있다. X선 조영제로서 사용하기 위해서는, 상기 방사성 금속 이온은 적절한 양의 X 선을 흡수할 수 있어야 하며(즉, 방사성 불투과성), 예를 들어 인듐, 요오드 등이 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 또한 치료제(예: 방사성 약물)로서 사용하기 위한 방사성 금속이온과 복합체를 형성할 수도 있다. 이러한 복합체를 형성하기 위해 적절한 금속의 방사성 동위원소가 이용될 수 있다. 예를 들어, 적절한 동위 원소로는 테크네튬, 비스머스, 납, 악티늄, 탄소, 질소, 요오드, 불소, 산소, 텔루륨, 헬륨, 인듐, 갈륨, 구리, 레늄, 이트륨, 사마륨, 지르코늄, 루테튬, 또는 홀륨 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 방사성 동위원소 중에서도 이트륨이 바람직하다. 상기 화학식 1의 화합물은 방사성 치료 및 분자영상 진단에 동시에 사용될 있는 방사성 금속 이온과도 결합하여 치료 및 진단 모두를 위한 복합체를 형성할 수도 있다. 예를 들어, 방사성 치료 및 SPECT를 포함한 분자영상기법에 사용될 수 있는 방사성 핵종으로는 213Bi, 212Bi, 212Pb, 225Ac, 177Lu, 111In, 166Ho, 90Y, 153Sm, 67Cu, 64Cu, 66Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr, 및 67Ga 등이 있다.
상기 본 발명의 복합체는 화학식 1의 화합물을 적절한 방사성 금속 이온과 복합체를 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 복합체 형성 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 금속 이온은 수중에서 옥사이드, 할라이드, 니트레이트, 또는 아세테이트의 형태(예: 이트륨 아세테이트, 비스머스 요오다이드)로 하고, 그것을 동량의 몰의 화학식 1의 화합물로 처리하여 제조할 수 있으며, 화학식 1의 화합물은 수용액 또는 현탁액으로서 가할 수 있다. 또한, 방사성 금속이온 및 화학식 1의 화합물에 적절한 pH를 유지하기 위해 묽은 산 또는 염기를 부가하거나, 약 100℃ 만큼 높은 온도로 가열하여 복합체 형성을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 및 방사성 금속이온을 포함한 복합체가 나노입자 또는 LDL(low density lipoprotein)에 결합된 분자영상 입자를 제공한다.
상기 나노입자는 생체에 투여될 수 있는 임의의 나노입자가 사용될 수 있으며, 예를 들어 실리카 나노입자, 은 나노입자, 금 나노입자, 또는 산화철 나노입자일 수 있다. 상기 나노입자 및 LDL은 당업자가 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 제조하거나, 실리카 나노입자는 시그마 알드리치에서 콜로이드 용액 상태로 구입 가능하고 은. 금 또는 산화철 나노입자도 시그마 알드리치서 구입이 가능하다.
상기 본 발명에 따른 분자영상 입자는 화학식 1의 화합물 및 방사성 금속이온을 포함한 복합체(이하, 방사성 프로브라고도 한다)가 나노입자 또는 LDL에 결합시킴으로써 표면 밀도(surface density)가 증강될 수 있다. 즉 나노입자는 많은 표면적을 가지고 되고 그 나노입자 하나에 수많은 방사성 프로브가 부착되게 되므로 보통의 단분자의 방사성 프로브보다 더 놓은 표면 밀도를 가지고 된다. 표면 밀도의 증가에 의해 본 발명에 따른 방사성 프로브에 의한 분자영상의 강도가 더욱 증가할 수 있어, 분자영상 측정에 있어 보다 정확한 영상을 얻을 수 있어 바람직하다.
상기 본 발명에 따른 분자영상 입자는 나노입자 또는 LDL에 상기 분자영상 프로브 이외에 치료, 진단, 물리화학적 성질의 변경을 위한 프로브, 또는 이들의 조합이 더 결합되어 다기능의 분자영상 입자로서 작용할 수 있다. 이러한 추가적인 프로브의 도입으로 하나 이상의 여러 가지 진단방법이나 치료에 이용할 수도 있으며, 입자의 생체 내에서의 분포를 제어할 수도 있다.
상기 치료, 진단, 또는 물리화학적 성질의 변경을 위한 프로브로는 형광물질, siRNA, CPPs, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 항체, 엽산, 콜레스테롤 유도체, 또는 항체 치료제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 원하는 목적에 따라 적절한 프로브가 이용될 수 있다. 상기 항체 치료제로는 리툭시맙(rituximab), 세툭시맙(cetuximab), 아바스틴(avastin), 또는 헤르셉틴(herceptin) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 폴리에틸렌글리콜은 생체 내(in vivo)에서 다른 일반적인 단백질 혹은 여러 가지 결합 리셉터 또는 펩티드, 호르몬 등과 특이적, 선별적으로 결합하지 않도록 하는 역할을 하며, 이는 PEG 길이에 따른 입체 장애 효과 및 산소 원자간의 반데르발스 힘에 의하여 가능하다. 형광물질은 분자영상 이외에 형광 이미징을 동시에 가능하게 한다. 상기 형광 물질로는 니트로벤족사디아졸(NBD), 단실 클로라이드, 플로오레세인(fluorescein)유도체(예: CFSE, FITC), 로다민 유도체(예: RITC), Cy3-NHS, 또는 Cy5.5-NHS 등이 사용될 수 있으며, 형광물질의 선택에 따라 Near IR부터 적색, 적황색, 황색, 녹색, 청색의 다양한 형광 이미징을 확인할 수 있다.
유방암 세포에는 엽산 수용체가 특정적으로 발현되므로, 상기 분자영영상 입자에 엽산을 결합시킬 경우 유방암 조직으로의 타겟팅이 가능하며, 콜레스테롤 유도체는 간암 또는 대장암으로의 타겟팅을 위해 상기 분자영상 입자에 결합시킬 수 있다. 또한, 혈관신생(angiogenesis)에 관여하는 단백질과 잘 결합될 수 있는 RDG 펩티드를 상기 분자영상 입자에 결합시키면 혈관신생이 일어나는 암 조직으로 타겟팅이 가능하다.
또한, 현재 연구가 많이 이루어지고 있는 siRNA 및 그 치료적 응용 역시 상기 분자영상 입자에 응용할 수 있다. 원하는 siRNA 서열을 합성 후 PEGylation한 다음 나노입자의 표면에 개열 가능한 링커(cleavable linker)를 사용하여 결합시킬 수 있다. 상기 링커로서 디설피드 결합, 이민 결합 등이 이용될 수 있으며, 디설피드 결합의 경우 산화조건에 따라 결합의 개열하거나 연결할 수 있으며, 이민 결합의 경우 물을 이용한 가수분해에 의해 아민과 알데히드로 분리할 수 있다. 또한, siRNA를 CPPs와 함께 상기 분자영상 입자에 결합시키면 특정 세포의 표면에서 RNAase에 의해 줄어드는 siRNA의 정도를 완화시킬 수 있다. 따라서, CPPs는 siRNA가 좀 더 효과적으로 유전자 차단(silencing) 기능을 수행할 수 있도록 하는 역할을 수행할 수 있다. CPPs는 다양한 펩티드 시퀀스를 가지고 있으나, 약 10 가지로 요약할 수 있으며, 다양한 CPPs에 대해 현재 계속해서 연구되어지고 있다.
상기 본 발명에 따른 분자영상 입자의 크기는 50~150 nm 정도의 크기가 바람직하며, 나노입자의 크기를 적절히 조절함으로써 나노입자를 특정세포 및 기관에 선택적으로 위치시킬 수 있다.
화학식 1의 화합물 및 방사성 금속이온을 포함한 복합체를 나노입자 또는 LDL에 결합시키기 위해서는 먼저 나노입자 또는 LDL의 표면을 상기 복합체의 아미노기 또는 티올기가 결합할 수 있도록 개질키거나, 화학식 1의 화합물에 나노입자 또는 LDL과 결합이 잘 될 수 있는 작용기를 도입하여야 한다. 또한, 화학식 1의 화합물 및 방사성 금속이온을 포함한 복합체 이외에도 치료, 진단, 또는 물리화학적 성질의 변경을 위한 추가 프로브를 결합시키기 위해서는, 나노입자 또는 LDL의 표면을 상기 추가 프로브가 결합할 수 있도록 개질키거나, 상기 추가 프로브에 나노입자 또는 LDL과 결합이 잘 될 수 있는 작용기를 도입하여야 한다.
이와 같이, 나노입자 또는 LDL의 표면을 개질하는 방법, 및/또는 화학식 1의 화합물 또는 추가 프로브에 나노입자 또는 LDL과 결합이 잘 될 수 있는 작용기를 도입하는 방법은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 나노입자 및 LDL의 종류, 및 결합시키고자 하는 복합체 또는 추가 프로브의 종류에 따라 결정할 수 있다. 예를 들어, 실리카 나노입자를 이용할 경우, 실리카 나노입자를 실란 커플링제로 개질시킬 수 있으며, 그러한 실란 커플링제로서 대표적으로 하기 화합물이 이용될 수 있다.
Figure 112010013675052-pat00015
Figure 112010013675052-pat00016
본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물, 또는 그 화합물 및 방사성 금속이온을 포함한 복합체를 포함하는 질병의 진단 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 분자영상 입자를 포함하는 질병의 진단 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 화학식 1에 킬레이팅되는 방사성 금속 이온의 종류에 따라 진단 또는 치료가 가능한 질병이 달라질 수 있으며, 진단 가능한 분자영상법이 달라질 수 있다. 킬레이팅되는 방사성 금속 이온의 종류에 따른 분자영상 진단법은 앞서 설명한 바와 같으며, 따라서 상기 약학 조성물은 MRI, PET, SPECT, 또는 CT를 이용한 진단을 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 방사성 금속이온의 종류에 따라 치료 가능한 질병이 달라지며, 이러한 방사성 금속이온의 종류에 따라 치료 가능한 질병은 당해 기술분야에 알려져 있다(Kaminski et al., Blood. 2000 Aug 15;96(4):1259-66.)
바람직하게는 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들어, 부형제, 희석제 등이 있으며, 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 담체의 선택은 제조하고자 하는 구체적인 제형 및 그 조성물의 구체적인 투여방법에 따라 결정될 수 있다. 따라서, 상기 본 발명의 약학 조성물은 매우 다양한 형태의 제제로서 존재할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 그 용도 또는 활성성분의 종류에 따라 적절한 투여방법으로 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물의 제형의 종류, 제형의 제조를 위해 필요한 담체, 투여방법, 투여량 등은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적절히 결정할 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여량은 진단 또는 치료하고자 하는 질병의 종류, 질병의 정도, 진단하고자 하는 대상 조직 또는 기관, 및 진단장치의 특성에 따라 달라질 수 있으며, 또한 상기 투여량은 투여 대상의 나이, 성별, 체중, 인종 등에 따라 증감할 수 있다. 상기 약학 조성물은 진단을 목적으로 할 경우 감지 가능한 콘트라스트 효과를 달성할 수 있는 한 적은 양을 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어 상기 화학식 1의 화합물 및 가돌리늄을 포함하는 복합체를 포함하는 약학 조성물의 경우, 투여량은 활성성분을 복합체를 기준으로 대략 0.1 ~ 10 mg /kg 으로 투여할 수 있다.
상기 약학 조성물이 분자영상 진단용 조성물인 경우 바람직한 투여방법은 비경구적, 예를 들어 볼루스 주입, 정맥내 주사, 동맥내 주입, 또는 폐가 조영되어야 하는 경우 스프레이, 예를 들어 연무제 분사가 있고, 경구 또는 직장 투여도 이용할 수 있으나, 공지된 조영제 투여방법으로도 가능하다. 비경구적 투여 제제는 무균이어야 하고, 생리학적으로 허용되지 않는 물질 및 상자성, 초상자성, 강자성, 또는 준강자성 오염물질이 없어야 하며, 방부제, 항균제, 비경구적 용액에 통상적으로 사용되는 완충액 및 항산화제, 부형제를 함유할 수 있으며, 분자영상에 방해가 되지 않는 다른 임의의 첨가제를 더 함유할 수도 있다.
상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 분자영상 프로브 제조용 리간드는 방사성 금속이온과 결합력이 우수하여 수율 및 안정성이 높은 분자영상 프로브를 형성할 수 있어, 정제과정의 번거로움을 피할 수 있으므로 실용적이며 방사독성이 유발시키지 않아 안전하다. 또한, 상기 분자영상 프로브를 나노입자에 결합시킴으로써, 나노입자로 인한 표면밀도 증가에 의해 분자영상 프로브의 강도를 조절할 수 있으며, 나노입자에 추가적으로 다양한 진단 및/또는 치료 물질을 결합시켜 다기능의 분자영상입자로서 사용할 수 있다.
도 1은 화학식 2의 일 구현예의 화합물의 LC-MS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 화학식 2의 일 구현예의 화합물의 13C NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 화학식 2의 일 구현예의 화합물의 1H NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 표면 개질된 실리카 나노입자의 1H NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 표면 개질된 실리카 나노입자의 13C NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따라 표면 개질된 실리카 나노입자의 입자크기분포를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따라 표면 개질된 실리카 나노입자의 제타전위를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따라 PEGylation된 실란 링커분자의 1H NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따라 NBD 형광 및 PEG 5000으로 표면 개질된 실리카 나노입자의 형광이미지 및 UV-Vis 분광분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따라 NBD 형광 및 PEG 5000으로 표면 개질된 실리카 나노입자의 형광 방출 및 여기 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따라 NBD 형광 및 PEG 5000으로 표면 개질된 실리카 나노입자의 1H NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따라 NBD 형광 및 PEG 5000으로 표면 개질된 실리카 나노입자의 입자크기분포를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따라 표면 개질된 실리카 나노입자의 제타전위를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14a는 본 발명의 일 구현예에 따른 분자영상 입자의 MRI 분석 영상이다.
도 14b는 순수한 증류수의 MRI 분석 영상이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 화학식 2의 화합물의 제조
Figure 112010013675052-pat00017
상기 반응식에서 R2가 에틸인 경우에 대해서 하기 반응을 수행하였다.
화합물(a1) 50mg 을 무수 DCM 50ml에 용해시킨 다음에 질소 가스 존재 하에서 건조된 둥근 바닥 플라스크로 이동시켰다. 그 후 에테르에 녹아 있는 LiAlH4 10 mg을 조심스럽게 혼합시켰다. 이때 혼합액의 온도를 0℃로 유지시키면서 반응을 실시하였다. 자석교반기를 통해서 8시간의 반응 시간 동안 TLC 확인으로 반응을 종결하였다. 그 다음 분리 정제 과정 즉, work-up과정을 통해서 시작물질을 걸러내고, 순수한 생성물만 걸러냈다. 그 다음 브롬화 반응을 위해서 생성된 화합물 30 mg을 무수 DCM에 용해시켰다. PBr3를 당량에 맞추어서 15 mg 정도를 혼합시키고 이때 반응의 온도는 0℃로 유지하면서 실시하였다. 촉매로는 PPh3 화합물을 넣어주었다. 그러면 화합물(a2)에서 존재했던 알코올 그룹이 브롬화기로 바뀌게 된다. 생성된 화합물은 컬럼크로마토그래피를 통해서 순수화 작업을 거쳤다.
다음은 생성된 브롬화 화합물(a) 1 당량과 바이알킬화 TACN(b)을 pH 8.0~10 조건에서 용매는 디클로로메탄 100ml 사용하여 반응시키고, 반응 시간은 10시간동안 TLC를 통해서 반응이 완료되었을 때 중지하였다. 생성된 화합물은 감압상태에서 건조시킨 후 냉동보관 하였다. 제조된 최종 생성물(화학식 2에서 R2가 에틸인 화합물)확인을 위해 LC-MS (ESI-QTOF, Applied Biosystems 사)를 수행하였으며, 13C NMR 및 1H NMR 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 1 내지 3에 나타내었다.
도 1은 화학식 2의 일 구현예의 화합물의 LC-MS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 화학식 2의 일 구현예의 화합물의 13C NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 화학식 2의 일 구현예의 화합물의 1H NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
실시예 2: 화학식 1의 화합물의 제조
실시예 1에서 합성된 화학식 2의 화합물(R2=에틸)에는 카르복실기가 존재하는데 이것을 N-히드록시숙신이미드로 활성화시키는 반응으로 실시예 1에서 합성된 생성물 30 mg을 1,4-디옥산에 용해시켰다. 그 다음에 pH를 8~9정도로 맞추기 위해서 NaHCO3 용액 수 ml를 사용해서 pH를 조절했다. 그리고 나서 DCC 2당량 비율로 40 mg을 무수 디클로로메탄에 용해시켰다. 용액의 온도는 0℃로 조절하면서 천천히 DCC 용액을 혼합시켰다. 반응시간은 12 시간으로 TLC로 확인하여 반응을 종결했다. 그 후 HPLC를 통하여 순수한 생성물을 분리 정제 했다. 합성된 화합물은 반드시 영하 20℃ 이하의 냉동실에서 보관했다.
그런 다음, 화학식 3의 화합물(R2=에틸)을 아미노 및 또는 티올기를 양말단에 갖고 한쪽 아미노 또는 티올만 보호된 PEG 링커인 화학식 4의 화합물(R3=아미노, R1=t-부틸옥시카르보닐(t-Boc), m=1, k=2, Q = NH)을 반응시키는데에는 먼저 둥근바닥플라스크에 NHS로 활성화된 화합물 30mg 을 무수 디클로로메탄 혹은 클로로포름 50 ml에 용해 시켰다. 중요한 pH 조절을 위해서 pH 7.4~8.4 정도로 맞추기 위해서 PBS 완충액 수ml를 사용했다. pH가 조절된 용액과 화학식 4의 화합물(R3=아미노, R1=t-부틸옥시카르보닐(t-Boc), m=1, k=2, Q = NH) 20mg을 무수 1,4-디옥산 30ml에 용해시켜 반응을 완성했다. 이때 반응의 온도는 4℃ 정도로 유지했다. 반응의 확인은 TLC를 이용해서 실시했다. 카르복실기 및 아미노기가 모두 보호되어 있는 화학식 5의 화합물(n= 1, R2=에틸, R1=t-부틸옥시카르보닐(t-Boc), Q= NH, m=1, k=2) 20 mg을 4 M 묽은 염산용액이 녹아있는 1,4-디옥산을 5ml 사용하여 24 시간동안 교반시키게 되면 화학식 1의 화합물(n= 1, R2=에틸, Q= NH)로 변환되었다. 상기 화학식 4의 화합물의 제조방법의 일 구현예로서 상기 반응식 1의 방법이 이용될 수 있다.
상기 반응식 1에 나타내는 바와 같이, 다아미노 또는 디티올의 이중작용기를 가지는 폴리에틸렌글리콜 화합물에 Boc 보호기를 선택적으로 도입하기 위해서 1,4-디옥산 100ml에 폴리에틸렌글리콜 화합물 40mg 을 용해시켰다. 그 후 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) (10mg)을 촉매로 하여 Boc2O 화합물 (0.7당량, 20mg)을 무수 디클로로메탄 40ml에 용해시켰다. 반응온도는 10~15℃ 정도에서 실시하며 Boc2O 용액을 4 시간동안 매우 천천히 조금씩 폴리에틸렌글리콜 용액에 혼합시켰다. 반응시간은 보통 4~8 시간사이로 TLC로 확인하여 반응이 80%정도 완결되었을 때 반응을 종결했다. 반응이 끝난 후 HPLC를 사용하여 한쪽만 보호된 폴리에틸렌글리콜 화합물이 생성되었다. 순수 정제화 과정이 끝난 후 화합물은 영하 20℃에서 냉동실에 보관했다.
실시예 3: 나노입자의 표면 개질(1)
콜로이드 실리카(AS-40 , 시그마 알드리치)를 40wt% 용액을 3차 증류수에 희석시켜 10 wt% 용액으로 제조했다. 그 후 APTES를 무수 에탄올 99%에 희석시켰다. 이때 APTES는 10 mmol 의 농도로 제조했다. 상기 두 용액을 아세트산 10ml 존재 하에서 콜로이드 실리카 용액 50 ml와 APTES 용액 30ml을 서로 혼합하여 48시간 동안 섭씨 80℃에서 교반하였다. 반응이 종결된 후 용매를 감압 하에서 증발시키고, 무수 디클로로메탄 50 ml로 3회 여과했다. 이때 반응에 참여하지 않았던 APTES 용액과 아세트산이 제거되었다. 그 후 순수화된 실리카 나노입자 용액을 동결건조기를 통해서 2 일동안 건조 후 얻어냈다. 생성된 실리카 나노입자는 표면에 아민기가 많이 존재하는 형태로 되어 있다.
그리하여 제조된 표면이 개질된 나노입자에 대해 13C NMR 및 1H NMR 분석을 수행하였으며, 입자크기 분포 및 제타전위를 측정하였다. 그 결과를 도 4 내지 7에 나타내었다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 표면 개질된 실리카 나노입자의 1H NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 표면 개질된 실리카 나노입자의 13C NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따라 표면 개질된 실리카 나노입자의 입자크기분포를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따라 표면 개질된 실리카 나노입자의 제타전위를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
실시예 4: 나노입자의 표면 개질(2)
(1) 실란 링커 분자의 PEGylation
Figure 112010013675052-pat00018
3-글라이코실프로필트리메톡시실란(3-GPTMS) 500mg을 무수 디클로로메탄 50ml에 희석시켰다. 그 다음 NHS-PEG5000 50mg을 무수 디클로로메탄 50ml에 희석시켰다. 먼저 둥근바탁 플라스크에 3-GPTMS 용액을 준비하고, 적하깔때기를 사용하여 NHS-PEG5000용액을 서서히 혼합했다. 대략 360분의 시간동안 부가했다. 그 다음 자석교반기를 통해서 12시간동안 반응을 진행했다. 그 후 PEG결합 실란 화합물을 1H NMR 을 통해서 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따라 PEGylation된 실란 링커분자의 1H NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
(2) 나노입자의 표면 개질
Figure 112010013675052-pat00019
상기 제조된 PEGlyation된 실란 링커분자 30mg을 무수 디클로로메탄 50ml에 용해시켰다. 그 후 NBD-Cl 1~1.2당량(15~20mg)을 무수 디클로로메탄 20 ml와 메탄올 20ml에 혼합했다. 반응온도는 10℃ 정도에서 실시했다. 반응시간은 16 시간정도로 TLC로 확인 후 반응을 종결했다. 반응 종결 후 반응하지 않은 NBD를 제거하기 위해서 HPLC를 통해서 순수화를 했다.
이렇게 제조된 두 가지의 실란 화합물, 첫째 Peglyation된 실란 화합물 20mg 과 NBD가 붙은 실란화합물 10mg을 콜로이드 실리카(AS-40 , 시그마 알드리치) 200mg 용액에 교반하여 PEG와 형광 염료인 NBD가 동시에 존재하는 실리카 나노입자를 합성했다. 반응은 24시간동안 자석교반기를 통해서 교반하고, 아세트산 5ml을 첨가하여 80℃에서 반응을 실시하였다. 반응이 종결된 후 반응에 참여하지 않은 실란 및 아세트산을 제거하기 위해서 무수디클로로메탄으로 3회 여과해 주었다.
그리하여 제조된 표면이 개질된 나노입자를 UV-Vis 분광분석기와 형광 분광분석기를 이용하여 흡수, 여기, 방출 파장을 측정하였다. 또한, 1H NMR을 측정하였고, DLS(dynamic light scattering)을 통해서 나노입자의 크기 분포를 측정하였으며, Zeta 포텐셜을 측정하여 표면의 전하 상태의 분포를 확인하였다. 그 결과를 하기 도 9-13에 나타내었다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따라 NBD 형광 및 PEG 5000으로 표면 개질된 실리카 나노입자의 형광이미지 및 UV-Vis 분광분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따라 NBD 형광 및 PEG 5000으로 표면 개질된 실리카 나노입자의 형광 방출 및 여기 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따라 NBD 형광 및 PEG 5000으로 표면 개질된 실리카 나노입자의 1H NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따라 NBD 형광 및 PEG 5000으로 표면 개질된 실리카 나노입자의 입자크기분포를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따라 표면 개질된 실리카 나노입자의 제타전위를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
실시예 5: 나노입자의 표면 개질(3)
콜로이드 실리카(AS-40 , 시그마 알드리치) 40 wt% 용액을 3차 증류수에 희석시켜 10 wt% 용액으로 제조했다. 그 후 3-글라이코실프로필트리메톡시실란(3-GPTMS) 100mg을 무수 디클로로메탄 50ml에 희석시켰다. 이때 3-GPTMS는 10 mmol 의 농도로 제조했다. 상기 두 용액을 아세트산 10 ml 존재 하에서 콜로이드 실리카 용액 50 ml와 3-GPTMS 용액 30ml을 서로 혼합하여 48시간 동안 섭씨 80도에서 교반하였다. 반응이 종결된 후 용매를 갑압 하에서 증발시키고, 무수 디클로로메탄 50ml로 3회 여과했다. 이때 반응에 참여하지 않았던 3-GPTMS 용액과 아세트산을 제거했다. 그 후 순수화된 실리카 나노입자 용액을 동결건조기를 통해서 2 일동안 건조 후 얻어냈다. 생성된 실리카 나노입자는 표면에 에폭사이드기가 많이 존재하는 형태로 되어있다.
실시예 6: 분자영상 입자의 합성(1)
상기 실시예 2에서 제조된 리간드 10mg 를 무수 1,4-디옥산 30ml에 용해시켰고 그 후 상기 실시예 5에서 합성된 나노입자(50mg)를 3차 증류수 50ml에 용해시켰다. 실시예 2에서 제조된 리간드 용액 30ml을 1시간 동안 천천히 상기 실시예 5에서 합성된 나노입자 용액 50ml에 첨가하였다. 첨가시의 온도는 0℃를 유지했다. 그 후 12시간 동안 상온에서 자석교반기를 통해서 교반시켰다. 반응이 끝난 후 투석 멤브레인(MWCO 10,000)을 통해서 2일동안 여과시켜서 반응이 일어나지 않은 리간드를 제거했다.
실시예 7: 분자영상 입자의 합성(2)
상기 실시예 6에서 합성된 분자영상입자 50mg을 3차 증류수 50ml에 분산시켰다. 그 후 GdCl3을 10 mM농도로 맞추어서 두 용액을 함께 교반시켰다. 그 후 자석교반기를 통해서 90℃에서 24시간동안 교반하면서 착화합물을 형성시켰다. 반응의 진척도는 Arsenazo III용액을 사용해서 측정했다. 결합하지 않은 Gd 이온이 있는 경우는 Arsenazo III용액이 분홍색에서 녹색으로 변하게 되고, 착화합물을 형성하였을 때에는 짙은 파랑색이나 분홍색을 띠게 되므로 반응을 종결했다. 그 후 투석 과정에서 3일동안 10,000 MWCO 멤브레인을 통해서 결합하지 않은 Gd 이온을 제거했다. 그 후 동결건조기를 통해서 최종 화합물을 완성했다. 완성된 최종 화합물을 일정 농도로 용액을 제조하고 MRI 분석을 하여 최종확인을 하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14a는 본 발명의 일 구현예에 따른 분자영상 입자의 MRI 분석 영상이다.
도 14b는 순수한 증류수의 MRI 분석 영상이다.
실시예 8: 분자영상 입자의 합성(3)
실시예 7의 방법과 동일한 방법으로 실시예 2에서 합성된 시료(폴리에틸렌글리콜과 TACN이 결합된 화합물) 20 mg을 디클로로메탄 20ml에 용해시켰다. 그리고 미리 제조된 LDL 20 mg을 1,4-디옥산 30ml에 잘 분산시켰다. 그 다음에 분산된 LDL 콜로이드 용액에 1,4-디옥산에 희석된 cis-아코니트산 안하이드라이드 10 mg을 혼합하여 LDL 표면에 존재하는 아민기를 카르복실기로 변화시켰다. 반응의 진척도는 TLC로 확인하였다. 8시간에 반응은 종결됐다. 그 후 리간드가 희석된 용액(20ml)과 카르복실기로 변환된 LDL 입자 20mg을 다시 1,4-디옥산 30ml에 분산시킨 뒤 DCC촉매를 사용하여서 결합을 완성시켰다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1의 화합물:
    [화학식 1]
    Figure 112010013675052-pat00020

    상기 화학식 1에서, n은 1 ~ 7의 정수이고;
    m은 0 ~ 3의 정수이고;
    k는 1 ~ 100의 정수이며;
    Q는 NH 또는 S이다.
  2. 제 1 항의 화합물 및 방사성 금속 이온을 포함하는 복합체.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 방사성 금속 이온은 Gd(Ⅲ), Mg(Ⅱ), Mn(Ⅲ), Cr(Ⅲ), Fe(Ⅱ), Fe(Ⅲ), Co(Ⅱ), Ni(Ⅱ), Cu(Ⅱ), 213Bi, 212Bi, 212Pb, 225Ac, 111In, 90Y, 67Cu, 64Cu, 66Ga, 86Y, 89Zr, 67Ga, 란타노이드로 구성된 그룹에서 선택된 것을 특징으로 하는 복합체.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 란타노이드는 Pr(Ⅲ), Nd(Ⅲ), Sm(Ⅲ), Yb(Ⅲ), Tb(Ⅲ), Dy(Ⅲ), Ho(Ⅲ), Er(Ⅲ),177Lu, 166Ho, 및 153Sm으로 구성된 그룹에서 선택된 것을 특징으로 하는 복합체.
  5. 제 1 항에 따른 화합물 또는 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 포함하는 분자영상 진단용 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 분자영상 진단은 자기공명영상촬영(MRI), 양전자단층촬영(PET), 단일광자전산화단층술(SPECT), 또는 전산화단층촬영(CT)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 하기 화학식 2의 화합물을 N-히드록시숙신이미드와 반응시켜 하기 화학식 3의 화합물을 형성시키는 단계;
    하기 화학식 3의 화합물을 하기 화학식 4의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 5의 화합물을 생성시키는 단계; 및
    하기 화학식 5의 화합물의 보호기 R1 및 R2를 탈보호하는 단계를 포함하는 제 1 항의 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법.
    [화학식 2]
    Figure 112010013675052-pat00021

    [화학식 3]
    Figure 112010013675052-pat00022

    [화학식 4]
    Figure 112010013675052-pat00023

    [화학식 5]
    Figure 112010013675052-pat00024

    상기 화학식 2-5에서,
    k, m, 및 n은 제 1 항에서 정의된 바와 같고;
    Q는 NH 또는 S이고; R1은 t-부틸옥시카르보닐(Boc), 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 벤질 카바메이트(benzyl carbamate), 아세타미드(acetamide), 트라이플루오로아세타미드(trifluoroacetamide), 프탈이미드(phthalimide), 벤질아민(benzylamine), 트리페닐메틸아민(triphenylamine), 벤질리덴아민(benzylideneamine), 및 p-톨루엔설폰아미드(p-Toluenesulfonamide)로부터 선택된 보호기이고;
    R2는 C1-6알킬이며;
    R3는 아미노 또는 티올기이다.
  8. 하기 화학식 2의 화합물:
    Figure 112010013675052-pat00025

    상기 화학식 2에서, n은 1 ~ 7의 정수이고,
    R2는 각각 독립적으로 C1-6알킬이다.
  9. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 복합체가 나노입자 또는 LDL(low density lipoprotein)에 결합된 분자영상 입자.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 나노입자는 실리카 나노입자, 은 나노입자, 금 나노입자, 또는 산화철 나노입자인 것을 특징으로 하는 분자영상 입자.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 나노입자 또는 LDL에 치료, 진단, 물리화학적 성질의 변경을 위한 프로브, 또는 이들의 조합이 더 결합하는 것을 특징으로 하는 다기능 분자영상 입자.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 프로브는 형광물질, siRNA, CPPs(cell penetrating peptide), 치료 펩티드 또는 단백질, 항체 치료제, PEG(polyethyleneglycol), 엽산, 콜레스테롤 유도체로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 다기능 분자영상 입자.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 형광 물질은 니트로벤족사디아졸(NBD), 단실 클로라이드, 플로오레세인(fluorescein) 유도체, 로다민 유도체, 시아닌 3-N-히드록시숙신이미드(Cy3-NHS), 또는 시아닌 5.5-N-히드록시숙신이미드(Cy5.5-NHS)인 것을 특징으로 하는 다기능 분자영상 입자.
  14. 제 9 항에 따른 분자영상 입자를 포함하는 분자 영상 진단용 또는 치료용 약학 조성물.
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